CN103266071A

CN103266071A - 一种甲氰菊酯农药残留降解菌、基于该菌的生物菌剂及应用

Info

Publication number: CN103266071A
Application number: CN2013101847487A
Authority: CN
Inventors: 张�浩; 侯志广; 杨丽莉; 赵晓峰; 逯忠斌; 王岩; 王鑫宏
Original assignee: Jilin Agricultural University
Current assignee: Jilin Agricultural University
Priority date: 2013-05-19
Filing date: 2013-05-19
Publication date: 2013-08-28

Abstract

一种甲氰菊酯农药残留降解菌、基于该菌的生物菌剂及应用,属于环境污染生物修复技术领域。一种甲氰菊酯农药残留降解菌，其分类命名为蜡样芽孢杆菌Y1（Bacillus cereus Y1），保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC No：M 2013018，保藏日期为2013年1月14日。该菌株可以在高浓度甲氰菊酯环境下生长，并可以高效降解甲氰菊酯，为微生物降解甲氰菊酯的研究提供重要基础。该菌株可用于受甲氰菊酯污染的水体、土壤的生物净化。

Description

一种甲氰菊酯农药残留降解菌、基于该菌的生物菌剂及应用

技术领域：

本发明属于环境污染生物修复技术领域，具体涉及一种甲氰菊酯农药残留降解菌、基于该菌的生物菌剂及应用，其是利用微生物的方法降解化学农药残留，适用于现代农业生产中绿色无公害农产品的生产与加工。

背景技术：

甲氰菊酯是一种广谱性的拟除虫菊酯类杀虫杀螨剂，在我国已广泛使用。主要用于果树、棉花、茶树、蔬菜等作物上防治鳞翅目、同翅目、半翅目、双翅目和鞘翅目等害虫及多种害螨。随着一些高毒有机磷农药的禁用，拟除虫菊酯类杀虫剂已经作为主要替代品之一，其使用量和施用频率不断加大，致使拟除虫菊酯类杀虫剂已经成为污染水体、食品及环境的重要因素。目前国内外的大量研究表明，拟除虫菊酯类杀虫剂不但对鱼类和某些益虫（如蜜蜂、桑蚕等）毒性高，而且影响人类生殖健康，甚至引起出生缺陷、发育异常。因此，研究解决甲氰菊酯残留毒害问题对扩大它在生产上应用，减少对环境造成的污染具有重要意义。

多年来，一些农药的不正确使用以及滥用造成的农药污染问题已引起了全球的高度重视。随着科学技术的迅速发展，生物修复技术以其廉价、高效、二次污染小等特点逐渐占据主要地位。目前国内外已分离得到许多能降解或转化农药的微生物类群，并对微生物降解农药的作用方式和降解机制等进行了研究，并且显示出良好的应用前景。但是，微生物修复受污染土壤在实际应用中受到很多因素影响，所以对污染物降解率往往偏低，影响了该技术的发展。通过筛选高效甲氰菊酯降解菌株，将微生物发酵制成菌剂，应用于农药残留降解，对甲氰菊酯残留的生物修复研究和应用具有十分重要的意义。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种甲氰菊酯农药残留降解菌。其分类命名为：蜡样芽孢杆菌Y1（Bacillus cereus Y1），保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），（地址是：中国湖北省武汉市武昌珞珈山，邮编：430072），保藏编号：CCTCC No：M2013018，保藏日期：2013年1月14日。

该降解菌菌株在平板培养基上生长的菌落形态为圆形菌落，直径5～7mm，菌落较大，表面粗糙，扁平，不规则；菌落呈白色稍有光泽。菌体细胞杆状，末端方，葡萄糖发酵试验为阳性。该菌株16S rDNA的Genbank登陆号为KC247316。

所述平板培养基配方是：氯化钠10.00g，酵母粉5.00g，蛋白胨10.00g，琼脂15.00～20.00g，加入到1000mL蒸馏水中，pH7.0。

本发明的第二个目的是提供一种包含上述甲氰菊酯农药残留降解菌的生物菌剂，其由如下步骤制备得到：

1）将保藏编号为CCTCC No：M2013018的蜡样芽孢杆菌Y1试管种用接种环沾少许菌体接种于100mL LB液体培养基中，振荡培养至对数期；

2）将上述培养好的菌种按1%体积分数的接种量接种于种子罐，振荡培养至对数期；

3）将上述培养好的种子液按10%体积分数的接种量接种于生产罐，振荡速度为150转/分，培养温度为30℃，培养48小时后菌体数量达到10¹³个/mL以上；

4）将发酵完成后培养液导出，直接用塑料包装瓶分装成液体菌剂，即生物菌剂。

其中，所述的LB液体培养基配方为：氯化钠10.00g，酵母粉5.00g，蛋白胨10.00g，加入到1000mL蒸馏水配制而成，调pH7.0；

种子罐所用培养基、生产罐所用的培养基相同，配方均为：蔗糖1.50g，蛋白胨25.00g，KH₂PO₄0.10g，K₂HPO₄0.01g，MgSO₄·7H₂O1.00g，NaCl0.10g，CaCl₂0.01g，加入到1000mL蒸馏水中，pH7.0。

本发明的第三个目的是提供上述甲氰菊酯农药残留降解菌在降解甲氰菊酯杀虫剂方面的应用。优选是在降解水体或土壤环境中甲氰菊酯杀虫剂的应用。

有益效果：

本发明筛选获得一株蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）Y1（CCTCC No：M2013018），由该降解菌制备的生物菌剂能够高效降解甲氰菊酯，为微生物降解甲氰菊酯的研究提供重要基础。该菌株制备的菌剂可用于甲氰菊酯污染的水体、土壤的生物净化，解决甲氰菊酯对水体、土壤环境、农作物和人体健康的危害问题。

本发明描述的环境修复菌剂可以用发酵工业常用发酵设备进行生产，具有生产成本低，使用方便，降解效果好的优点，适合治理水体或土壤环境中甲氰菊酯造成的污染。本发明对于保护生态环境，降低农药对农作物药害，保护人体健康具有重要意义。

附图说明：

图1：不同pH培养条件对甲氰菊酯降解的影响曲线；

图2：不同培养温度对甲氰菊酯降解的影响曲线；

图3：不同初始浓度对甲氰菊酯降解的影响曲线；

图4：不同接菌量对甲氰菊酯降解的影响曲线；

图5：Y1生物菌剂在土壤中对甲氰菊酯的降解曲线。

具体实施方式：

实施例1:菌株的分离、纯化、鉴定及菌悬液的制备

取5g土壤样品（吉林农业大学农业科学试验站多年使用甲氰菊酯农药的试验田），加入盛有50mL无机盐培养基的三角瓶中，从浓度为1000mg/L甲氰菊酯的甲醇溶液中取1mL直接加到三角瓶中，使甲氰菊酯的浓度达到20mg/L，在摇床上培养2d（30℃，150r/min）后转接至含甲氰菊酯50mg/L的无机盐培养基中培养2d后，然后在含浓度为100mg/L的甲氰菊酯平板培养基上接入上述培养2d的无机盐培养基0.1mL，涂布后于30℃培养箱中培养2d，挑出单菌落在平板培养基上重复移种划线3～4次进行纯化，将纯化后Y1菌株用接种环沾取少许接种于50mL的LB液体培养基中，30℃、150r/min的摇床中震荡培养48h，取适量菌液离心，弃去上清液，用等量磷酸缓冲溶液洗涤沉淀，用50mL的磷酸缓冲溶液悬浮，得Y1菌悬液备用。

所述的LB液体培养基配方是：氯化钠10.00g，酵母粉5.00g，蛋白胨10.00g，加入到蒸馏水1000mL，琼脂15.00～20.00g，pH7.0。

所述无机盐培养基为蔗糖1.50g，KH₂PO₄0.10g，K₂HPO₄0.01g，MgSO₄·7H₂O1.00g，NaCl0.1g，CaCl₂0.01g，加蒸馏水1000mL，pH7.0。

从上述纯化好的菌株中获得一株甲氰菊酯降解菌，该降解菌为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）的Y1菌株。其在CCTCC的保藏编号是CCTCC No：M2013018。该降解菌菌株在平板培养基上生长的菌落形态为圆形菌落。菌落较大，表面粗糙，扁平，不规则。菌落呈白色稍有光泽。菌体细胞杆状，末端方，葡萄糖发酵试验为阳性。该菌株16S rDNA的Genbank登陆号为KC247316。

实施例2：修复菌剂的制备

使用上述菌株蜡样芽孢杆菌Y1（Bacillus cereus Y1）生产修复菌剂的工艺为：试管种—摇瓶种子液—种子罐—菌剂（剂型为液体菌剂）

实施例3：降解条件

1、pH对菌株Y1降解甲氰菊酯的影响

按体积百分比为5%接菌量，将实施例1制备的Y1菌悬液接入甲氰菊酯的浓度为10mg/L的无机盐培养基中，分别调节培养基的pH为5、5.5、6、6.5、7、8、9，在30℃、150rpm摇床震荡培养，分别在24h、48h、72h、96h测定甲氰菊酯的含量。

pH值对菌株降解甲氰菊酯的实验结果表明，当pH为7.0时，Y1降解甲氰菊酯的降解率最高，达到97.35%。甲氰菊酯在酸性环境中的降解率低于碱性环境中的降解率。结果如图1所示。

2、温度对菌株Y1降解甲氰菊酯的影响

温度实验中，选用五种不同温度20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，在甲氰菊酯浓度为10mg/L的无机盐培养基中，按体积百分比为5%接入实例1制备的Y1菌悬液，150rpm条件下进行振荡培养，分别24h、48h、72h、96h取样测定甲氰菊酯的含量。

在20～40℃培养条件下，分别测定菌株Y1对甲氰菊酯的降解率。菌株Y1降解甲氰菊酯的最适温度为30℃，24h降解率可达到96.6%。说明Y1菌在此温度下生长最好，降解酶活性最高。40℃时，甲氰菊酯降解率最低，表明高温影响菌株对甲氰菊酯的降解能力。结果如图2所示。

3、甲氰菊酯的初始浓度对菌株Y1降解甲氰菊酯的影响

在无机盐培养基中加入甲氰菊酯溶液，使其终浓度分别为5mg/L、10mg/L、20mg/L、50mg/L、80mg/L、100mg/L，以体积百分比为5%的接菌量接入实例1制备的Y1菌悬液，30℃、150rpm摇床震荡培养，分别24h、48h、72h、96h取样测定甲氰菊酯的含量。结果参见图3、表1。

表1：Y1菌株降解甲氰菊酯的一级动力学方程

实验结果表明氰菊酯浓度为10mg/L，Y1对甲氰菊酯的降解率最高，降解率达到98.81%，当甲氰菊酯初始浓度高于20mg/L时，随着底物浓度的提高降解率表现为下降趋势，当初始浓度为100mg/L时，降解率为13.38%。结果如图3所示。

4、接菌量对菌株Y1降解甲氰菊酯的影响

以体积分数1%、3%、4%、5%、6%、7%、9%的接菌量接入实例1制备的Y1菌悬液于含有10mg/L甲氰菊酯的无机盐培养基中，在30℃、150rpm摇床振荡培养，分别24h、48h、72h、96h取样测定甲氰菊酯的含量。结果参见图4。

实验结果表明甲氰菊酯浓度为10mg/L时，接菌量为6%时降解率最高，达到99.79%。接菌量过低时，基础盐培养基中的降解菌初始菌量过低，导致降解率低，而接菌量达到一定程度后，再提高接菌量，降解率基本不变。结果如图4所示。

实施例4：Y1生物菌剂在土壤中对甲氰菊酯的降解实验

实验处理1：取风干过筛（2mm）的土壤500g，加入甲氰菊酯药液，充分拌匀，制成甲氰菊酯浓度为10mg/kg的含药土壤。以10¹²cfu g^-1个菌体浓度接入Y1生物菌剂于土壤中，加入蒸馏水调整含水量为30%，混匀待测，同时设置含药但不加Y1生物菌剂的土壤作为对照。

实验处理2：取风干过筛（2mm）的土壤500g，湿热灭菌，加入甲氰菊酯药液，制成含药量10mg/kg的土壤，以10¹²cfu g^-1个菌体浓度接入Y1生物菌剂于土壤中，搅匀待测，同时设置灭菌含药但不加Y1生物菌剂的土壤作为对照。

将各处理放置于恒温培养箱中30℃黑暗条件下培养，按照2h，1d，3d，5d，7d，14d，20d，30d，定时取土样测定甲氰菊酯在土壤中的残留量。

甲氰菊酯浓度为10mg/kg的灭菌但不加Y1生物菌剂土壤，培养30d后甲氰菊酯降解率为13.56%；灭菌且加Y1生物菌剂土壤培养30d后，降解率为66.17%。甲氰菊酯浓度为10mg/kg的未灭菌且不加Y1生物菌剂土壤，培养30d后降解率为28.47%；未灭菌且加Y1生物菌剂土壤，30d后的降解率为84.53%。结果表明加入Y1生物菌剂后甲氰菊酯的降解速度明显加快，同时，未灭菌且加Y1生物菌剂土壤降解率更高。结果如图5所示。

Claims

1.一种甲氰菊酯农药残留降解菌，其分类命名为蜡样芽孢杆菌Y1（Bacillus cereus Y1），保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC No：M2013018，保藏日期为2013年1月14日。

2.一种包含权利要求1所述的甲氰菊酯农药残留降解菌的生物菌剂。

3.权利要求1所述的甲氰菊酯农药残留降解菌在降解甲氰菊酯方面的应用。

4.如权利要求1所述的甲氰菊酯农药残留降解菌在降解甲氰菊酯方面的应用，其特征在于：是在降解水体或土壤环境中的甲氰菊酯方面的应用。

5.权利要求2所述的生物菌剂在降解甲氰菊酯方面的应用。

6.如权利要求2所述的生物菌剂在降解甲氰菊酯方面的应用，其特征在于：是在降解水体或土壤环境中的甲氰菊酯方面的应用。