CN101880641B - 一种高效氯氰菊酯降解菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种高效氯氰菊酯的降解菌——固氮弧菌(Azoarcus indigens)HZ5，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市珞珈山武汉大学，430072，保藏日期2010年3月17日，保藏号为CCTCC No：M 2010060。本发明菌种对高浓度的高效氯氰菊酯具有一定的降解能力，在纯培养条件下对50mg/L的高效氯氰菊酯的降解率达65.2％，且降解过程中不存在对映体选择性。该降解菌可通过直接投加的方式应用于水体中高效氯氰菊酯的降解，能安全、高效、快速的降解水体、土壤等物体上残留的高效氯氰菊酯，含有该菌株的菌剂制备工艺简单，成本低廉，使用方便，具有很好的应用前景。

Description

一种高效氯氰菊酯降解菌及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一种高效氯氰菊酯降解菌——固氮弧菌(Azoarcusindigens)HZ5及其应用。

(二)背景技术

拟除虫菊酯类农药在我国已有五十多年施用历史，随着国家对有机磷、有机氯等高毒性、难降解农药的禁用，促使拟除虫菊酯类农药扩大生产和使用范围，现在拟除虫菊酯类农药占我国杀虫剂总施用面积的三分之一以上，主要是施用于棉花、果树、蔬菜以及对家庭害虫的防治。拟除虫菊酯类农药具有胃毒和触杀作用，虽然对作物安全，但是它们对人、畜有中等毒性，对水生生物、蜜蜂、家蚕高毒。1997年，林小涛等人就发现，甲氰菊酯对罗氏沼虾表现为高毒；1999年，朱鲁生等发现，甲氰菊酯及其混合剂对鸡也表现为高毒；另外，2002年鲁兴萌等研究发现，即使低浓度的拟除虫菊酯农药也会对一些经济昆虫造成极大的危害，如家蚕；2001年桐乡和海宁发生的桑园中毒事件就是因拟除虫菊酯农药残留问题引起的，而且菊酯还具有在高等动物体内富集的能力，潜在危害很突出。而且残留农药使得我国蜂产品、茶叶、纺织品、蔬果等遭遇“绿色壁垒”，自从我国加入WTO以来，欧洲不断降低从我国进口的蔬果、茶叶、肉类等产品的拟除虫菊酯类农药的残留标准，严重影响了我国的出口贸易，阻碍了经济发展。

高效氯氰菊酯虽然属于低毒农药，但是它对鱼类及其他水生生物高毒。近年来，研究发现高效氯氰菊酯对哺乳动物及人类有潜在的致癌性和生殖、发育毒性。因此，随着高效氯氰菊酯的广泛应用，由其引起的环境污染问题受到人们的普遍关注。氯氰菊酯(cypermethrin，CP，式1，其中*为手性中心)是一种重要的拟除虫菊酯杀虫剂，具有较高的杀虫活性，可以用于防治多种农业害虫，应用范围非常广泛。其化学结构中包含3个手性碳原子，因此共有4对对映异构体。顺式、反式氯氰菊酯为各含有两个对映异构体的混合物。而高效氯氰菊酯(beta-cypermethrin，β-CP)则为顺式、反式氯氰菊酯的混合物，共含有4个对映异构体，其中顺反式的比例为2∶3，由于其各个对映异构体之间的杀虫活性存在着明显差异，且大部分对映异构体是没有药效或是低药效的，如果喷洒在农田，不仅不能杀灭害虫，还造成资源的大量浪费，严重的还会影响到人体健康和生态安全，这就使得在对映体水平上研究手性农药的降解趋势显得尤为重要。

式1

对于环境中的农药残留的解决，可以采用禁用、物化方法和生物修复方法，物化方法工程大、费用高、副作用大、易引起二次污染、而且解决不彻底，生物修复方法具有高效、安全、成本低、无二次污染、应用范围广等优势，主要有动植物修复、微生物修复、根际环境的生物降解。生物降解技术因其不易造成二次污染，保护了生态系统的完整性，能够做到污染前预防、污染后防治，因此具有得天独厚的优势。国内外研究最多的就是利用微生物降解修复环境中的农药残留。微生物能以农药作为碳源和能源，对农药进行代谢或者共代谢，从而达到修复环境的目的。迄今，已经筛选到多株氯氰菊酯降解菌。但是，关于高效氯氰菊酯降解菌以及微生物选择性降解高效氯氰菊酯的报道则很少见到。

(三)发明内容

本发明的主要目的是筛选能降解高效氯氰菊酯的菌种，并考察此菌种对高效氯氰菊酯的降解过程中是否存在对映体选择性。

本发明的技术方案是：

一种高效氯氰菊酯降解菌——固氮弧菌(Azoarcus indigens)HZ5，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市珞珈山武汉大学，430072，保藏日期2010年3月17日，保藏号为CCTCC No：M 2010060。

所述固氮弧菌HZ5生物学特征如下：革兰氏染色反应阴性，菌体短杆状，有鞭毛，无芽孢，大小约为(0.5μm～1.0μm)×(1.0μm～2.0μm)，菌落平滑，在生理盐水中不易分散，接触酶阳性，氧化酶阴性，能利用β-环糊精、淀粉、葡萄糖、吐温40，不能利用乙酸盐、柠檬酸盐，乙酰甲基甲醇试验阴性，甲基红试验阴性。该菌株16S rDNA的Genbank登陆号为GU592532。

本发明还涉及所述的固氮弧菌HZ5在降解水体中高效氯氰菊酯中的应用。

具体的，所述应用为：将活化后的固氮弧菌HZ5菌种接种至含20～70mg/L(优选50mg/L)高效氯氰菊酯的LB液体培养基中，30℃、150rpm振荡养至对数生长期，菌液离心取菌体直接或悬浮于缓冲液中制成菌剂投入含高效氯氰菊酯的水体中，对高效氯氰菊酯进行降解。

优选的，所述降解在pH7.0、30℃下进行。

本发明的有益效果主要体现在：本发明的高效氯氰菊酯降解菌可通过直接投加的方式应用于水体中高效氯氰菊酯的降解，能安全、高效、快速的降解水体、土壤等物体上残留的高效氯氰菊酯，含有该菌株的菌剂制备工艺简单，成本低廉，使用方便，具有很好的应用前景。

(四)附图说明

图1为本发明高效氯氰菊酯降解菌的电镜图；

图2为标准样品(50ppm，图A)、添加样品(50ppm，图B)的正相手性高效液相色谱图；

图3为本发明的高效氯氰菊酯降解菌在纯培养条件下对浓度为50ppm的高效氯氰菊酯的降解曲线图；

图4为原始添加浓度(图a)与降解后(图b)高效氯氰菊酯的正相手性高效液相色谱图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：菌株的筛选与鉴定

培养基：

无机盐培养基：NaCl 1g，K₂HPO₄ 1.5g，KH₂PO₄ 0.5g，(NH4)₂SO₄1.5g，MgSO₄ 0.1g，1ml微量元素溶液(1L微量元素溶液按如下组成配制：MnSO₄·H₂O 0.13g，ZnCl₂ 0.23g，CuSO₄·H₂O 0.03g，CoCl₂·6H₂O 0.42g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.15g，AlCl₃·6H₂O 0.05g，用蒸馏水补足至1000ml)，蒸馏水补足至1000ml，混合后搅拌均匀，自然pH值，高压蒸汽灭菌(121℃，20min)后制得。

富集培养液：在无机盐培养液中加入高效氯氰菊酯溶液，使得高效氯氰菊酯浓度为50mg/L。

LB液体培养基：酵母粉10g，蛋白胨5.0g，氯化钠10.0g，蒸馏水补足至1000ml，混合后搅拌均匀，自然pH值，高压蒸汽灭菌(121℃，20min)后制得。

LB固体培养基：酵母粉10g，蛋白胨5.0g，氯化钠10.0g，琼脂15.0g，蒸馏水补足至1000ml，混合后搅拌均匀，自然pH值，高压蒸汽灭菌(121℃，20min)后制得。

菌株分离纯化：

污泥样品采自江苏永农农药厂，取5ml污泥样品置于250ml锥形瓶中，加入100ml富集培养液，黑暗振荡培养(30℃，150rpm)1周，取5ml上层浊液于新鲜的富集培养液中，继续黑暗振荡培养(30℃，150rpm)1周，重复上述操作过程3次，每次培养的接种物均取自于上次培养所得的培养液。

取最后一次培养所得的培养液少许进行梯度稀释，取稀释后的培养液150μl涂布于含150mg/L高效氯氰菊酯的LB固体平板上，置于恒温培养箱(30℃)中培养，待平板上长出菌落后，挑取各菌落于含150mg/L高效氯氰菊酯的LB固体平板上反复纯化，直至菌落单一，将纯化后的各菌落分别接至LB液体试管中振荡培养(30℃，150rpm)过夜，将培养好的菌液离心后接至富集培养液中培养一周，通过高效液相色谱法(HPLC)检测各富集培养液中高效氯氰菊酯残留量，最后筛选获得一株能降解高效氯氰菊酯的菌株，命名为HZ5。

菌株鉴定：

将上述获得的菌株进行形态特征和分子生物学鉴定，该菌株的电镜照片如图1所示。该菌株的主要生物学特征为：革兰氏染色反应阴性，菌体短杆状，有鞭毛，无芽孢，大小约为(0.5μm～1.0μm)×(1.0μm～2.0μm)，菌落平滑，在生理盐水中不易分散，接触酶阳性，氧化酶阴性，能利用β-环糊精、淀粉、葡萄糖、吐温40，不能利用乙酸盐、柠檬酸盐，乙酰甲基甲醇试验阴性，甲基红试验阴性。该菌株最适宜的生长条件为PH值7.0，温度30℃。该菌株经16S rDNA序列分析鉴定为固氮弧菌属的Azoarcus indigens种。

实施例2：菌剂制备

1、将保藏于液体试管中的菌种接种于40ml的无机盐培养液中活化培养4d；

2、将活化好的菌种接种于100ml含50mg/L的LB液体培养基中，30℃、150rpm振荡养至对数生长期；

3、将上述处于对数生长期的菌液进行离心(6000rpm)3min，弃上清，菌体用适量的PH值为7.0的磷酸缓冲液悬浮，此即为菌剂。

pH为7.0的0.2mol/L的磷酸缓冲液的配方为：取0.2mol/L的磷酸二氢钠39ml和0.2mol/L的磷酸氢二钠61ml，用超纯水定容至1000ml，高压蒸汽灭菌(121℃、20min)后即得。

实施例3：高效氯氰菊酯降解实验

无机盐培养液中高效氯氰菊酯含量的检测：

采用整瓶萃取法萃取高效氯氰菊酯，在含40ml富集液的锥形瓶中加入等体积的二氯甲烷，充分振荡后静置3h，取下层有机相5ml于干净试管中，加入无水硫酸钠脱水，过0.45μm的滤膜后，吸取1ml液体于进样瓶中，在氮气保护下吹干，用色谱级的正己烷定容至1ml，保存于4℃冰箱中，供高效液相色谱分析。

高效氯氰菊酯(beta-cypermethrin，β-CP)具有两个手性中心，含4个对映异构体，在手性高效液相色谱图谱上会出现四个峰，可以通过考察降解前后ER(对映体比率)值的变化来判断该菌是否具有对映体选择性降解功能。

手性高效液相色谱(HPLC)检测条件：流动相为正己烷∶异丙醇＝97∶3(体积比)，手性分析色谱柱为chiralcel OD-H柱，流速为0.5ml/min，进样量为20μl，柱温为25℃。

高效氯氰菊酯残留量计算公式如下：

$X=\frac{A_x}{A_0}\×\mathrm{Cs}$

其中：X为待测样品中高效氯氰菊酯的残留浓度(mg/L)；Ax为样品中高效氯氰菊酯的峰面积；A₀为高效氯氰菊酯标准样品峰面积；Cs为高效氯氰菊酯标准样品的浓度(mg/L)。

高效氯氰菊酯降解率计算公式：

$P(\%)=(1-\frac{X}{C_0})\×100\%$

其中：P为待测样品中高效氯氰菊酯的降解率(％)；X为待测样品中高效氯氰菊酯的残留浓度(mg/L)；C₀为待测样品中高效氯氰菊酯的初始浓度(mg/L)。

高效氯氰菊酯回收率实验：

在无机盐培养基中分别加入高效氯氰菊酯，使其终浓度均为50mg/L，然后根据上述方法回收无机盐培养基中的高效氯氰菊酯，利用高效液相色谱法检测高效氯氰菊酯的含量，每个浓度重复三次。

高效氯氰菊酯的标准样品、添加样品的色谱图如图2所示，测得各无机盐培养基中高效氯氰菊酯的添加回收率为105.4％，变异系数分别为2.1％。

由以上数据可知，高效氯氰菊酯在无机盐培养基中的平均回收率达90％以上，变异系数在1.2％～5％之间，这些数据表明用上述方法来检测无机盐培养基中高效氯氰菊酯含量是符合农药残留分析的要求的。

高效氯氰菊酯降解实验

取100ml锥形瓶若干，均加入40ml无机盐培养基，高压蒸汽灭菌(121℃，20min)后加入高效氯氰菊酯溶液，使其浓度均为50mg/L，取适量的高效氯氰菊酯降解菌菌种接种于此无机盐培养基中，相应的配置不含该菌种的作为空白对照，然后一同置于摇床(30℃，150rpm)中黑暗振荡培养。试验组与对照组均为15个重复，在培养时间为0、1、3、5、7d时定时取样，随机抽取三瓶，根据上述方法检测无机盐培养基中高效氯氰菊酯的残留量。

本发明菌株在纯培养条件下对不同浓度的高效氯氰菊酯的降解曲线如图3所示。观察图3，可以发现，培养7d后，本发明高效氯氰菊酯降解菌对50mg/L的高效氯氰菊酯的降解率为65.2％，所有未加菌的空白对照7d后的水解率均小于5％。

高效氯氰菊酯异构体绝对构型归属：

Liu等利用高效液相色谱法成功拆分了氯氰菊酯的8个对映体(LiuWP and Gan JJ.J Agric Food Chem，2004(52)：755-761)，并且确认了各个异构体的绝对构型，发明人在相同色谱条件下将OD柱拆分β-氯氰菊酯得到的4个异构体分别再次进样，确定了四个色谱峰的绝对构型：按出峰时间先后顺序依次为1R-cis-αS、1R-trans-αS、1S-cis-αR和1S-trans-αR。由图4通过计算ER值可以发现，此降解菌在7d时间内对高效氯氰菊酯的降解不存在对映体选择性。

实验结果表明该菌种对高浓度的高效氯氰菊酯具有一定的降解能力，因此，该菌对环境中高效氯氰菊酯的降解尤其是对高效氯氰菊酯的集中修复具有一定的积极意义。

Claims (5)

1.一种高效氯氰菊酯降解菌——固氮弧菌(Azoarcus indigens)HZ5，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市珞珈山武汉大学，430072，保藏日期2010年3月17日，保藏号为CCTCC No：M 2010060。

2.如权利要求1所述的固氮弧菌HZ5，其特征在于所述固氮弧菌HZ5生物学特征如下：革兰氏染色反应阴性，菌体短杆状，有鞭毛，无芽孢，大小为(0.5μm～1.0μm)×(1.0μm～2.0μm)，菌落平滑，在生理盐水中不易分散，接触酶阳性，氧化酶阴性，能利用β-环糊精、淀粉、葡萄糖、吐温40，不能利用乙酸盐、柠檬酸盐，乙酰甲基甲醇试验阴性，甲基红试验阴性。

3.如权利要求1所述的固氮弧菌HZ5在降解水体中高效氯氰菊酯中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述应用为：将活化后的固氮弧菌HZ5菌种接种至含20～70mg/L高效氯氰菊酯的LB液体培养基中，30℃、150rpm振荡养至对数生长期，菌液离心取菌体直接或制成菌剂投入含高效氯氰菊酯的水体中，对高效氯氰菊酯进行降解。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述降解在pH7.0、30℃下进行。

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