CN100497593C - 一种低温淀粉酶菌株、低温淀粉酶及其生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种产生低温淀粉酶的中间气单孢菌(A.media)和利用此菌株生产低温淀粉酶的生产方法，同时还提供了低温淀粉酶。通过利用中间气单孢菌(CGMCC.No.1490)，建立菌种保藏、复壮及选育的系统方法，经过培养基配方优化筛选及发酵工艺条件优化控制，确立了生产低温淀粉酶的方法，生产出低温淀粉酶具有良好的低温活性、高酶活。可广泛用于造纸、食品、医药工业，如饴糖、啤酒、黄酒、葡萄糖、味精、抗生素等行业，并具有重要意义。

Description

一种低温淀粉酶菌株、低温淀粉酶及其生产方法
发明领域
本发明涉及微生物及微生物发酵领域。具体的说，本发明涉及一种细菌产生的，具有较低最适酶解温度的淀粉酶、产生该酶的微生物菌种及生产该酶的方法。
背景技术
在工业生产中，依靠无机酸或酶的催化作用将淀粉水解成葡萄糖等产物。目前优选使用酶，其可提高产量并带来有益经济效益、社会效益等多种优势。酶促水解可在更大程度上控制淀粉水解、反应特异性和产物的稳定性。温和的反应条件包括较低的温度，接近中性的pH等，由此减少生产中能源的消耗、降低生产成本和环境污染。
淀粉酶是一种用途极广的生物催化剂，广泛应用于造纸、食品、医药工业，如饴糖、啤酒、黄酒、葡萄糖、味精、抗生素等行业；用于高质量的丝绸、人造棉、化学纤维退浆；制成不同品种的工业酶、医用酶、诊断酶等；在洗涤剂工业中，作为洗涤剂酶与碱性蛋白酶、脂肪酶一起添加于洗衣粉中制成多酶洗衣粉等，具有极广泛的用途。但目前商品生产的淀粉酶为中温酶，在0～20℃常温范围活力很低，不适于食品、饲料、纺织和洗涤剂工业的低温条件而限制其应用。其主要研究及生产的菌株及特性如下：
细菌菌株B-9545，最适酶解条件为：50℃、pH9.0(闫浩林、张惠丽等碱性淀粉酶产生菌的筛选和产酶条件研究，微生物学杂志，1996，1：26～30)；
Bacillus subtilis 14140 & 14141，最适酶解条件为：60～70℃、pH6.0(管斌、谢来苏、丁友芳、隆言泉 枯草芽胞杆菌A-淀粉酶高产菌株的选育浙江农业大学学报1997，23(5)：88～92)；
耐碱芽孢杆菌9-A2，最适酶解条件为：50℃、pH8.0(贾士儒 赵树欣 FrzncoG·Tevec 耐碱芽孢杆菌碱性淀粉酶研究I-菌种的分离与筛选天津轻纺工业学院学报1994，2：1～6)；
芽孢杆菌(Bacillus)ZX99，最适酶解条件为：60℃、pH6.0(张应玖 朱学军 关键、李吉平、薛雁 一种新型淀粉酶的鉴定及其产酶菌株的筛选 微生物学通报2002，29(5)：38～41)；
嗜碱芽孢杆菌SX212，最适酶解条件为：55℃、pH9.0(马晓军 张晓君 杨玲 冯清平 支链淀粉酶产生菌的筛选及发酵条件的研究 兰州大学学报(自然科学版)2001，37(6)：80～85)；
诺卡氏菌株Nocarida sp 82，最适酶解条件为：60℃、pH7.0(王银定 杨秀琴 王建平 诺卡氏菌胞外β-淀粉酶的分离和鉴定 河北大学学报(自然科学版)1997，17(2)41～45)；
Asp.oryzaevar.30103，最适酶解条件为：60℃、pH5.0；Rhi.niveus4810，最适酶解条件为：60℃、pH5.0(管斌、谢来苏、丁友芳、隆言泉枯草芽胞杆菌 A-淀粉酶高产菌株的选育 浙江农业大学学报1997，23(5)：88～92)；
地衣芽孢杆菌A.404，最适酶解温度高于90℃；(杨傻豪 胡学智 地农芽孢杆菌A.4041耐高温淀粉酶的研究维普资讯1997：286～289)；
地衣芽孢杆菌(Bacitlus licheni/ormis)Js-5，最适酶解条件为：90℃；(李佑红 吴衍庸 地衣芽孢杆菌Js一5一淀粉酶的研究 微生物学报1998，29(4)：314～316)；
枯草芽孢杆菌Bacillus subtilise 8631，其最适酶解条件为：65℃、pH5.6(姜涌明 史永昶 隋德新 枯草芽孢杆菌 86315 α-淀粉酶的研究II.分离提纯、性质及动力学 江苏农学院学报 1992，13(2)：47～5)；
米曲霉(Aspergillus oryzae)突变株6-193，其最适酶解条件为：60℃、pH5.0～6.0(孔显良 王傻英 崔雅洁 姜面萍 米曲霉 6-193 α一淀粉酶的纯化和性质的研究微生物学报1991，31(4)：274～280)；
嗜碱芽孢杆菌NT-3，其最适酶解条件为：50℃、pH9.0(田小群 嗜碱性芽孢杆菌(Bacillus sp)NT-39及其所产碱性淀粉酶的初步研究 武汉大学学报(自然科学版)1992，2：105～111)；
嗜碱单胞菌(alkalomonas amylolytics)N-l0产生的a一淀粉酶，其最适酶解条件为：50℃、pH10(马延和薛燕芬窦岳坦一种碱性α-淀粉酶、其编码基因及用途专利公开号CN1500870A)；
古细菌芝田硫化叶茵B1，其最适酶解条件为：60℃(刘莉 吴襟 陈炜张树政 芝田硫化叶菌新型 α-淀粉酶基因工程菌表达条件的优化 中国生物工程杂志 2003，23(1)：70～74)；
古细菌Pyrococcus furious，其最适酶解条件为：95℃、pH5.0(沈微王正祥 古细菌 Pyrococcus furious 嗜热 α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的表达 食品与发酵工业 2002，29(3)：10～14)；
Thermomucor indicae-seudaticae，最适酶解条件为：60℃、pH 7.0(Sanjeev Kumar and T.Satyanarayana Purification and Kinetics ofa Raw Starch-Hydrolyzing，Thermostable，and Neutral Glucoamylase ofthe Thermophilic Mold Thermomucor indicae-seudaticae Biotechnol.Prog.2003，19，936-944)
Bacteroides amylophilus 70，最适酶解条件为：43℃、pH 6.3(StevenJ.Mcwethy Paul A.Hartman Purification and Some Properties of anExt-racellular Alpha-Amylase from Bacteroides amylophiluslJournal of Bacteriology，Mar.1977，p.1537-1544)；
Thermomonospora curvata，最适酶解条件为：65℃、pH 6.0(FredStutz-enberger Rick Carnel Amylase Production by Thermomonosporacurvata Applied and Enyromen talMicrobiology，Aug.1977，p.234-236)；
B.stearothermophilus 1518，最适酶解条件为：60℃、B.coagulans43P最适酶解条件为：70℃、Bacillus stearothermophilus ATCC 7954，最适酶解条件为：90℃(Paul A.Hartman Ralph Wellerson，JR.P.A.Tetrault Bacillus StearothermophilusI.-Thermal and pH Stability ofthe Amylase July 16，1954)；
Bcillus subtilis strain W23 & B.Amyloliquefaciens strain F最适酶解条件为65℃(N.E.WELKER′AND L.LEON CAMPBELL Comparison ofthe a-Amylase of Bacillus subtilis and Bacillus amyloliquefaciensJOURNAL OF BACTERIOLOGY，Oct.1967，p.1131-1135)；
Bacillus species NRRLB-3881，最适酶解条件为50℃、pH 9.5(E.W.BO-YER AND M.B.INGLE Extracellular Alkaline Amylase from aBacillus Species JOURNAL oF BACTERIOLOGY，June 1972，p.992-1000)；
Thermomonospora curvata，最适酶解条件为65℃、pH 6.0(J.L.GLYMPHAND.J.STUTZENBERGER Production，Purification，and Characterizat-ionof a-Amylase from Thermomonospora curvata APPLIED AND ENVIRONMENTALMICROBIOLOGY，OCt.1977，P.391-397)；
Halobacterium halobium，最适酶解条件为55℃、pH6.6(WENDY A.GOODAND PAUL A.HARTMAN Properties of the Amylase from Halobacteriumha-lobium JOURNAL OF BACTERIOLOGY，Oct.1970，p.601-603)；
Micrococcus sp.，最适酶解条件为50℃、pH6～7(HIROSHI ONISHIHal-ophilic Amylase from a Moderately Halophilic MicrococcusJOURNAL OF BACTERIOLOGY，Feb.1972，p.570-574)；
Bacillusacidocaldarius Agnano 101，最适酶解条件为75℃、pH 3.5(VINCENZO BUONOCORE，CARLO CAPORALE，MARIO DE ROSA，AND AGATAGAMBACORT-A Stable，Inducible Thermoacidophilic α-Amylase fromBacillus acidoc-aldarius JOURNAL OF BACTERIOLOGY，Nov.1976，p.515-521)；
Streptococcus bovis JB1，最适酶解条件为50℃、pH5～6(SHELBY N.FREER Purification and Characterization of the Extracellular α-Amyla-se from Streptococcus bovis JB1 APPLIED AND ENVIRONMENTALMICROBIOL-OGY，May 1993，p.1398-1402)；
C.thermosulfurogenes，最适酶解条件为75℃(NORIYUKI KITAMOTO，Cloning and Sequencing of the Gene Encoding Thermophilic β-Amylaseof Clostridium thermosulfurogenes JOURNAL OF BACTERIOLOGY，Dec.1988，p.5848-5854)；
Aspergillus oryzae strain El 212，最适酶解条件为55℃、pH 5.0(A.K.KUNDU AND S.DAS Production of Amylase in Liquid Culture by a Strainof Aspergillus oryzae APPLIED MICROBIOLOGY，Apr.1970，p.598-603)
Clostridium acetobutylicum ATCC 824，最适酶解条件为45℃、pH5.6(VERONIQUE PAQUET，CHRISTIAN CROUX，GERARD GOMA，Purification andCharacterization of the Extracellular α-Amylase from Clostridiumacetobutylicu-m ATCC 824 APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY，Jan.1991，p.212-218)；
利用基因工程技术构建的淀粉酶基因工程生产菌株，其产生的碱性淀粉酶最适酶解温度50～60℃(荒木裕行远藤圭二荻原浩五十岚一晓林康弘尾崎克也高生产能力的α一淀粉酶专利公开号CN1348000A)；
利用芽孢杆菌NCIMB40916的淀粉酶基因构建的基因工程生产菌，产生的碱性淀粉酶最适酶解条件为：55℃、pH9.5(赫勒·奥特拉普比贾恩·R·尼尔森碱性芽抱杆菌淀粉酶专利公开号CN1399676A)；
嗜碱单胞菌(alkalomonas amylolytics)N10，其最适酶解条件为：50℃，pH10(马延和 薛燕芬 窦岳坦 一种碱性α-淀粉酶、其编码基因及用途专利公开号：CN1500870A)；
耐冷菌Penicillum sp.FS 010441，最适酶解条件：40℃、pH6.0(张刚 汪天虹 张臻峰 产低温淀粉酶的海洋真菌筛选及研究MarineSciences/ Vol.26，No.2/2002)。
耐冷菌Moritella profunda，其产生的低温淀粉酶最适酶解条件为，34℃(Ying Xu Georges Feller Charles Gerday Nicolas Glansdorff1Moritella Cold-Active Dihydrofolate Reductase：Are There NaturalLimits to Optimization of Catalytic Efficiency at Low Temperature？JOURNAL OF BACTERIOLOGY Sept.2003，5519～526)
低温酶类因其独特的酶学特性受到世界范围内科学家的重视，其中，低温淀粉酶的研究较早。可产生低温酶类的微生物菌种主要存在于低温的自然生态环境中，分离较难。因而，可提供的研究菌株很少。目前，已分离的低温淀粉酶产生菌，主要来自于海洋的深深海样本或是南极等极端的低温环境样本，其分离的菌株以耐低温菌或嗜冷菌为主。由于菌种之间的差异性，存在所产生菌的酶的特性差异性，包括最适作用条件、热稳定性、对底物的水解特性等。在现有的研究水平下，可供研究的菌种及其产生的酶十分稀少。
发明内容
针对国内外目前菌种之间的差异性，存在所产生菌的酶的特性差异性，包括最适作用条件、热稳定性、对底物的水解特性等。在现有的研究水平下，可供研究的菌种及其产生的酶十分稀少。本发明提供一种产生该淀粉酶的微生物菌种、低温淀粉酶及生产该低温淀粉酶的方法。所述的低温淀粉酶较常温淀粉酶、高温淀粉酶比较，在较低温的作用温度下可发挥较高的酶解特性。
本发明提供一株产低温淀粉酶的微生物菌种，通过对新疆富蕴地区典型的自然低温环境中的土壤样本进行了微生物菌种的培养、分离与筛选，获得一批耐低温微生物菌株，并从中分离筛选出低温淀粉酶产生菌株，编号为LA140，从而提供了一种低温淀粉酶产生菌株，其具有生产低温淀粉酶的优良特性，经微生物学鉴定，属于气单孢菌属菌(Aeromonas)的中间气单孢菌(A.media)。
本发明在获得的气单孢菌属菌(Aeromonas)的中间气单孢菌(A.media)LA140的基础上，提供了一种生产低温淀粉酶的方法。
同时，本发明还提供了一种低温淀粉酶，通过利用本发明的菌株经过本发明确定的具体发酵技术而获得。
本发明提供了一种低温淀粉酶菌株，命名为LA140，其能够以高产率产生低温淀粉酶。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，邮编：100080。保藏日期是2005年10月14日，保藏号是CGMCC.No 1490。经微生物学鉴定为气单孢菌属菌(Aeromonas)的中间气单孢菌(A.media)。该菌株生长于肉汤蛋白胨培养基表面，菌落圆形、突起、表面光滑、透明、有光泽，产生棕黄色色素；该菌种在5-35℃及pH4-9范围内均可生长。依照伯杰氏系统细菌学手册第八版，LA140菌为气单孢菌属菌(Aeromonas)属中的的中间气单孢菌(A.media)。该菌种产生的低温淀粉酶，在pH4～8、5～40℃范围内均有酶解特性，其最适酶解条件为30℃左右、pH6.4。本发明进一步建立菌种保藏、复壮及选育的系统工艺流程技术。
用于生产本发明的低温淀粉酶微生物菌种，可产生下述特性的淀粉酶，且具有下列分类学意义上的性质的气单孢菌属菌(Aeromonas)的中间气单孢菌(A.media)即可。该菌株可由保藏的菌种分离，或从自然界中培养、筛选。另外，该菌种可是通过自然及人工的诱导变异的菌株，只要产生下述淀粉酶特性的菌株皆在此范围。
作为本发明的产生低温淀粉酶的微生物菌种，其在分类学意义上属于气单孢菌属菌(Aeromonas)的中间气单孢菌(A.media)LA140，本发明菌种从新疆富蕴地区的土壤样本中分离获得。
本发明的低温淀粉酶微生物菌种，其菌学特性如表1所示。
 
序号 测试项目 结果
1 菌体形态 杆状
2 芽孢 无芽孢
 
3 革兰氏染色 阴性
4 Glucose(oxidative)(葡萄糖氧化) 阳性
5 极毛运动 阳性
6 最适生长温度 ≦30℃
7 NaCl需求 阴性
8 Esculin(七叶树苷(七叶灵)) 阳性
9 Urea(尿素) 阳性
10 Malonate(丙二酸盐) 阴性
11 TDA(苯丙氨酸) 阳性
12 Lactose(乳糖) 阳性
13 Maltose(麦芽糖) 阳性
14 Mannitol(甘露醇) 阳性
15 Xylose(木糖) 阴性
16 Sorbitol(山梨糖) 阴性
17 Sucose(蔗糖) 阳性
18 Inositol(肌醇) 阴性
19 H2S(硫化氢) 阴性
20 Rhamnose(鼠李糖) 阴性
21 Arabinose(阿拉伯糖) 阳性
22 Arginine(精氨酸) 阳性
23 Lysine(赖氨酸) 阴性
24 Ornithine(鸟氨酸) 阴性
 
25 Oxidase(氧化酶) 阳性
26 脂酶 阳性
作本发明低温淀粉酶的产生菌种，可为自然筛选的原始菌株，或通过自然变异或人工诱导变异的变异菌株。
作为上述变异菌株的研制方法，包括物理诱变，如紫外线辐射处理、钴60辐照处理、离子注入处理、激光辐照等各种射线处理；化学诱变，如亚硝基胍(NTG)、硫酸二乙酯等化学诱变剂处理，用常规淀粉酶产生菌分离筛选培养基及方法优选出生产性能优异的菌株。
另外，也可通过分子生物学技术，从原始菌株或诱导变异菌种中获取低温淀粉酶基因，以原菌核微生物，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等、真核微生物，如酵母等，作为基因受体菌，构建基因工程生产菌株，也可作为本发明的低温淀粉酶产生菌种。
作为本发明的低温淀粉酶产生菌种LA140，可采用如下方法对其进行保存、复壮与筛选，及其摇瓶发酵获得本发明的低温果胶酶。
本发明的低温淀粉酶产生菌LA140采用常规的斜面传代保存法，此方法是将本发明菌种接种于只要适合于细菌生长的斜面培养基表面，15～25℃培养3～4天，再置于4℃下低温保藏，可存放3个月；或是利用真空冷冻干燥法将本发明菌种制成干粉菌种，低温或常温保藏可达1年以上。
长期保藏的菌种在使用时按如下方法进行复壮、筛选。将长期保藏的本发明菌种接种于肉汤蛋白胨培养基或其它适合于细菌生长的培养基表面，15～25℃培养3～4天；肉汤蛋白胨培养基成分如下：牛肉膏1％、蛋白胨1％、NaCl o.5％、琼脂3g、水100mL、pH7.0。再将其接种于含有2％的可溶性淀粉的肉汤蛋白胨培养基表面，15～25℃培养2～3天；加入I-KI溶液，静置。在菌落周围可形成明显的透明圈，挑取透明圈与菌落直径比最大的菌株作为本发明的实验菌株。
同时本发明提供一种生产上述低温淀粉酶的生产方法。
利用经活化筛选出的本发明的实验菌种进行发酵培养实验。在发酵培养过程中，可将斜面菌种直接接种于发酵培养基中，或是将菌种先进行液体增殖培养，再以5％-15％的接种量接种于发酵培养基中进行发酵培养。
作为培养基的营养源，可广泛使用通常用于培养的营养源。只要是可作为碳源同化的碳化合物或者是含有该碳化合物的，微生物菌种可利用的、适合于发酵培养产生菌本发明的低温淀粉酶的碳源即可，例如，可使用淀粉、玉米粉、葡萄糖、麦芽汁、蔗糖、水解糖、可用的多糖等。其用量依据其它营养源的选择不同及培养条件的差异而有所不同，本发明中优选玉米粉为最优碳源，其用量为0.5-1.5％。
作为氮源，只要是可作为氮源同化的氮化合物或者是含有该氮化合物的即可，例如，可用铵盐、硝酸盐、大豆粉、肉类提取物、玉米浸渍液、玉米浆、酵母膏等。其氮源的选择和用量，可依据其它营养源的成分和用量的不同而不同，只要选合于本发明的低温淀粉酶产生菌的培养及酶的产生即可。在本发明中优选蛋白胨、酵母膏、牛肉膏作为最佳的氮源，其中蛋白胨用量为0.2-1.0％，酵母膏用量为0.1-0.2％，牛肉膏用量为0.5-1.0％。
作为无机盐类，可适当添加磷酸氢氨、磷酸二氢钾等的磷酸盐、镁盐、钙盐、锰盐等的盐类。培养条件依培养基的组份而多少不同，但只要是适合于菌体培养产的、产生本发明中的淀粉酶的条件即可。
作为产酶促进剂，可适量添加Tween系的表面活性剂、SDS等，添加量适培养基的不同而定，只要适宜促进培养过程产生本发明的淀粉酶即可。
通常，可选择以下的条件进行培养。即，培养温度为5～35℃，最好为15～25℃的范围；培养时间约为60小时，只要在本发明的低温淀粉酶的生产量达到最高时结束培养即可；培养基的pH可在4～9的生产范围，特别是在5.6～7.4更适于本发明的淀粉酶的生产。经如上所述的培养，主要在菌体外(培养液中)产生目的产物的低温淀粉酶。
从如上所得的培养液中采集低温淀粉酶，可按照通常用于采集细胞外酶的方法，如硫酸铵盐析、超滤浓缩、冷冻干燥、色谱分离等，由分离、精制而进行。
即，可由下述方法获得本发明的低温淀粉酶酶：由过滤法或离心分离法从培养液中分离菌体及培养基固形物，得到上清液或滤液，对该些分离液进行或不进行浓缩，添加可溶性盐类，使酶沉淀的盐析法；添加亲水性的有机溶剂，使酶或夹杂物沉淀的有机溶剂沉淀法；使用离子交换树脂等的吸附脱离法；凝胶过滤法；添加稳定辅助剂或不添加稳定辅助剂的喷雾干燥法；单独或多个组合使用冷冻干燥法等的分离或精制方法。
通过本发明如上的阐述，得到后面实施例进一步的验证，得知本发明低温淀粉酶的酶学特性。本发发明菌株产生的低温淀粉酶最适酶解pH为6.4左右，在pH5～8范围内可保持较高的酶活性；在5～40℃范围内均有酶特性，最适酶解温度为30℃，在30℃以下保温60分钟，其酶活性仍可保持80％左右的相对酶学活性；金属离子对低温淀粉酶的活性具有一定的影响作用，其中K+、Ca2+、Fe3+、Cu2+对酶具有激活作用、Mg2+对其活性无显著影响；Mn2+、Hg2+、pb2+对酶活性具有抑制作用。
通过实施本发明具体的技术方案，实现本发明内容，并可以达到以下有益效果。
本发明的气单孢菌属菌(Aeromonas)的中间气单孢菌(A.media)菌株及在菌学上来说与其同等的菌株及其变异菌株，可有效地用于产生本发明的低温淀粉酶。该低温淀粉酶具有较高的热稳定性，在30℃以下保温60分钟，其酶活性仍可保持80％左右；再有，本发明的优点在于，使用所述菌株的制造具有上述性质的低温淀粉酶的方法可有效地产生所述的低温淀粉酶，其酶活可达28u/ml～50u/ml。
附图说明
图1：所示为本发明的气单孢菌属菌(Aeromonas)的中间气单孢菌(A.media)LA140产生的低温淀粉酶反应pH和相对酶活性关系的图表。
图2：所示为本发明的气单孢菌属菌(Aeromonas)的中间气单孢菌(A.media)LA140产生的低温淀粉酶反应温度和相对酶活性关系的图表。
图3：所示为本发明的气单孢菌属菌(Aeromonas)的中间气单孢菌(A.media)LA140产生的低温淀粉酶在温度30℃下处理残余酶活性的图表。
图4：所示为各种金属离子对本发明的气单孢菌属菌(Aeromonas)的中间气单孢菌(A.media)LA140产生的低温淀粉酶酶活性的影响效果图。
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。另外，在下述的说明中，如无特别说明，则％皆指重量写。
具体实施方式
实施例1：低温淀粉酶产生菌(LA140)的培养
将本发明的低温淀粉酶产生菌LA140接种于含可溶性淀粉的肉汤培养基中，其中可溶性淀粉2％、牛肉膏1％、蛋白胨1％、NaCl o.5％、琼脂3g、水100mL、pH7，0.1MPa蒸汽灭菌30分钟。20℃左右培养2～3天，加入0.4mol/L I+2KI溶液显色。则在本发明低温淀粉酶产生菌的菌落周围形成明显的透明圈。
实施例2：低温淀粉酶产生菌(LA140菌株)的发酵培养-I
将本发明低温淀粉酶产生菌斜面菌种接种于发酵培养基中。其中蛋白胨：10g、玉米粉：15g、酵母膏：2g、牛肉膏：10g、氯化钠：1g、氯化钙：2g、硫酸亚铁：0.1g、硫酸镁：0.5g、水：1000mL、pH7.0。每250ml三角瓶装液30mL，0.1MPa蒸汽灭菌30分钟。培养条件为：20℃、200rpm，发酵培养36h，酶活达到28U/mL。
实施例3：低温淀粉酶产生菌(LA140菌株)的发酵培养-II
将低温淀粉酶产生菌LA140接种于肉汤蛋白胨培养基中，其中牛肉膏1％、蛋白胨1％、NaCl0.5％、可溶性淀粉1％、pH7.0，0.1MPa蒸汽灭菌25分钟。20℃、150rpm，培养36小时后，将培养物以15％的比例加入到发酵培养基中。
发酵培养基成分为：蛋白胨：10g、玉米粉：15g、酵母膏：2g、牛肉膏：10g、氯化钠：1g、氯化钙：2g、硫酸亚铁：0.1g、硫酸镁：0.5g、水：1000mL。0.1MPa蒸汽灭菌25分钟。500ml三角瓶装液100mL。在20℃、200rpm下振荡培养60小时。培养后，经离心分离，得到低温淀粉酶粗酶液。所得的淀粉酶酶液的低温淀粉酶活性可达为50U/ml。
从如此所得的淀粉酶液中，由硫酸按沉淀法得到65％饱和度的沉淀。再以通常的方法脱盐后，冷冻干燥得低温淀粉酶的原粉。
实施例4：酶活酶活性的测量方法
采用Yoo改良法，反应体系为5ml0.5％淀粉(pH6.0醋酸缓冲液)加0.5ml酶液，30℃反应5min后，加0.1mol/L HCl5ml终止反应。取0.5ml反应液加于5ml0.4mol/L I+2KI溶液显色，620nm测光密度。1活力单位定义为5min内水解1mg淀粉的酶量。
A(U/ml)＝D×(R0-R)/R0×100
A ---酶活；
R0---底物加淀粉液的光吸收值；
R ---反应物加淀粉液的光吸收值；
D ---酶的稀释倍数。
实施例5：作用pH对低温淀粉酶酶活力的影响
作用pH和最佳作用pH测定。以0.5％的可溶性淀粉溶液为基质，按前述的活性测试方法进行测定。测定在pH4～8范围内的不同的pH值下的酶活力。以测定酶活力最高的pH值为对照，设定其相对酶活力为100％。作用pH与酶活性的关系如图1所示。本发明菌株LA140产生的低温淀粉酶最适酶解pH为6.4，在pH5～7.4范围内可保持较高的酶学活性。
实施例6：作用温度与低温淀粉酶酶活力的关系
作用温度及最佳温度测定。0.5％的可溶性淀粉溶液为基质，与前述的活性测定方法相同。在5～40℃的范围内的不同的反应温度下进行测试。以测定酶活力最高的温度为对照，设定其相对酶活力为100％。反应温度和相对酶活性的关系如图2所示。在5～40℃的温度范围内，本发明菌株LA140产生的低温淀粉酶均呈现酶活性，其最佳酶解温度为30℃左右。在15～35℃的测定温度范围内具有良好的酶学特性，在5℃下仍可保持50％左右的相对酶学活性。
实施例7：低温淀粉酶热稳定性
将实施例3所得到的低温淀粉酶粗酶液在30℃、pH5.6下保温，然后按上述酶活性测定方法每隔10分钟对其残余酶活力进行测定一次。以未进行保温处理的为对照，设定其相对酶活力为100％。测定条件为pH6.4、30℃。此时的处理温度和残余酶活性的关系如图3所示。本发明菌株LA140所产生的低温淀粉酶在30℃下保温60分钟仍可保持80％以上的相对酶活力，具有较高的热稳定性。
实施例8：金属离子对低温淀粉酶酶活力的影响作用
金属离子对低温淀粉酶的影响作用按上述酶活性测定法，在pH＝5.7的磷酸缓冲液中添加Ca2+、Mn2+、Cu2+、Na2+、Fe3+、Hg2+、Mg2+、K+、Pb2+，使其终浓度达到0.02M。按上述测定方法对酶活性进行测定。以未加金属离子的处理为对照，设定其相对酶活力为100％。金属离子对酶活力的影响作用如图4所示。Ca2+、K+、Cu2+、Fe3+对本发明的低温淀粉酶具有的激活作用，特别是Ca2+对酶的激活作用显著；Hg2+、Mg2+、Pb2+对酶活性具有不同程度的抑制作用，其余金属离子对低温淀粉酶无明显的激活或抑制作用。

Claims (9)

1、一种具有产生低温淀粉酶能力的中间气单孢菌(Aeromonasmedia)CGMCC.No.1490。
2、一种低温淀粉酶的生产方法，其包括，
A：对中间气单孢菌(Aeromonas media)CGMCC.No.1490进行菌种活化培养步骤；
B：利用步骤A获得的活化菌种进行发酵步骤。
3、如权利要求2所述的生产方法，其特征在于，所述的活化菌种进行发酵步骤中选用的发酵培养基中，最优碳源为玉米粉，其用量为0.5-1.5％，最优氮源为蛋白胨、酵母膏、牛肉膏，其中蛋白胨用量为0.2-1.0％，酵母膏用量为0.1-0.2％，牛肉膏用量为0.5-1.0％；
以上％为W/V。
4、如权利要求2所述的生产方法，其特征在于发酵步骤中，接种量按体积比为5％-15％，发酵温度15℃-25℃，生长pH范围为5.6-7.4，转速为150-200rpm，发酵周期36-60小时。
5、如权利要求3所述的生产方法，其特征在于发酵中，最适发酵培养温度为20℃，最适生长pH为7.0。
6、一种低温淀粉酶，其利用权利要求1所述的中间气单孢菌(Aeromonas media)CGMCC.No.1490，由权利要求2所述的生产方法制备而成。
7、如权利要求6所述的低温淀粉酶，其特征在于，该低温淀粉酶具有较高的热稳定性，在5℃-40℃范围内均有酶学活性，在30℃保温60分钟，仍可保持80％的相对酶学活性，在5℃仍可保持50％的相对酶学活性，在pH4—8范围内均有酶学活性。
8、如权利要求7所述的低温淀粉酶，其特征在于，该酶最适酶解温度为30℃，最适酶解pH6.4。
9、如权利要求7所述的低温淀粉酶，其特征在于，金属离子对低温淀粉酶的活性有影响作用，其中Ca2+、K+、Cu2+、Fe3+对其具有激活作用，Hg2+、Mg2+、Pb2+对其酶学活性具有抑制作用。
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