CN101298604B - 高温耐酸性α-淀粉酶的突变株及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高温耐酸性α-淀粉酶的突变株及其构建方法，是将地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因经突变后(Leu134→Arg和Ser320→Ala)获得的高温耐酸性α-淀粉酶基因，通过构建打靶载体，利用同源重组的方法，将其整合到出发菌株地衣芽孢杆菌的基因组DNA中，得到了地衣芽孢杆菌突变株，实现高温耐酸性α-淀粉酶的同源高效表达。本发明中的突变株所产α-淀粉酶在本身耐高温的基础上，酸稳定性也有了明显地提高，为我国酒精、淀粉糖化等淀粉深加工行业提供了更好的工艺条件，降低了成本，节省了能源和工业用粮，满足了一些在酸性条件下进行淀粉原料液化工艺的要求。

Description

高温耐酸性α-淀粉酶的突变株及其构建方法

技术领域

本发明涉及生物工程领域，尤其是一种高温耐酸性α-淀粉酶的突变株及其构建方法。

背景技术

α-淀粉酶(α-1，4-glucan-glucanhydrolasa EC 3.2.1.1)又称为液化型淀粉酶，它能从淀粉分子的内部任意切开α-1，4键，产生分子量比较小的麦芽糖糊精。淀粉在α-淀粉酶的作用下，分子迅速降解，粘度下降，即完成液化。α-淀粉酶具有相当大的商业价值，广泛应用于淀粉深加工工业、酒精工业、啤酒工业、柠檬酸工业、味精及淀粉糖化工业、制药工业及纺织业。α-淀粉酶可由微生物发酵产生，也可由植物、动物提取。目前工业生产上大都以微生物发酵法大规模生产α-淀粉酶。枯草杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽抱杆菌、米曲霉、黑曲霉等都是有实用价值的α-淀粉酶产生菌，其中地衣芽孢杆菌生产的α-淀粉酶因具有热稳定性而被优选使用。耐高温α-淀粉酶由于具有相当高的热稳定性，因此被广泛应用于啤酒、酒精、制药及食品等行业，是目前工业上用途最广泛的一种酶。

但是，近年来随着淀粉原料深加工行业的发展，要求酶制剂行业需要不断更新和完善酶的种类以满足工业生产的要求。对于淀粉糖化工业，目前工业上常采用双酶法水解淀粉制糖，自然pH为4.0-5.0的淀粉浆需经液化和糖化两个过程处理，即先加淀粉酶液化，再加糖化酶糖化来生产葡萄糖，但是由于目前市售的淀粉酶最适pH为6.5-9.0，而糖化酶的最适pH为4.5左右，因此淀粉浆需先加碱调整pH进行液化，液化液还需再加酸调整pH才能用于糖化，反复调节pH不仅使工艺变得繁琐增加生产成本，引入外源离子，加重离交负担，而且调节不当还会产生大量的副产物，使葡萄糖收率降低。在我国传统白酒生产中，随着发酵的进行，酸度不断增加，pH下降，使酶的活性降低，淀粉水解不彻底，原料大约有12％不能被利用；而在酒精行业中，由于废水的回填，使得原料液pH值降为4.0-5.0，也不适合α-淀粉酶的作用。味精行业对淀粉水解糖液的质量要求十分严格，加工工艺的pH一般为4.6-4.8。为了给淀粉原料的深加工提供更好的条件，开创新的酶法工艺，提高收得率、降低消耗、提高产品质量、增加效益，特别对于节约工业用粮，满足一些在酸性条件下进行淀粉原料液化工艺的要求，开发一种耐酸的高温α-淀粉酶就势在必行。

早在1963年，日本的研究者Yasuji Minoda等人就发现可以用真菌生产耐酸性α淀粉酶，以后欧洲、美国、韩国、中国等国家都对耐酸性α-淀粉酶进行了研究，其中得到的产耐酸性α-淀粉酶的微生物大多为芽孢杆菌和曲霉。1994年，日本宫崎大学的高崎幸义教授从土壤中分离到一株地衣芽孢杆菌，所产的α-淀粉酶最适pH为5.0，最适温度为90℃。另外，日本科学家今中忠行选育出一株耐酸性的α-淀粉酶产生菌Pyrococcussp.，该菌株所产的α-淀粉酶最适pH为5.0，在pH5.0时最适反应温度为100℃。

运用基因工程手段，构建耐高温耐酸性α-淀粉酶生产菌，是目前各国研究者最常用的一种育种方法。欧洲的研究者采用基因技术改造Bacillus licheniformis来生产耐热性的耐酸性α-淀粉酶。在原有天然菌株的DNA序列中将N188位的天冬氨酸残基用其它任何一种氨基酸取代，并使在N15或N197位的蛋氨酸残基缺失，得到的高产菌株所生产的α-淀粉酶适用的液化pH值可以降低到5.0，且在100-110℃时活性不变。

在我国，20世纪70年代时已有人用Aspergillus niger进行酸性α-淀粉酶的发酵研究，但未取得进展。90年代时，中科院微生物研究所研究了嗜热真菌Thermomyceslanuginosus对α-淀粉酶的生产，该酶的最适温度和pH分别为65℃和5.0，其耐热性较差。目前商品化应用的真菌Aspergillus oryzae和Aspergillus awamori的α-淀粉酶pH范围为5-6，但不耐高温。江南大学从淀粉加工厂的酸性土壤中筛选到的Bacillusstearothermopilius，能够产生两种酸性α-淀粉酶，其最适pH分别为4.5和5.0，最适温度为60℃，可以应用于一定条件下的酒糟利用和处理。

可以看出，目前国内酸性α-淀粉酶的最适温度都低于70℃，由于超过70℃进行水解反应时酶活就会大量损失，因此不能适应我国酒精、淀粉糖化等淀粉深加工行业工艺的要求。为了给淀粉原料的深加工提供更好的条件，需要开创新的酶法工艺；特别是为了节约工业用粮，就需要运用基因工程手段，获得既耐酸又耐高温的α-淀粉酶的高效表达，以显著提高经济效益和社会效益。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种高温耐酸性α-淀粉酶的突变株及其构建方法。本发明是将经过体外定点突变改造后获得的耐高温及耐酸同时兼顾的α-淀粉酶突变基因经过与出发菌株地衣芽孢杆菌的基因组DNA同源重组后整合到其基因组上，使高温耐酸性α-淀粉酶获得了同源高效表达。

本发明采取的技术方案是：

一种高温耐酸性α-淀粉酶的突变株，是将出发菌株地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因经体外Leu134→Arg和Ser320→Ala突变后所获得的高温耐酸性α-淀粉酶基因取代原始耐高温α-淀粉酶基因后得到的突变株。

而且，所述的出发菌株地衣芽孢杆菌在中国工业微生物菌种保藏管理中心CICC保藏，保藏号：10181。

一种高温耐酸性α-淀粉酶的突变株的构建方法，其构建方法包括如下步骤：

(1).构建打靶载体pUC-amy1-amy2-Km^r：以地衣芽孢杆菌基因组DNA为模板，各设计两对特异的PCR引物，扩增耐高温α-淀粉酶的上游、下游同源性核苷酸片段，得到两个同源性核苷酸片段，将上游片段、卡那霉素抗性基因、下游片段定向连接入载体中，构建得到打靶载体pUC-amy1-amy2-Km^r；

(2).构建打靶载体pUC-amyd：以含高温耐酸性α-淀粉酶基因的重组质粒为模板，设计特异的PCR引物，扩增高温耐酸性α-淀粉酶基因，将该片段连入载体中，构建得到打靶载体pUC-amyd；

(3).获得地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因缺失株：利用打靶载体pUC-amy1-amy2-Km^r转化地衣芽孢杆菌原始出发菌株，同源重组其宿主细胞基因组DNA，卡那抗性基因取代基因组DNA中部分耐高温α-淀粉酶基因，获得地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因缺失株；

(4).获得高温耐酸性α-淀粉酶基因突变株：利用打靶载体pUC-amyd转化地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因缺失株，同源重组其宿主细胞基因组DNA，高温耐酸性α-淀粉酶基因带有两个突变位点的部分基因取代缺失株基因组中卡那抗性基因，获得地衣芽孢杆菌高温耐酸性α-淀粉酶基因突变株。

而且，所述步骤(1)的耐高温α-淀粉酶的上游、下游同源性核苷酸片段分别为372bp和350bp。

而且，所述步骤(1)、(2)中连接基因片段的载体为pUC19；所述步骤(3)、(4)中卡那抗性基因来自于枯草芽孢杆菌pWB980质粒，大小为1112bp；所述步骤(2)中含高温耐酸性α-淀粉酶基因的重组质粒为pBEC。

而且，所述步骤(3)的转化宿主细胞为地衣芽孢杆菌细胞；所述步骤(4)的转化宿主细胞为地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因缺失株细胞。

本发明的优点和积极效果是：

本发明利用同源重组技术，将经过体外定点突变后获得的高温耐酸性α-淀粉酶基因整合到出发菌株地衣芽孢杆菌基因组DNA上，取代原有的耐高温α-淀粉酶基因，获得了耐高温及耐酸同时兼顾的α-淀粉酶的高效表达。该酶最适温度为95℃，最适pH为4.5，在温度40℃-95℃，pH4.0-6.5之间时，酶活较稳定，说明该酶具有良好的热稳定性和酸稳定性。本发明开创了新的酶法工艺，节约了工业用粮，给淀粉原料的深加工提供了更好的条件，更适用于工业化的生产和应用，不仅具有重要的经济效益，也具有明显的社会效益。

附图说明

图1是本发明amy1，amy2，Km^r的PCR扩增电泳图；

图2是本发明打靶载体pUC-amy1-amy2-Km^r构建示意图；

图3是本发明amyd的PCR扩增电泳图；

图4是本发明打靶载体pUC-amyd构建示意图；

图5是本发明突变α-淀粉酶对照原始α-淀粉酶最适pH示意图；

图6是本发明突变α-淀粉酶对照原始α-淀粉酶pH稳定性示意图；

图7是本发明突变α-淀粉酶对照原始α-淀粉酶DE值变化曲线示意图；

图8是本发明突变α-淀粉酶对照原始α-淀粉酶透光率变化曲线示意图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

本发明将已经获得的高温耐酸性α-淀粉酶(α-淀粉酶的耐酸性改造及在枯草芽孢杆菌中的分泌表达.食品与发酵工业，2005，31(10)：33-36.耐酸耐高温的α-淀粉酶及其制备方法，专利申请号：200510013865.2)，为了提高从地衣芽孢杆菌(中国工业微生物菌种保藏管理中心，CICC，保藏号，10181)中分离出的耐高温α-淀粉酶的耐酸稳定性，将该基因成熟肽134位的L-亮氨酸变为L-精氨酸、其320位的L-丝氨酸变为L-丙氨酸所获得的突变基因；将该基因利用同源重组的方法整合到出发菌株地衣芽孢杆菌基因组DNA中，取代原有的耐高温α-淀粉酶基因，实现高温耐酸性α-淀粉酶的同源高效表达。该α-淀粉酶突变株产酶活力高，在保持其热稳定性的同时，具有了良好的酸稳定性，适用于工业化的生产和应用。

本发明设计了3对上下游引物，按照图1所示以pUC19为载体，将耐高温α-淀粉酶基因的上游372bp、下游350bp的片段与卡那霉素抗性基因进行连接，构建打靶载体pUC-amy1-amy2-Km^r，与出发菌株地衣芽孢杆菌进行同源重组，筛选卡那霉素抗性、氨苄青霉素敏感的地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因缺失株。按照图2所示以pUC19为载体，与高温耐酸性α-淀粉酶基因进行连接，构建打靶载体pUC-amyd，与获得的基因敲除突变株进行同源重组，筛选卡那霉素及氨苄青霉素敏感的地衣芽孢杆菌高温耐酸性α-淀粉酶基因突变株。本发明获得的突变株所产的α-淀粉酶在pH4.5时，具有良好的酸稳定性。

一、打靶载体pUC-amy1-amy2-Km^r的构建

从地衣芽孢杆菌(中国工业微生物菌种保藏管理中心，CICC，保藏号：10181)中分离出耐高温α-淀粉酶基因，设计如下引物(引物委托上海英骏生物技术有限公司合成)：

上游引物F1：5’-CCCAAGCTTGCAAATCTTAATGGGACGCT-3’

下游引物R1：5’-CGCGGATCCGTCAGCGGGATCGACTTCAA-3’

上游引物F2：5’-CGGGGTACCACGGGACGAAAGGAGACTC-3’

下游引物R2：5’-CCGGAATTCTCTTTGAACATAAATTGAAACCG-3’

上游引物F3：5’-CGCGGATCCGCCGATGAAGATGGATTTTC-3’

下游引物R3：5’-CGGGGTACCGCACACCCTTTATTCCGTTA-3’

1.PCR扩增

(1).PCR1

按以下次序，将各成分在灭菌薄壁离心管内混合，

反应组分                    加入量

10×Probest buffer          5μL

dNTP(2.5mol/L)              4μL

上游引物F1(10pmol/μL)      4μL

下游引物R1(10pmol/μL)      4μL

DNA模板                     1μL

Probest高保真DNA聚合酶      0.5μL

ddH₂O                       31.5μL

总体积                      50μL

扩增条件：95℃ 3min，1个循环；94℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 60s，30个循环；72℃10min，1个循环。

其中上游引物F1 5’端含HindIII酶切位点，下游引物R1 5’端含BamHI酶切位点。

以地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因为模板，引物F1和R1为引物，在上述体系和条件下进行PCR1扩增，得到该基因上游372bp的DNA片段amy1。

(2).PCR2

按以下次序，将各成分在灭菌薄壁离心管内混合，

反应组分              加入量

10×Probest buffer          5μL

dNTP(2.5mol/L)              4μL

上游引物F2(10pmol/μL)      4μL

下游引物R2(10pmol/μL)      4μL

DNA模板                     1μL

Probest高保真DNA聚合酶      0.5μL

ddH₂O                       31.5μL

总体积                      50μL

扩增条件：95℃ 3min，1个循环；94℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 60s，30个循环；72℃10min，1个循环。

其中上游引物F2 5’端含KpnI酶切位点，下游引物R2 5’端含EcoRI酶切位点。

以地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因为模板，引物F2和R2为引物，在上述体系和条件下进行PCR2扩增，得到该基因下游350bp的DNA片段amy2。

(3).PCR3

按以下次序，将各成分在灭菌薄壁离心管内混合，

反应组分                  加入量

10×Probest buffer        5μL

dNTP(2.5mol/L)            4μL

上游引物F3(10pmol/μL)    4μL

下游引物R3(10pmol/μL)    4μL

DNA模板                   1μL

Probest高保真DNA聚合酶    0.5μL

ddH₂O                     31.5μL

总体积                    50μL

扩增条件：95℃ 3min，1个循环；94℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 60s，30个循环；72℃20min，1个循环。

其中上游引物F3 5’端含BamHI酶切位点，下游引物R3 5’端含KpnI酶切位点。

以枯草芽孢杆菌pWB980质粒为模板，引物F3和R3为引物，在上述体系和条件下进行PCR3扩增，得到编码卡那抗性基因1112bp的DNA片段Km^r。

将所得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，在约370bp，350bp，1112bp处出现特异性条带，结果如图1所示，其大小与目的基因片段amy1，amy2，Km^r完全吻合。

2.构建打靶载体pUC-amy1-amy2-Km^r

如图2，构建过程如下：

(1).将PCR扩增得到的目的基因amy1分别用HindIII和BamHI双酶切，酶切产物经DNA纯化试剂盒(该试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限公司)纯化。

(2).将pUC19质粒(该质粒购自TAKARA公司)经HindIII和BamHI双酶切、纯化后与第(1)步的纯化产物通过连接试剂盒(该试剂盒购自TAKARA公司)在12℃的条件下连接12h，得到重组质粒pUC-amy1。

(3).将10μL的pUC-amy1电转化40μL大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布在含氨苄青霉素(100μg/mL)的IPTG、X-gal的LA平板上，从蓝白选择平板上挑选验证正确的的阳性转化子pUC-amy1，经KpnI和EcoRI双酶切、切胶纯化后回收。

(4).将amy2经KpnI和EcoRI双酶切、纯化后与第(3)步的回收产物通过连接试剂盒在12℃的条件下连接12h，得到重组质粒pUC-amy1-amy2。

(5).将10μL的pUC-amy1-amy2电转化40μL大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布在含氨苄青霉素(100μg/mL)的IPTG、X-gal的LA平板上，从蓝白选择平板上挑选验证正确的阳性转化子pUC-amy1-amy2，经BamHI和KpnI双酶切、切胶纯化后回收。

(6).将Km^r经BamHI和KpnI双酶切、纯化后与第(5)步的回收产物通过连接试剂盒在12℃的条件下连接12h，得到重组质粒pUC-amy1-amy2-Km^r。

(7).将10μL的pUC-amy1-amy2-Km^r电转化40μL大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布在含氨苄青霉素(100μg/mL)的IPTG、X-gal的LA平板上，从蓝白选择平板上挑选验证正确的阳性转化子pUC-amy1-amy2-Km^r，得到打靶载体pUC-amy1-amy2-Km^r。

二、打靶载体pUC-amyd的构建

1.PCR扩增

按以下次序，将各成分在灭菌薄壁离心管内混合，

反应组分                  加入量

10×Probest buffer        5μL

dNTP(2.5mol/L)            4μL

上游引物F1(10pmol/μL)    4μL

下游引物R2(10pmol/μL)    4μL

DNA模板                   1μL

Probest高保真DNA聚合酶    0.5μL

ddH₂O                     31.5μL

总体积                    50μL

扩增条件：95℃ 3min，1个循环；94℃ 30s，63℃ 30s，72℃ 60s，30个循环；72℃10min，1个循环。

其中上游引物F1 5’端含HindIII酶切位点，下游引物R2 5’端含EcoRI酶切位点。

以地衣芽孢杆菌高温耐酸性α-淀粉酶基因为模板，引物F1和R1为引物，在上述体系和条件下进行PCR扩增，得到该基因1449bp的DNA片段amyd。

将所得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，在1500bp处出现特异性条带，结果如图3所示，其大小与目的基因片段amyd完全吻合。

2.构建打靶载体pUC-amyd

如图4，构建过程如下：

(1).将PCR扩增得到的目的基因amyd份别用HindIII和EcoRI双酶切，酶切产物经DNA纯化试剂盒纯化。

(2).将pUC19质粒经HindIII和EcoRI双酶切、纯化后与第(1)步的纯化产物通过连接试剂盒在12℃的条件下连接12h，得到重组质粒pUC-amyd。

(3).将10μL的pUC-amyd电转化40μL大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布在含氨苄青霉素(100μg/mL)的IPTG、X-gal的LA平板上，从蓝白选择平板上挑选验证正确的阳性转化子pUC-amyd，得到打靶载体pUC-amyd。

三、利用打靶载体pUC-amy1-amy2-Km^r同源重组地衣芽孢杆菌，获得地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因缺失株

将出发菌株地衣芽孢杆菌单菌落接种到30mL PA液体培养基/250mL三角瓶(PA培养基配方：100g去皮马铃薯加500ml水煮沸30min，双层纱布过滤；1g酵母粉；10g蛋白胨，pH 7.2，H₂O 1000mL)37℃，200r/min培养72h。离心收集芽孢。将10⁷个芽孢接种到25mLNBSG-X生长培养基/250mL三角瓶(NBSG-X培养基配方：K₂HPO₄ 56.0g，KH₂PO₄ 24.0g，(NH₄)₂SO₄ 2.0g，柠檬酸三钠6.0g，MgSO₄·7H₂O 1.2g，FeCl₃·6H₂O 0.04g，MnSO₄·H₂O 0.0025g，甘油5.0g，营养肉汤8.0g，pH 8.0，H₂O 1000mL)37℃，往复式摇床，振幅5cm，100次/min，培养18h。将0.1mL培养液、0.1mL(100μg)质粒pUC-amy1-amy2-Km^r与0.8mLTM培养基(TM培养基配方：K₂HPO₄ 14.0g，KH₂PO₄ 6.0g，(NH₄)₂SO₄2.0g，柠檬酸三钠1.0g，MgSO₄·7H₂O 1.0g，MnSO₄·H₂O 0.0125g，CaCl₂·2H₂O 0.30g，NaCl 11.7g，葡萄糖5.0g，H₂O 1000mL)混合，37℃，往复式摇床，振幅5cm，100次/min，培养3h。将转化液涂布于含卡那霉素(30μg/mL)的minimal 1琼脂平板上(minimal 1琼脂培养基配方：K₂HPO₄14.0g，KH₂PO₄6.0g，(NH₄)₂SO₄2.0g，柠檬酸三钠1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.20g，FeCl₃·6H₂O 0.04g，MnSO₄·H₂O 0.0025g，葡萄糖5.0g，酸水解酪蛋白1g，琼脂粉20g，H₂O 1000mL)。48h后挑取转化子，点接到含氨苄青霉素(100μg/mL)的minimal 1琼脂平板上，以在含氨苄青霉素(100μg/mL)的minimal 1琼脂平板上未长的转化子基因组DNA为模板，利用上游引物F3、下游引物R3，上游引物F1、下游引物R2分别进行PCR扩增，将所得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，在约1100bp，1800bp处出现特异性条带，即为阳性转化子。此转化子即为地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因缺失株。

四、利用打靶载体pUC-amyd同源重组地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因缺失株，获得高温耐酸性α-淀粉酶基因突变株

将地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因缺失株单菌落接种到30mL PA液体培养基/250mL三角瓶，37℃，200r/min培养72h。离心收集芽孢。将10⁷个芽孢接种到25mL NBSG-X生长培养基/250mL三角瓶，37℃，往复式摇床，振幅5cm，100次/min，培养18h。将0.1mL培养液、0.1mL(100μg)质粒pUC-amyd与0.8mL TM培养基混合，37℃，往复式摇床，振幅5cm，100次/min，培养3h。将转化液涂布于miniml 1琼脂平板上。48h后挑取转化子，点接到含氨苄青霉素(100μg/mL)、卡那霉素(30μg/mL)的minimal 1琼脂平板上，以在含氨苄青霉素(100μg/mL)、卡那霉素(30μg/mL)的minimal 1琼脂平板上未长的转化子基因组DNA为模板，上游引物F1、下游引物R2，进行PCR扩增，将所得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，在约1500bp处出现特异性条带，即为阳性转化子。将转化子该基因进行核苷酸序列测定进行比对，结果与高温耐酸性α-淀粉酶基因完全吻合的，即为高温耐酸性α-淀粉酶基因突变株。

五、突变株高温耐酸性α-淀粉酶的表达及纯化

在活化培养基(牛肉粉5.0g，NaCl 2.0g，酵母粉2.0g，蛋白胨10g，粗淀粉10g，葡萄糖50g(单消)，琼脂粉17g，H₂O 1000mL)上培养36h，挑取地衣芽孢杆菌突变株单菌落接种到50mL种子培养基/250mL三角瓶(种子培养基配方：牛肉粉1.50g，酵母粉1.50g，蛋白胨5.00g，磷酸二氢钾(无水)1.32g，磷酸氢二钾3.68g，葡萄糖1.00g，NaCl 3.00g，H₂O 1000mL)，37℃，200r/min培养16h。然后按2％接种量转接至50mL发酵培养基/250mL挡板三角瓶(豆饼粉26g，棉籽饼粉21g，磷酸氢二钾28.8g，磷酸二氢钾(无水)6.7g，柠檬酸三钠2.0g，玉米浆20g，(NH₄)₂SO₄5.0g，CaCl₂0.45g，乳糖10g(单消)，H₂O 1000mL)，42℃，300r/min培养96h。

将发酵液经离心后获得的上清液，先加入30％饱和度的硫酸铵盐析除去杂蛋白，再把饱和度加大到70％，沉淀目的蛋白，可取得较好的分离效果。用0.02mol/L Tris-HCl(pH7.0)缓冲液平衡DEAE-Sepharose Fast Flow(2.4cm×30cm)离子交换层析柱，将盐析脱盐后得到的活性组分用同样的缓冲液溶解，6000r/min离心10min，上样(2ml)后用同样的缓冲液先洗脱未吸附的蛋白，再用含0-1mol/L NaCl的0.02mol/L Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液梯度洗脱，分步收集。用0.02mol/L Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液平衡Sephadex G-75(1.6cm×80cm)凝胶层析柱，将离子交换得到的活性组分先用含0.15mol/L NaCl的0.02mol/L Tris-HCl(pH7.0)缓冲液平衡，样品6000r/min离心10min，上样(2ml)后用相同的缓冲液以0.5ml/min的速度洗脱，每管收集2.0ml，紫外检测器在线检测A280nm，收集活性峰，得到电泳纯的高温耐酸性α-淀粉酶。

产品性能测定：

1.α-淀粉酶活力的测定

酶活力单位定义：在70℃、pH6.0条件下，1min液化1mg可溶性淀粉成为糊精所需要的酶量，即为1个酶活力单位，以U/mL(U/g)表示。测定方法(QB/T 2306-97)如下：

1.酶液制备：用缓冲液配制成酶溶液，使其最终酶浓度控制在65U/mL-70U/mL范围之内。

2.测定：(1)吸取可溶性淀粉溶液(20g/L)20mL和磷酸缓冲液(pH＝6.0)5mL于试管中。在70℃恒温水浴中预热3min-5min。(2)加入稀释好的待测酶液1.00mL，立即计时，摇匀，准确反应5min。(3)立即吸取1.00mL反应液移入预先装有0.1mol/L HCl 0.5mL和5mL稀碘液的试管中摇匀。(4)以0.1mol/L HCl 0.5mL和5mL稀碘液的混合液作空白，于660nm波长下，用10mm比色皿迅速测定吸光度(A)。根据吸光度查表，求得测试酶液的浓度(C)。3.计算：X＝C×N×16.67式中：X-样品的酶活力U/mL(U/g)；C-测试的酶液浓度U/mL；N-样品的稀释倍数；16.67-换算常数。所得结果表示至整数。

将突变株及原始株发酵液，12000r/min离心10min去除细胞，测定上清液中的酶活(记为细胞外酶活)。

2.α-淀粉酶性质的研究

经硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephadex G-75凝胶层析分离纯化后，得到电泳纯的突变α-淀粉酶及原始α-淀粉酶，对其进行酶学性质的研究。

(1).温度对酶活力的影响

①纯酶最适反应温度的测定：在不同温度(30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃)，pH6.5的条件下测定重组酶纯化酶液的酶活，将最高活力定为100％。

②纯酶的热稳定性测定：将两种重组酶纯化酶液分别置于不同温度(40℃、60℃、80℃、100℃)pH6.5的条件下保温2h，每隔20min取出，各自测定其残余酶活力，以相应温度下未保温的酶液活力为100％，绘制温度稳定性曲线。

原始α-淀粉酶和突变α-淀粉酶反应的最适温度均为95℃，在70℃到100℃之间相对酶活为80％以上。两种酶在40到80℃保温120min，酶活基本没有损失，残余酶活保持在80％以上，100℃保温60min，原始α-淀粉酶和突变α-淀粉酶仍有61％、68％的残余酶活，具有一定的耐热性，说明原始α-淀粉酶经过体外定点突变后获得突变α-淀粉酶，耐高温的酶学特性并没有改变，。

(2).pH对酶活力的影响

①纯酶最适反应pH的测定：在不同pH值(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)70℃的下测定重组酶纯化酶液的酶活，将最高活力定为100％。

②纯酶的pH稳定性测定：将两种重组酶纯化酶液在不同pH(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)条件下在70℃保温60min，各自测定其残余酶活力，以相应pH下未保温的酶活力为100％，绘制pH稳定性曲线。

由图5可知，原始α-淀粉酶的最适pH为6.5，在pH6-7之间，相对酶活在90％以上，pH3.5以下完全失活。突变α-淀粉酶最适pH为4.5，在pH4时相对酶活仍达到80％。由图6可知，原始α-淀粉酶在pH 5.5-7.0范围内较稳定，残余酶活为80％以上，突变α-淀粉酶在pH 4.0-6.5范围内较稳定，残余酶活为80％以上，pH 4.5时残余酶活为90％，具有很好的耐酸稳定性。结果表明，原始α-淀粉酶经过体外定点突变后获得突变α-淀粉酶，耐高温的酶学特性并没有改变，而耐酸稳定性明显提高，获得了既耐酸又耐高温的新型α-淀粉酶。

(3).α-淀粉酶应用实验

配置浓度为20％的玉米淀粉溶液100mL，调节pH值至4.5，按30U/g淀粉加入重组酶，95℃保温90min后，加入盐酸调液化液pH至2.0，使酶钝化，终止酶的反应，并迅速冷却至常温，钝化后加入相应的氢氧化钠中和盐酸进行DE值测定。

①DE值的测定与计算：测定方法参照中华人民共和国行业标准QB1216-91中6.6.2直接滴定法。DE计算按下式进行： $\mathrm{DE}=\frac{1\×V_1\×10}{V_2\×m\×G}$

式中：DE-样品的DE值，％；V1-标定时消耗葡萄糖标准溶液(1g/L)；V2-测定时消耗试样的体积，mL；m-样品的质量，g；G-样品的固形物含量。

②透光率的测定：玉米淀粉液化反应结束，立即加入一定量的1mol/L盐酸终止反应，并冷却至室温，以蒸馏水做对照，测定640nm波长下的透光率。

DE值的变化结果如图7所示，在95℃，pH值4.5的反应体系下，突变α-淀粉酶的DE值明显高于原始α-淀粉酶。由图8所示，突变α-淀粉酶的透光率值高于原始α-淀粉酶，说明在此反应体系下，突变α-淀粉酶液化液中杂质凝聚的效果好于原始α-淀粉酶液化液。这一应用试验结果表明，突变α-淀粉酶在高温酸性条件下的酶活力及稳定性明显高于原始α-淀粉酶。

SEQUENCE LISTING

<110>天津科技大学

<120>高温耐酸性α-淀粉酶的突变株及其构建方法

<130>20080511

<160>14

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>483

<212>PRT

<213>高温耐酸α-淀粉酶突变株(α-1，4-glucan-glucanhydrolase)

<400>1

Ala Asn Leu Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Met Pro

1               5                   10                  15

Asn Asp Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ser Ala Tyr Leu

            20                  25                  30

Ala Glu His Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly

        35                  40                  45

Thr Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu

    50                  55                  60

Gly Glu Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Ser Thr Lys

65                  70                  75                  80

Gly Glu Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn

                85                  90                  95

Val Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr

            100                 105                 110

Glu Asp Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val

        115                 120                 125

Ile Ser Gly Glu His Arg Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro

    130                 135                 140

Gly Arg Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe

145                 150                 155                 160

Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys

                165                 170                 175

Phe Gln Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Asn Gly Asn

            180                 185                 190

Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val

        195                 200                 205

Ala Ala Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln

    210                 215                 220

Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe

225                 230                 235                 240

Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met

                245                 250                 255

Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn

            260                 265                 270

Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu

        275                 280                 285

His Tyr Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met

    290                 295                 300

Arg Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ala

305                 310                 315                 320

Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu

                325                 330                 335

Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu

            340                 345                 350

Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly

        355                 360                 365

Thr Lys Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile

    370                 375                 380

Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His

385                 390                 395                 400

Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp

                405                 410                 415

Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro

            420                 425                 430

Gly Gly Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr

        435                 440                 445

Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser

    450                 455                 460

Glu Gly Trp Gly Glu Phe His Vai Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr

465                 470                 475                 480

Val Gln Arg

<210>2

<211>1846

<212>PRT

<213>耐高温α-淀粉酶缺失株(α-1，4-glucan-glucanhydrolase)

<400>2

Gly Cys Ala Ala Ala Thr Cys Thr Thr Ala Ala Thr Gly Gly Gly Ala

1               5                   10                  15

Cys Gly Cys Thr Gly Ala Thr Gly Cys Ala Gly Thr Ala Thr Thr Thr

            20                  25                  30

Thr Gly Ala Ala Thr Gly Gly Thr Ala Cys Ala Thr Gly Cys Cys Cys

        35                  40                  45

Ala Ala Thr Gly Ala Cys Gly Gly Cys Cys Ala Ala Cys Ala Thr Thr

    50                  55                  60

Gly Gly Ala Ala Gly Cys Gly Thr Thr Thr Gly Cys Ala Ala Ala Ala

65                  70                  75                  80

Cys Gly Ala Cys Thr Cys Gly Gly Cys Ala Thr Ala Thr Thr Thr Gly

                85                  90                  95

Gly Cys Thr Gly Ala Ala Cys Ala Cys Gly Gly Thr Ala Thr Thr Ala

            100                 105                 110

Cys Thr Gly Cys Cys Gly Thr Cys Thr Gly Gly Ala Thr Thr Cys Cys

        115                 120                 125

Cys Cys Cys Gly Gly Cys Ala Thr Ala Thr Ala Ala Gly Gly Gly Ala

    130                 135                 140

Ala Cys Gly Ala Gly Cys Cys Ala Ala Gly Cys Gly Gly Ala Thr Gly

145                 150                 155                 160

Thr Gly Gly Gly Cys Thr Ala Cys Gly Gly Thr Gly Cys Thr Thr Ala

                165                 170                 175

Cys Gly Ala Cys Cys Thr Thr Thr Ala Thr Gly Ala Thr Thr Thr Ala

            180                 185                 190

Gly Gly Gly Gly Ala Gly Thr Thr Thr Cys Ala Thr Cys Ala Ala Ala

        195                 200                 205

Ala Ala Gly Gly Gly Ala Cys Gly Gly Thr Thr Cys Gly Gly Ala Cys

    210                 215                 220

Ala Ala Ala Gly Thr Ala Cys Ala Gly Cys Ala Cys Ala Ala Ala Ala

225                 230                 235                 240

Gly Gly Ala Gly Ala Gly Cys Thr Gly Cys Ala Ala Thr Cys Thr Gly

                245                 250                 255

Cys Gly Ala Thr Cys Ala Ala Ala Ala Gly Thr Cys Thr Thr Cys Ala

            260                 265                 270

Thr Thr Cys Cys Cys Gly Cys Gly Ala Cys Ala Thr Thr Ala Ala Cys

        275                 280                 285

Gly Thr Thr Thr Ala Cys Gly Gly Gly Gly Ala Thr Gly Thr Gly Gly

    290                 295                 300

Thr Cys Ala Thr Cys Ala Ala Cys Cys Ala Cys Ala Ala Ala Gly Gly

305                 310                 315                 320

Cys Gly Gly Cys Gly Cys Thr Gly Ala Thr Gly Cys Gly Ala Cys Cys

                325                 330                 335

Gly Ala Ala Gly Ala Thr Gly Thr Ala Ala Cys Cys Gly Cys Gly Gly

            340                 345                 350

Thr Thr Gly Ala Ala Gly Thr Cys Gly Ala Thr Cys Cys Cys Gly Cys

        355                 360                 365

Thr Gly Ala Cys Gly Gly Ala Thr Cys Cys Gly Cys Cys Gly Ala Thr

    370                 375                 380

Gly Ala Ala Gly Ala Thr Gly Gly Ala Thr Thr Thr Thr Cys Thr Ala

385                 390                 395                 400

Thr Thr Ala Thr Thr Gly Cys Ala Ala Thr Gly Thr Gly Gly Ala Ala

                405                 410                 415

Thr Thr Gly Gly Gly Ala Ala Cys Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala Thr

            420                 425                 430

Thr Ala Thr Thr Thr Thr Ala Thr Thr Ala Ala Ala Gly Ala Gly Thr

        435                 440                 445

Ala Gly Thr Thr Cys Ala Ala Cys Ala Ala Ala Cys Gly Gly Gly Cys

    450                 455                 460

Cys Ala Gly Thr Thr Thr Gly Thr Thr Gly Ala Ala Gly Ala Thr Thr

465                 470                 475                 480

Ala Gly Ala Thr Gly Cys Thr Ala Thr Ala Ala Thr Thr Gly Thr Thr

                485                 490                 495

Ala Thr Thr Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Thr Thr Gly Ala Ala Gly

            500                 505                 510

Gly Ala Thr Gly Cys Thr Thr Ala Gly Gly Ala Ala Gly Ala Cys Gly

         515                520                 525

Ala Gly Thr Thr Ala Thr Thr Ala Ala Thr Ala Gly Cys Thr Gly Ala

    530                 535                 540

Ala Thr Ala Ala Gly Ala Ala Cys Gly Gly Thr Gly Cys Thr Cys Thr

545                 550                 555                 560

Cys Cys Ala Ala Ala Thr Ala Thr Thr Cys Thr Thr Ala Thr Thr Thr

                565                 570                 575

Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Cys Ala Ala Ala Thr Cys Thr Ala Ala

            580                 585                 590

Ala Ala Thr Thr Ala Thr Cys Thr Gly Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gly

        595                 600                 605

Ala Ala Thr Gly Ala Gly Ala Ala Thr Ala Gly Thr Gly Ala Ala Thr

    610                 615                 620

Gly Gly Ala Cys Cys Ala Ala Thr Ala Ala Thr Ala Ala Thr Gly Ala

625                 630                  635                640

Cys Thr Ala Gly Ala Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ala Ala Thr

                645                 650                 655

Gly Ala Ala Gly Ala Thr Thr Gly Thr Thr Cys Ala Thr Gly Ala Ala

            660                 665                 670

Ala Thr Thr Ala Ala Gly Gly Ala Ala Cys Gly Ala Ala Thr Ala Thr

        675                 680                 685

Thr Gly Gly Ala Thr Ala Ala Ala Thr Ala Thr Gly Gly Gly Gly Ala

    690                 695                 700

Thr Gly Ala Thr Gly Thr Thr Ala Ala Gly Gly Cys Thr Ala Thr Thr

705                 710                 715                 720

Gly Gly Thr Gly Thr Thr Thr Ala Thr Gly Gly Cys Thr Cys Thr Cys

                725                 730                 735

Thr Thr Gly Gly Thr Cys Gly Thr Cys Ala Gly Ala Cys Thr Gly Ala

            740                 745                 750

Thr Gly Gly Gly Cys Cys Cys Thr Ala Thr Thr Cys Gly Gly Ala Thr

        755                 760                 765

Ala Thr Thr Gly Ala Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Thr Gly Thr Gly

    770                 775                 780

Thr Cys Ala Thr Gly Thr Cys Ala Ala Cys Ala Gly Ala Gly Gly Ala

785                 790                 795                 800

Ala Gly Cys Ala Gly Ala Gly Thr Thr Cys Ala Gly Cys Cys Ala Thr

                805                 810                 815

Gly Ala Ala Thr Gly Gly Ala Cys Ala Ala Cys Cys Gly Gly Thr Gly

            820                 825                 830

Ala Gly Thr Gly Gly Ala Ala Gly Gly Thr Gly Gly Ala Ala Gly Thr

        835                 840                 845

Gly Ala Ala Thr Thr Thr Thr Gly Ala Thr Ala Gly Cys Gly Ala Ala

    850                 855                 860

Gly Ala Gly Ala Thr Thr Cys Thr Ala Cys Thr Ala Gly Ala Thr Thr

865                 870                 875                 880

Ala Thr Gly Cys Ala Thr Cys Thr Cys Ala Gly Gly Thr Gly Gly Ala

                885                 890                 895

Ala Thr Cys Ala Gly Ala Thr Thr Gly Gly Cys Cys Gly Cys Thr Thr

            900                 905                 910

Ala Cys Ala Cys Ala Thr Gly Gly Thr Cys Ala Ala Thr Thr Thr Thr

        915                 920                 925

Thr Cys Thr Cys Thr Ala Thr Thr Thr Thr Gly Cys Cys Gly Ala Thr

    930                 935                 940

Thr Thr Ala Thr Gly Ala Thr Thr Cys Ala Gly Gly Thr Gly Gly Ala

945                 950                 955                 960

Thr Ala Cys Thr Thr Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ala Gly Thr Gly Thr

                965                 970                 975

Ala Thr Cys Ala Ala Ala Cys Thr Gly Cys Thr Ala Ala Ala Thr Cys

            980                 985                 990

Gly Gly Thr Ala Gly Ala Ala Gly Cys Cys Cys Ala Ala  Ala Cys Gly

        995                 1000                1005

Thr Thr Cys Cys Ala Cys Gly Ala Thr Gly Cys Gly Ala Thr Thr

    1010                1015                1020

Thr Gly Thr Gly Cys Cys Cys Thr Thr Ala Thr Cys Gly Thr Ala

    1025                1030                1035

Gly Ala Ala Gly Ala Gly Cys Thr Gly Thr Thr Thr Gly Ala Ala

    1040                1045                1050

Thr Ala Thr Gly Cys Ala Gly Gly Cys Ala Ala Ala Thr Gly Gly

    1055                1060                1065

Cys Gly Thr Ala Ala Thr Ala Thr Thr Cys Gly Thr Gly Thr Gly

    1070                1075                1080

Cys Ala Ala Gly Gly Ala Cys Cys Gly Ala Cys Ala Ala Cys Ala

    1085                1090                1095

Thr Thr Thr Cys Thr Ala Cys Cys Ala Thr Cys Cys Thr Thr Gly

    1100                1105                1110

Ala Cys Thr Gly Thr Ala Cys Ala Gly Gly Thr Ala Gly Cys Ala

    1115                1120                1125

Ala Thr Gly Gly Cys Ala Gly Gly Thr Gly Cys Cys Ala Thr Gly

    1130                1135                1140

Thr Thr Gly Ala Thr Thr Gly Gly Thr Cys Thr Gly Cys Ala Thr

    1145                1150                1155

Cys Ala Thr Cys Gly Cys Ala Thr Cys Thr Gly Thr Thr Ala Thr

    1160                1165                1170

Ala Cys Gly Ala Cys Gly Ala Gly Cys Gly Cys Thr Thr Cys Gly

    1175                1180                1185

Gly Thr Cys Thr Thr Ala Ala Cys Thr Gly Ala Ala Gly Cys Ala

    1190                1195                1200

Gly Thr Thr Ala Ala Gly Cys Ala Ala Thr Cys Ala Gly Ala Thr

    1205                1210                1215

Cys Thr Thr Cys Cys Thr Thr Cys Ala Gly Gly Thr Thr Ala Thr

    1220                1225                1230

Gly Ala Cys Cys Ala Thr Cys Thr Gly Thr Gly Cys Cys Ala Gly

    1235                1240                1245

Thr Thr Cys Gly Thr Ala Ala Thr Gly Thr Cys Thr Gly Gly Thr

    1250                1255                1260

Cys Ala Ala Cys Thr Thr Thr Cys Cys Gly Ala Cys Thr Cys Thr

    1265                1270                1275

Gly Ala Gly Ala Ala Ala Cys Thr Thr Cys Thr Gly Gly Ala Ala

    1280                1285                1290

Thr Cys Gly Cys Thr Ala Gly Ala Gly Ala Ala Thr Thr Thr Cys

    1295                1300                1305

Thr Gly Gly Ala Ala Thr Gly Gly Gly Ala Thr Thr Cys Ala Gly

    1310                1315                1320

Gly Ala Gly Thr Gly Gly Ala Cys Ala Gly Ala Ala Cys Gly Ala

    1325                1330                1335

Cys Ala Cys Gly Gly Ala Thr Ala Thr Ala Thr Ala Gly Thr Gly

    1340                1345                1350

Gly Ala Thr Gly Thr Gly Thr Cys Ala Ala Ala Ala Cys Gly Cys

    1355                1360                1365

Ala Thr Ala Cys Cys Ala Thr Thr Thr Thr Gly Ala Ala Cys Gly

    1370                1375                1380

Ala Thr Gly Ala Cys Cys Thr Cys Thr Ala Ala Thr Ala Ala Thr

    1385                1390                1395

Thr Gly Thr Thr Ala Ala Thr Cys Ala Thr Gly Thr Thr Gly Gly

    1400                1405                1410

Thr Thr Ala Cys Gly Thr Ala Thr Thr Thr Ala Thr Thr Ala Ala

    1415                1420                1425

Cys Thr Thr Cys Thr Cys Cys Thr Ala Gly Thr Ala Thr Thr Ala

    1430                1435                1440

Gly Thr Ala Ala Thr Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gly Gly Cys Thr

    1445                1450                1455

Gly Thr Cys Ala Thr Gly Gly Cys Gly Cys Ala Thr Thr Ala Ala

    1460                1465                1470

Cys Gly Gly Ala Ala Thr Ala Ala Ala Gly Gly Gly Thr Gly Thr

    1475                1480                1485

Gly Cys Gly Gly Thr Ala Cys Cys Ala Cys Gly Gly Gly Ala Cys

    1490                1495                1500

Gly Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Ala Cys Thr Cys Cys Cys Ala

    1505                1510                1515

Gly Cys Gly Cys Gly Ala Ala Ala Thr Thr Cys Cys Thr Gly Cys

    1520                1525                1530

Cys Thr Thr Gly Ala Ala Ala Cys Ala Cys Ala Ala Ala Ala Thr

    1535                1540                1545

Thr Gly Ala Ala Cys Cys Gly Ala Thr Cys Thr Thr Ala Ala Ala

    1550                1555                1560

Ala Gly Cys Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Cys Ala Gly Thr Ala

    1565                1570                1575

Thr Gly Cys Gly Thr Ala Cys Gly Gly Ala Gly Cys Ala Cys Ala

    1580                1585                1590

Gly Cys Ala Thr Gly Ala Thr Thr Ala Thr Thr Thr Cys Gly Ala

    1595                1600                1605

Cys Cys Ala Cys Cys Ala Thr Gly Ala Cys Ala Thr Thr Gly Thr

    1610                1615                1620

Cys Gly Gly Cys Thr Gly Gly Ala Cys Ala Ala Gly Gly Gly Ala

    1625                1630                1635

Ala Gly Gly Cys Gly Ala Cys Ala Gly Cys Thr Cys Gly Gly Thr

    1640                1645                1650

Thr Gly Cys Ala Ala Ala Thr Thr Cys Ala Gly Gly Thr Thr Thr

    1655                1660                1665

Gly Gly Cys Gly Gly Cys Ala Thr Thr Ala Ala Thr Ala Ala Cys

    1670                1675                1680

Ala Gly Ala Cys Gly Gly Ala Cys Cys Cys Gly Gly Thr Gly Gly

    1685                1690                1695

Gly Gly Cys Ala Ala Ala Gly Cys Gly Ala Ala Thr Gly Thr Ala

    1700                1705                1710

Thr Gly Thr Cys Gly Gly Cys Cys Gly Gly Cys Ala Ala Ala Ala

    1715                1720                1725

Cys Gly Cys Cys Gly Gly Thr Gly Ala Gly Ala Cys Ala Thr Gly

    1730                1735                1740

Gly Cys Ala Thr Gly Ala Cys Ala Thr Thr Ala Cys Cys Gly Gly

    1745                1750                1755

Ala Ala Ala Cys Cys Gly Thr Thr Cys Gly Gly Ala Gly Cys Cys

    1760                1765                1770

Gly Gly Thr Thr Gly Thr Cys Ala Thr Cys Ala Ala Thr Thr Cys

    1775                1780                1785

Gly Gly Ala Ala Gly Gly Cys Thr Gly Gly Gly Gly Ala Gly Ala

    1790                1795                1800

Gly Thr Thr Thr Cys Ala Cys Gly Thr Ala Ala Ala Cys Gly Gly

    1805                1810                1815

Cys Gly Gly Gly Thr Cys Gly Gly Thr Thr Thr Cys Ala Ala Thr

    1820                1825                1830

Thr Thr Ala Thr Gly Thr Thr Cys Ala Ala Ala Gly Ala

    1835                1840                1845

<210>3

<211>483

<212>PRT

<213>耐高温α-淀粉酶模板(α-1，4-glucan-glucanhydrolase)

<400>3

Ala Asn Leu Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Met Pro

1               5                   10                  15

Asn Asp Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ser Ala Tyr Leu

            20                  25                  30

Ala Glu His Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly

        35                  40                  45

Thr Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu

    50                  55                  60

Gly Glu Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Ser Thr Lys

65                  70                  75                  80

Gly Glu Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn

                85                  90                  95

Val Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr

            100                 105                 110

Glu Asp Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val

        115                 120                 125

Ile Ser Gly Glu His Leu Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro

    130                 135                 140

Gly Arg Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe

145                 150                 155                 160

Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys

                165                 170                 175

Phe Gln Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Asn Gly Asn

            180                 185                 190

Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val

        195                 200                 205

Ala Ala Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln

    210                 215                 220

Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe

225                 230                 235                 240

Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met

                245                 250                 255

Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn

            260                 265                 270

Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu

        275                 280                 285

His Tyr Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met

    290                 295                 300

Arg Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser

305                 310                 315                 320

Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu

                325                 330                 335

Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu

            340                 345                 350

Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly

        355                 360                 365

Thr Lys Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile

    370                 375                 380

Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His

385                 390                 395                 400

Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp

                405                 410                 415

Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro

            420                 425                 430

Gly Gly Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr

        435                 440                 445

Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser

    450                 455                 460

Glu Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr

465                 470                 475                 480

Val Gln Arg

<210>4

<211>483

<212>PRT

<213>高温耐酸α-淀粉酶模板(α-1，4-glucan-glucanhydrolase)

<400>4

Ala Asn Leu Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Met Pro

1               5                   10                  15

Asn Asp Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ser Ala Tyr Leu

            20                  25                  30

Ala Glu His Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly

        35                  40                  45

Thr Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu

    50                  55                  60

Gly Glu Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Ser Thr Lys

65                  70                  75                  80

Gly Glu Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn

                85                  90                  95

Val Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr

            100                 105                 110

Glu Asp Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val

        115                 120                 125

Ile Ser Gly Glu His Arg Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro

    130                 135                 140

Gly Arg Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe

145                 150                 155                 160

Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys

                165                 170                 175

Phe Gln Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Asn Gly Asn

            180                 185                 190

Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val

        195                 200                 205

Ala Ala Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln

    210                 215                 220

Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe

225                 230                 235                 240

Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met

                245                 250                 255

Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn

            260                 265                 270

Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu

        275                 280                 285

His Tyr Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met

    290                 295                 300

Arg Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ala

305                 310                 315                 320

Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu

                325                 330                 335

Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu

            340                 345                 350

Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly

        355                 360                 365

Thr Lys Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile

    370                 375                 380

Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His

385                 390                 395                 400

Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp

                405                 410                 415

Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro

            420                 425                 430

Gly Gly Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr

        435                 440                 445

Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser

    450                 455                 460

Glu Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr

465                 470                 475                 480

Val Gln Arg

<210>5

<211>372

<212>DNA

<213>amyl

<400>5

gcaaatctta atgggacgct gatgcagtat tttgaatggt acatgcccaa tgacggccaa    60

cattggaagc gtttgcaaaa cgactcggca tatttggctg aacacggtat tactgccgtc    120

tggattcccc cggcatataa gggaacgagc caagcggatg tgggctacgg tgcttacgac    180

ctttatgatt taggggagtt tcatcaaaaa gggacggttc ggacaaagta cagcacaaaa    240

ggagagctgc aatctgcgat caaaagtctt cattcccgcg acattaacgt ttacggggat    300

gtggtcatca accacaaagg cggcgctgat gcgaccgaag atgtaaccgc ggttgaagtc    360

gatcccgctg ac                                                        372

<210>6

<211>350

<212>DNA

<213>amy2

<400>6

acgggacgaa aggagactcc cagcgcgaaa ttcctgcctt gaaacacaaa attgaaccga    60

tcttaaaagc gagaaaacag tatgcgtacg gagcacagca tgattatttc gaccaccatg    120

acattgtcgg ctggacaagg gaaggcgaca gctcggttgc aaattcaggt ttggcggcat    180

taataacaga cggacccggt ggggcaaagc gaatgtatgt cggccggcaa aacgccggtg    240

agacatggca tgacattacc ggaaaccgtt cggagccggt tgtcatcaat tcggaaggct    300

ggggagagtt tcacgtaaac ggcgggtcgg tttcaattta tgttcaaaga               350

<210>7

<211>1449

<212>DNA

<213>amyd

<400>7

gcaaatctta atgggacgct gatgcagtat tttgaatggt acatgcccaa tgacggccaa    60

cattggaagc gtttgcaaaa cgactcggca tatttggctg aacacggtat tactgccgtc    120

tggattcccc cggcatataa gggaacgagc caagcggatg tgggctacgg tgcttacgac    180

ctttatgatt taggggagtt tcatcaaaaa gggacggttc ggacaaagta cagcacaaaa    240

ggagagctgc aatctgcgat caaaagtctt cattcccgcg acattaacgt ttacggggat    300

gtggtcatca accacaaagg cggcgctgat gcgaccgaag atgtaaccgc ggttgaagtc    360

gatcccgctg accgcaaccg cgtaatttca ggagaacacc gcattaaagc ctggacacat    420

tttcattttc cggggcgcgg cagcacatac agcgatttta aatggcattg gtaccatttt    480

gacggaaccg attgggacga gtcccgaaag ctgaaccgca tctataagtt tcaaggaaag    540

gcttgggatt gggaagtttc caatgaaaac ggcaactatg attatttgat gtatgccgac    600

atcgattatg accatcctga tgtcgcagca gaaattaaga gatggggcac ttggtatgcc    660

aatgaactgc aattggacgg tttccgtctt gatgctgtca aacacattaa attttctttt    720

ttgcgggatt gggttaatca tgtcagggaa aaaacgggga aggaaatgtt tacggtagct    780

gaatattggc agaatgactt gggcgcgctg gaaaactatt tgaacaaaac aaattttaat    840

cattcagtgt ttgacgtgcc gcttcattat cagttccatg ctgcatcgac acagggaggc    900

ggctatgata tgaggaaatt gctgaacggt acggtcgttt ccaagcatcc gttgaaagcg    960

gttacatttg tcgataacca tgatacacag ccggggcaat cgcttgagtc gactgtccaa    1020

acatggttta agccgcttgc ttacgctttt attctcacaa gggaatctgg ataccctcag    1080

gttttctacg gggatatgta cgggacgaaa ggagactccc agcgcgaaat tcctgccttg    1140

aaacacaaaa ttgaaccgat cttaaaagcg agaaaacagt atgcgtacgg agcacagcat    1200

gattatttcg accaccatga cattgtcggc tggacaaggg aaggcgacag ctcggttgca    1260

aattcaggtt tggcggcatt aataacagac ggacccggtg gggcaaagcg aatgtatgtc    1320

ggccggcaaa acgccggtga gacatggcat gacattaccg gaaaccgttc ggagccggtt    1380

gtcatcaatt cggaaggctg gggagagttt cacgtaaacg gcgggtcggt ttcaatttat    1440

gttcaaaga                                                            1449

<210>8

<211>1112

<212>DNA

<213>kmr

<400>8

gccgatgaag atggattttc tattattgc aatgtggaatt gggaacggaa aaattatttt    60

attaaagagt agttcaacaa acgggccagt ttgttgaaga ttagatgcta taattgttat    120

taaaaggatt gaaggatgct taggaagacg agttattaat agctgaataa gaacggtgct    180

ctccaaatat tcttatttag aaaagcaaat ctaaaattat ctgaaaaggg aatgagaata    240

gtgaatggac caataataat gactagagaa gaaagaatga agattgttca tgaaattaag    300

gaacgaatat tggataaata tggggatgat gttaaggcta ttggtgttta tggctctctt    360

ggtcgtcaga ctgatgggcc ctattcggat attgagatga tgtgtgtcat gtcaacagag    420

gaagcagagt tcagccatga atggacaacc ggtgagtgga aggtggaagt gaattttgat    480

agcgaagaga ttctactaga ttatgcatct caggtggaat cagattggcc gcttacacat    540

ggtcaatttt tctctatttt gccgatttat gattcaggtg gatacttaga gaaagtgtat    600

caaactgcta aatcggtaga agcccaaacg ttccacgatg cgatttgtgc ccttatcgta    660

gaagagctgt ttgaatatgc aggcaaatgg cgtaatattc gtgtgcaagg accgacaaca    720

tttctaccat ccttgactgt acaggtagca atggcaggtg ccatgttgat tggtctgcat    780

catcgcatct gttatacgac gagcgcttcg gtcttaactg aagcagttaa gcaatcagat    840

cttccttcag gttatgacca tctgtgccag ttcgtaatgt ctggtcaact ttccgactct    900

gagaaacttc tggaatcgct agagaatttc tggaatggga ttcaggagtg gacagaacga    960

cacggatata tagtggatgt gtcaaaacgc ataccatttt gaacgatgac ctctaataat    1020

tgttaatcat gttggttacg tatttattaa cttctcctag tattagtaat tatcatggct    1080

gtcatggcgc attaacggaa taaagggtgt gc                                  1112

<210>9

<211>  29

<212>DNA

<213>上游引物F1

<400>9

cccaagcttg caaatcttaa tgggacgct                                       29

<210>10

<211>29

<212>DNA

<213>下游引物R1

<400>10

cgcggatccg tcagcgggat cgacttcaa                                       29

<210>11

<211>28

<212>DNA

<213>上游引物F2

<400>11

cggggtacca cgggacgaaa ggagactc                                        28

<210>12

<211>32

<212>DNA

<213>下游引物R2

<400>12

ccggaattc tctttgaacat aaattgaaac cg                                   32

<210>13

<211>29

<212>DNA

<213>上游引物F3

<400>13

cgcggatccg ccgatgaaga tggattttc    29

<210>14

<211>29

<212>DNA

<213>下游引物R3

<400>14

cggggtaccg cacacccttt attccgtta    29

<210>15

<211>1846

<212>DNA

<213>耐高温α-淀粉酶缺失株基因序列(α-1，4-glucan-glucanhydrolase)

<400>15

gcaaatctta atgggacgct gatgcagtat tttgaatggt acatgcccaa tgacggccaa  60

cattggaagc gtttgcaaaa cgactcggca tatttggctg aacacggtat tactgccgtc  120

tggattcccc cggcatataa gggaacgagc caagcggatg tgggctacgg tgcttacgac  180

ctttatgatt taggggagtt tcatcaaaaa gggacggttc ggacaaagta cagcacaaaa  240

ggagagctgc aatctgcgat caaaagtctt cattcccgcg acattaacgt ttacggggat  300

gtggtcatca accacaaagg cggcgctgat gcgaccgaag atgtaaccgc ggttgaagtc  360

gatcccgctg acggatccgc cgatgaagat ggattttcta ttattgcaat gtggaattgg  420

gaacggaaaa attattttat taaagagtag ttcaacaaac gggccagttt gttgaagatt  480

agatgctata attgttatta aaaggattga aggatgctta ggaagacgag ttattaatag  540

ctgaataaga acggtgctct ccaaatattc ttatttagaa aagcaaatct aaaattatct  600

gaaaagggaa tgagaatagt gaatggacca ataataatga ctagagaaga aagaatgaag  660

attgttcatg aaattaagga acgaatattg gataaatatg gggatgatgt taaggctatt  720

ggtgtttatg gctctcttgg tcgtcagact gatgggccct attcggatat tgagatgatg  780

tgtgtcatgt caacagagga agcagagttc agccatgaat ggacaaccgg tgagt ggaag 840

gtggaagtga attttgatag cgaagagatt ctactagatt atgcatctca ggtggaatca  900

gattggccgc ttacacatgg tcaatttttc tctattttgc cgatttatga ttcaggtgga  960

tacttagaga aagtgtatca aactgctaaa tcggtagaag cccaaacgtt ccacgatgcg  1020

atttgtgccc ttatcgtaga agagctgttt gaatatgcag gcaaatggcg taatattcgt  1080

gtgcaaggac cgacaacatt tctaccatcc ttgactgtac aggtagcaat ggcaggtgcc  1140

atgttgattg gtctgcatca tcgcatctgt tatacgacga gcgcttcggt cttaactgaa  1200

gcagttaagc aatcagatct tccttcaggt tatgaccatc tgtgccagtt cgtaatgtct  1260

ggtcaacttt ccgactctga gaaacttctg gaatcgctag agaatttctg gaatgggatt  1320

caggagtgga cagaacgaca cggatatata gtggatgtgt caaaacgcat accattttga  1380

acgatgacct ctaataattg ttaatcatgt tggttacgta tttattaact tctcctagta  1440

ttagtaatta tcatggctgt catggcgcat taacggaata aagggtgtgc ggtaccacgg  1500

gacgaaagga gactcccagc gcgaaattcc tgccttgaaa cacaaaattg aaccgatctt  1560

aaaagcgaga aaacagtatg cgtacggagc acagcatgat tatttcgacc accatgacat  1620

tgtcggctgg acaagggaag gcgacagctc ggttgcaaat tcaggtttgg cggcattaat    1680

aacagacgga cccggtgggg caaagcgaat gtatgtcggc cggcaaaacg ccggtgagac    1740

atggcatgac attaccggaa accgttcgga gccggttgtc atcaattcgg aaggctgggg    1800

agagtttcac gtaaacggcg ggtcggtttc aatttatgtt caaaga                   1846

Claims (2)

1.一种产高温耐酸性α-淀粉酶的突变株的构建方法，其特征在于：所述突变株是将出发菌株地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因经体外Leu134→Arg和Ser320→Ala突变后所获得的高温耐酸性α-淀粉酶基因取代原始耐高温α-淀粉酶基因后得到的突变株；构建方法包括如下步骤：

(1).构建打靶载体pUC-amy1-amy2-Km^r：以地衣芽孢杆菌基因组DNA为模板，各设计两对特异的PCR引物，该两对特异的PCR引物的序列为：序列9、序列10和序列11、序列12：，扩增耐高温α-淀粉酶的上游、下游同源性核苷酸片段，得到两个同源性核苷酸片段，将上游片段、卡那霉素抗性基因、下游片段定向连接入载体中，构建得到打靶载体pUC-amy1-amy2-Km^r；

(2).构建打靶载体pUC-amyd：以地衣芽孢杆菌耐高温耐酸性α-淀粉酶基因为模板，该基因编码的氨基酸序列为：序列4，设计特异的PCR引物，该引物序列为：序列9、序列12，扩增高温耐酸性α-淀粉酶基因，将该片段连入载体中，构建得到打靶载体pUC-amyd；

(3).获得地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因缺失株：利用打靶载体pUC-amy1-amy2-Km^r化地衣芽孢杆菌原始出发菌株，同源重组其宿主细胞基因组DNA，卡那抗性基因取代基因组DNA中部分耐高温α-淀粉酶基因，获得地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因缺失株；

(4).获得高温耐酸性α-淀粉酶基因突变株：利用打靶载体pUC-amyd转化地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因缺失株，同源重组其宿主细胞基因组DNA，高温耐酸性α-淀粉酶基因带有两个突变位点的部分基因取代缺失株基因组中卡那抗性基因，获得地衣芽孢杆菌高温耐酸性α-淀粉酶基因突变株；

所述步骤(1)、(2)中连接基因片段的载体为pUC19；所述步骤(1)、(3)、(4)中卡那抗性基因来自于枯草芽孢杆菌pWB980质粒，大小为1112bp；

所述的地衣芽孢杆菌和出发菌株地衣芽孢杆菌在中国工业微生物菌种保藏管理中心CICC保藏，保藏号：10181。

2.根据权利要求1所述的产高温耐酸性α-淀粉酶的突变株的构建方法，其特征在于：所述步骤(1)的耐高温α-淀粉酶的上游、下游同源性核苷酸片段分别为372bp和350bp。

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