CN100447236C - 添加胰蛋白酶提高发酵法制备谷氨酰胺转胺酶产量的方法 - Google Patents
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Abstract
一种添加胰蛋白酶提高发酵法制备谷氨酰胺转胺酶产量的方法，涉及吸水链霉菌发酵制备谷氨酰胺转胺酶技术领域。本发明采用吸水链霉菌为发酵菌株，经斜面培养和种子培养后，接种在发酵培养基中经液体发酵制备谷氨酰胺转胺酶。通过在发酵过程中添加胰蛋白酶，最终实现了提高谷氨酰胺转胺酶产量的目标。本发明的优点是所用胰蛋白酶用量较少，且价格低廉，可显著提高谷氨酰胺转胺酶的产量，在其它培养条件相同的情况下，本发明比不添加胰蛋白酶的对照例产量提高达35%，达到发酵法制备谷氨酰胺转胺酶的先进水平。
Description
技术领域
一种添加胰蛋白酶提高发酵法制备谷氨酰胺转胺酶产量的方法，涉及吸水链霉菌发酵制备谷氨酰胺转胺酶技术领域。
背景技术
谷氨酰胺转胺酶(Microbial transglutaminase，简称MTG)是一种催化酰基转移反应的转移酶，能催化蛋白质分子内、分子间发生交联，蛋白质和氨基酸之间的连接以及蛋白质分子内谷氨酰胺基的水解反应，从而直接改变蛋白质本身以及蛋白质所附着的细胞、组织等的结构与功能性质的特性，提高蛋白质的营养价值，生产出满足人们需求的新型蛋白食品。现在谷氨酰胺转胺酶已经广泛应用在许多方面：在食品加工过程中，可以保护食品蛋白质中的赖氨酸避免发生化学反应，从而保护限制性氨基酸，提高食品的营养价值；在肉制品加工中，谷氨酰胺转胺酶的交联作用将一些低价值的碎肉进行重组，从而改善其外观、结构、风味，以提高其营养价值和市场价值；在水产品保鲜中，可通过形成可食性的薄膜，包埋脂类物质；在乳制品加工中，提高蛋白质的营养性；在医药工业中，谷氨酰胺转胺酶包埋脂类或脂溶性物质，形成耐热耐水性的膜；在非肉类的豆类食品中，提高食品的弹性和持水能力；在纺织行业，还被用来提高蚕丝织物以及羊毛织物的品质。
目前生产MTG的方法主要是微生物发酵法生产，目前商业化的产品主要由日本味之素等公司生产。国内用微生物发酵法生产MTG尚处于起步阶段，菌种主要为茂原链霉菌，生产水平较低。
发明内容
本发明的目的是提供一种添加胰蛋白酶提高发酵法制备谷氨酰胺转胺酶产量的方法。
本发明的技术方案：
菌种：吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)WSH03-13，CCTCC No.：203062(中国专利03152956.9 2003年公开)，由江南大学生物工程学院环境生物技术研究室保藏和提供。
培养基
麦汁斜面培养基(g/L)：麦汁50，葡萄糖4，酵母膏4，琼脂20，PH 7.0。
种子培养基(g/L)：甘油20，葡萄糖20，酵母膏5，NaH2PO45，Na2HPO45，MgSO45，pH 7.0
发酵培养基(g/L)：淀粉5，甘油20，葡萄糖5，蛋白胨15，冷榨豆饼粉30，酵母膏5，碳酸钙5，NaH2PO45，Na2HPO45，Mg2SO45，pH 8.0。
培养方法
将成熟的孢子接种到麦汁斜面上，32℃下培养10～20d。待孢子成熟后，刮取斜面上的孢子，用无菌水制成孢子悬液接种于种子培养基中，32℃摇床培养至对数生长后期。吸取种子培养液，按4％～8％的接种量接种于发酵培养基中，32℃摇床培养48h。
谷氨酰胺转胺酶活力的测定方法
发酵液经离心后的清液稀释5倍后用于活力的测定。谷氨酰胺转胺酶活力采用分光光度法在37℃下测定。吸取0.4mL稀释样品于试管中，加入1mL试剂A；37℃水浴保温10min，加入0.4mL试剂B，终止反应，525nm波长比色。
试剂A：将100mg底物CBZ-GLN-GLY(Nalpha-Carbobenzyloxy-Glutamine Glycine)完全溶解于2mL 0.2mol/L的NaOH溶液中，并加入：4mLa溶液，2mL b溶液和2ml c溶液，调pH为6.0。[a溶液：0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)缓冲液，pH6.0；b溶液：1mol/L羟胺；c溶液：0.01mol/L GSH(还原型谷光甘肽)]。
试剂B：3mol/L HCl，12％TCA(三氯乙酸)，5％FeCl3·6H2O(溶于0.1mol/LHCl中)按1∶1∶1混合配制。一个单位谷氨酰胺转胺酶酶活定义(U/mL)：37℃时每分钟催化形成1μmol的L-谷氨酸-γ-单羟胺酸的酶量。
提高谷氨酰胺转胺酶产量的培养方式
谷氨酰胺转胺酶是一种胞外酶，首先生成没有酶活力的酶原，经蛋白酶切割后生成有活力的成熟酶。在普通的发酵过程中，由于蛋白酶抑制剂的存在，酶原只能在特定阶段缓慢逐步地转化为成熟酶。
在发酵过程中，适时添加适量的胰蛋白酶可以促进产酶，实现了谷氨酰胺转胺酶的高表达。可以使酶原从一产生就开始大量迅速地转化为成熟酶，从而使生物反应的平衡发生改变，产生更多的酶原，最终提高发酵的产酶量。在发酵至0-16h在发酵液中添加10-100U/mL的胰蛋白酶，发酵终了时发酵液中谷氨酰胺转胺酶的酶活水平达5.6U/mL。
本发明的有益效果：本发明选用的吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)WSH03-13合成的谷氨酰胺转胺酶为胞外酶，并且是迄今为止已报道过的热、碱稳定性和蛋白质交联特性都较好的谷氨酰胺转胺酶，用于食品加工、医药行业以及纺织行业具有很大的潜力。所用的胰蛋白酶价格低廉，用量少，显著提高了谷氨酰胺转胺酶的产量，摇瓶培养的实验水平达国内领先水平。
具体实施方式
实施例1
在谷氨酰胺转胺酶发酵液中，在发酵的0h添加20U/ml的胰蛋白酶，发酵至结束时，发酵液中的谷氨酰胺转胺酶产量为5.64U/mL，比不加胰蛋白酶的对照例提高了35.2％。不添加胰蛋白酶的发酵液中的谷氨酰胺转胺酶产量为4.17U/mL。
实施例2
在谷氨酰胺转胺酶发酵液中，在发酵的16h添加50U/mL的胰蛋白酶，发酵至结束时，发酵液中的谷氨酰胺转胺酶产量为5.24U/mL。
实施例3
在谷氨酰胺转胺酶发酵液中，在发酵的8h添加10u/ml的胰蛋白酶，发酵至结束时，发酵液中的谷氨酰胺转胺酶产量为5.42U/mL。
Claims (1)
1、一种提高发酵法制备谷氨酰胺转胺酶产量的方法，其特征是采用吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)WSH03-13，菌种保藏编号为CCTCC NO：203062，作为出发菌株，经液体发酵制备谷氨酰胺转胺酶，通过在发酵过程中添加胰蛋白酶，发酵至0-16h在发酵液中添加10-100U/mL的胰蛋白酶，提高谷氨酰胺转胺酶的发酵产酶量。
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| Date | Code | Title | Description |
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Owner name: TAIXING YIMING BIOLOGICAL PRODUCTS CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: JIANGNAN UNIVERSITY Effective date: 20110413 |
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| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 214036 NO. 170, HUIHE ROAD, WUXI CITY, JIANGSU PROVINCE TO: 225433 YIMING ROAD, GENSI TOWNSHIP, TAIXING CITY, JIANGSU PROVINCE |
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Effective date of registration: 20110413 Address after: Taixing City, Jiangsu province 225433 root homesickness Yat Ming Road Patentee after: YIMING BIOLOGICAL PRODUCTS Co.,Ltd. Address before: 214036 Jiangsu city of Wuxi Province River Road No. 170 Patentee before: Jiangnan University |
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Address after: Taixing City, Jiangsu province 225433 root homesickness Yat Ming Road Patentee after: JIANGSU YIMING BIOLOGICAL CO.,LTD. Address before: Taixing City, Jiangsu province 225433 root homesickness Yat Ming Road Patentee before: YIMING BIOLOGICAL PRODUCTS Co.,Ltd. |
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Denomination of invention: Method for Increasing the Production of Transglutaminase by Fermentation by Adding Trypsin Effective date of registration: 20230721 Granted publication date: 20081231 Pledgee: Jiangsu Changjiang Commercial Bank Co.,Ltd. Taixing Branch Pledgor: JIANGSU YIMING BIOLOGICAL CO.,LTD. Registration number: Y2023980049356 |
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