CN101126097A - 一种吸水链霉菌的谷氨酰胺转胺酶酶原基因及其表达 - Google Patents

Abstract

一种吸水链霉菌的谷氨酰胺转胺酶酶原基因及其表达，属于分子生物学领域。本发明提供了吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)CCTCC M203062(中国专利：03152956.9，2003)的谷氨酰胺转胺酶酶原的基因序列；进一步提供了能够使该基因编码的酶原可溶性表达的载体系统和宿主系统，利用该表达系统可以获得一部分可溶性表达的酶原，利用胰蛋白酶处理酶原可以得到有活性的谷氨酰胺转胺酶。

Description

一种吸水链霉菌的谷氨酰胺转胺酶酶原基因及其表达

技术领域

一种吸水链霉菌的谷氨酰胺转胺酶酶原基因及其表达，属于分子生物学领域。涉及一种编码谷氨酰胺转胺酶酶原的新DNA分子和其编码的谷氨酰胺转胺酶酶原。

背景技术

谷氨酰胺转胺酶(蛋白质-谷氨酸-γ谷氨酰胺转胺酶，Transglutaminase，简称MTG，EC 2.3.2.13)，又称转谷氨酰胺酶或谷氨酰胺酰-肽γ-谷氨酰胺酰基转移酶，可以催化蛋白质分子内、分子间发生交联，蛋白质和氨基酸之间的连接以及蛋白质分子内谷氨酰胺基的水解，从而进一步改善蛋白质功能性质，提高蛋白质的营养价值，生产出满足人们需求的新型蛋白食品，被誉为“21世纪超级粘合剂”。

谷氨酰胺转胺酶在食品加工中的应用主要包括：(1)通过催化蛋白质分子之间发生的交联，改善蛋白质的溶解性、起泡性和乳化性等重要性能；(2)将某些人体必需氨基酸(如赖氨酸)共价交联到蛋白质上，防止美拉德反应对氨基酸的破坏，提高蛋白质的营养价值；(3)用该酶交联过的酪蛋白脱水后可形成耐热、耐水性的薄膜，能够用作食品包装材料；(4)用于包埋脂类或脂溶性物质，催化蛋白质分子的去酰胺化。

谷氨酰胺转胺酶在医药领域也有很好的应用前景。谷氨酰胺转胺酶(即人体凝血因子XIII)在凝血过程中能够加固纤维结构；在表皮角质化过程中形成角化层；加速伤口愈合；参与受体介导的蛋白质和多肽激素的胞吞作用等。这些生理功能也说明谷氨酰胺转胺酶已成为医药工业研究者所瞩目的焦点。最近在化妆品、纺织工业上也有学者开始关注谷氨酰胺转胺酶，相关的应用研究正在展开。

目前报道的生产谷氨酰胺转胺酶的方法主要有从动植物组织中提取，从微生物发酵法生产两种。上世纪六十年代以来，对来自动物体(主要是豚鼠肝脏)的谷氨酰胺转胺酶的纯化方法、性质以及应用进行了广泛研究。由于来源稀少、提取工艺复杂，因此这种酶的售价较高，很难应用于食品工业。因此期望能够找到产谷氨酰胺转胺酶(TG)的微生物菌株，1989年，Ando，Motoki等人(AndoH et，al.Agric Biol Chem，1989，53：2613-2617)首先报道用微生物发酵法生产MTG。国内对发酵法生产谷氨酰胺转胺酶的研究起步较晚。江南大学环境技术研究室是国内较早开展微生物法发酵生产谷氨酰胺转胺酶的科研单位。研究小组郑美英等人以茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)为出发菌株，通过发酵优化最高达到3.37U/ml；柏映国等人用传统方法筛到一株高产谷氨酰胺转胺酶的菌株鉴定为吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicu；CCTCC M203062；中国专利：03152956.9，2003)，通过150L中试，MTG酶活最高达到4.20U/mL。

近年来，随着基因工程技术的发展，人们开始尝试采用重组DNA技术构建工程菌来进一步提高MTG的发酵水平。Washizu等人和Takehana等人首先进行了MTG的克隆与表达，但是酶活水平都很低，无法达到工业化生产的要求。Date等人将编码谷氨酰胺转胺酶的基因转入Corynebacterium glutamicum中表达，并同时将一段可以特异切割谷氨酰胺转胺酶前提酶原的蛋白酶(SAM-45)基因转入宿主表达，结果获得了很高的产量，最高酶活达到16U/mL。国外在基因工程方面的研究主要包括采用不同的表达载体，融合不同来源的酶原区域，共表达切割酶原的蛋白酶基因，利用不同的宿主等，在产酶机理和分子水平上有深入研究，国内在2004年周建等利用大肠杆菌宿主将枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转氨酶基因与硫氧还蛋白融合表达，但是必须经过复杂的复性操作后才得到较低的生物活性；江南大学唐名山等利用茂原链霉菌的MTG基因在大肠杆菌E.coliM15中尝试表达，产物主要为包涵体，通过Ni-NTA亲和柱分离纯化和稀释法复性。徐斌等同样利用茂原链霉菌的TG基因在大肠杆菌中表达，表达产物也是包涵体。Christian K等(Christian K.et，al.Enzyme and Microbial Technology2007，40：1543-1550)利用茂原链霉菌的谷氨酰胺转胺酶基因在大肠杆菌中获得部分可溶性表达，但酶活不高。利用基因工程菌获得可溶性表达有活性的谷氨酰胺转胺酶还需要进一步研究。

编码谷氨酰胺转胺酶基因已经从链轮丝菌S-8112(Washizu等，1994，Biosci，Biotechnol，Biochen.58(1)：82-7)，枯草芽孢杆菌(Kobayashi等，1998，J.Gen.Appl.Microbial，44：85-91)，利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)(WO9606931)和肉桂链轮丝菌(Pasternack等，1998，Eur.J.Biochem.2573)：570-6)中得到克隆。拉达卡链轮丝菌(Streptomyces ladakanum)的谷氨酰胺转胺酶已经得到克隆并申请专利(申请号01143722.7，2001年)。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种分离和纯化的DNA分子，其编码吸水链霉菌谷氨酰胺转胺酶酶原氨基酸序列，其包含编码谷氨酰胺转胺成熟酶的序列。

本发明的另一个目的是提供包含本发明DNA分子的表达载体。

本发明的再一个目的是提供包含本发明表达载体的两种宿主细胞。

本发明的又一个目的是提供由本发明DNA分子编码的谷氨酰胺转胺酶多肽。

本发明的技术方案：一种来源于吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)CCTCC M203062(中国专利：03152956.9，2003)的谷氨酰胺转胺酶酶原，其基因核苷酸序列为SEQ ID NO：1。其氨基酸组成为SEQ ID NO：2。

所述的谷氨酰胺转胺酶酶原的表达：

(1)吸水链霉菌的谷氨酰胺转胺酶基因的获得

通过NCBI基因库查到平板链霉菌(Streptomyces platensis)，茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)，肉桂链霉菌(Streptomyces cinnamoneus)，弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)的谷氨酰胺转胺酶完整氨基酸序列，根据文献报道结果找到酶原起始序列和终止序列，然后通过比对相应碱基序列；另一方面在纯化获得来源于天然吸水链霉菌的酶原之后，通过N端氨基酸测序；确定PCR的引物如下：

P1：5’-GCTAGCGGTGACGACGAGG-3’

P2：5’-TTACGGCCAGCCCTGCTTTAC-3’

利用上述引物，以提取的吸水链霉菌CCTCC M203062总DNA为模板，PCR反应在50μL体系中进行，反应条件为在95℃变性5min后开始循环，然后95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，共35个循环后，再于72℃延伸10min；通过PCR扩增得到1170bp的DNA片段，编码389个氨基酸；测序结果在NCBI利用Blast分析，结果显示该基因序列与其它链霉菌产谷氨酰胺转胺酶的基因序列同源性最高达92％，Blast RID：7A2RYJJS015；

(2)谷氨酰胺转胺酶酶原基因的克隆

将扩增得到的DNA利用上海生工UNIQ-10柱式胶回收试剂盒回收纯化，将纯化产物4.5μL，pMD-18T载体0.5μL，按照试剂盒操作，16℃连接12小时，连接产物热击转化大肠杆菌JM109，操作如下：

1)将JM109感受态细胞从-80℃冰箱取出迅速放在冰上，溶化5min；

2)10μL连接产物加入至100μL JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟；

3)42℃加热90秒钟后，再在冰中放置3分钟；

4)加入950μL 37℃预热的SOC培养基，37℃振荡培养90分钟；

5)在含有0.04mg/mL 5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷、0.024mg/mL异丙基-β-D-硫代半乳糖苷、0.1mg/mL氨苄青霉素的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落；

6)16h后，挑选白色菌落，挑出的菌落接种于含有0.1mg/mL氨苄青霉素的LB培养基，37℃培养过夜，利用上海生工UNIQ-10柱式质粒抽提试剂盒操作得到含有目的基因的质粒pMD/pro-MTG；

(3)吸水链霉菌谷氨酰胺转胺酶的表达

利用限制性内切酶NcoI和BamHI从pMD/pro-MTG双酶切切下，将表达载体pET20b也同样双酶切，然后利用T4DNA连接酶进行连接反应，将连接产物先转化大肠杆菌JM109，得到正确的表达质粒pET/pro-MTG后再将表达质粒转化BL21(DE3)或Rosetta(DE3)pLysS，得到含有表达质粒pET/pro-MTG的工程菌命名为BL21/pET-MTG或Rosetta/pET-MTG；

诱导表达按下面操作进行：

1)将甘油管保存的BL21/pET-MTG或Rosetta/pET-MTG菌液0.1ml快速加入到装有25ml含有0.1mg/mL Amp的LB培养基的50ml三角瓶中，200rpm种子培养过夜；

2)按3％的接种量将种子分别接种到三个装有50ml含有0.1mg/mL Amp的LB培养基的250ml三角瓶中，37℃，200rpm培养4h；

3)加入终浓度为0.4mM IPTG，降低温度至24℃诱导4h；

4)取3mL步骤3)处理后的发酵液12000rpm离心2min，发酵液上清几乎没有酶活；离心沉淀用pH8.0的1.0mL Tris-HCl缓冲液悬浮，悬浮液经过超声破壁，12000rpm离心5min，离心上清有可溶性的酶原存在，经过胰蛋白酶100U/ml37℃处理10分钟后，最高酶活达到0.14U/mL；

5)对发酵上清液、破壁沉淀、破壁上清液，分别进行蛋白电泳SDS-PAGE表达产物的分布：胞外几乎没有可溶性谷氨酰胺转胺酶酶原，胞内有少量可溶性谷氨酰胺转胺酶酶原，大部分为不可溶的包涵体。

本发明的主要特点是得到了来自于吸水链霉菌的谷氨酰胺转胺酶的新DNA分子，另外，本发明还提供了能够可溶性表达新DNA分子编码的谷氨酰胺转胺酶的方法。

定义

本文所用术语“分离和纯化的”是指DNA分子或者蛋白质分子从其天然细胞环境中，以及与细菌基因组的其它编码区的结合体中经体外分离，从而可被测序，复制或表达。本发明中的DNA分子，编码谷氨酰胺转胺酶酶原，共1170个碱基，编码389个氨基酸。

本文所述的“谷氨酰胺转胺酶成熟酶”或者“谷氨酰胺转胺酶”(MTG)是指在天然环境中有催化活性的，具有正确的催化活性中心和三维结构的一种蛋白分子，根据大量研究报道由330或331个氨基酸组成。

本文所述的“谷氨酰胺转胺酶酶原”(pro-MTG)是指在天然环境中有催化活性的谷氨酰胺转胺酶成熟酶N末端带有58-59个氨基酸的酶原区。酶原区具有促进成熟酶区正确折叠为有活性的三维结构的功能。

本文所述的“氨基酸序列”是指天然存在的蛋白质的氨基酸序列，氨基酸序列包括寡肽，肽，多肽和蛋白质序列，及其片断或部分，以及天然存在或合成的分子。

本文所述的“载体”是指能够连接另一核酸的核酸分子，是一种独立于染色体的能够自主复制和/或表达与其连接的核酸的载体。优先的，能够指导并可操纵连接基因表达的载体叫表达载体。DNA技术中常用的表达载体是以质粒的形式，是一种双链闭合环状的DNA分子，其在细胞内不与细胞染色体结合。

本文所用术语“宿主细胞”是指可被载体感染的宿主细胞。本发明使用的是本领域常规使用的大肠杆菌宿主细胞。

核酸：本发明的DNA分子，是编码谷氨酰胺转胺酶酶原的核酸序列。其完整序列见附序列表SEQ ID NO.1，共有1170bp。本DNA序列是通过同源性克隆，利用与本DNA来源菌种吸水链霉菌同源性高的几种链霉菌，如平板链霉菌(Streptomyces platensis)，茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)，肉桂链霉菌(Streptomyces cinnamoneus)，弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)，通过在编码谷氨酰胺转胺酶酶原的核酸序列的前后两端保守性比对，设计正反引物，利用PCR(聚合酶链式反应，polymerase chain reaction)扩增得到。然后将纯化得到的来自于吸水链霉菌天然培养基中的谷氨酰胺转胺酶酶原通过N末端前十个氨基酸测序，修正正向引物设计的随机性而带来的氨基酸序列错误，使得所得到的DNA所编码的氨基酸序列与天然来源的吸水链霉菌的谷氨酰胺转胺酶酶原完全一致。

表达载体和宿主系统：本发明的另一目的是提供能够表达本发明DNA的表达载体，为能够得到可溶性表达，我们选择商业化的Novagen公司的pET20b(+)载体，将目的基因插入到pelB信号肽后，酶原区序列对成熟酶的正确折叠是必要的，所以在表达了可溶性酶原后经过胰蛋白酶处理得到成熟酶。该载体系统利用常规IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)0.4mM诱导。

本发明的另一目的是提供含有该表达载体的宿主细胞。根据本发明，可采用各种不同宿主系统包括但不限于用重组噬菌体，质粒或粘粒DNA表达载体转化的细菌，酵母表达系统或者动物表达系统等。优先的，本发明选用常规大肠杆菌宿主BL21(DE3)或Rosetta(DE3)pLysS。

多肽：本发明的氨基酸序列，包括由本发明DNA编码的谷氨酰胺转胺酶酶原氨基酸序列，还有该酶原序列被胰蛋白酶切割后产生的谷氨酰胺转胺酶成熟酶序列。酶原蛋白分子没有生物学催化活性，而成熟酶蛋白分子具有生物学催化活性。

本发明的有益效果：本发明提供了吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)CCTCC M203062(中国专利：03152956.9，2003)的谷氨酰胺转胺酶酶原的基因序列；进一步，提供了能够使该基因编码的酶原可溶性表达的载体系统和宿主系统，利用该表达系统可以获得一部分可溶性表达的酶原，利用胰蛋白酶处理酶原可以得到有活性的谷氨酰胺转胺酶。

附图说明

图1利用吸水链霉菌PCR扩增得到的DNA序列电泳图。

图2pET/pro-MTG经过限制酶NcoI和BamHI双酶切后电泳验证图。

具体实施方式

以下实施示例是举例而非限制性。

实施例1：吸水链霉菌的谷氨酰胺转胺酶基因的获得

通过NCBI基因库查到平板链霉菌(Streptomyces platensis)，茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)，肉桂链霉菌(Streptomyces cinnamoneus)，弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)的谷氨酰胺转胺酶完整氨基酸序列。根据文献报道结果找到酶原起始序列和终止序列，然后通过比对相应碱基序列；另一方面在纯化获得来源于天然吸水链霉菌的酶原之后，通过N端氨基酸测序。

确定PCR的引物如下：

P1：5’-GCTAGCGGTGACGACGAGG-3’

P2：5’-TTACGGCCAGCCCTGCTTTAC-3’

利用上述引物，以提取的吸水链霉菌CCTCC M203062总DNA为模板，PCR反应在50μL体系中进行，反应条件为在95℃变性5min后开始循环，然后95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，共35个循环后，再于72℃延伸10min。通过PCR扩增得到1170bp的DNA片段，编码389个氨基酸。测序结果在NCBI利用Blast分析，结果显示该基因序列与其它链霉菌产谷氨酰胺转胺酶的基因序列同源性最高达92％，(Blast RID：7A2RYJJS015)。

实施例2：谷氨酰胺转胺酶酶原基因的克隆

将扩增得到的DNA利用上海生工UNIQ-10柱式胶回收试剂盒回收纯化，将纯化产物4.5μL，pMD-18T载体0.5μL，按照试剂盒操作，16℃连接12小时，连接产物热击转化大肠杆菌JM109。具体操作如下：

1)将JM109感受态细胞从-80℃冰箱取出迅速放在冰上，溶化5min。

2)10μL连接产物加入至100μL JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。

3)42℃加热90秒钟后，再在冰中放置3分钟。

4)加入950μL SOC(37℃预热)培养基，37℃振荡培养90分钟。

5)在含有0.04mg/mL X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷)、0.024mg/mLIPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)、0.1mg/mL Amp(氨苄青霉素)的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。

6)16h后，挑选白色菌落，挑出的菌落接种含有0.1mg/mL Amp的LB培养基，37℃培养过夜，利用上海生工UNIQ-10柱式质粒抽提试剂盒操作得到大量含有目的基因的质粒pMD/pro-MTG。

实施例3：吸水链霉菌谷氨酰胺转胺酶的表达

利用限制性内切酶NcoI和BamHI从pMD/pro-MTG双酶切切下，将表达载体pET20b也同样双酶切，然后利用T4 DNA连接酶进行连接反应，将连接产物先转化大肠杆菌JM109，得到正确的表达质粒pET/pro-MTG后再将表达质粒转化BL21(DE3)或Rosetta(DE3)pLysS。得到含有表达质粒pET/pro-MTG的工程菌命名为BL21/pET-MTG或Rosetta/pET-MTG。

诱导表达按下面操作进行：

(1)将甘油管保存的BL21/pET-MTG或Rosetta/pET-MTG菌液0.1ml快速加入到装有25ml含有0.1mg/mL Amp的LB培养基的50ml三角瓶中，200rpm种子培养过夜(12h)。

(2)按3％的接种量将种子接种到三个装有50ml含有0.1mg/mL Amp的LB培养基的250ml三角瓶中，37℃，200rpm培养4h。

(3)加入终浓度为0.4mM IPTG，降低温度至24℃诱导4h。

(4)取3mL步骤(3)发酵液12000rpm离心2min，发酵液上清几乎没有酶活；离心沉淀用1.0mL Tris-HCl(pH8.0)缓冲液悬浮，悬浮液经过超声破壁，12000rpm离心5min，离心上清有可溶性的酶原存在，经过胰蛋白酶100U/ml 37℃处理10分钟后，最高酶活达到0.14U/mL。

(5)对发酵上清液、破壁沉淀、破壁上清液，分别进行蛋白电泳(SDS-PAGE)表达产物的分布：胞外几乎没有可溶性谷氨酰胺转胺酶酶原，胞内有少量可溶性谷氨酰胺转胺酶酶原，大部分为不可溶的包涵体。

序列表

<210>SEQ ID NO：1

<211>1170

<212>DNA

<213>吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicu)CCTCC M203062

<214>

gctagcggtg acgacgagga aagggagggg tcctacgccg aaacgcacgg tctgacggcg  60

gaggacgtca agaacatcaa cgcactgaac aaaagggccc tgactgcggg tcaacctggc  120

aattctctga cggaattgcc gccgagcgtc agtgcgctct tccgggcccc cgacgctgcc  180

gacgagaggg tgacccctcc tgccgagccg ctcaaccgga tgcctgacgc gtaccgggcc  240

tacggaggta gggccactac ggtcgtcaac aactacatac gcaagtggca gcaggtctac  300

agtcaccgcg acggcatcca acagcaaatg accgaagagc agcgagaaaa gctgtcctac  360

ggctgcgtcg gcgtcacctg ggtcaattcg ggcccctacc cgacgaacaa attggcgttc  420

gcgttcttcg acgaggacaa gtacaagagt gacctggaaa acagcaggcc acgccccaat  480

gagacgcaag ccgagtttga ggggcgcatc gtcaaggaca gtttcgacga ggggaagggc  540

ttcaagcggg cgcgtgatgt ggcgtccatc atgaacaagg ccctggatag tgcgcacgac  600

gaggggactt acatcgacaa cctcaagaaa gagctcgcga acaaaaatga cgctctgcgc  660

tacgaggaca gtcgctcgaa cttttactcg gcgctgagga atacgccgtc cttcaaggaa  720

agggatggag gcaactacga cccatccaag atgaaggcgg tggtctactc gaaacacttc  780

cggagcgggc aggaccagcg gggctcctct gacaagagga agtacggcga cccggatgcc  840

ttccgccccg accagggcac aggcctggtc gacatgtcga aggacaggaa tattccgcgc  900

agtcccgccc gacctggcga aagttgggtg aatttcgact acggctggtt tggggctcag  960

acggaagcgg atgccgacaa aaccatatgg acccacgcca accactatca cgcgcccaac  1020

ggcggcgtgg gccccatgaa cgtatacgag agcaagttcc ggaactggtc tgccgggtac  1080

gcggatttcg accgcggaac ctacgtcatc acgttcatac ccaagagctg gaacaccgcc  1140

cccgccgagg taaagcaggg ctggccgtaa                                   1170

<210>SEQ ID NO：2

<211>389

<212>PRT

<213>吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicu)CCTCC M203062

<214>

Ala Ser Gly Asp Asp Glu Glu Arg Glu Gly Ser Tyr Ala Glu Thr

 1               5                  10                   15

His Gly Leu Thr Ala Glu Asp Val Lys Asn Ile Asn Ala Leu Asn

                20                  25                   30

Lys Arg Ala Leu Thr Ala Gly Gln Pro Gly Asn Ser Leu Thr Glu

                35                  40                   45

Leu Pro Pro Ser Val Ser Ala Leu Phe Arg Ala Pro Asp Ala Ala

                50                  55                   60

Asp Glu Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asn Arg Met Pro

                65                  70                  75

Asp Ala Tyr Arg Ala Tyr Gly Gly Arg Ala Thr Thr Val Val Asn

                80                  85                  90

Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly

                95                  100                 105

Ile Gln Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Lys Leu Ser Tyr

                110                 115                 120

Gly Cys Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Pro Tyr Pro Thr

                125                 130                 135

Asn Lys Leu Ala Phe Ala Phe Phe Asp Glu Asp Lys Tyr Lys Ser

                140                 145                 150

Asp Leu Glu Asn Ser Arg Pro Arg Pro Asn Glu Thr Gln Ala Glu

                155                 160                 165

Phe Glu Gly Arg Ile Val Lys Asp Ser Phe Asp Glu Gly Lys Gly

                170                 175                 180

Phe Lys Arg Ala Arg Asp Val Ala Ser Ile Met Asn Lys Ala Leu

                185                 190                 195

Asp Ser Ala His Asp Glu Gly Thr Tyr Ile Asp Asn Leu Lys Lys

                200                 205                 210

Glu Leu Ala Asn Lys Asn Asp Ala Leu Arg Tyr Glu Asp Ser Arg

                215                 220                 225

Ser Asn Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn Thr Pro Ser Phe Lys Glu

                230                 235                 240

Arg Asp Gly Gly Asn Tyr Asp Pro Ser Lys Met Lys Ala Val Val

                245                 250                 255

Tyr Ser Lys His Phe Arg Ser Gly Gln Asp Gln Arg Gly Ser Ser

                260                 265                 270

Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Asp Ala Phe Arg Pro Asp Gln

                275                 280                 285

Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Lys Asp Arg Asn Ile Pro Arg

                290                 295                 300

Ser Pro Ala Arg Pro Gly Glu Ser Trp Val Asn Phe Asp Tyr Gly

                305                 310                 315

Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys ThrIle Trp

                320                 325                 330

Thr His Ala Asn His Tyr His Ala Pro Asn Gly Gly Val Gly Pro

                335                 340                 345

Met Asn Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Ala Gly Tyr

                350                 355                 360

Ala Asp Phe Asp Arg Gly Thr Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys

                365                 370                 375

Ser Trp Asn Thr Ala Pro Ala Glu Val Lys Gln Gly Trp Pro

                380                 385             389

Claims (3)

1.一种来源于吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)CCTCC M203062的谷氨酰胺转胺酶酶原，其基因核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

2.如权利要求1所述的谷氨酰胺转胺酶酶原，其氨基酸组成为SEQ IDNO：2。

3.如权利要求1所述的谷氨酰胺转胺酶酶原的表达，其特征是：

(1)吸水链霉菌的谷氨酰胺转胺酶基因的获得

通过NCBI基因库查到平板链霉菌(Streptomyces platensis)，茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)，肉桂链霉菌(Streptomyces cinnamoneus)，弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)的谷氨酰胺转胺酶完整氨基酸序列，根据文献报道结果找到酶原起始序列和终止序列，然后通过比对相应碱基序列；另一方面在纯化获得来源于天然吸水链霉菌的酶原之后，通过N端氨基酸测序；确定PCR的引物如下：

P1：5’-GCTAGCGGTGACGACGAGG-3’

P2：5’-TTACGGCCAGCCCTGCTTTAC-3’

利用上述引物，以提取的吸水链霉菌CCTCC M203062总DNA为模板，PCR反应在50μL体系中进行，反应条件为在95℃变性5min后开始循环，然后95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，共35个循环后，再于72℃延伸10min；通过PCR扩增得到1170bp的DNA片段，编码389个氨基酸；测序结果在NCBI利用Blast分析，结果显示该基因序列与其它链霉菌产谷氨酰胺转胺酶的基因序列同源性最高达92％，Blast RID：7A2RYJJS015；

(2)谷氨酰胺转胺酶酶原基因的克隆

将扩增得到的DNA利用上海生工UNIQ-10柱式胶回收试剂盒回收纯化，将纯化产物4.5μL，pMD-18T载体0.5μL，按照试剂盒操作，16℃连接12小时，连接产物热击转化大肠杆菌JM109，操作如下：

1)将JM109感受态细胞从-80℃冰箱取出迅速放在冰上，溶化5min；

2)10μL连接产物加入至100μL JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟；

3)42℃加热90秒钟后，再在冰中放置3分钟；

4)加入950μL37℃预热的SOC培养基，37℃振荡培养90分钟；

5)在含有0.04mg/mL 5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷、0.024mg/mL异丙基-β-D-硫代半乳糖苷、0.1mg/mL氨苄青霉素的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落；

6)16h后，挑选白色菌落，  挑出的菌落接种于含有0.1mg/mL氨苄青霉素的LB培养基，37℃培养过夜，利用上海生工UNIQ-10柱式质粒抽提试剂盒操作得到含有目的基因的质粒pMD/pro-MTG；

(3)吸水链霉菌谷氨酰胺转胺酶的表达

利用限制性内切酶NcoI和BamHI从pMD/pro-MTG双酶切切下，将表达载体pET20b也同样双酶切，然后利用T4DNA连接酶进行连接反应，将连接产物先转化大肠杆菌JM109，得到正确的表达质粒pET/pro-MTG后再将表达质粒转化BL21(DE3)或Rosetta(DE3)pLysS，得到含有表达质粒pET/pro-MTG的工程菌命名为BL21/pET-MTG或Rosetta/pET-MTG；

诱导表达按下面操作进行：

1)将甘油管保存的BL21/pET-MTG或Rosetta/pET-MTG菌液0.1ml快速加入到装有25ml含有0.1mg/mLAmp的LB培养基的50ml三角瓶中，200rpm种子培养过夜；

2)按3％的接种量将种子分别接种到三个装有50ml含有0.1mg/mL Amp的LB培养基的250ml三角瓶中，37℃，200rpm培养4h；

3)加入终浓度为0.4mM IPTG，降低温度至24℃诱导4h；

4)取3mL步骤3)处理后的发酵液12000rpm离心2min，发酵液上清几乎没有酶活；离心沉淀用pH8.0的1.0mL Tris-HCl缓冲液悬浮，悬浮液经过超声破壁，12000rpm离心5min，离心上清有可溶性的酶原存在，经过胰蛋白酶100U/ml37℃处理10分钟后，最高酶活达到0.14U/mL；

5)对发酵上清液、破壁沉淀、破壁上清液，分别进行蛋白电泳SDS-PAGE表达产物的分布：胞外几乎没有可溶性谷氨酰胺转胺酶酶原，胞内有少量可溶性谷氨酰胺转胺酶酶原，大部分为不可溶的包涵体。

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