CN112410253B - 枯草芽孢杆菌及其抗黄曲霉和高产聚谷氨酸的应用和方法 - Google Patents

枯草芽孢杆菌及其抗黄曲霉和高产聚谷氨酸的应用和方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其保藏编号为CGMCC No.20341；含有枯草芽孢杆菌的菌剂；枯草芽孢杆菌或菌剂在抑制黄曲霉生长、降解黄曲霉毒素B1、高产γ‑聚谷氨酸中的应用；抑制黄曲霉生长的方法，使用枯草芽孢杆菌或菌剂对黄曲霉进行抑制处理；降解黄曲霉毒素B1的方法，使用枯草芽孢杆菌或菌剂对黄曲霉毒素B1进行生物降解处理；高产γ‑聚谷氨酸的方法，使用枯草芽孢杆菌或菌剂通氧发酵处理。本发明的枯草芽孢杆菌在开发抑制黄曲霉毒素产生菌生长的微生物制剂以及高产低分子量γ‑聚谷氨酸的微生物制剂方面都有很好的应用前景。

Description

枯草芽孢杆菌及其抗黄曲霉和高产聚谷氨酸的应用和方法
技术领域
本发明涉及微生物及微生物应用技术领域。更具体地说，本发明涉及一种枯草芽孢杆菌及其抗黄曲霉和高产聚谷氨酸的应用和方法。
背景技术
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种需氧菌，其生长速度快，对营养要求比较低，能高效分泌许多蛋白及代谢产物，且不会产生毒素，是一种无致病性的安全微生物。在医药卫生食品等方面用途很广。枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用。
黄曲霉菌(Aspergillus flavus)是广泛分布于自然界的一种好氧腐生型真菌，能寄生于粮食、食品及饲料中生长繁殖，并导致上述食品及饲料霉变变质，营养品质和加工品质大幅度下降，造成巨大的经济损失。此外，黄曲霉所产生的次生代谢产物黄曲霉毒素具有很强的致癌、致畸和致突变性。因此，筛选和开发能够高效抑制黄曲霉生长并降解黄曲霉毒素的安全、无毒的微生物，加强黄曲霉防控研究已成为保障我国粮食安全和食品安全的迫切需求。
聚谷氨酸(聚-γ-谷氨酸，英文poly-γ-glutamicacid，简称PGA)是自然界中微生物发酵产生的水溶性多聚氨基酸，其结构为谷氨酸单元通过α-氨基和γ-羧基形成肽键的高分子聚合物，分子量分布在50-2 000kDa之间。聚-γ-谷氨酸具有优良的水溶性、超强的吸附性和生物可降解性，降解产物为无公害的谷氨酸，是一种优良的环保型高分子材料，可作为保水剂、重金属离子吸附剂、絮凝剂、缓释剂以及药物载体等，在化妆品、环境保护、食品、医药、农业、沙漠治理等产业均有很大的商业价值和社会价值。但聚谷氨酸的分子量分布范围不同，其物化特性差异较大，例如高分子量的聚谷氨酸并不适宜于化妆品应用中，在实际生产中，当需要低分子量的聚谷氨酸时，大多采用化学降解或物理超滤截留的方法获得低分子的聚谷氨酸，因此，十分需要一种能高效生产低分子量聚谷氨酸的发酵方法。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种能抑制黄曲霉生长、降解黄曲霉毒素B1与高产低分子量γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌以及应用。
本发明的另一个目的是提供一种抑制黄曲霉生长、降解黄曲霉毒素B1、高产低分子量γ-聚谷氨酸的方法。
为了实现根据本发明的目的和其它优点，提供了一种枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，其保藏编号为CGMCC No.20341，于2020年07月10号保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)。
本发明还提供了一种含有枯草芽孢杆菌的菌剂。
本发明还提供了一种枯草芽孢杆菌或菌剂在抑制黄曲霉生长、降解黄曲霉毒素B1、高产γ-聚谷氨酸中的应用。
本发明还提供了一种抑制黄曲霉生长的方法，使用所述的枯草芽孢杆菌或所述的菌剂对黄曲霉进行抑制处理。
本发明还提供了一种降解黄曲霉毒素B1的方法，使用所述的枯草芽孢杆菌或所述的菌剂对黄曲霉毒素B1进行生物降解处理。
本发明还提供了一种高产γ-聚谷氨酸的方法，使用所述的枯草芽孢杆菌或所述的菌剂通氧发酵处理。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)可高效抑制黄曲霉生长，并高效降解黄曲霉毒素B1，还能高产低分子量的γ-聚谷氨酸，在开发抑制黄曲霉毒素产生菌生长的微生物制剂以及高产低分子量γ-聚谷氨酸的微生物制剂方面都有很好的应用前景。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为枯草芽孢杆菌对黄曲霉生长的抑制试验照片。
图2为黄曲霉毒素B1降解效果液相色谱图。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其保藏编号为CGMCC No.20341，于2020年07月10号保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
NA(牛肉膏蛋白胨琼脂培养基)：购买于北京陆桥公司，现配现用，称取33g于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，121℃高压灭菌15min，冷却至46℃倒平板。
LB液体培养基：由溶剂和溶质组成，溶质为蛋白胨、牛肉膏和NaCl，溶剂为水；蛋白胨在LB液体培养基中的浓度为1g/100mL，牛肉膏在LB液体培养基中的浓度为0.3g/100mL，NaCl在LB液体养基中的浓度为0.5g/100mL，并用NaOH调节该培养基的pH值至7.4。
PDA(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)：购买于北京陆桥公司，现配现用，称取33g于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，121℃高压灭菌15min，冷却至46℃倒平板。
黄曲霉，编号为NRRL3357，于中国科学院微生物研究所尹文兵教授处获得。
黄曲霉毒素B1免疫亲和柱：中国MZ standard，产品编号HCM0350A。
AFB1标准品：中国MZ standard，产品编号AF031。
实施例1：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的筛选、鉴定
以自然界的土壤为细菌来源，取5g土壤样品放入50mL离心管中，加入45mL去离子水，于摇床上震荡30min，静置30s，制成10-1；取100μL 10-1稀释液加900μL去离子水装入1mL EP管中，旋涡3-5s，制成10-2，取100μL 10-2稀释液加900μL去离子水装入1mL EP管中，旋涡3-5s，制成10-3，以此类推至10-6；采用NA平板，取300μl稀释液涂板，于37℃下培养24h；采用四区划线法从NA平板中挑单菌落(形状、大小、粘稠度各异)，并将单菌落加入LB液体培养基中，于37℃，180rpm(转/分钟)下培养48h，得细菌菌液，备用。
将107CFU/mL的黄曲霉孢子悬浮液点10μL于PDA平板的中央，等距离2cm处点涂10μl不同细菌菌液，待液体晾干后封口，37℃倒置培养5d，观察，选取抑制黄曲霉生长结果更好的菌株，将其于-80℃甘油保存，备用。
使用通用引物扩增16s rDNA片段，并对扩增产物进行测序，得到该菌株的16srDNA序列，然后将所得序列用BLAST比对，结果显示该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。
实施例2：枯草芽孢杆菌抑制黄曲霉生长效果的测定
菌种活化：接种实施例1得到的枯草芽孢杆菌于NA培养基上，37℃下生长24h，4℃储藏；接种黄曲霉于PDA培养基上，28℃下生长7天，4℃储藏。
枯草芽孢杆菌对黄曲霉生长抑制试验采用平板对峙方法，具体为：(1)实验组，将黄曲霉孢子悬浮液(接种浓度107CFU/mL，接种量10μL)接种于PDA培养基平板中央点，三周等距离点枯草芽孢杆菌悬浮液(接种浓度OD600＝0.8，接种量10μL)；(2)对照组为实验组基础上，三周不添加枯草芽孢杆菌悬浮液的平板；(3)实验组与对照组每组各设置3个平行，将两组样品置于培养箱中28℃培养，培养96h后观察黄曲霉的生长情况。
如图1所示，A为对照组，B为实验组。
AFB1抑制率(％)＝(对照组菌生长半径—实验组菌生长半径)/对照组菌生长半径×100。
对照组菌生长半径为3.7cm，实验组为1.9cm，因此，本申请得到的枯草芽孢杆菌对黄曲霉毒素B1(AFB1)的抑制率为48％。结果表明，枯草芽孢杆菌可有效抑制黄曲霉的生长。
实施例3：
利用实施例1得到的枯草芽孢杆菌高产γ-聚谷氨酸的方法，使用枯草芽孢杆菌或菌剂通氧发酵处理，具体步骤如下：
(1)种子液的制备：将枯草芽孢杆菌(接种浓度OD600＝0.8，接种量1％)接种到种子培养基中，摇床转速180rpm，37℃下培养24h至OD600值大于3.0，得到种子液，其中，种子培养基的浓度组成为：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠，蒸馏水配制。
(2)发酵培养：将步骤(1)中的种子液以3％的接种量接种于发酵培养基中，7.5L发酵罐发酵培养基装液量为4L，通气比控制在1.0vvm(每分钟通气量与罐体实际料液体积的比值)，初始pH值为6.5、在28℃培养48h，得到发酵液，其中，发酵培养基的浓度组成为：45g/L谷氨酸钠、50g/L柠檬酸、40g/L豆饼粉、1g/L磷酸二氢钾、0.05g/L硫酸锰、1.2g/L硫酸镁，蒸馏水配制；
(3)检测：讲步骤(2)中得到的发酵液经过稀释处理(控制浓度在1g/L以下)，然后通过高效液相色谱对稀释液中γ-聚谷氨酸分子量和产量进行检测，经稀释倍数计算得到发酵液中的γ-聚谷氨酸分子量约为89kDa，而且发酵液中γ-聚谷氨酸产量为100.8g/L。
实施例4：枯草芽孢杆菌对黄曲霉毒素B1(AFB1)的降解作用
步骤1、将枯草芽孢杆菌(接种浓度OD600＝0.8，接种量1％)接种于LB液体培养基中至初始OD600＝0.05，37℃条件下，200rpm(旋转半径20mm)震荡培养24h，10 000r/min离心10分钟，收集上清液；
步骤2、将1mg AFB1标准品溶解于10mL色谱纯甲醇中获得浓度为100ppm(mg/L)的AFB1溶液；
步骤3、制备实验组溶液：
取5mL步骤1收集的上清液，置于10mL离心管中，向离心管中加入5μL步骤2得到的AFB1溶液，充分混匀后37℃静置72h，然后10 000g离心10min并收集上清，得到实验组溶液；
步骤4、制备对照组溶液：
按照步骤3的方法，取5mL LB液体培养基替代5mL步骤1收集的上清液，其余操作不变，得到对照组溶液。
步骤5、效果检测：
实验组溶液和对照组溶液分别作为待测溶液，进行如下步骤：
1、向4体积份待测溶液中加入6体积份无水甲醇，室温震荡提取5分钟，12 000r/min离心5分钟，取上清液用于下一步净化操作；
2、取步骤1得到的上清液，使用AFB1免疫亲和柱进行除杂，具体操作如下：
取步骤1得到的上清液，使其通过AFB1免疫亲和柱，调节流速为1-2滴/s，直至空气完全通过免疫亲和柱。用10mL纯水以1-2滴/s的流速通过亲和柱，对亲和柱进行清洗。最后用1mL无水甲醇以1-2滴/s的流速淋洗亲和柱，将此洗脱液收集于1.5mL的离心管中，用0.22μm有机相尼龙膜过滤后，装入2mL色谱进样小瓶中，得到样品液。
3、取步骤2得到的样品液，用HPLC(柱后光化学衍生)对净化提取得到的样品进行检测。
HPLC检测条件为流动相甲醇:水＝7:3；流速1mL/min；色谱柱C18 150mm×4.6mm，5μm；激发波长350nm，检测波长450nm；柱温30℃；进样量20μL。
计算黄曲霉毒素B1(AFB1)降解率，计算方法为：
AFB1降解率(％)＝(对照组残留AFB1含量－实验组残留AFB1含量)/对照组残留AFB1含量×100。
实验重复五次，结果取平均值。
检测结果如图2所示，其中，A为黄曲霉毒素标准品(AFB1的保留时间为5.705min)；B为对照组(AFB1的保留时间为5.712min)；C为实验组(AFB1的保留时间为5.716min)。
对照组残留AFB1含量为97.95±0.96μg/L；
实验组残留AFB1含量为21.74±1.49μg/L；
结果表明，枯草芽孢杆菌对AFB1有较好的降解效果，降解率为77.80％。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (6)

1.枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），其特征在于，其保藏编号为CGMCC No. 20341。
2.含有如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的菌剂。
3.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌或权利要求2所述的菌剂在抑制黄曲霉生长、降解黄曲霉毒素B1或高产γ-聚谷氨酸中的应用，所述应用不包括疾病的诊断与治疗应用。
4.抑制黄曲霉生长的方法，其特征在于，使用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌或权利要求2所述的菌剂对黄曲霉进行抑制处理，所述方法不包括疾病的诊断和治疗方法。
5.降解黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，使用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌或权利要求2所述的菌剂对黄曲霉毒素B1进行生物降解处理，所述方法不包括疾病的诊断和治疗方法。
6.高产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，使用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌或权利要求2所述的菌剂通氧发酵处理。
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武国慧等.枯草芽孢杆菌发酵生产聚-γ-谷氨酸的条件优化.《食品研究与开发》.2017,(第11期),第174-179页，参见全文. *

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