CN107201322A - 用于降解黄曲霉毒素b1的枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于降解黄曲霉毒素B1的枯草芽孢杆菌及其应用，属于生物技术领域。本发明以香豆素为唯一碳源和能源进行初筛，以菌株对AFB1的降解率为复筛指标，筛选得到一株能够高效降解AFB1的枯草芽孢杆菌S1(CCTCC NO:M 2016390)。该菌株发酵液对AFB1的降解率达61.36％；以10％接种量培养后，降解率可达80.26％；发酵上清液浓缩8倍后，降解率达85.65％。研究表明，枯草芽孢杆菌S1分泌的胞外酶能够降解黄曲霉毒素B1，因此该菌株发酵液或者从菌株发酵液中分离得到的活性蛋白可用于降解黄曲霉毒素B1或者制备降解黄曲霉毒素B1的生物添加剂。

Description

用于降解黄曲霉毒素B1的枯草芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种用于降解黄曲霉毒素B1的枯草芽孢杆菌，同时还涉及该枯草芽孢杆菌的应用，属于生物技术领域。

背景技术

黄曲霉毒素(Aflatoxins,AFT)主要是由黄曲霉和寄生曲霉等多种真菌产生的高毒性次级杂环代谢产物。粮食、饲料和食品等由于储藏和运输不当，极易发生霉变产生黄曲霉毒素。黄曲霉毒素中AFB1的毒性最强，对人和动物有较强的致癌、致畸和免疫抑制作用。因此，解决粮食及饲料中黄曲霉毒素的污染问题对提高食品安全和保障动物健康具有十分重要的意义。

目前，粮食及饲料中黄曲霉毒素的去除方法主要包括物理法、化学法和生物法。但是传统的物理法和化学法存在去毒效果不稳定、营养成分损失大及适口性降低等诸多缺点。而生物法主要是采用微生物及其产物酶进行脱毒，反应条件温和，对原料性状及适口性等影响较小，还有助于增加产品的营养价值，被公认为最佳的脱毒方法。研究证明，细菌、放线菌、酵母菌、霉菌、藻类等均可用于降解黄曲霉毒素。细菌包括地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、橙色粘球菌(Myxococcus fulvus)等。

公布号CN101705203A的发明专利公开了一种用于降解黄曲霉毒素的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ANSB060(保藏编号CGMCC No.3440)，对黄曲霉毒素B1、G1的降解率均达80％以上，对M1的降解率达60％以上，降解效率高、特异性强，且为不可逆降解。公布号CN102031234A的发明专利公开了一种用于降解黄曲霉毒素的枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis ANSB324(CGMCC No.3609)，对黄曲霉毒素B1的降解率达85％，对G1、M1的降解率均达65％以上，该菌株分泌的活性蛋白解毒活性高、特异性强且作用效果温和，适用于降解去除饲料中的黄曲霉毒素，不会破坏饲料中的营养成分。但是，Bacillus subtilisANSB060和Bacillus subtilis ANSB324菌株只是对较低浓度的AFB1(终浓度0.5μg/mL)有较高的降解率(80％以上)，对高浓度AFB1的降解效果还有待提高。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于降解黄曲霉毒素B1的枯草芽孢杆菌。

同时，本发明还提供一种上述枯草芽孢杆菌的应用。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

用于降解黄曲霉毒素B1的枯草芽孢杆菌，其名称为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)S1，保藏编号：CCTCC NO:M 2016390，保藏日期：2016年7月12日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国武汉.武汉大学(湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心)。

枯草芽孢杆菌S1(CCTCC NO:M 2016390)的菌落形态为圆形，边缘整齐，中间凸起，干燥。细胞呈杆状，有芽孢；革兰氏阳性；过氧化氢：+；吲哚产生：+；淀粉水解：+；V.P：+；甲基红：-；明胶液化：+；脲酶：+；吐温80：+；硝酸盐还原：+；纤维素利用：+；50℃生长：-。

枯草芽孢杆菌S1(CCTCC NO:M 2016390)的16S rRNA基因序列(经通用引物16S27f、16S 1525r扩增)全长约1500bp，测序后在NCBI使用Blast比对，从GenBank数据库中获得相关序列进行系统发育分析，结果显示枯草芽孢杆菌S1与枯草芽孢杆菌LC155966.1的16S rRNA基因序列的同源性达到100％，结合生理生化特征，鉴定为枯草芽孢杆菌。

枯草芽孢杆菌S1(CCTCC NO:M 2016390)在降解黄曲霉毒素B1中的应用。具体为：取枯草芽孢杆菌S1进行发酵培养，所得发酵液即可用于降解黄曲霉毒素B1；或者将发酵液离心(除菌体)，分离出上清液中的活性蛋白，将该活性蛋白用于降解黄曲霉毒素B1。

枯草芽孢杆菌S1(CCTCC NO:M 2016390)在制备降解黄曲霉毒素B1的生物饲料添加剂中的应用。具体为：取枯草芽孢杆菌S1进行发酵培养，培养后离心取上清液；从上清液中分离出活性蛋白，并与辅料混合，得到生物饲料添加剂。

本发明的有益效果：

本发明以香豆素为唯一碳源和能源进行初筛，以菌株对AFB1的降解率为复筛指标，筛选得到一株能够高效降解AFB1的枯草芽孢杆菌S1(CCTCC NO:M 2016390)。该菌株发酵液对AFB1的降解率达61.36％；以10％接种量培养后，降解率可达80.26％；发酵上清液浓缩8倍后，降解率达85.65％。

枯草芽孢杆菌S1(CCTCC NO:M 2016390)分泌的胞外酶能够降解黄曲霉毒素B1，因此该菌株发酵液或者从菌株发酵液中分离得到的活性蛋白可用于降解黄曲霉毒素B1或者制备降解黄曲霉毒素B1的生物添加剂。

保藏证明和存活证明说明

保藏菌株：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S1，保藏编号：CCTCC NO:M2016390，保藏日期：2016年7月12日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国武汉.武汉大学(湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心)。

附图说明

图1为试验例中菌株不同接种量对降解率的影响；

图2为粗酶液不同降解时间对降解率的影响；

图3为菌株S1的菌落特征与细胞形态图；

图4为菌株S1的16S rRNA扩增序列电泳图。

具体实施方式

下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

实施例1

用于降解黄曲霉毒素B1的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S1，保藏编号：CCTCC NO:M 2016390，保藏日期：2016年7月12日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国武汉.武汉大学(湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心)。

实施例2

枯草芽孢杆菌S1(CCTCC NO:M 2016390)在降解黄曲霉毒素B1中的应用，包括：取枯草芽孢杆菌S1进行发酵培养，所得发酵液用于降解黄曲霉毒素B1。或者将发酵液离心(除菌体)，分离出上清液中的活性蛋白，将该活性蛋白用于降解黄曲霉毒素B1。

实施例3

枯草芽孢杆菌S1(CCTCC NO:M 2016390)在制备降解黄曲霉毒素B1的生物饲料添加剂中的应用，包括：取枯草芽孢杆菌S1进行发酵培养，培养后离心取上清液；从上清液中分离出活性蛋白，并与辅料混合，得到生物饲料添加剂。

试验例

1、材料与方法

1.1材料

PCR仪器，酶标仪，低温离心机；AFB1标准品(Pribolab)，AFB1 ELISA检测试剂盒(Pribolab)，甲醇，聚乙二醇6000，7KD透析膜。

初筛培养基(g/L)：KH₂PO₄ 0.25g，MgSO₄·7H₂O 0.25g，NH₄NO₃ 1g，FeSO₄ 0.001g，香豆素1g，琼脂17g。

种子培养基为常用的营养肉汤培养基。

1.2方法

1.2.1降解AFB1菌株的初筛

称取5g健康斑马、羊、骆驼、牦牛粪便和发霉饲料混合物，用100mL初筛培养基溶解于灭菌的250mL锥形瓶中。在37℃、160r/min的条件下震荡24h。取上清100μL涂布于初筛培养基上，37℃培养5～7d，以此方法连续筛选4次。分离、保留有能生长的菌株。

1.2.2降解AFB1菌株的复筛及AFB1含量检测

取分离菌于10mL离心管中，加入4ml营养肉汤，37℃、160r/min培养24h，取900μL发酵液与100μL AFB1(终浓度为1μg/mL)于37℃、160r/min继续培养72h，以不接菌的营养肉汤加AFB1作为空白对照。样品于12000r/min离心10min，按照ELISA试剂盒说明书，取100μL上清液，加入900μL 35％的甲醇，混匀，取上述混匀液体100μL，加入900μL样本稀释液，用酶联免疫检测仪检测。

AFB1降解率(％)＝(对照组含量-试验组含量)/对照组含量×100％。

1.2.3不同接种量对降解菌株降解AFB1的影响

取分离菌于50mL/250mL(250mL锥形瓶中装有50mL营养肉汤)营养肉汤中，37℃、160r/min培养8h后，以不同的接种量(4％、6％、8％、10％)接入100mL/250mL(250mL锥形瓶中装有100mL营养肉汤)营养肉汤中，继续培养24h。取900μL发酵液与100μL AFB1(终浓度为1μg/mL)混匀，37℃、160r/min培养72h，以不接菌的营养肉汤加AFB1作为空白对照。

1.2.4菌株粗酶液降解AFB1

菌株以10％接种量在营养肉汤中37℃、160r/min培养24h后，4℃离心(5000r/min)15min，分离上清液与菌体，上清液用0.22μm大小孔径的滤膜过滤，除去少量杂菌。过滤后的上清液于透析袋中经聚乙二醇6000浓缩8倍后，取900μL与100μL AFB1(终浓度为1μg/mL)37℃、180r/min共同孵育3h、12h、15h、24h、48h和72h，以浓缩8倍的营养肉汤加AFB1作为空白对照。

1.2.5菌株的鉴定

根据《常见细菌系统鉴定手册》中的实验方法，对高效降解AFB1的菌株进行形态特征和生理生化特性鉴定。同时提取菌株基因组总DNA，用16S rRNA通用引物16S 27f(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和16S 1525r(AAGGAGGTGATCCAGCCGCA)扩增菌株16S rRNA片段。PCR反应体系(50μL)为：2×Taq Mix 25μL，16S 27f(10μmol/L)2.5μL，16S 1525r(10μmol/L)2.5μL，细菌DNA 5μL，无菌水15μL。PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸50s，32个循环；72℃延伸8min。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物大小，然后将16S rRNA基因产物交华大基因公司测序。测序结果与NCBI中的GenBank数据库进行BLAST，分析序列同源性。

2、结果与分析

2.1降解菌株的筛选

以香豆素为选择压力，筛选到42株可生长的菌株。分别取菌株发酵液与AFB1反应进行复筛，如表1所示，有5株菌株有降解能力，其中从羊粪便混合物中分离的菌株S1降解效果最好，降解率可达61.36％。因此选择S1菌株进行后续研究。

表1分离自不同样品的降解AFB₁的菌株

2.2不同接种量对降解菌株降解AFB1的影响

不同接种量对菌株S1降解AFB1的影响如图1所示；当接种量为10％时，对AFB1的降解率最高，达80.26％；当接种量为4％、6％和8％时，降解率分别为70.13％、75.29％和62.34％。

2.3菌株粗酶液不同降解时间对AFB1降解率的影响

如图2所示，粗酶液与AFB1共同孵育3h、12h、15h、24h、48h和72h，降解率分别为10.35％、17.85％、20.46％、25.36％、45.8％和85.65％，降解率随着孵育时间的增加而增加，在72h达到最大。

2.4降解AFB1菌株的鉴定

菌株S1在LB培养基上为圆形菌落，菌落边缘整齐，中间凸起，干燥。细胞为杆状；有芽孢；革兰氏阳性；过氧化氢：+；吲哚产生：+；淀粉水解：+；V.P：+；甲基红：-；明胶液化：+；脲酶：+；吐温80：+；硝酸盐还原：+；纤维素利用：+；50℃生长：-。菌落特征与细胞形态见图3，图中A为细胞形态，B为菌落特征。

经PCR扩增得到16S rRNA基因序列，全长约1500bp(电泳结果见图4，图中M：Marker，S1：菌株S1 16S rRNA基因序列PCR产物电泳)。测序后，在NCBI上使用Blast比对，从GenBank数据库中获得相关序列并进行系统发育分析，测序结果见SEQ ID NO.1。结果表明，菌株S1与枯草芽孢杆菌(LC155966.1)16S rRNA同源性达到100％，结合生理生化特征，判定菌株S1为枯草芽孢杆菌。

3、结论

本发明以香豆素为唯一碳源和能源进行初筛，以菌株发酵液对AFB1的降解率为复筛指标，从羊粪便混合物中分离到一株能高效降解AFB1的细菌S1。当菌株S1以10％的量接种量时，其发酵液在37℃、160r/min、72h对AFB1的降解率达到80.26％。粗酶液72h内对AFB1的降解率为85.65％。结合形态鉴定、生理生化特征以及16S rRNA序列比对分析，最终判定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。试验表明，菌株S1的去毒活性物质主要存在于发酵后的上清液中，这为菌株S1应用于生物添加剂提供了有力依据。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110> 河南农业大学

<120> 用于降解黄曲霉毒素B1的枯草芽孢杆菌及其应用

<170> PatentIn version 3.5

<211> 1436

<212> RNA

<213> 扩增序列

<221> 枯草芽孢杆菌S1的16S rRNA序列

<222> (1)..(1436)

<400> 1

GTCGAGCGGA CAGATGGGAG CTTGCTCCCT GATGTTAGCG GCGGACGGGT GAGTAACACG 60

TGGGTAACCT GCCTGTAAGA CTGGGATAAC TCCGGGAAAC CGGGGCTAAT ACCGGATGGT 120

TGTTTGAACC GCATGGTTCA AACATAAAAG GTGGCTTCGG CTACCACTTA CAGATGGACC 180

CGCGGCGCAT TAGCTAGTTG GTGAGGTAAC GGCTCACCAA GGCAACGATG CGTAGCCGAC 240

CTGAGAGGGT GATCGGCCAC ACTGGGACTG AGACACGGCC CAGACTCCTA CGGGAGGCAG 300

CAGTAGGGAA TCTTCCGCAA TGGACGAAAG TCTGACGGAG CAACGCCGCG TGAGTGATGA 360

AGGTTTTCGG ATCGTAAAGC TCTGTTGTTA GGGAAGAACA AGTACCGTTC GAATAGGGCG 420

GTACCTTGAC GGTACCTAAC CAGAAAGCCA CGGCTAACTA CGTGCCAGCA GCCGCGGTAA 480

TACGTAGGTG GCAAGCGTTG TCCGGAATTA TTGGGCGTAA AGGGCTCGCA GGCGGTTTCT 540

TAAGTCTGAT GTGAAAGCCC CCGGCTCAAC CGGGGAGGGT CATTGGAAAC TGGGGAACTT 600

GAGTGCAGAA GAGGAGAGTG GAATTCCACG TGTAGCGGTG AAATGCGTAG AGATGTGGAG 660

GAACACCAGT GGCGAAGGCG ACTCTCTGGT CTGTAACTGA CGCTGAGGAG CGAAAGCGTG 720

GGGAGCGAAC AGGATTAGAT ACCCTGGTAG TCCACGCCGT AAACGATGAG TGCTAAGTGT 780

TAGGGGGTTT CCGCCCCTTA GTGCTGCAGC TAACGCATTA AGCACTCCGC CTGGGGAGTA 840

CGGTCGCAAG ACTGAAACTC AAAGGAATTG ACGGGGGCCC GCACAAGCGG TGGAGCATGT 900

GGTTTAATTC GAAGCAACGC GAAGAACCTT ACCAGGTCTT GACATCCTCT GACAATCCTA 960

GAGATAGGAC GTCCCCTTCG GGGGCAGAGT GACAGGTGGT GCATGGTTGT CGTCAGCTCG 1020

TGTCGTGAGA TGTTGGGTTA AGTCCCGCAA CGAGCGCAAC CCTTGATCTT AGTTGCCAGC 1080

ATTCAGTTGG GCACTCTAAG GTGACTGCCG GTGACAAACC GGAGGAAGGT GGGGATGACG 1140

TCAAATCATC ATGCCCCTTA TGACCTGGGC TACACACGTG CTACAATGGA CAGAACAAAG 1200

GGCAGCGAAA CCGCGAGGTT AAGCCAATCC CACAAATCTG TTCTCAGTTC GGATCGCAGT 1260

CTGCAACTCG ACTGCGTGAA GCTGGAATCG CTAGTAATCG CGGATCAGCA TGCCGCGGTG 1320

AATACGTTCC CGGGCCTTGT ACACACCGCC CGTCACACCA CGAGAGTTTG TAACACCCGA 1380

AGTCGGTGAG GTAACCTTTT AGGAGCCAGC CGCCGAAGGT GGGACAGATG ATTGGG 1436

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物16S 27f

<222> (1)..(20)

<400> 2

AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物16S 1525r

<222> (1)..(20)

<400> 3

AAGGAGGTGA TCCAGCCGCA 20

Claims (3)

1.用于降解黄曲霉毒素B1的枯草芽孢杆菌，其特征在于：该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S1，保藏编号：CCTCC NO:M 2016390。

2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在降解黄曲霉毒素B1中的应用。

3.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在制备降解黄曲霉毒素B1的生物添加剂中的应用。