CN102120978A

CN102120978A - 一种分泌谷氨酰胺转胺酶酶原的大肠杆菌及其应用

Info

Publication number: CN102120978A
Application number: CN 201010581546
Authority: CN
Inventors: 陈坚; 堵国成; 刘松; 张东旭
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2010-12-10
Filing date: 2010-12-10
Publication date: 2011-07-13

Abstract

本发明公开了一种分泌谷氨酰胺转胺酶酶原的大肠杆菌及其应用，属于分子生物学技术领域。是将谷氨酰胺转酶酶原基因TG3989(GenBank NO：HM231108)导入大肠杆菌BL21(DE3)得到的重组大肠杆菌，在本表达体系中，谷氨酰胺转胺酶酶原被分泌至胞外，可以在胞外进行酶原的活化，为谷氨酰胺转胺酶的工业化生产提供了一种新方法。

Description

一种分泌谷氨酰胺转胺酶酶原的大肠杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种分泌谷氨酰胺转胺酶酶原的大肠杆菌及其应用，属于分子生物学技术领域。

背景技术

谷氨酰胺转胺酶(Transglutaminase EC 2.3.2.13全称R-glutaminyl-peptide：amine-γ-glutayle-transferase简称TGase)，又称转谷氨酰胺酶或谷氨酰胺酰-肽γ-谷氨酰胺酰基转移酶，具有多种催化功能。它能够通过催化蛋白质分子间或分子内形成ε-(γ-谷氨酰基)赖氨酸共价键，引起蛋白质分子内、分子间发生交联、蛋白质和氨基酸之间的连接以及蛋白质分子内谷氨酰胺基的水解。具体包括：(1)可催化蛋白质以及肽键中谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基和伯胺之间的酰胺基转移反应；(2)当蛋白质中的赖氨酸残基的ε-氨基作为酰基受体时，蛋白质在分子内或分子间形成ε-(γ-谷氨酰基)赖氨酸共价键；(3)当不存在伯胺时，水会成为酰基受体，其结果是谷氨酰胺残基脱去氨基生成谷氨酸残基(Yokoyama et al.Appl.Microbiol.Biotechnol.2004，81(3)，523-532)。TGase具有的独特催化功能，使其在许多领域发挥着重要的作用。目前该酶广泛用于食品工业，改善各类食品蛋白质的功能性质和营养价值，应用范围包括肉制品、水产品、乳制品、植物蛋白制品、可食性包装等。由于独特的催化特性，TGase在一些非食品领域也具有很大的应用前景，包括组织工程、纺织与皮毛加工、蛋白质工程等。

TGase广泛分布于动物，植物及微生物中。第一种微生物来源的TGase在Streptomycesmobaraensis中获得。之后，又陆续分离到其它微生物来源的TGase。Streptomyces来源的TGase是一种活性不依于Ca2+的酶；在液体培养基中它以酶原形式(pro-TGase)分泌，通过切除N-端酶原区，产生活性TGase。一种金属蛋白酶和一种氨肽酶参与了Streptomyces来源的pro-TGase活化过程。本研究室最近的研究发现，除了金属蛋白酶，还有一种内源的丝氨酸蛋白酶参与了吸水链霉菌来源的pro-TGase活化。这些研究为其在异源系统中表达活性TGase提供了重要的基础资料。

微生物TGase至今被表达于S.lividans，E.coli，Corynebactetium glutamicum，methylotropic yeasts。在这些表达系统中，由于大肠杆菌表达系统相对简单，便宜并可高密度发酵培养，TGase在大肠杆菌系统中的表达受到广泛关注。总体上，在大肠杆菌中表达TGase的策略有三种：(1)融合或未融合额外序列的TGase成熟酶在大肠杆菌中表达；(2)pro-TGase在大肠杆菌中表达后，在体外切割获得活性TGase；(3)pro-TGase与活化蛋白酶在大肠杆菌中共表达。对于第一个表达策略，单独表达成熟酶基因常常导致低水平的蛋白质表达，然而在TGase N-端融合可增加表达量的T7基因前导肽导致TGase包涵体的形成。第二个表达策略的结果表明，S.mobaraensis来源的pro-TGase在pET表达系统中获得了可溶表达且表达量较高。重组的pro-TGase可被dispase、cathepsin B及trypsin等蛋白酶进行活化(Marx et al.2008.Enzyme.Microb.Technol.42(7)，568-575)。对于第三个策略，最近研究人员建立了一个pro-TGase与活蛋白酶的共表达系统。通过这种策略，可以在胞内利用pET表达系统直接表达具有活性的TGase。尽管pro-TGase已在大肠杆菌中成功表达，但是pro-TGase在肠杆菌中分泌的策略还未见有报道。

发明内容

本发明提供了一种分泌谷氨酰胺转胺酶酶原的大肠杆菌，是将谷氨酰胺转酶酶原基因TG3989(GenBankNO：HM231108)导入大肠杆菌BL21(DE3)得到的重组大肠杆菌。

所述分泌谷氨酰胺转胺酶酶原的大肠杆菌的构建方法：

1)根据包含吸水链霉菌来源的谷氨酰胺转胺酶酶原基因的TG3989的序列(GenBankNO.：HM231108)，设计PCR引物，以吸水链霉菌基因组DNA为模板，扩增谷氨酰胺转胺酶酶原基因proTG；

2)谷氨酰胺转胺酶酶原基因连接至大肠杆菌表达载体pET-22b(+)，Nco I-BamH位点，转化大肠杆菌JM109，提取质粒，命名为pETproTG，，并测序确证基因无突变，pET-22b(+)含有pelB信号肽，谷氨酰胺转胺酶酶原在此信号肽的作用下进行分泌；

3)将谷氨酰胺转胺酶酶原的表达质粒pETproTG转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到含有表达质粒的工程菌，命名为BL21(DE3)/pETproTG。

本发明还提供了一种大肠杆菌基因工程菌BL21(DE3)/pETproTG用于生产谷氨酰胺转胺酶的方法。

解决上述问题的技术方案为：将蛋白酶添加于大肠杆菌基因工程菌BL21(DE3)/pETproTG发酵液。

大肠杆菌基因工程菌BL21(DE3)/pETproTG的发酵培养是将甘油管保存的菌液100μl接种至装有25ml含100μg/ml羧苄青霉素的LB液体培养基的250ml三角瓶中，200rpm，37℃培养过夜得到种子培养液，按3％的接种量将种子培养液接种至装有25ml含100μg/ml羧苄青霉素的TB液体培养基的250ml三角瓶中。

为了提高基因工程菌对于谷氨酰胺转胺酶酶原的分泌，在上述TB液体培养基中分别加入葡萄糖或乙醇，其中优选加入0.5％(w/v)葡萄糖。

所述蛋白酶可以为dispase，cathepsin B，胰蛋白酶等，

在本表达体系中，谷氨酰胺转胺酶酶原被分泌至胞外，可以在胞外进行酶原的活化，在工业生产中具有较高的可行性。

附图说明

图1添加物对BL21(DE3)/pETproTG分泌谷氨酰胺转胺酶酶原的影响，0.4mM IPTG 20℃诱导表达50h，取发酵上清液进行SDS-PAGE检测。

M：蛋白质标准分子量；1：无添加物；2：添加甘氨酸；3：添加葡萄糖；4：添加乙醇图2谷氨酰胺转胺酶酶原的活化过程SDS-PAGE分析。

M：蛋白质标准分子量；1-8：0、5、10、15、30、60、120及180min活化图3谷氨酰胺转胺酶酶原的活化反应过程中的酶活力

具体实施方式：

以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例用于说明目的而非用于限制本发明范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都按照常见的分子克隆手册所述的条件进行操作。

材料和试剂：

所用限制性内切酶，T4DNA连接酶，PCR试剂，DNA Marker等均购于TaKaRa宝生物公司；pET-22b(+)载体，JM109购自Novogen公司；引物，质粒提取试剂盒购于上海生工生物工程公司；电转仪购自Bio-Rad公司；其他试剂均为国内或国外购买的分析纯试剂。

吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)WSH03-13，巳在中国专利ZL03152956.9公开，授权公告号CN 1208452C，授权公告日2005年6月29日。

实施例1分泌谷氨酰胺转胺酶酶原的重组大肠杆菌的构建

根据包含吸水链霉菌来源的谷氨酰胺转酶酶原基因TG3989(GenBankNO：HM231108)，设计PCR引物，以吸水链霉菌基因组DNA为模板，扩增谷氨酰胺转胺酶酶原基因，并连接至大肠杆菌表达载体pET-22b(+)(Novogen)Nco I-BamH位点，转化大肠杆菌JM109(Novogen)，提取质粒，命名为pETproTG，，并测序确证基因无突变。pET-22b(+)含有pelB信号肽，谷氨酰胺转酶酶原在此信号肽的作用下进行分泌；将谷氨酰胺转胺酶的表达质粒pETproTG转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到含有表达质粒的工程菌，命名为BL21(DE3)/pETproTG。

PCR引物如下：

PTG 1：5’-ATATGACCATGGCCAGCGGCG GCGACG-3’

PTG2：5’-GAATTCGGATCCTTACGACCAGCCCTGCTTCACCTC-3’

PCR反应条件：PCR反应条件：50μl反应体系，95℃变性1min，65℃退火30s，72℃延伸1.5min，35个反应循环。

实施例2培养大肠杆菌BL21(DE3)/pETproTG分泌酶原

1.将甘油管保存的BL21(DE3)/pETproTG菌液100μl接种至装有25ml含100μg/ml羧苄青霉素的LB液体培养基的250ml三角瓶中，200rpm，37℃培养过夜得到种子培养液；

2.按3％的接种量将种子培养液接种至装有25ml含100μg/ml羧苄青霉素的TB液体培养基的250ml三角瓶中，37℃培养OD₆₀₀至1.0；

3.加入终浓度为0.4mM IPTG，降温至20℃培养50h；

取发酵液10000rpm离心10min，取上清液进行SDS-PAGE分析(图1)，发酵上清液含有大量的谷氨酰胺转胺酶原(pro-TGase，43.6kDa)。

实施例3提高大肠杆菌BL21(DE3)/pETproTG酶原表达量

培养条件以及培养基组成同实施例2，在TB液体培养基中按终浓度0.5％分别添加甘氨酸、葡萄糖以及乙醇，取上清液进行SDS-PAGE分析，发酵上清液谷氨酰胺转胺酶原含量提高，其中，添加0.5％(w/v)葡萄糖的效果最好(图1)。

实施例4应用大肠杆菌BL21(DE3)/pETproTG生产谷氨酰胺转胺酶

a.添加4ul活化蛋白酶dispase(上海生工)溶液(2.4mg/ml，26Ucas/ml)至200ul上述添加葡萄糖的发酵上清液，37℃反应3h。

b.于0、5、10、15、30、60、120及180min移取活化应液样品。10ul样品与SDS-PAGE5×上样缓冲液以1∶4比例混合，用于SDS-PAGE检测。40ul样品直接用于酶活力检测。结果如图2、图3所示，谷氨酰胺转胺酶酶原(43.6kDa)在30min内迅速转化为谷氨酰胺转胺酶(37.8kDa)，相应检测到活化反应液中到谷氨酰胺转胺酶活力随时间的上升，最高活力达到4.5U/ml。活化反应持续3h未检测到谷氨酰胺转胺酶的持续降解，酶活力达到最高值后未发生明显下降。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110>江南大学

<120>一种分泌谷氨酰胺转胺酶酶原的大肠杆菌及其应用

<160>2

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>27

<212>DNA

<213>人工合成序列

<220>

<223>根据基因序列设计用于扩增

<400>1

atatgaccat ggccagcggc ggcgacg 27

<210>2

<211>36

<212>DNA

<213>人工合成序列

<220>

<223>根据基因序列设计用于扩增

<400>2

gaattcggat ccttacgacc agccctgctt cacctc 36

Claims

1.一种分泌谷氨酰胺转胺酶酶原的大肠杆菌，是将吸水链霉菌来源的谷氨酰胺转酶酶原基因导入大肠杆菌得到的基因工程菌。

2.根据权利要求1所述大肠杆菌，是将吸水链霉菌来源的谷氨酰胺转酶酶原基因导入大肠杆菌BL21(DE3)。

3.根据权利要求1所述大肠杆菌，是将吸水链霉菌来源的谷氨酰胺转酶酶原基因连接至大肠杆菌表达载体pET-22b(+)，得到表达质粒pETproTG，将pETproTG转化大肠杆菌BL21(DE3)。

4.根据权利要求1所述大肠杆菌，其特征在于，构建方法如下：

1)根据包含吸水链霉菌来源的谷氨酰胺转胺酶酶原基因的TG3989的序列，设计PCR引物，以吸水链霉菌基因组DNA为模板，扩增谷氨酰胺转胺酶酶原基因proTG；

2)谷氨酰胺转胺酶酶原基因连接至大肠杆菌表达载体pET-22b(+)，Nco I-BamH位点，转化大肠杆菌JM109，提取质粒，命名为pETproTG.，并测序确证基因无突变，pET-22b(+)含有pelB信号肽，谷氨酰胺转胺酶酶原在此信号肽的作用下进行分泌；

3)将谷氨酰胺转胺酶酶原的表达质粒pETproTG转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到含有表达质粒的工程菌。

5.一种促进权利要求1所述大肠杆菌分泌谷氨酰胺转胺酶酶原的方法，其特征在于，在液体培养基中加入葡萄糖或乙醇。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，在液体培养基中加入0.5％的葡萄糖。

7.一种应用权利要求1所述大肠杆菌生产谷氨酰胺转胺酶方法，其特征在于，将蛋白酶添加于重组菌的发酵液中。

8.根据权利要求1所述大肠杆菌的应用，其特征在于，所述蛋白酶为dispase，cathepsin B或胰蛋白酶。