CN101603017B

CN101603017B - 一种约氏不动杆菌lp28以及利用该菌制备低温碱性脂肪酶的方法

Info

Publication number: CN101603017B
Application number: CN200910069155XA
Authority: CN
Inventors: 戚薇; 王海宽; 邵静; 马会景; 魏玉洁
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2009-06-05
Filing date: 2009-06-05
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2029-06-05
Also published as: CN101603017A

Abstract

本发明涉及一种约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)LP28以及利用该菌制备低温碱性脂肪酶的方法，菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号CGMCC 3069，其16S rDNA序列与DQ257426的同源性高达100％；制备低温碱性脂肪酶的步骤为：(1)筛选菌株；(2)种子培养；(3)发酵培养；(4)分离纯化。本发明所涉及的约氏不动杆菌LP28来源于天津渤海湾盐碱地被油污染的土壤，产酶稳定，原料来源广泛，生产成本低廉；所获得的低温碱性脂肪酶对洗涤剂添加成分表面活性剂、氧化剂、蛋白酶等有良好的稳定性，能够作为洗涤剂添加用酶应用于洗涤剂行业。

Description

一种约氏不动杆菌LP28以及利用该菌制备低温碱性脂肪酶的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其一种约氏不动杆菌LP28以及利用该菌制备低温碱性脂肪酶的方法。

背景技术

脂肪酶(lipase)全称为甘油三酰酯水解酶，主要用于水解和合成由甘油和12个碳原子以上不溶性长链脂肪酸所形成的甘油三酯，它是一种特殊的酯键水解酶，只能在异相系统或不溶性系统的油-水界面处水解酯。按照国际生化联合会的命名分类原则，脂肪酶编号为EC 3.1.1.3，系统名称为三脂酰甘油酰基水解酶，习惯名称为脂肪酶。

脂肪酶水解脂肪具有高效、反应条件温和、无毒等优点。它不需要辅酶即可催化油-水界面的甘油三酯水解生成甘油及长链脂肪酸，脂肪酶水解脂肪后的产物为甘油二酯、甘油一酯、脂肪酸和甘油。

脂肪酶在自然界中广泛存在，但是只有微生物脂肪酶具有商业价值。目前，脂肪酶在医药、洗涤剂添加酶、生物素合成、有机质合成、油脂水解、油脂改造、食品工业中的风味增香、外消旋物质和其他化合物的合成、皮革绢纺原料脱脂和洗涤剂、污水处理等许多工业领域中均有应用价值。此外，近年来非水相酶学的研究又进一步拓宽了脂肪酶的应用领域，利用脂肪酶在有机相催化的各种反应，可以合成许多高附加值产品。

脂肪酶具有水解油脂的特性，能提高含蛋白酶洗衣粉的洗涤能力，并且能清除含油脂食物的污渍和普通洗衣粉难以清除的皮脂屑，被广泛用作工业用和家用洗涤剂的添加剂。据统计，洗涤剂用酶占据了大部分的酶制剂市场，对于脂肪酶，占其总销量的32％。作为洗涤剂添加剂的脂肪酶必须具有以下特性：①较低的底物特异性，具有水解多种脂肪类底物的能力；②能够适应洗涤剂的极端环境(pH10-11，温度30-60℃)③具有表面活性剂和一些洗涤剂添加酶的稳定性(如LAS和蛋白酶)。而一般而言，大部分分离的脂肪酶缺乏这些性质。因此，获得性质稳定的脂肪酶成为当前研究的热门。

当前所用的洗涤剂添加脂肪酶都是来源于Bacillus sp，比如Alcalase

Esperase

，Everlase

and Savinase

(Novozymes，Biotech，Inc.，Denmark)、PurafectOxPDM and ProperaseTM(Genencor，Int.，USA)。同时，也有一些假单胞菌来源的商业用脂肪酶，比如Pseudomonas stutzeri ATCC 19.154脂肪酶(British Patent 1,372,034)和Pseudomonas fluorescens IAM 1057产生的Lipase P(Amano Pharmaceutical Co.Ltd.，Nagoya，Japan)，其中获得稳定性良好的低温脂肪酶和降低应用于洗涤剂添加的脂肪酶的生产成本是脂肪酶研究的关键。当代低温脂肪酶由于在低温下具有良好的催化活性和低温适应性，在应用中有着中温脂肪酶无法取代的优越性，比如在应用中可大大缩短处理过程的时间并省却昂贵的加热、冷却系统，因而在节能方面有相当大的好处；相对中温型酶而言，低温酶反应所需的时间更短，因而提高了反应效率等。

另外，现报道的低温脂肪酶产生菌主要以细菌为主，兼以少量真菌，而这些菌中有些菌株所产生的低温脂肪酶由于其最适酶解温度过低(＜20℃)，存在中温条件下不稳定、使用与保藏中同样消耗能量而使其应用受到限制，因此，获得一株优良的低温稳定性脂肪酶产生菌株也成为研究的关键。

目前国内外有关低温碱性脂肪酶的研究工作刚刚展开，研究的低温脂肪酶主要由耐冷性微生物产生，可供研究的菌种较少、其性能及适合工业化生产方法还没有健全的技术体系。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种对温度、pH、表面活性剂和蛋白酶具有较好的耐受能力、所产生的低温碱性脂肪酶具有优良特性的约氏不动杆菌LP28以及利用该菌制备低温碱性脂肪酶的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种约氏不动杆菌LP28，该菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号是：CGMCC 3069，其16S rDNA序列与DQ257426的同源性高达100％。保藏日期为：2009年5月14日，保藏单位全称为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为：北京市朝阳区大屯路。

而且，所述菌株具有产生低温碱性脂肪酶的特性。

一种利用约氏不动杆菌LP28制备低温碱性脂肪酶的方法，制备步骤是：

(1)将保藏的约氏不动杆菌LP28菌种进行活化和筛选，将筛选出菌株用于脂肪酶的发酵培养；

(2)挑取上述菌株，接种于种子培养基中，在25-30℃、175-185r/min条件下培养8-12h，得到种子培养液；

(3)将种子培养液以1.5-2.5％的接种量接种于发酵培养基上，25-35℃、175-185r/min培养34-38h，至产酶高峰，得到富含低温碱性脂肪酶的培养液；

(4)将上述培养液低温高速离心除菌体、硫酸铵盐析、超滤浓缩、色谱分离，得到低温碱性脂肪酶。

而且，所述种子培养基的优选成分为：淀粉10g、豆饼粉20g、玉米浆20mL、磷酸氢二钾1g、蒸馏水1000mL、pH7.5-9.5。

而且，所述发酵培养基的优选成分为：淀粉10g、豆饼粉20g、玉米浆20mL、磷酸氢二钾1g、大豆油-聚乙烯醇乳化液20mL、蒸馏水1000mL、 pH7.5-9.5。

而且，所述低温碱性脂肪酶的分子量为53kDa，最适酶解温度为30℃，最适酶解pH为9.0，热稳定性良好，该酶对洗涤剂添加成分表面活性剂、氧化剂、蛋白酶有良好的稳定性。

本发明的优点和积极效果是：

1、本发明的约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)及其变异菌株能够有效的产生本发明的低温碱性脂肪酶，涉及的菌株使用的碳源是选用微生物菌种中可利用的、适于发酵产生的低温碱性脂肪酶的碳源，其氮源则只要是可作为氮源同化的含氮物质即可，原料来源广泛，为大规模生产提供便利条件。

2、本发明菌株约氏不动杆菌LP28产生的低温碱性脂肪酶最适酶解温度为30℃，最适pH为9.0。该脂肪酶的热稳定性和耐碱能力良好，粗酶液在室温条件下放置48h仍具有93.78％的残余酶活；50℃保温处理30min后残余酶活为原酶活的80.9％，pH8-11的碱环境下处理30min后均残余90％以上的酶活力；金属离子对低温碱性脂肪酶的活性有一定的影响，K⁺、Mg²⁺、Na⁺、Ca²⁺对酶具有激活作用，Cr³⁺、Co²⁺、Ba²⁺、Mn²⁺对其活性无显著影响，Cu²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺、Al³⁺对酶具有抑制作用；金属螯合剂柠檬酸钠对酶有促进作用，而EDTA对酶活力有一定的抑制作用。

3、本发明筛选的的低温菌株约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)LP28能够分泌具有温度、pH、表面活性剂和蛋白酶稳定性的低温稳定性碱性脂肪酶，该菌株能够有效地获得具有上述性质的低温碱性脂肪酶，该低温稳定性碱性脂肪酶在洗涤剂添加用酶方面具有广阔的应用前景。

4、本发明碱性脂肪酶适用于洗涤剂添加剂用酶的开发。稳定性试验分别以1％的洗涤剂添加成分作用30min。所有试验的表面活性剂仅TritonX-100对酶活性有一定的抑制作用，该酶对Tween 20、Tween 80、脱氧胆酸钠、牛黄胆酸钠稳定，皂角苷对酶催化有促进作用；本发明脂肪酶对氧化剂，如过氧化氢、过硼酸钠和次氯酸钠具有稳定性，处理后分别具有78.25％、83.88％和60.87％的残余酶活；本发明脂肪酶对国内品牌洗涤剂立白、碧浪、雕牌、汰渍、奥妙具有一定的稳定性，处理后均残余有80％以上酶活力；以终浓度为10000U/mL的碱性蛋白酶处理本发明脂肪酶30min后，该酶仍具有76.17％的残余酶活，能够在较低的温度和碱性条件下发挥较高的酶解特性。

附图说明

图1为本发明低温碱性脂肪酶蛋白的电泳图，其中注：1发酵液；2离子交换层析；3凝胶过滤层析；

图2为本发明低温碱性脂肪酶的反应温度和相对酶活的关系图；

图3为本发明低温碱性脂肪酶的反应pH和相对酶活的关系图；

图4为本发明低温碱性脂肪酶在不同温度下处理后残余酶活的图；

图5为本发明低温碱性脂肪酶在室温条件下处理不同时间后残余酶活的图；

图6为本发明低温碱性脂肪酶在不同pH下处理后残余酶活的图；

图7为本发明低温碱性脂肪酶在不同金属离子存在下相对酶活的图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

1、约氏不动杆菌LP28菌种的分离

本发明通过以大豆油为碳源，通过对渤海湾盐碱地被油污染的土壤样本进行微生物菌种的培养、分离和筛选，获得了一批产脂肪酶的微生物菌株，并从中分离出1株低温碱性脂肪酶产生菌株，编号为LP28，该菌具有产生低温碱性脂肪酶的优良特性。将LP28的16S rDNA序列与Genebank中的同源序列进行比对，LP28的16S rDNA序列与DQ257426的同源性高达100％，因此将其确定为约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)。该菌种已于申请日前保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号是：CGMCC 3069。

2、约氏不动杆菌LP28的保藏，以及长期保藏的菌种的活化及筛选

保藏：该菌采用常规的斜面传代保藏法，具体方法是：将分离出的菌种接种于细菌基本培养基斜面的表面，25-35℃培养1-2天，再于4℃下保藏，每月转接一次，或者添加15％甘油制成液体菌种，-70℃超低温保藏可达6个月，或者利用真空冷冻干燥法将本发明菌种制成干粉菌种，低温和常温保藏可达1年以上。

活化：长期保藏的菌种依照如下方法进行活化，将长期保藏的LP28菌种接种于细菌基本培养基或者LA培养基等其他适于细菌生长的培养基表面，25-35℃培养1-2天。本步骤优先选用LA培养基，其成分为：蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。

筛选：将活化后的LP28菌种接种于脂肪酶筛选培养基上，接种菌株，于28℃培养2天左右，菌落周围产生蓝色水解圈的极为脂肪酶产生菌，采用维多利亚蓝法(该方法是福建师范大学施巧琴教授首创的方便快捷的脂肪酶产生菌筛选方法，在众多文献中均有报道)筛选脂肪酶，挑取变色圈与直径比最大的菌株即可作为生产脂肪酶的实验菌株。脂肪酶筛选培养基的成分为：K₂HPO₄1g，NaNO₃3g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH 8.0，经121℃灭菌20min后，降温至50℃左右，每100mL 培养基中添加12mL聚乙烯醇-大豆油乳化液(大豆油∶2％聚乙烯醇＝1∶3，另添加0.2％的维多利亚蓝B)在培养剂未凝固之前倾倒平板。

3、利用约氏不动杆菌LP28生产低温碱性脂肪酶的方法如下

(1)将长期保藏的LP28菌种经过活化和筛选，将筛选出菌株用于脂肪酶的发酵培养；

(2)挑取上述菌株，接种于30mL/250mL种子培养基中，28℃、180r/min条件下培养10h，得到种子培养液；

种子培养基成分为：淀粉10g，豆饼粉20g，玉米浆20mL，磷酸氢二钾1g，蒸馏水1000mL，pH8.0。

(3)将种子培养液以2％的接种量接种于发酵培养基上，28℃、180r/min培养36h，至产酶高峰，得到富含脂肪酶的培养液；

发酵培养基成分为：淀粉10g，豆饼粉20g，玉米浆20mL，磷酸氢二钾1g，大豆油-聚乙烯醇乳化液20mL，蒸馏水1000mL，pH8.0。

(4)将上述培养液在4℃、8000r/min条件下离心10min，弃去固形物，上清即为粗酶液，将得到的粗酶液，以饱和度为25％的硫酸铵进行盐析，对沉淀物质进行透析除盐，之后使用cellulose DE52离子交换层析和Sephadex-G75凝胶过滤层析进行分离纯化，cellulose DE52离子交换层析所用的平衡缓冲液为0.01mol/L的Tris-HCl，并用0.1-1.0mol/L NaCl进行梯度洗脱，最终在0.3mol/L浓度条件下洗脱获得目的蛋白(即低温碱性脂肪酶蛋白)，其中Sephadex-G75凝胶过滤层析所用的洗脱缓冲液为0.02mol/L的磷酸缓冲液(pH 7.4)，即得到低温碱性脂肪酶。

在发酵培养过程中，也可省略步骤(2)，将筛选出的菌株可以直接接种于发酵培养基中进行发酵培养。

在上述实验中涉及的种子培养基和发酵培养基，其中的培养基的营养源，可广泛使用通常用于生产的营养源，碳源、氮源、无机盐类以及产酶诱导剂的说明如下：

碳源：选用微生物菌种可利用的、适于发酵产生本发明的低温碱性脂肪酶的碳源即可，例如，可使用淀粉、蔗糖、水解糖、可用的多糖、葡萄糖等。本发明中优选淀粉，其用量为0.5-1.0％，葡萄糖对产酶有一定的葡萄糖抑制效应。

氮源：只要是可作为氮源同化的含氮物质即可，例如，可用铵盐、硝酸盐、豆饼粉、牛肉浸膏、玉米浆、酵母浸膏等，用量根据其它营养成分的不同而定。本发明中，优选玉米浆和豆饼粉作为组合氮源，其用量均在2％。

无机盐类：可适当添加磷酸氢二钾、磷酸氢氨等磷酸盐，钙盐，镁盐等。组分和用量只要适于菌体培养产生发明中的脂肪酶即可。本发明选择0.1％磷酸氢二钾作为无机盐添加成分。

产酶诱导剂：可选用大豆油、橄榄油、花生油、蓖麻油、葵花油等油脂或者乳化液，只要适于菌体产生本发明中的脂肪酶即可。本发明优选2％的大豆油-聚乙烯醇(PVA)乳化液为诱导剂。

4、以下是对本实验产生的低温碱性脂肪酶的理化性质进行检测分析

(1)低温碱性脂肪酶酶活的测定方法

方法一：分光光度法

溶液A：90mg p-棕榈酸硝基苯酯(p-NPP)溶于30mL异丙醇中。

溶液B：450mL 50mmol/L磷酸缓冲液(pH8.0)，并含有1％的TritonX-100。

2.7mL基质溶液(由溶液A和溶液B按1∶9比例，缓慢混合，新鲜配制而成，该溶液至少可稳定2h)25℃预培养，然后加入0.3mL稀释至一定程度的粗酶液，继续在25℃保温15min。然后-20℃冷冻15min终止反应。用分光光度计，在400nm下测定溶液中已释放对硝基酚的数量(以不加酶的溶液作对照)。

以pH 8.0，25℃条件下，分解底物(对棕榈酸硝基苯酯)释放1μmol/min对硝基酚所需酶量定义为1个碱性脂肪酶活力国际单位(U)，以表示。

计算公式：A＝[(A₁-A₀)*k+C₀]*V₁*n/(T*V₂)，其中：

A——样本酶活力(U/mL)；

A₁——样本酶液400nm下吸光度的OD值；

A₀——空白样在400nm下吸光度的OD值；

K——对硝基酚标准曲线的斜率；

C₀——硝基酚标准曲线的截距；

n——稀释倍数；

V₁——反应液体积(mL)；

V₂——酶液的体积(mL)；

T——反应时间(min)

方法二：平板扩散法

平板扩散法又名维多利亚蓝透明圈法，即在初筛测酶活平板上打4mm孔，将酶液加入孔中培养24h，测量其出圈大小以判断酶活力。

(2)低温碱性脂肪酶的分离纯化和分子量测定

将所得的脂肪酶，将该脂肪酶的蛋白溶液参照常规方法进行SDS-PAGE，结果如图1所示，获得单一纯的本发明低温碱性脂肪酶，该酶分子量大小为53kDa。

(3)作用温度对低温碱性脂肪酶活性的影响

最适作用温度的确定，是参照实施例3所述的酶活力检测方法，在15-40℃范围内，以5℃为间隔，测定温度对酶活力的影响。以所测得酶活力最高的温度下的酶活力值为对照，设定其相对酶活力为100％，则反应温度和相对活性的关系如图2所示。结果表明，在所测温度范围内，本发明所获得的低温碱性脂肪酶均表现出一定的活性，但是其最适作用温度为30℃，明显表现出低温活性优势。

(4)作用pH对低温碱性脂肪酶活性的影响

最适作用pH的确定，参照实施例3所述的酶活力检测方法进行，但需配制不同pH的缓冲液作为溶剂(pH5.0-8.0为磷酸缓冲液，pH9.0-11.0为甘氨酸-NaOH缓冲液)。以所测得酶活力最高的pH条件下的酶活力值为对照，设定其相对酶活力为100％，则作用pH和相对活性的关系如图3所示。该脂肪酶表现出极明显的碱性优势，且最适作用pH为9.0。

(5)低温碱性脂肪酶的温度稳定性

依照实施例2获得低温碱性脂肪酶粗酶液，在pH8.0条件下，分别在30、40、50、60、70、80℃下保温30min，然后按照上述实施例3所述的酶活力测定方法对残余酶活里进行测定。以未进行保温处理的酶活力值作为对照，设定其相对酶活力为100％，则此时的处理温度和残余活力关系如图4所示。结果可见，本发明菌株LB28所产生的低温碱性脂肪酶在50℃以内处理都具有很好的稳定性，50℃保温处理30min后残余酶活为原酶活的80.9％。

(6)低温碱性脂肪酶的室温放置稳定性

依照施例2获得低温碱性脂肪酶粗酶液，分别在室温条件下放置6、12、24、36、48h，然后按照上述实施例3所述的酶活力测定方法对残余酶活里进行测定。以未进行处理的酶活力值作为对照，设定其相对酶活力为100％，则此时的处理温度和残余活力关系如图5所示。本发明所获得的低温碱性脂肪酶具有很好的稳定性，在室温下放置48h后，仍然残余93.78％的酶活力。

(7)低温碱性脂肪酶的pH稳定性

得到的低温碱性脂肪酶粗酶液，以1∶9分别与pH5-11的缓冲液进行混合，均匀混合后30℃下放置60min。然后按照上述实施例3所述的酶活力测定方法对残余酶活力进行测定。以未进行处理的酶活力值作为对照，设定其相对酶活力为100％，则不同处理pH和残余活力关系如图6所示。本发明所获得的低温碱性脂肪酶在所测定pH范围内稳定性，特别是pH8.0-11.0环境下表现出极强的稳定性。

(8)金属离子对低温碱性脂肪酶活性的影响

金属离子对低温碱性脂肪酶活性影响的测定，首先在0.2mol/L、pH8.0的磷酸缓冲液中添加NaCl、KCl、MgCl₂、CaCl₂、BaCl₂、CoCl₂、CrCl₃、MnCl₂、 AlCl₃、CuCl₂、FeSO₄、Fe₂(SO₄)₃、ZnSO₄，以及金属螯合剂EDTA和柠檬酸钠至终浓度10mmol/L，将上述缓冲液添加到反应体系至金属离子终浓度为1mmol/L，然后30℃下放置60min。然后将如实施例2获得的粗酶液按照上述实施例3所述的酶活力测定方法对残余酶活里进行测定。以未进行处理的酶活力值作为对照，设定其相对酶活力为100％，则不同离子对酶活性的影响如图7所示。结果可见，金属离子对低温碱性脂肪酶的活性有一定的影响，Na⁺、Ca²⁺、K⁺、Mg²⁺对酶具有激活作用，Ba²⁺、Mn²⁺、Cr³⁺、Co²⁺对其活性无显著影响，Al³⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺对酶具有抑制作用。螯合剂柠檬酸钠促进酶促反应，而EDTA对本说明脂肪酶的活力有显著抑制作用。

(9)低温碱性脂肪酶对洗涤剂添加成分稳定性的测定

洗涤剂添加成分包括表面活性剂TritonX-100、Tween-20、Tween-80、皂角苷、脱氧胆酸钠、牛胆酸钠；过氧化氢、次氯酸钠、过硼酸钠；碱性蛋白酶。同时，对国内现销售不同品牌洗衣粉对该酶稳定性的影响进行了测定，它们包括：立白、碧浪、雕牌、奥妙、汰渍。对低温碱性脂肪酶对洗涤剂添加成分稳定性的测定，首先配制1％浓度的洗涤剂成分(w/v，v/v)，将以上溶液与实施例2获得的粗酶液9∶1体积比混合，室温下放置60min后按照实施例3所述的方法一对残余酶活进行测定。其中，皂角苷使底物p-NPP以未进行处理的酶活力值作为对照，设定其相对酶活力为100％，则低温碱性脂肪酶对不同洗涤剂添加成分稳定性的结果如表1所示。

表1低温碱性脂肪酶对洗涤剂添加成分稳定性的表

通过本发明如上的阐述，得到后面实施例的进一步验证，得知本发明低温碱性脂肪酶的酶学特性。

作为本发明低温碱性脂肪酶的产生菌种，既可为本发明所保护的菌种，也可为自然筛选的原始菌株，或为保护菌株通过自然变异或人工诱导变异的变异菌株，通过本发明所述的方法，均可实现本发明阐述的技术效果。

作为上述变异菌株的研制方法，包括常规物理诱变，如紫外线辐射、离子注入、激光辐照等各种射线处理；化学诱变，如硫酸二乙酯(DES)、亚硝基胍(NTG)等化学诱变剂处理，以及用常规脂肪酶产生菌筛选培养基及方法优选出生产性能优异的菌种等。

另外，也可通过分子生物学技术，从原始菌株或诱变菌株中获取低温碱性脂肪酶基因，通过shuffling等手段获得突变基因，以原核微生物，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等作为基因受体菌构建基因工程生产菌株，也可作为本发明的低温碱性脂肪酶产生菌种。

本发明低温碱性脂肪酶产生菌LP28的16S rDNA序列。

TTGTTACGACTTCCCCCAGTCATCGGCCACACCGTGGTAAGCGTCCTCCTTACGGTTAGACTACCTACTTCTGGTGCAACAAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATTCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGATCGGCTTTTTGAGATTAGCATCCTATCGCTAGGTAGCAACCCTTTGTACCGACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTGGTCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCGTCCCCGCCTTCCTCCAGTTTGTCACTGGCAGTATCCTTAAAGTTCCCGGCTTAACCCGCTGGCAAATAAGGAAAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACAACAGCCATGCAGCACCTGTATGTAAGTTCCCAAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCTTACTATGTCAAGACCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCAAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGTCTACTTATCGCGTTAGCTGCGCCACTAAAGCCTCAAAGGCCCCAACGGCTAGTAGACATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCATGCTTTCGTACCTCAGCGTCAGTATTAGGCCAGATGGCTGCCTTCGCCATCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCTACCATCCTCTCCCATACTCTAGCTGACCAGTATCGAATGCAATTCCTAAGTTAAGCTCAGGGATTTCACATCCGACTTAATCAGCCGCCTACGCACGCTTTACGCCCAGTAAATCCGATTAACGCTCGCACCCTCTGTATTACCGCGGCTGCTGGCACAGAGTTAGCCGGTGCTTATTCTGCGAGTAACGTCCACTATCTCTAGGTATTAACTAGAGTAGCCTCCTCCTCGCTTAAAGTGCTTTACA ACCAAAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATGGCTGGATCAGGCTTCCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCGGATCATCCTCTCAGACCCGCTACAGATCGTCGCCTTGGTAGGCCTTTACCCCACCAACTAGCTAATCCGACTTAGGCTCATCTATTAGCGCAAGGTCCGAAGATCCCCTGCTTTCTCCCGTAGGACGTATGCGGTATTAGCATTCCTTTCGGAATGTTGTCCCCCACTAATAGGCAGATTCCTAAGCATTACTCACCCGTCCGCCGCTAGGTAATGTAGCAAGCTACACTTCCCCGCTCGACGTGCACGGTA

Claims

1.一种约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)LP28，其特征在于：该菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏号是：CGMCC 3069。

2.一种利用如权利要求1所述的约氏不动杆菌LP28制备低温碱性脂肪酶的方法，其特征在于：

(3)将种子培养液以1.5-2.5％的接种量接种于发酵培养基上，25-35℃、175-185r/min培养34-38h，至产酶高峰，得到富含脂肪酶的培养液；

(4)将上述培养液低温高速离心除菌体、硫酸铵盐析、超滤浓缩、色谱分离，得到低温碱性脂肪酶浓缩品，

所述种子培养基的成分为：淀粉10g、豆饼粉20g、玉米浆20mL、磷酸氢二钾1g、蒸馏水1000mL、pH7.5-9.5，

所述发酵培养基的成分为：淀粉10g、豆饼粉20g、玉米浆20mL、磷酸氢二钾1g、大豆油-聚乙烯醇乳化液20mL、蒸馏水1000mL、pH7.5-9.5。

3.根据权利要求3所述的一种利用约氏不动杆菌LP28制备低温碱性脂肪酶的方法，其特征在于：所述脂肪酶浓缩品中脂肪酶的分子量为53kDa、最适酶解温度为30℃、最适酶解pH为9.0热稳定性良好，该酶对洗涤剂添加成分表面活性剂、氧化剂、蛋白酶等有良好的稳定性。