CN111592999B - 一种简单芽孢杆菌及其生产低温淀粉酶的应用 - Google Patents

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    • C12N9/2411—Amylases

Abstract

本发明提供一种简单芽孢杆菌（Bacillus simplex）SX‑GL4，所述简单芽孢杆菌（Bacillus simplex）SX‑GL4于保藏日期是2019年11月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号码是CGMCC No.18952；本发明的有益效果是：简单芽孢杆菌的新种，研究发现该菌株能够产生低温淀粉酶，同时该菌株适应低温及偏碱性环境的特性，在食品和洗涤行业具有非常大的应用潜力，该研究的发现不仅丰富了简单芽孢杆菌属下的种类，同时，也丰富了产品剂型、为作物生产提供了安全保障。

Description

一种简单芽孢杆菌及其生产低温淀粉酶的应用
技术领域
本发明涉及土壤微生物领域，尤其是一种简单芽孢杆菌及其生产低温淀 粉酶的应用。
背景技术
自然界中有许多微生物都能够产生淀粉酶，如根霉、曲霉、芽孢杆菌等。 淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总成，本着营养、健康、安全的宗旨，低温 淀粉酶非热加工已经成为一种新型果蔬加工技术，具有减少营养损失、降低 损耗和保持新鲜度等优点，能够提高果蔬加工产品品质，便于生产过程的控 制和食品安全监控。
低温淀粉酶一般来源与低温微生物，通常情况下，在相对较低温范围内， 低温淀粉酶的活性比相应的嗜温淀粉酶要高。现有技术中，研究的酶多为中 高温淀粉酶，这些酶在较高温度下才具有较好的催化活性，耗费能量较多， 如果采用低温淀粉酶则可以节约能量，降低生产成本，生产前景广阔。同时， 研究新的产低温淀粉酶的菌株能够扩大微生物资源库，增加生物的多样性。
发明内容
本发明克服了现有技术中的不足，目的是提供了一种简单芽孢杆菌 (Bacillussimplex)以及简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)能够生产低温淀粉 酶的应用。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现。
一种简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)SX-GL4，所述简单芽孢杆菌(Bacillussimplex)SX-GL4于保藏日期是2019年11月15日，保藏于中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号码是CGMCC No.18952。
本发明还提供了一种简单芽孢杆菌用于生产低温淀粉酶的应用。
进一步，所述简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)SX-GL4的低温淀粉酶的 酶活力测定方法，包括：
配置反应试剂，所述反应试剂包括：柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液、淀粉 溶液、粗酶液以及蒸馏水；
将反应试剂混合均匀，室温反应10min，将所述反应试剂与碘液混匀测 定OD620值；
将所述OD620值代入工作曲线，计算剩余淀粉含量，求得酶活力，其中， 反应淀粉量(mg)＝8mg-剩余淀粉含量(mg)。
进一步，所述柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配置步骤为：
称取柠檬酸(含2水)21.01g，溶于1000mL蒸馏水中，备用；称取无 水磷酸氢二钠28.40g，溶于1000mL蒸馏水中，备用；取0.1moL/L柠檬酸溶 液7.37mL和0.2moL/L磷酸氢二钠溶液12.63mL混合。
进一步，所述粗酶液的配置步骤为：
将所述简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)SX-GL4菌株接入100ml种子培 养液，20℃、140r/min条件下培养2d，得到种子液；
按0.2％-17％接种量将种子液加到发酵培养液中，20℃、140r/min条件 下培养2d，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，滤液为所述粗酶液。
进一步，所述简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)SX-GL4的最佳碳源为麦 芽糖。
进一步，所述简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)SX-GL4的最适氮源为复 合氮源，所述复合氮源为牛肉膏和蛋白胨，其中，牛肉膏和蛋白胨比例为1:1。
进一步，所述简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)SX-GL4的最适接种量为 1％。
进一步，所述简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)SX-GL4的发酵培养液的 配方为：芽糖7.15g，蛋白胨5g，牛肉膏5g，MgSO4·7H2O 0.05g，FeSO4·7H2O 0.01g，NaCl 3g，蒸馏水1000mL。
进一步，所述发酵培养液配置完成后，置于121℃、1×105Pa条件下 灭菌30min。
本发明中的简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)SX-GL4在忻州市五台县豆 村镇非耕作土壤采集到菌株后，经过分离，通过16S rDNA鉴定发现该菌株 属于简单芽孢杆菌属，发明人经过实验发现该菌株能够产生低温淀粉酶，该 菌株的发现不仅丰富了简单芽孢杆菌属下菌株的种类，同时也丰富了产品剂 型、从而为农作物生产提供产品保障。
另外，本发明中简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)SX-GL4所产低温淀粉 酶的最适反应温度为15℃，温度超过50℃将会严重影响酶的催化效率，最 适pH为8，Ca2+、紫外线、三氯甲烷对酶活力无影响，Fe2+、Cu2+、Mg2+、K+、 Na+、甲醇、二甲苯、乙酸和石油醚等对酶活力的影响尚在可控范围。淀粉酶 是一类非常重要的工业用酶，已广泛应用于食品、医药、洗涤、环保、纺织 等各个方面，该低温淀粉酶适应低温及偏碱性环境的特性，在食品和洗涤行业具有非常大的应用潜力。
附图说明
图1是本发明菌株的16S rDNA序列的系统进化发育树分析图；
图2为本发明菌株产酶最适碳源的筛选；
图3为本发明菌株最适碳源浓度的确定；
图4为本发明菌株产酶最适氮源的筛选；
图5为本发明菌株产酶最适接种量的测定；
图6为本发明菌株产酶培养液初始pH对酶活力的影响；
图7为培养温度对本发明菌株产酶的影响；
图8为催化温度对本发明菌株产酶的影响；
图9为催化pH对本发明菌株的低温淀粉酶的影响；
图10为本发明菌株的生长曲线；
图11为本发明所产低温淀粉酶的生产曲线；
图12为本发明菌株所产低温淀粉酶的热稳定性；
图13为紫外线对本发明菌株所产低温淀粉酶稳定性的影响；
图14为金属离子对本发明菌株所产低温淀粉酶活力的影响；
图15为有机溶剂对本发明菌株所产低温淀粉酶活力的影响。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。
本发明所利用的菌株为简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)SX-GL4，是从 忻州市五台县豆村镇非耕作土壤采集分离获得的，本发明菌株已于保藏日期 是2019年11月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号码是CGMCC No.18952。
实施例1：简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)SX-GL4菌株的鉴定
简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)SX-GL4的16S rDNA基因序列鉴定
以通用引物27F(5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')和1492R(5'-GGT TAC CTTGTT ACG ACT T-3')对筛选分离出的菌株的16S rDNA进行扩增。 反应采用25μL体系：2×F8PCR MasterMix Taq 12.5μL，菌体DNA 1.0μL， 引物各0.5μL，ddH2O 10.5μL。以不加DNA模板的反应体系为阴性对照。 扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性10s，55℃退火30s，72℃延 伸40s，共35个循环；最后72℃延伸2min。反应终止后，用1％琼脂糖 凝胶电泳检测扩增产物，并将其送至上海生工进行测序，使用Vector NTI 7.0 拼接序列。将拼接好的序列上传至NCBI中并进行同源性比对，然后采用Mage X构建系统发育树。其中，如图1所示，为本发明简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)SX-GL4菌株的16S rDNA序列的系统进化发育树分析图。
结果表明，SX-GL4菌株与Bacillus simplex(GenBank收录号MF581431) 的16SrDNA序列相似性最高，结合其菌落颜色金黄色，形状褶皱，运能能 力差等生理生化特性，鉴定菌株为简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)，其 序列上传至NCBI上获得GenBank收录号为MN641832。
本发明SX-GL4菌株的菌落呈乳白色，边缘带有褶皱，培养两周后培养基 黄色变深，说明菌株产金黄色色素。密封培养30～40d后，菌落死亡，属于 好氧菌。菌株革兰氏染色呈阳性，具芽孢，无荚膜，无鞭毛，运动能力较弱。
实施例2：简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)生产低温淀粉酶的应用
简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)SX-GL4的低温淀粉酶的酶活力测定方 法，步骤如下：
按表1配制0～10号溶液，将1mL溶液与10mL碘液混匀测定OD620值。 根据OD620值和淀粉含量(mg)绘制工作曲线；配置反应试剂，所述反应试 剂包括：柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液、淀粉溶液、粗酶液以及蒸馏水；将反 应试剂混合均匀，室温反应10min，将所述反应试剂与碘液混匀测定OD620值； 将所述OD620值代入工作曲线，计算剩余淀粉含量，求得酶活力，其中，反应 淀粉量(mg)＝8mg-剩余淀粉含量(mg)。
上述步骤中，反应试剂包括，2mL柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液、4mL淀 粉溶液、1mL粗酶液和3mL蒸馏水。在测定OD620值时，将1mL反应液和 10mL碘液混匀测定OD620值。调零溶液为1mL蒸馏水和10mL碘液的混合 液。试验重复3次。
上述步骤中，柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配置步骤为：
称取柠檬酸(含2水)21.01g，溶于1000mL蒸馏水中，备用；称取无 水磷酸氢二钠28.40g，溶于1000mL蒸馏水中，备用；取0.1moL/L柠檬酸溶 液7.37mL和0.2moL/L磷酸氢二钠溶液12.63mL混合。在低温淀粉酶活力测 定的过程中，缓冲液现配现用。
粗酶液的配置步骤为：将所述简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)SX-GL4 菌株接入100ml种子培养液，20℃、140r/min条件下培养2d，得到种子液； 按0.2％-17％接种量将种子液加到发酵培养液中，20℃、140r/min条件下培 养2d，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，滤液为所述粗酶液。其中在本实施例中 最适接种量为1％。
种子培养液的配方为：蛋白胨10g，牛肉膏3g，葡萄糖1g，NaCl 0.5 g，蒸馏水1000mL，pH 7.0。
发酵培养液的配方为：可溶性淀粉10g，蛋白胨5g，牛肉膏5g， MgSO4·7H2O0.05g，FeSO4·7H2O 0.01g，NaCl 3g，蒸馏水1000mL， pH 7.0。
碘液的配方为：1.27g碘，3g碘化钾，蒸馏水定容至1000mL，浓度 为0.005mol/L。
表1工作曲线的制备
Figure BDA0002402105230000051
菌株产酶最适碳源的筛选
分别以碳含量为0.4％碳源(可溶性淀粉、麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、玉米 粉)替换发酵培养液中碳源，进行单因素实验，探究最佳碳源。按1％接种量 将种子液分别接入含不同碳源的发酵培养液中，20℃ 140r/min培养72h。 按照上述方法测定低温淀粉酶的活力。试验重复3次，结果如图2所示，麦 芽糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖和玉米粉均可作为SX-GL4的有效碳源，促进低 温淀粉酶的合成。其中，麦芽糖是SX-GL4菌株产酶的最佳碳源，显著优于 其他碳源，而玉米粉最差。
菌株产酶最适碳源浓度的确定
在确定了最适碳源的基础上，按照0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、1.0％、1.5％、2.0％和2.5％最适碳源的浓度配制发酵培养液，探 究最适碳源最佳浓度。按1％接种量将种子液分别接入含最适碳源不同浓度的 发酵培养液中，20℃140r/min培养72h。按照上述方法测定低温淀粉酶 的活力。试验重复3次，结果如图3所示，麦芽糖浓度在0.2％～0.4％时SX-GL4 所产低温淀粉酶的酶活力达到最高，为碳源最适浓度。在效果相同的结果下， 考虑到经济节约选取0.2％的麦芽糖浓度作为后期发酵中的碳源浓度。
菌株产酶最适氮源的筛选
以最适碳源为本试验碳源，在确定最适碳源浓度的基础上，分别加入含 氮量为0.14％的不同氮源(蛋白胨、牛肉膏+蛋白胨、牛肉膏、大豆粉和硝酸 铵)替换原发酵培养液中的氮源，探究最佳氮源种类。按1％接种量将种子液 分别接入含不同氮源的发酵培养液中，20℃ 140r/min培养72h。按照上 述方法测定低温淀粉酶的活力。试验重复3次，结果如图4所示，复合氮源 (牛肉膏和蛋白胨)、牛肉膏、蛋白胨、豆饼粉和硝酸铵均有利于SX-GL4菌株代谢产酶。在这些供试氮源中，SX-GL4利用复合氮源(牛肉膏和蛋白胨) 所产的低温淀粉酶酶活力最高，与利用牛肉膏的无显著差异(P>0.05)， 但比其余3种要好(P<0.05)，可以作为SX-GL4菌株的最适氮源。
菌株产酶最适接种量的测定
根据已确定的最佳营养源及浓度，配制改良后的发酵培养液，在其中分 别接入0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％、3.0％、5.0％、7.0％、9.0％、11.0％、 13.0％和17.0％的种子液，探究最适接种量。20℃ 140r/min培养72h。按 照上述方法测定低温淀粉酶的活力。试验重复3次，结果如图5所示，接种 量0.2％～17％下均可促进SX-GL4菌株产低温淀粉酶。SX-GL4菌株在接种量为1％时其产的低温淀粉酶活力最高，且显著优于其他接种量(P<0.05)。故 选取1％的接种量为后期发酵中的接种浓度。
菌株产酶培养液初始最适pH的测定
调节改良发酵培养液的pH值，使其初始pH值分别为3、4、4.5、5、5.5、 6、6.5、7、7.5、8、9和10，探究其最适初始pH值。按最适接种量将种子 液分别接入初始pH值不同的改良后的发酵培养液中，20℃ 140r/min培养 72h。按照上述方法测定低温淀粉酶的活力。试验重复3次，结果如图6所 示，发酵培养液的初始pH值在4.5-8之间均可促进SX-GL4菌株产低温淀粉 酶。SX-GL4菌株在初始pH值为6.5时其产的低温淀粉酶活力最高，且显著 优于其他pH值环境下(P<0.05)。故选取pH＝6.5作为后期发酵中的初始 pH值。
菌株产酶最适培养温度的测定
按最适接种量将种子液接入最适初始pH值的改良后的发酵培养液中， 分别置于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃和30℃下140r/min培养72h。 按照上述方法测定低温淀粉酶的活力。试验重复3次，结果如图7所示，培 养温度在5～30℃之间均可促进SX-GL4菌株产低温淀粉酶。在20℃时所产 低温淀粉酶的活力最高，但与15℃的差异不显著，显著高于5℃、10℃、25℃ 和30℃的(P<0.05)。在效果相同的结果下，考虑到经济节约选取20℃ 作为后期发酵中的培养温度。
菌株所产酶最适催化温度的测定
按最适接种量将种子液接入最适初始pH值的改良后的发酵培养液中， 置于最适培养温度下培养72h。先制备粗酶液，并将粗酶液、柠檬酸-磷酸 二氢钠缓冲液、淀粉溶液、蒸馏水等反应所需试剂各分6份，分别在5℃、 10℃、15℃、20℃、25℃和30℃下预冷1h。按照反应试剂的配方混合粗酶 液和其他反应试剂，并继续在预冷温度下反应10min，立刻将1mL反应试 剂和10mL碘液混匀测定OD620值。调零溶液为1mL蒸馏水和10mL碘液的 混合液。按照上述的公式测定低温淀粉酶的酶活力。试验重复3次，结果如 图8所示，SX-GL4菌株的低温淀粉酶在5℃时催化活性最低，其最适催化温 度为15-20℃时催化活性最强(P<0.05)，选取15℃作为SX-GL4菌株的 低温淀粉酶的最适催化温度。
菌株所产酶最适催化pH的测定
按表2配置pH为4.0、4.6、5.0、5.6、6.0、6.6、7.0、7.6、8.0的 柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液。将粗酶液和其他反应试剂在低温淀粉酶的最适 催化温度下预冷1h。然后按照反应试剂的配方混合粗酶液和其他反应试剂， 并在最适催化温度下反应10min。按照上述的方法测定低温淀粉酶的酶活 力。试验重复3次，结果如图9所示，SX-GL4菌株的低温淀粉酶在最适催化 温度15℃下，在不同的pH环境中降解淀粉，发现低温淀粉酶的最适催化pH 值为8，酸性条件下该酶的活力相对较低，适宜于偏碱的反应环境(P<0.05)。 故选取pH＝8作为SX-GL4菌株的低温淀粉酶的最适催化pH值。
表2不同pH的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配置(mL)
Figure BDA0002402105230000081
菌株生长曲线及收获其所产酶最佳时间的测定
准备42支50mL试管，每管内加入20mL改良发酵培养液，121℃下灭 菌30min。将最佳接种量的种子液接入混入改良后的发酵培养基中，在最适 培养温度下140r/min震荡培养。每隔8h从试管中取出1mL发酵培养液， 稀释5倍，以蒸馏水调零，测OD600值，试验重复3次。以所测OD600值为纵坐 标，发酵时间为横坐标，绘制生长曲线。
同时将剩余的发酵培养基制备成粗酶液，将粗酶液和其他反应试剂在低 温淀粉酶的最适催化温度下预冷1h。然后按照反应试剂的配方混合粗酶液 和其他反应试剂，并在最适催化温度下反应10min。按照上述的方法测定低 温淀粉酶的酶活力。以酶活为纵坐标，发酵时间为横坐标，绘制酶生产曲线。 试验重复3次，结果如图10所示，菌体的浑浊度随着发酵时间的递增而缓 慢上升，88h时菌株的浑浊度最大，即菌含量达到最大，随后又呈现下降趋 势。而低温淀粉酶的生产在SX-GL4菌株培养72h时出现一个最高峰。因此， 在培养基中菌体达到最高密度(88h)之前16h，即SX-GL4菌株培养72h 时就可收获其所产的低温淀粉酶。
菌株所产酶的热稳定性测定
将反应试剂(其中柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液调至最适催化pH值)和粗 酶液在15℃、30℃、50℃、70℃、90℃下分别保温30min、60min、90min、 120min、150min、180min。然后按照反应试剂的配方混合粗酶液和其他合 反应试剂，并在最适催化温度下反应10min。按照上述的方法测定低温淀粉 酶的酶活力。试验重复3次，结果如图11所示，SX-GL4菌株所产低温淀粉 酶活力随温度的上升显著降低。当环境温度为30℃时，随着保温时间的延长， 酶活有所下降，下降率为4.8％-15.2％；当温度达到50℃和70℃时，酶活力 显著下降，活力降低了25.6％-41.7％；当环境温度达90℃时，酶失活明显， 在保温150min后酶活力基本丧失。可见，较高的温度(>50℃)严重影响 SX-GL4菌株所产低温淀粉酶的活力；在较低温度环境(15℃)下，该低温淀 粉酶才能发挥最大的催化活性。
紫外线对菌株所产酶的稳定性的影响
将粗酶液在19W紫外灯下20cm处分别照射2h、4h、6h、8h、10h。 其余反应试剂(其中柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液调至最适催化pH值)在15℃ 下保温1h。然后按照反应试剂的配方混合反应试剂和粗酶液，并在最适催 化温度下反应10min。按照上述的方法测定低温淀粉酶的酶活力。试验重复 3次，结果如图12所示，SX-GL4菌株所产低温淀粉酶经紫外线照射2h、4h、 6h、8h、10h后，其酶活性显著降低(P<0.05)，但在照射10h后也 只降低了8.4％的活力，因此虽然通过统计分析表明该低温淀粉酶对紫外线敏 感，但从其活力降低比率来说，可以认为SX-GL4菌株所产低温淀粉酶具有 较强的抗紫外线照射的能力。。
金属离子对菌株所产低温淀粉酶活力的影响
实验组：1mL粗酶液、2mL缓冲液、2mL蒸馏水、4mL淀粉溶液、1mL 0.01mol/L Fe2+、Cu2+、Mg2+、K+、Ca2+或Na+溶液；对照组：2mL缓冲液、7mL 蒸馏水、1mL 0.01mol/L Fe2+、Cu2+、Mg2+、K+、Ca2+或Na+金属离子溶液。混 匀。将实验组和对照组各试剂在15℃下保温1h后分别混匀，并在最适催化 温度下反应10min。按照上述的方法测定低温淀粉酶的酶活力。试验重复3 次，结果如图13所示，Ca2+对SX-GL4菌株所产低温淀粉酶的活力与对照(CK) 相比，无显著差异，故Ca2+不影响该酶的活力；而Fe2+、Cu2+、Mg2+、K+、Na+等离子对酶活力有显著的抑制作用(P<0.05)，但对酶活的抑制率也只在14.6-20.3％间。
有机溶剂对菌株所产低温淀粉酶活力的影响
将粗酶液10mL与等体积的甲醇、二甲苯、三氯甲烷、乙酸乙酯和石油 醚混合，震荡均匀后室温放置24h，再通过旋转蒸发仪蒸发去除有机溶剂。 取1mL处理后的粗酶液到实验组其他反应试剂混合，并在最适催化温度下 反应10min。按照上述的方法测定低温淀粉酶的酶活力。试验重复3次，结 果如图14所示，除三氯甲烷外，其他有机溶剂均可降低SX-GL4菌株所产低 温淀粉酶的活力(P<0.05)。但这5种有机溶剂对酶活力的抑制率在 1.6％-11.6％之间，因此虽然通过统计分析表明该低温淀粉酶对这些有机溶剂 敏感，但从其活力降低比率来说，可以认为SX-GL4菌株所产低温淀粉酶对 甲醇、二甲苯、乙酸、三氯甲烷和石油醚具有较强的抵抗能力。
上述实施例证明，SX-GL4所产低温淀粉酶的最适反应温度为15℃，温度 超过50℃将会严重影响酶的催化效率，最适pH为8，Ca2+、紫外线、三氯甲 烷对酶活力无影响，Fe2+、Cu2 +、Mg2+、K+、Na+、甲醇、二甲苯、乙酸和石油 醚等对酶活力的影响尚在可控范围。淀粉酶是一类非常重要的工业用酶，已 广泛应用于食品、医药、洗涤、环保、纺织等各个方面，该低温淀粉酶适应 低温及偏碱性环境的特性，在食品和洗涤行业具有非常大的应用潜力。
以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的 较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围 所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (8)

1.一种简单芽孢杆菌（Bacillus simplex）SX-GL4，其特征在于：所述简单芽孢杆菌（Bacillus simplex）SX-GL4于保藏日期是2019年11月15日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号码是CGMCC No.18952。
2.根据权利要求1所述的简单芽孢杆菌（Bacillus simplex）SX-GL4用于生产低温淀粉酶的应用。
3.根据权利要求2所述的简单芽孢杆菌用于生产低温淀粉酶的应用，其特征在于：将所述简单芽孢杆菌（Bacillus simplex）SX-GL4菌株接入100ml种子培养液，20℃、140r/min条件下培养2d，得到种子液；按0.2%-17%接种量将种子液加到发酵培养液中，20℃、140r/min条件下培养2d，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，滤液为所述粗酶液。
4.根据权利要求2所述的简单芽孢杆菌用于生产低温淀粉酶的应用，其特征在于：所述简单芽孢杆菌（Bacillus simplex）SX-GL4的最佳碳源为麦芽糖。
5.根据权利要求2所述的简单芽孢杆菌用于生产低温淀粉酶的应用，其特征在于：所述简单芽孢杆菌（Bacillus simplex）SX-GL4的最适氮源为复合氮源，所述复合氮源为牛肉膏和蛋白胨，其中，牛肉膏和蛋白胨比例为1:1。
6.根据权利要求3所述的简单芽孢杆菌用于生产低温淀粉酶的应用，其特征在于：所述简单芽孢杆菌（Bacillus simplex）SX-GL4的最适接种量为1%。
7.根据权利要求3所述的简单芽孢杆菌用于生产低温淀粉酶的应用，其特征在于，所述简单芽孢杆菌（Bacillus simplex）SX-GL4的发酵培养液的配方为：麦芽糖7.15 g，蛋白胨5g，牛肉膏5 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，NaCl 3 g，蒸馏水1000 mL。
8.根据权利要求7所述的简单芽孢杆菌用于生产低温淀粉酶的应用，其特征在于，所述发酵培养液配置完成后，置于121 ℃、1×105Pa条件下灭菌30min。
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