CN105420213A - 一种畜禽饲料专用低温淀粉酶的制备方法 - Google Patents

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CN105420213A CN201510922478.4A CN201510922478A CN105420213A CN 105420213 A CN105420213 A CN 105420213A CN 201510922478 A CN201510922478 A CN 201510922478A CN 105420213 A CN105420213 A CN 105420213A
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases

Abstract

本发明提供了一种畜禽饲料专用低温淀粉酶的制备方法，包括如下步骤：1)一级斜面培养2)二级培养3)三级扩大培养4)固体发酵或1’)一级斜面培养2’)二级斜面培养3’)固体发酵。本发明的一种畜禽饲料专用低温淀粉酶的制备方法采用固体发酵工艺研制和生产，其最适作用温度条件较低，在动物体温(38-42℃)的条件下具有很强的活性，发挥最佳活性的pH值(4-6)范围和畜禽胃肠道pH值相吻合，具有优越的过胃性能，能抵抗胃酸和胃蛋白酶的破坏，耐热性能良好，能抵抗饲料制粒过程中的高温，储存稳定性好，是一种高效内切型淀粉酶，且是一种无毒副作用、无污染、无残留、安全高效的绿色饲料添加剂。

Description

一种畜禽饲料专用低温淀粉酶的制备方法
技术领域
本发明属于饲料添加剂领域，具体涉及一种畜禽饲料专用低温淀粉酶的制备方法。
背景技术
畜禽对营养物质的消化、吸收和代谢都是在酶的作用下进行的。饲用酶制剂是由微生物发酵产生的一种天然、绿色、安全、高效的新型饲料添加剂，对畜禽具有多种重要的生物学功能，而其中最重要也是最直接的功能就是帮助畜禽提高对营养物质的消化和利用。在饲料中添加外源性消化酶可以促进畜禽对饲料养分的消化、吸收和利用已经被大量试验所证实。淀粉酶是消化酶中的关键酶，畜禽对淀粉的消化利用主要依靠淀粉酶的水解作用。通过在饲料中添加外源性淀粉酶以提高淀粉的消化利用率可以看作是动物体内消化的一种延伸。
畜禽日粮中，作为能量饲料原料，玉米的使用非常普遍，一般占日粮总量的50-70％。玉米中的淀粉是畜禽主要的能量来源，由淀粉酶水解淀粉产生的葡萄糖所提供的能量约占动物总能量需求的60-80％。在常规情况下，任何饲料都不会被完全消化。过去，许多人认为玉米中的淀粉消化性良好，消化率超过90％，而事实并非如此。Noy和Sklan(1995)等研究发现，在理想状态下，4-12日龄肉鸡日粮中淀粉的回肠末端消化率很少超过85％，肉仔鸡(4-21日龄)小肠末端消化率仍然仅为82％。对回肠食糜进行显微镜检查发现，回肠内有大量未消化玉米胚乳成分，鸡日龄增加时消化率也没有提高的现象。大量实验也都证明了淀粉的低消化率。究其原因，一方面，畜禽处于幼龄阶段，消化器官发育不成熟，自身分泌的淀粉酶不足和酶活性较低在很大程度上限制了淀粉的消化吸收。另一方面，现代畜禽养殖模式都是向集约化、规模化发展，生长速度快、生产周期短，饲养密度过高，加之饲料配方趋于富营养化，这些特点很容易对动物造成不同程度地应激，应激会对动物消化生理和消化酶的分泌造成一定的影响，降低饲料养分的消化利用。即使是在动物生长的中后期，其对淀粉的消化率也不是100％，仍有部分抗性淀粉未能被消化利用。畜禽对淀粉的消化不完全不仅使能量利用率降低，更造成了饲料资源的严重浪费。
玉米中的淀粉含量高达60％-65％，即使是淀粉消化率的轻微改善也能对能量的利用率产生显著的影响。通过在畜禽饲料中添加外源性淀粉酶来提高饲料淀粉的消化，对于提高动物生产性能、节约饲料资源具有非常重大的意义。
目前，饲料工业缺乏专门针对畜禽消化道生理特点而开发的淀粉酶，一般均采用中温淀粉酶。中温淀粉酶主要通过液体发酵方式生产，它是一种应用于食品加工、化纤、印染等行业的工业用酶。该酶作用温度较高，最适作用温度是70-80℃，而动物消化道环境温度一般为37-40℃，中温淀粉酶在动物体温的温度条件下活性很低。同时，中温淀粉酶耐胃酸性能差，最适作用pH6.0-6.4，pH5.0以下即严重失活，无法过胃进入肠道发挥有效作用。在畜禽日粮中添加中温淀粉酶起不到提高淀粉消化率的目的。因此，开发高效酶切、低成本的饲料专用的低温淀粉酶对提高饲料利用率、节约饲料资源、增进动物健康、降低污染物排放具有十分重要的意义。
从动物消化生理特点来看，饲料专用的淀粉酶应满足以下条件才能真正发挥作用：⑴在动物体温(37-42℃)的温度条件下能发挥较高的活性；⑵最适作用pH值与消化道内食糜的pH一致；⑶对淀粉有较高的酶解效率(内切酶)；⑷具有良好的稳定性，包括在饲料高温制粒过程中的温度性，保存过程中的温度性以及在动物消化道中对胃酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶、金属离子等的耐受性。
发明内容
本发明提供了一种畜禽饲料专用低温淀粉酶的制备方法，该低温淀粉酶解决了现有技术中淀粉酶生效温度高的问题，应用于猪、鸡等畜禽等配合饲料，以提高畜禽对淀粉的消化利用率，解决畜禽对淀粉的消化利用率低的问题，节约饲料资源。
一种畜禽饲料专用低温淀粉酶，其产酶菌种在CA培养基上菌落直径为6.8mm～7.0mm，菌落中央橄榄绿色，周边黄绿色，菌丛厚度适中，丝绒状，无渗出液，无色素，菌落反面青灰色；孢梗茎较长，壁粗糙，宽7.0～14μm；分生孢子头辐射状，直径45～80μm；顶囊烧瓶形或倒梨形，长轴为20～40μm，表面二分之一伙四分之三可育；产孢结构大多为单层，瓶梗8.0～11μm×2.0～5.0μm；分生孢子椭圆形3.5～5.0μm×2.5～4.2μm，壁平滑。
本发明的一种畜禽饲料专用低温淀粉酶的制备方法，包括以下步骤：
1)一级斜面培养：将低温淀粉酶产酶菌种接种至斜面培养基上，25℃～35℃培养4～8d，得到一级斜面种子孢子；
2)二级培养：将步骤1)中的一级斜面种子孢子接种于液体培养基中，装液量为50～100mL/500mL，25℃～35℃、160～300rpm/min条件下培养48～55h得到二级种子液；
3)三级扩大培养：将步骤2)中得到的二级种子液体积百分比0.5％～10％接种于发酵罐内，在液体培养基中25℃～45℃、160～300rpm/min条件下培养20～36h，得到三级种子液；
4)固体发酵：将步骤3)的三级种子液的液体培养基按1％～10％的重量比接入固体发酵培养基中，培养基含水量为49％～65％，pH为5.0～7.0，曲房相对湿度保持在95％以上，料温为30℃～45℃，采用固体发酵48～72h；
或者
1’)一级斜面培养：将低温淀粉酶产酶菌种接种至斜面培养基上，25℃～35℃培养4～8d，得到一级斜面种子孢子；
2’)二级斜面培养：将步骤1’)中的一级斜面种子孢子接种于内含斜面培养基的二级茄形培养瓶斜面，25℃～35℃培养4～8d得到二级斜面孢子；
3’)固体发酵：将步骤2’)的二级斜面孢子制备为孢子悬液，按1个茄形培养瓶孢子悬液接种于100kg固体发酵培养基中，培养基含水量为50％～65％，pH为5.0～7.0，曲房相对湿度保持在95％以上，料温为30℃～45℃，采用固体发酵48～72h。
进一步的，步骤1)或1’)或2’)中所述斜面培养基为按下述比例配制的混合液：硝酸钠3.0～5.0g/L、磷酸氢二钾0.5～1.5g/L、硫酸镁0.5～5g/L、氯化钾1.0～10g/L、硫酸亚铁1～5g/L、蔗糖10～30g/L、琼脂15g。
进一步的，步骤2)或3)中所述的液体培养基为按下述比例配制的混合液：玉米淀粉5～40g/L、豆粕粉5～20g/L、葡萄糖3～12g/L、胰蛋白胨10～25g/L、牛肉膏5～10g/L、磷酸二氢钾1～5g/L、硫酸镁1～5g/L、碳酸钙1～5g/L。
进一步的，步骤2)或3)中所述的液体培养基为按下述比例配制的混合液：麦芽糊精5～20g/L、玉米淀粉5～40g/L、豆粕粉5～20g/L、葡萄糖3～12g/L、胰蛋白胨10～25g/L、牛肉膏5～10g/L、磷酸二氢钾1～5g/L、硫酸镁1～5g/L、碳酸钙1～5g/L。
进一步的，步骤4)中所述固体发酵培养基为按下述质量比配制：麸皮30％～40％，玉米粉1％～5％，豆粕粉30％～40％，葡萄糖0.1％～2％，氯化钠2％～5％，磷酸氢二钾0.2％～1％，硫酸锰0.1％～0.5％，碳酸钙0.5％～2％，氯化铵0.5％～1％，pH5.0～7.0。
进一步的，步骤4)中所述固体发酵培养基为按下述质量比配制：麸皮55％～70％，豆粕10％～30％，玉米粉1％～5％，麦芽糊精1％～5％，碳酸钙1％～5％，蔗糖0.1％～1％，乳糖0.5％～1.5％，葡萄糖0.1％～1％，酵母膏0.1％～1％，pH5.0～7.0。
进一步的，步骤3’)中所述固体发酵培养基为按下述质量比配制：麸皮55％～70％，豆粕10％～30％，玉米粉1％～5％，蔗糖0.1％～1％，乳糖0.5％～1.5％，葡萄糖0.1％～1％，酵母膏0.1％～1％，pH5.0～7.0。
本发明的低温淀粉酶与现有市售中温淀粉酶产品相比，它采用固体发酵工艺研制和生产，最适作用温度条件较低，在动物体温(38-42℃)的条件下具有很强的活性，发挥最佳活性的pH值(4-6)范围和畜禽胃肠道pH值相吻合，具有优越的过胃性能，能抵抗胃酸和胃蛋白酶的破坏，耐热性能良好，能抵抗饲料制粒过程中的高温，储存稳定性好，是一种高效内切型淀粉酶。饲料在畜禽胃内有2～3个小时的停留时间，中温淀粉酶因耐酸性能差过不了胃而无法有效发挥作用，低温淀粉酶在胃内即可把淀粉水解为糊精、低聚糖、麦芽糖、葡萄糖等易于被肠道消化吸收的成分，减少小肠的消化负担，提高淀粉的消化吸收。
本发明的低温淀粉酶在每吨全价配合饲料中的添加量为100-1000克。
在畜禽饲料中添加本发明的低温淀粉酶，可显著促进动物对淀粉的消化吸收，提高饲料利用率，降低料重比，提高动物生长速度和均匀度，降低后肠有害微生物发酵，减少营养性腹泻，改善动物皮色和毛色，解决了畜禽对淀粉的消化利用率低的问题，节约饲料资源，具有很好的产业效益，是一种无毒副作用、无污染、无残留、安全高效的绿色饲料添加剂。
具体实施方式
下面通过实例进一步描述本发明的特征，但本发明并不局限于下述实例。
实施例1
本实施例的一种畜禽饲料专用低温淀粉酶的制备方法，包括以下步骤：
1)一级斜面培养：将低温淀粉酶产酶菌种接种至斜面培养基上，25℃～35℃培养4～8d，得到一级斜面种子孢子；斜面培养基为按下述比例配制的混合液：硝酸钠3.0～5.0g/L、磷酸氢二钾0.5～1.5g/L、硫酸镁0.5～5g/L、氯化钾1.0～10g/L、硫酸亚铁1～5g/L、蔗糖10～30g/L、琼脂15g；
2)二级培养：将步骤1)中的一级斜面种子孢子接种于液体培养基中，装液量为50～100mL/500mL，25℃～35℃、160～300rpm/min条件下培养48～55h得到二级种子液；液体培养基为按下述比例配制的混合液：玉米淀粉5～40g/L、豆粕粉5～20g/L、葡萄糖3～12g/L、胰蛋白胨10～25g/L、牛肉膏5～10g/L、磷酸二氢钾1～5g/L、硫酸镁1～5g/L、碳酸钙1～5g/L；
3)三级扩大培养：将步骤2)中得到的二级种子液体积百分比0.5％～10％接种于发酵罐内，在液体培养基中25℃～35℃、160～300rpm/min条件下培养20～36h，得到三级种子液；液体培养基为按下述比例配制的混合液：玉米淀粉5～40g/L、豆粕粉5～20g/L、葡萄糖3～12g/L、胰蛋白胨10～25g/L、牛肉膏5～10g/L、磷酸二氢钾1～5g/L、硫酸镁1～5g/L、碳酸钙1～5g/L；
4)固体发酵：将步骤3)的三级种子液的液体培养基按1％～10％的重量比接入固体发酵培养基中，培养基含水量为49％～58％，pH为5.0～7.0，曲房相对湿度保持在95％以上，料温为30℃～45℃，采用固体发酵48～72h；固体发酵培养基为按下述质量比配制：麸皮30％～40％，玉米粉1％～5％，豆粕粉30％～40％，葡萄糖0.1％～2％，氯化钠2％～5％，磷酸氢二钾0.2％～1％，硫酸锰0.1％～0.5％，碳酸钙0.5％～2％，氯化铵0.5％～1％，pH5.0～7.0；低温淀粉酶酶活达到4500U/g。
实施例2
本实施例的一种畜禽饲料专用低温淀粉酶的制备方法，包括以下步骤：
1)一级斜面培养：将低温淀粉酶产酶菌种接种至斜面培养基上，25℃～35℃培养4～8d，得到一级斜面种子孢子；斜面培养基为按下述比例配制的混合液：硝酸钠3.0～5.0g/L、磷酸氢二钾0.5～1.5g/L、硫酸镁0.5～5g/L、氯化钾1.0～10g/L、硫酸亚铁1～5g/L、蔗糖10～30g/L、琼脂15g；
2)二级培养：将步骤1)中的一级斜面种子孢子接种于液体培养基中，装液量为50～100mL/500mL，25℃～35℃、160～300rpm/min条件下培养48～55h得到二级种子液；液体培养基为按下述比例配制的混合液：玉米淀粉5～40g/L、豆粕粉5～20g/L、葡萄糖3～12g/L、胰蛋白胨10～25g/L、牛肉膏5～10g/L、磷酸二氢钾1～5g/L、硫酸镁1～5g/L、碳酸钙1～5g/L；
3)三级扩大培养：将步骤2)中得到的二级种子液体积百分比0.5％～10％接种于发酵罐内，在液体培养基中30℃～45℃、160～300rpm/min条件下培养20～36h，得到三级种子液；液体培养基为按下述比例配制的混合液：玉米淀粉5～40g/L、豆粕粉5～20g/L、葡萄糖3～12g/L、胰蛋白胨10～25g/L、牛肉膏5～10g/L、磷酸二氢钾1～5g/L、硫酸镁1～5g/L、碳酸钙1～5g/L；
4)固体发酵：将步骤3)的三级种子液的液体培养基按1％～10％的重量比接入固体发酵培养基中，培养基含水量为49％～58％，pH为6.0～7.0，曲房相对湿度保持在95％以上，料温为30℃～45℃，采用固体发酵48～72h；固体发酵培养基为按下述质量比配制：麸皮55％～70％，豆粕10％～30％，玉米粉1％～5％，麦芽糊精1％～5％，碳酸钙1％～5％，蔗糖0.1％～1％，乳糖0.5％～1.5％，葡萄糖0.1％～1％，酵母膏0.1％～1％，pH5.0～7.0；低温淀粉酶酶活达到4000U/g。
实施例3
本实施例的一种畜禽饲料专用低温淀粉酶的制备方法，包括以下步骤：
1)一级斜面培养：将低温淀粉酶产酶菌种接种至斜面培养基上，25℃～35℃培养4～8d，得到一级斜面种子孢子；斜面培养基为按下述比例配制的混合液：硝酸钠3.0～5.0g/L、磷酸氢二钾0.5～1.5g/L、硫酸镁0.5～5g/L、氯化钾1.0～10g/L、硫酸亚铁1～5g/L、蔗糖10～30g/L、琼脂15g；
2)二级培养：将步骤1)中的一级斜面种子孢子接种于液体培养基中，装液量为50～100mL/500mL，25℃～35℃、160～300rpm/min条件下培养48～55h得到二级种子液；麦芽糊精5～20g/L、玉米淀粉5～40g/L、豆粕粉5～20g/L、葡萄糖3～12g/L、胰蛋白胨10～25g/L、牛肉膏5～10g/L、磷酸二氢钾1～5g/L、硫酸镁1～5g/L、碳酸钙1～5g/L；
3)三级扩大培养：将步骤2)中得到的二级种子液体积百分比0.5％～10％接种于发酵罐内，在液体培养基中30℃～45℃、160～300rpm/min条件下培养20～36h，得到三级种子液；麦芽糊精5～20g/L、玉米淀粉5～40g/L、豆粕粉5～20g/L、葡萄糖3～12g/L、胰蛋白胨10～25g/L、牛肉膏5～10g/L、磷酸二氢钾1～5g/L、硫酸镁1～5g/L、碳酸钙1～5g/L；
4)固体发酵：将步骤3)的三级种子液的液体培养基按1％～10％的重量比接入固体发酵培养基中，培养基含水量为50％～65％，pH为5.0～7.0，曲房相对湿度保持在95％以上，料温为30℃～45℃，采用固体发酵48～72h；固体发酵培养基为按下述质量比配制：麸皮55％～70％，豆粕10％～30％，玉米粉1％～5％，麦芽糊精1％～5％，碳酸钙1％～5％，蔗糖0.1％～1％，乳糖0.5％～1.5％，葡萄糖0.1％～1％，酵母膏0.1％～1％，pH5.0～7.0；低温淀粉酶酶活达到3500U/g。
实施例4
本实施例的一种畜禽饲料专用低温淀粉酶的制备方法，包括以下步骤：
1’)一级斜面培养：将低温淀粉酶产酶菌种接种至斜面培养基上，25℃～35℃培养4～8d，得到一级斜面种子孢子；斜面培养基为按下述比例配制的混合液：硝酸钠3.0～5.0g/L、磷酸氢二钾0.5～1.5g/L、硫酸镁0.5～5g/L、氯化钾1.0～10g/L、硫酸亚铁1～5g/L、蔗糖10～30g/L、琼脂15g；
2’)二级斜面培养：将步骤1’)中的一级斜面种子孢子接种于内含斜面培养基的二级茄形培养瓶斜面，25℃～35℃培养4～8d得到二级斜面孢子；斜面培养基为按下述比例配制的混合液：硝酸钠3.0～5.0g/L、磷酸氢二钾0.5～1.5g/L、硫酸镁0.5～5g/L、氯化钾1.0～10g/L、硫酸亚铁1～5g/L、蔗糖10～30g/L、琼脂15g；
3’)固体发酵：将步骤2’)的二级斜面孢子制备为孢子悬液，按1个茄形培养瓶孢子悬液接种于100kg固体发酵培养基中，培养基含水量为50％～65％，pH为5.0～7.0，曲房相对湿度保持在95％以上，料温为30℃～45℃，采用固体发酵48～72h；固体发酵培养基为按下述质量比配制：麸皮55％～70％，豆粕10％～30％，玉米粉1％～5％，蔗糖0.1％～1％，乳糖0.5％～1.5％，葡萄糖0.1％～1％，酵母膏0.1％～1％，pH5.0～7.0；低温淀粉酶酶活达到3000U/g。
将以上实施例用于仔猪饲养的应用。
选取实施例2的一种畜禽饲料专用低温淀粉酶，酶活性为4000U/g。选取28日龄断奶仔猪128头，采取同窝分组的方式随机分成2组，即对照组与试验组，每组8个重复64头，直至仔猪68日龄试验结束。试验期间，试验组日粮在对照组基础上添加低温淀粉酶500克/吨，两组饲养管理条件完全相同，于断奶后15天、断奶后40天分别个体称重，记录每组耗料情况，统计试验期间日增重及料重比。试验结果如下：
试验期增重情况见表1。
表128-68日龄试验期间生产性能分析表
项目 试验组 对照组 优势％
头数 64 64 /
28日龄起始重 9.77 9.61 /
28-43日龄日增重 179.78±74.20b 134.7±91.71 33.47％
43-68日龄日增重 552.36±91.00b 487.92±102.33 13.21％
全程日增重 395.8±64.80b 339.65±85.84 16.53％
死亡率％ 0％ 0％ 0％
注：1、起始重单位：kg；日增重单位：g；2、数字右肩上标字母a表示差异显著(p<0.05)，数字右肩上标字母b表示差异极显著(p<0.01)。
由表1可知，试验组的前期(28-43日龄)日增重比对照组高45g，说明低温淀粉酶对断奶仔猪顺利过渡断奶应激有较大的帮助；整个保育期间(28-68日龄)，与对照组相比，试验组在增重上始终保持较大的优势，全程日增重提高16.53％，说明在保育仔猪饲料中添加一定量的低温淀粉酶有助于提高保育仔猪的生产性能。
试验期耗料情况见表2。
表2仔猪试验期耗料结果/kg
指标 对照组 试验组
总耗料 1750.35 1959.25
头平耗料 27.35 30.61
头平净增重 13.75 16.04
料重比 1.99 1.91
由表2可知，试验组头平耗料比对照组多了3.26kg，但其个体增重比对照组多了2.29kg，在料重比上占有绝对优势，在饲料转化率上试验组比对照组提高4.02％。从而，可以看出，低温淀粉酶对于提高保育仔猪肠道消化有明显促进作用，较好地提高了仔猪的饲料转化与吸收能力。
经济效益分析见表3。
表3保育仔猪经济效益分析表kg、元/头
项目 对照组 试验组
头平净增重 13.75 16.04
头平耗料 27.35 30.61
饲料单价 4.30 4.29
饲料成本 117.6 131.32
猪活重单价 15 15
每头增重总价 206.25 240.60
注：1、饲料单价核算：保育阶段三个料种，第一阶段6200元/吨，按每头仔猪均耗料5kg；第二阶段4200元/吨，按每头仔猪均耗料9.5kg计；第三阶段3700元/吨，根据实际耗料计算余料。试验组添加安酶乐需另加30元/吨成本；
2、对照组饲料单价：(5*6.2+8*4.2+14.35*3.7)/27.35＝4.30元/kg；
3、试验组饲料单价：(5*6.2+9.5*4.2+16.11*3.7)/30.61+0.03＝4.29元/kg。
由表3可知，扣除饲料成本，试验组每头仔猪因增重增加的毛利为109.28元，对照组为88.65元，试验组每头仔猪比对照组净利增加20.63元，提高23.27％。可以得出结论，在保育仔猪日粮中添加适当比例的低温淀粉酶，能有效提高保育仔猪的生产性能，进而直接提高猪场的经济效益；另外，试验组的皮色和毛色明显皮红毛亮，好于对照组。
选取实施例4的一种畜禽饲料专用低温淀粉酶，酶活性为3000U/g。选取28日龄胎次、体重接近的健康仔猪200头(公母各半)，采用随机分组方式分成试验组和对照组，每组4个重复，每个重复25头仔猪，试验期20天。试验期间，试验组日粮在对照组日粮基础上添加低温淀粉酶500克/吨。试验结果如下：
仔猪生产性能分析见表4
表4饲养1～20日龄试验期间生产性能分析表
项目 试验组 对照组
仔猪头数 100 100
进苗起始重(kg) 6.97±1.42 7.02±1.15
饲养10天后的平均体重(kg/头) 10.41±1.75 10.18±1.16
饲养20天后的平均体重(kg/头) 13.52±1.67 12.97±1.27
饲养天龄1～10日龄平均日增重(g/头) 344±3.6 316±3.2
饲养天龄1～20日龄平均日增重(g/头) 328±1.4 298±2.5
试验全程死亡率(％) 0 0
仔猪试验期间耗料情况见表5
表5仔猪试验期间耗料情况表
项目 试验组 对照组
总耗料(kg) 956 954.5
总增重(kg) 654.5 595.5
每头平均耗料(kg) 9.56 9.545
每头平均净增重(kg) 6.545 5.955
料肉比 1.46 1.60
表4、表5结果表明：
仔猪增重方面：按照试验设计饲喂10天和20天后，试验组和对照组各栏仔猪体重均有所增加。试验组的起始均重低于对照组，但是饲喂10天和20天后称重，试验组的平均体重均高于对照组。整个试验期间试验组仔猪的平均净增重比对照组高590g，提高了9.91％。
日增重方面：试验组饲养1～10日龄平均日增重比对照组高28g，提高了8.86％；1～20天日龄的平均日增重比对照组高30g，提高了10.07％。
仔猪耗料方面：试验期间两组的总耗料相差不大，试验组略高于对照组，但是试验组的料肉比比对照组低0.14，降低了8.75％。
仔猪健康方面：试验期间试验组和对照组仔猪均未出现明显的呼吸道和消化道疾病，两组仔猪死亡率均为0。
投入与产出经济效益分析见表6。
表6仔猪投入与产出经济效益分析表
由表6分析可知，饲喂低温淀粉酶20天试验组每头比对照组多盈利7.83元，经济效益十分可观。另外，从外观来看，试验组的皮色和毛色明显好于对照组。
选取实施例3的一种畜禽饲料专用低温淀粉酶，酶活性为3500U/g。选取1日龄健康的AA肉鸡300羽，随机分成2个处理组，每个处理组3个重复，每个重复50只。试验分为对照组(基础日粮)和试验组(基础日粮+400克/吨低温淀粉酶)，试验期42天。
低温淀粉酶对AA肉鸡生产性能的影响见表7。
表7饲养1～42日龄试验期间各项生产性能指标表
由表7中试验结果可知：
平均净增重方面：按照试验设计饲喂1～21天，试验组比对照组每只鸡平均净增重高30.99g，提高了4.29％；饲喂22～42天试验组比对照组平均净增重高75.8g，提高了4.89％。整个试验期间试验组比对照组平均净增重高106.79g，提高了4.86％。
平均日增重方面：试验组饲喂1～21天比对照组高1.48g，提高了4.29％；饲喂22～42天试验组比对照组平均日增重高3.61g，提高了5.14％。整个试验期间试验组比对照组平均日增重高2.54g，提高了4.86％。
耗料及料肉比方面：试验期间两组的总耗料相差不大试验组略微高于对照组。但是试验组饲喂1～21天料肉比比对照组低0.05，降低了3.38％；饲喂22～42天试验组比对照组平均料肉比低0.1，降低了4.83％。整个试验期间试验组比对照组料肉比低0.08，降低了4.28％。
以上实施例的一种畜禽饲料专用低温淀粉酶的制备方法采用固体发酵工艺研制和生产，其低温淀粉酶最适作用温度条件较低，在动物体温(38-42℃)的条件下具有很强的活性，发挥最佳活性的pH值(4-6)范围和畜禽胃肠道pH值相吻合，具有优越的过胃性能，能抵抗胃酸和胃蛋白酶的破坏，耐热性能良好，能抵抗饲料制粒过程中的高温，储存稳定性好，是一种无毒副作用、无污染、无残留、安全高效的绿色饲料添加剂。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (7)

1.一种畜禽饲料专用低温淀粉酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)一级斜面培养：将低温淀粉酶产酶菌种接种至斜面培养基上，25℃～35℃培养4～8d，得到一级斜面种子孢子；
2)二级培养：将步骤1)中的一级斜面种子孢子接种于液体培养基中，装液量为50～100mL/500mL，25℃～35℃、160～300rpm/min条件下培养48～55h得到二级种子液；
3)三级扩大培养：将步骤2)中得到的二级种子液体积百分比0.5％～10％接种于发酵罐内，在液体培养基中25℃～45℃、160～300rpm/min条件下培养20～36h，得到三级种子液；
4)固体发酵：将步骤3)的三级种子液的液体培养基按1％～10％的重量比接入固体发酵培养基中，培养基含水量为49％～65％，pH为5.0～7.0，曲房相对湿度保持在95％以上，料温为30℃～45℃，采用固体发酵48～72h；
或者
1’)一级斜面培养：将低温淀粉酶产酶菌种接种至斜面培养基上，25℃～35℃培养4～8d，得到一级斜面种子孢子；
2’)二级斜面培养：将步骤1’)中的一级斜面种子孢子接种于内含斜面培养基的二级茄形培养瓶斜面，25℃～35℃培养4～8d得到二级斜面孢子；
3’)固体发酵：将步骤2’)的二级斜面孢子制备为孢子悬液，按1个茄形培养瓶孢子悬液接种于100kg固体发酵培养基中，培养基含水量为50％～65％，pH为5.0～7.0，曲房相对湿度保持在95％以上，料温为30℃～45℃，采用固体发酵48～72h。
2.根据权利要求1所述的一种畜禽饲料专用低温淀粉酶的制备方法，其特征在于：步骤1)或1’)或2’)中所述斜面培养基为按下述比例配制的混合液：硝酸钠3.0～5.0g/L、磷酸氢二钾0.5～1.5g/L、硫酸镁0.5～5g/L、氯化钾1.0～10g/L、硫酸亚铁1～5g/L、蔗糖10～30g/L、琼脂15g。
3.根据权利要求1所述的一种畜禽饲料专用低温淀粉酶的制备方法，其特征在于：步骤2)或3)中所述的液体培养基为按下述比例配制的混合液：玉米淀粉5～40g/L、豆粕粉5～20g/L、葡萄糖3～12g/L、胰蛋白胨10～25g/L、牛肉膏5～10g/L、磷酸二氢钾1～5g/L、硫酸镁1～5g/L、碳酸钙1～5g/L。
4.根据权利要求1所述的一种畜禽饲料专用低温淀粉酶的制备方法，其特征在于：步骤2)或3)中所述的液体培养基为按下述比例配制的混合液：麦芽糊精5～20g/L、玉米淀粉5～40g/L、豆粕粉5～20g/L、葡萄糖3～12g/L、胰蛋白胨10～25g/L、牛肉膏5～10g/L、磷酸二氢钾1～5g/L、硫酸镁1～5g/L、碳酸钙1～5g/L。
5.根据权利要求1所述的一种畜禽饲料专用低温淀粉酶的制备方法，其特征在于：步骤4)中所述固体发酵培养基为按下述质量比配制：麸皮30％～40％，玉米粉1％～5％，豆粕粉30％～40％，葡萄糖0.1％～2％，氯化钠2％～5％，磷酸氢二钾0.2％～1％，硫酸锰0.1％～0.5％，碳酸钙0.5％～2％，氯化铵0.5％～1％，pH5.0～7.0。
6.根据权利要求1所述的一种畜禽饲料专用低温淀粉酶的制备方法，其特征在于：步骤4)中所述固体发酵培养基为按下述质量比配制：麸皮55％～70％，豆粕10％～30％，玉米粉1％～5％，麦芽糊精1％～5％，碳酸钙1％～5％，蔗糖0.1％～1％，乳糖0.5％～1.5％，葡萄糖0.1％～1％，酵母膏0.1％～1％，pH5.0～7.0。
7.根据权利要求1所述的一种畜禽饲料专用低温淀粉酶的制备方法，其特征在于：步骤3’)中所述固体发酵培养基为按下述质量比配制：麸皮55％～70％，豆粕10％～30％，玉米粉1％～5％，蔗糖0.1％～1％，乳糖0.5％～1.5％，葡萄糖0.1％～1％，酵母膏0.1％～1％，pH5.0～7.0。
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