CN109609531A - 一种重组表达活性谷氨酰胺转氨酶及其解脂耶氏酵母菌株的构建方法 - Google Patents

一种重组表达活性谷氨酰胺转氨酶及其解脂耶氏酵母菌株的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其是一种重组表达活性谷氨酰胺转氨酶的制备方法，包括以下步骤；步骤一、在pinA1297质粒上插入胰蛋白酶序列和谷氨酰胺转氨酶酶原序列；步骤二、将步骤一获得的质粒转化解脂耶氏酵母菌株Yarrowia lipolytica polh中；步骤三、将步骤二获得的菌株在YPD培养基中培养、在PPB培养基中发酵，获得谷氨酰胺转氨酶；步骤四、将获取的胰蛋白酶和谷氨酰胺转氨酶酶原分别表达并分泌到细胞外，在胞外蛋白酶切除谷氨酰胺转氨酶酶原的酶原区，获得有活性的谷氨酰胺转氨酶，本发明发酵中不需诱导或添加抗生素，能用于食品和药品的生产，易于培养，发酵方法简单，周期短，重组表达谷氨酰胺转氨酶，不用体外活化，简化谷氨酰胺转氨酶生产工艺，降低生产成本。

Description

一种重组表达活性谷氨酰胺转氨酶及其解脂耶氏酵母菌株的 构建方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种重组表达活性谷氨酰胺转氨酶及其解脂耶氏酵母菌株的构建方法。
背景技术
谷氨酰胺转氨酶又称转谷氨酰胺酶（TG酶）是由331个氨基组成的分子量约38000的具有活性中心的单体蛋白质，其可催化蛋白质多肽发生分子内和分子间发生共价交联，从而改善蛋白质的结构和功能，对蛋白质的性质如：发泡性，乳化性，乳化稳定性，热稳定性、保水性和凝胶能力等效果显著，进而改善食品的风味、口感、质地和外观等；
目前人们对解脂酵母的研究愈来愈多，解脂酵母作为一种非常规的安全酵母被更多的拿来生产，解脂酵母在生产柠檬酸，脂肪酸以及番茄红素上都有巨大的优势，由于解脂酵母中的油滴比酿酒酵母大，所以可以更好的容纳一些疏水产品，这些疏水产品储存在油滴中减轻对细胞的毒害作用，解脂酵母可以将很多物质作为自己的碳源，并且在各种碳源中都能获得较大的生物量；
现有的在解脂耶氏酵母中表达重组谷氨酰胺转氨酶的方法是先表达谷氨酰胺转氨酶酶原，然后外加蛋白酶，进行活化，由于先表达谷氨酰胺转氨酶酶原，再外加蛋白酶活化，相比较直接表达谷氨酰胺转氨酶，工艺更复杂，增加了原料成本、设备成本和分离成本。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组表达活性谷氨酰胺转氨酶及其解脂耶氏酵母菌株的构建方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
设计一种重组表达活性谷氨酰胺转氨酶的制备方法，包括以下步骤；
步骤一、在pinA1297质粒上插入胰蛋白酶序列和谷氨酰胺转氨酶酶原序列，获得pinA1297/trypsin-proTGase质粒；
步骤二、将步骤一获得的质粒转化解脂耶氏酵母菌株Yarrowia lipolytica polh中，获得Y. lipolytica Po1h/trypsin-proTGase菌株；
步骤三、将步骤二获得的菌株在YPD培养基中培养、在PPB培养基中发酵，获得谷氨酰胺转氨酶；
步骤四、将获取的胰蛋白酶和谷氨酰胺转氨酶酶原分别表达并分泌到细胞外，在胞外蛋白酶切除谷氨酰胺转氨酶酶原的酶原区，获得有活性的谷氨酰胺转氨酶。
优选的，步骤三中，发酵方法为：
S1、挑取保藏的菌株菌落于25mlYPD培养基中；
S2、在28℃，220rpm的速度下摇动，进行培养20-24h；
S3、转接到25ml的PPB培养基中，接种量是10-15%，在28℃，220rpm的速度下摇动，发酵110-120h。
优选的，步骤三中，所述YPD培养基由6.7g YNB，20g葡萄糖，121℃灭菌15min生成。
优选的，步骤三中，所述PPB培养基由15g甘油，20g酵母粉，2.64g氯化铵，0.32g磷酸二氢钾，无水硫酸镁0.25g，19.45ml 200mM磷酸二氢钠，0.55ml 100mM柠檬酸，用NaOH调pH值为8.0，121℃灭菌15min生成。
一种重组表达活性谷氨酰胺转氨酶的解脂耶氏酵母菌株的构建方法，载体pcr扩增条件：98℃，3min；98℃，30s；57℃，30s；72℃，6min30；72℃，10min循环34次；
载体pcr体系：takara primestar HS premix 25μl， primer3 1μl，primer4 1μl，模板是前期构建的pinA1297-hpro-mtg质粒，0.1μl，双蒸水22.9μl；
片段pcr扩增条件：98℃，3min；98℃，30s；57℃，30s；72℃，1min5s；72℃，10min循环34次；
片段pcr体系：takara primestar HS premix 25μl，primer1 1μl，primer2 1μl，模板合成的基因序列xprpre-sprT，0.1μl，双蒸水22.9μl，pcr产物的回收采用胶回收试剂盒，回收后测定载体和片段的浓度分别为a ng/μl和b ng/μl；
使用一步克隆试剂盒进行载体与片段的连接，连接体系；载体使用量(μl)=0.02*载体序列长度/a，片段使用量(μl)=0.04*载体序列长度/b，5*CE buffer 2μl，Exnase II 1μl，加ddH2O至总体系为10μl；
连接反应条件：37℃连接30min，转化E.coli JM109菌株，用卡那霉素固体培养皿筛选转化子，挑取阳性菌落，过夜培养，提取质粒，测序正确后，先用NotⅠ用醋酸锂转化法将质粒转化Yarrowia lipolytica Polh菌株，使用YNB固体培养基筛选转化子。
优选的，所述YNB固体培养基由6.7g YNB，20g葡萄糖，121℃灭菌15min生成。
本发明提出的一种重组表达活性谷氨酰胺转氨酶及其解脂耶氏酵母菌株的构建方法，有益效果在于：
1、本发明，发酵中不需诱导或添加抗生素，能用于食品和药品的生产，易于培养，发酵方法简单，周期短，高密度发酵，分泌能力强，利于大量表达谷氨酰胺转氨酶；
2、本发明重组表达谷氨酰胺转氨酶，不用体外活化，简化谷氨酰胺转氨酶生产工艺，降低生产成本。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1，一种重组表达活性谷氨酰胺转氨酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤；
步骤一、在pinA1297质粒上插入胰蛋白酶序列和谷氨酰胺转氨酶酶原序列，获得pinA1297/trypsin-proTGase质粒；
步骤二、将步骤一获得的质粒转化解脂耶氏酵母菌株Yarrowia lipolytica polh中，获得Y. lipolytica Po1h/trypsin-proTGase菌株；
步骤三、将步骤二获得的菌株在YPD培养基中培养、在PPB培养基中发酵，获得谷氨酰胺转氨酶；
发酵方法为：
S1、挑取保藏的菌株菌落于25mlYPD培养基中；
S2、在28℃，220rpm的速度下摇动，进行培养24h；
S3、转接到25ml的PPB培养基中，接种量是10%，在28℃，220rpm的速度下摇动，发酵120h；
所述YPD培养基由6.7g YNB，20g葡萄糖，121℃灭菌15min生成；
所述PPB培养基由15g甘油，20g酵母粉，2.64g氯化铵，0.32g磷酸二氢钾，无水硫酸镁0.25g，19.45ml 200mM磷酸二氢钠，0.55ml 100mM柠檬酸，用NaOH调pH值为8.0，121℃灭菌15min生成；
步骤四、将获取的胰蛋白酶和谷氨酰胺转氨酶酶原分别表达并分泌到细胞外，在胞外蛋白酶切除谷氨酰胺转氨酶酶原的酶原区，获得有活性的谷氨酰胺转氨酶。
一种重组表达活性谷氨酰胺转氨酶的解脂耶氏酵母菌株的构建方法，载体pcr扩增条件：98℃，3min；98℃，30s；57℃，30s；72℃，6min30；72℃，10min循环34次；
载体pcr体系：takara primestar HS premix 25μl， primer3 1μl，primer4 1μl，模板是前期构建的pinA1297-hpro-mtg质粒，0.1μl，双蒸水22.9μl；
片段pcr扩增条件：98℃，3min；98℃，30s；57℃，30s；72℃，1min5s；72℃，10min循环34次；
片段pcr体系：takara primestar HS premix 25μl，primer1 1μl，primer2 1μl，模板合成的基因序列xprpre-sprT，0.1μl，双蒸水22.9μl，pcr产物的回收采用胶回收试剂盒，回收后测定载体和片段的浓度分别为a ng/μl和b ng/μl；
使用一步克隆试剂盒进行载体与片段的连接，连接体系；载体使用量(μl)=0.02*载体序列长度/a，片段使用量(μl)=0.04*载体序列长度/b，5*CE buffer 2μl，Exnase II 1μl，加ddH2O至总体系为10μl；
连接反应条件：37℃连接30min，转化E.coli JM109菌株，用卡那霉素固体培养皿筛选转化子，挑取阳性菌落，过夜培养，提取质粒，测序正确后，先用NotⅠ用醋酸锂转化法将质粒转化Yarrowia lipolytica Polh菌株，使用YNB固体培养基筛选转化子，所述YNB固体培养基由6.7g YNB，20g葡萄糖，121℃灭菌15min生成。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种重组表达活性谷氨酰胺转氨酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤；
步骤一、在pinA1297质粒上插入胰蛋白酶序列和谷氨酰胺转氨酶酶原序列，获得pinA1297/trypsin-proTGase质粒；
步骤二、将步骤一获得的质粒转化解脂耶氏酵母菌株Yarrowia lipolytica polh中，获得Y. lipolytica Po1h/trypsin-proTGase菌株；
步骤三、将步骤二获得的菌株在YPD培养基中培养、在PPB培养基中发酵，获得谷氨酰胺转氨酶；
步骤四、将获取的胰蛋白酶和谷氨酰胺转氨酶酶原分别表达并分泌到细胞外，在胞外蛋白酶切除谷氨酰胺转氨酶酶原的酶原区，获得有活性的谷氨酰胺转氨酶。
2.根据权利要求1所述的重组表达活性谷氨酰胺转氨酶的制备方法，其特征在于：步骤三中，发酵方法为：
S1、挑取保藏的菌株菌落于25mlYPD培养基中；
S2、在28℃，220rpm的速度下摇动，进行培养20-24h；
S3、转接到25ml的PPB培养基中，接种量是10-15%，在28℃，220rpm的速度下摇动，发酵110-120h。
3.根据权利要求1所述的重组表达活性谷氨酰胺转氨酶的制备方法，其特征在于：步骤三中，所述YPD培养基由6.7g YNB，20g葡萄糖，121℃灭菌15min生成。
4.根据权利要求1所述的重组表达活性谷氨酰胺转氨酶的制备方法，其特征在于：步骤三中，所述PPB培养基由15g甘油，20g酵母粉，2.64g氯化铵，0.32g磷酸二氢钾，无水硫酸镁0.25g，19.45ml 200mM磷酸二氢钠，0.55ml 100mM柠檬酸，用NaOH调pH值为8.0，121℃灭菌15min生成。
5.一种重组表达活性谷氨酰胺转氨酶的解脂耶氏酵母菌株的构建方法，其特征在于：载体pcr扩增条件：98℃，3min；98℃，30s；57℃，30s；72℃，6min30；72℃，10min循环34次；
载体pcr体系：takara primestar HS premix 25μl， primer3 1μl，primer4 1μl，模板是前期构建的pinA1297-hpro-mtg质粒，0.1μl，双蒸水22.9μl；
片段pcr扩增条件：98℃，3min；98℃，30s；57℃，30s；72℃，1min5s；72℃，10min循环34次；
片段pcr体系：takara primestar HS premix 25μl，primer1 1μl，primer2 1μl，模板合成的基因序列xprpre-sprT，0.1μl，双蒸水22.9μl，pcr产物的回收采用胶回收试剂盒，回收后测定载体和片段的浓度分别为a ng/μl和b ng/μl；
使用一步克隆试剂盒进行载体与片段的连接，连接体系；载体使用量(μl)=0.02*载体序列长度/a，片段使用量(μl)=0.04*载体序列长度/b，5*CE buffer 2μl，Exnase II 1μl，加ddH2O至总体系为10μl；
连接反应条件：37℃连接30min，转化E.coli JM109菌株，用卡那霉素固体培养皿筛选转化子，挑取阳性菌落，过夜培养，提取质粒，测序正确后，先用NotⅠ用醋酸锂转化法将质粒转化Yarrowia lipolytica Polh菌株，使用YNB固体培养基筛选转化子。
6.根据权利要求5所述的一种重组表达活性谷氨酰胺转氨酶的解脂耶氏酵母菌株的构建方法，其特征在于：所述YNB固体培养基由6.7g YNB，20g葡萄糖，121℃灭菌15min生成。
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