CN105255774B - 降解黄曲霉毒素b1和赭曲霉毒素a的藤黄单胞菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供降解黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A的藤黄单胞菌及其应用。具体地，本发明提供一株双功能高效降解菌(Luteimonas sp.)CW574及其在降解低污染浓度黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A中的应用。与现有的黄曲霉毒素降解菌相比，本发明的菌株CW574能够在低浓度毒素污染条件下达到极佳的降解效果。在液体发酵条件下，在含有黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A终浓度20μg/L的发酵培养液中，48h菌株CW574对赭曲霉毒素A的降解率为90.1％；48h菌株CW574对黄曲霉毒素B1的降解率为85.5％。用菌株CW574处理毒素污染的饲料(终浓度20μg/kg)，48h对OTA降解率为48.3％，AFB1降解率为52.1％。菌株CW574在食品及饲料生物脱毒应用方面具有实质性的应用价值和重大意义。

Description

降解黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A的藤黄单胞菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物学及生物降解领域，具体地说，涉及一种高效降解黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A的藤黄单胞菌及其应用。

背景技术

曲霉类真菌毒素主要由黄曲霉、寄生曲霉和赭曲霉等曲霉菌产生的次生代谢产物，已分离鉴定了二十多种结构类似物，其中以黄曲霉毒素B1(AFB1)和赭曲霉毒素A(OTA)毒性最大，在农业生产和食品工业中污染最为广泛。1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织(WHO)癌症研究机构划定为Ⅰ类致癌物，因其具有强烈的致癌、致畸和致突变性，已逐渐成为公共健康和科研领域关注的焦点。黄曲霉毒素和赭曲霉毒素污染谷物和油料作物已成为全球性问题，在畜牧业中，两类曲霉毒素可通过污染饲料危害动物健康，导致畜牧业生产率低下，造成严重的经济损失，并通过直接或间接(动物产品传播)途径污染食品，影响人类的身体健康。动物从饲料中摄入AFB1或AFB2，经体内转化为AFM1或AFM2，存在于奶、肉和禽蛋中，污染人类食物链。2011年底，我国乳制品行业发生的黄曲霉毒素超标事件即为AFB1污染饲料导致奶制品AFM1超标的典型案例，已引起我国政府和食品安全部门的高度重视。随着人们对真菌毒素危害性认识的逐步加深，对于曲霉类真菌毒素检测、污染防控和脱毒技术方面的研究工作也在不断深入，其与人们生活品质、身体健康和经济利益休戚相关。

近几年，发现了多种微生物对黄曲霉毒素具有显著的降解或吸附作用。例如，丁酸弧菌属(Butyrivibrio sp.)、乳酸杆菌(Lactobacillus sp.)、链球菌(Streptococcussp.)、双歧杆菌(Bifidobacterium sp.)和不动杆菌属(Acinetobacter sp.)等。目前报道的绝大多数脱毒菌种在实际应用中存在如下两方面的共性问题：其一，部分脱毒菌种的脱毒机理属于物理吸附，并非实质性的生物降解，吸附在菌体细胞壁的毒素，在动物或人体内不同理化环境下可能发生解吸附作用，没有实质性脱毒意义；其二，报道菌种对毒素的脱毒率多数在100μg/kg以上较高浓度条件下测定，对于食品原料和饲料等复杂基质中低浓度曲霉类毒素(低于20μg/kg)的实际脱毒能力研究鲜见报道。然而，低剂量、复合污染及高污染率又是曲霉类真菌毒素污染的普遍特征，而且20μg/kg的低浓度曲霉类真菌毒素已能够对人畜脏器造成伤害，尤其是被多种毒素复合污染的农产品，其毒性更具有显著的增效作用。因此，发掘具有降解低浓度条件下，多种曲霉类真菌毒素复合污染的脱毒菌种，在农业生产和食品安全领域具有重大的实践意义和应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效降解黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A的藤黄单胞菌及其应用。

为了实现本发明目的，本发明从受多环芳烃严重污染的土壤(炼油厂、汽车修理厂附近)和受真菌毒素严重污染的霉烂食品样品中分离出一株能够高效降解黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A的菌株CW574。在显微镜或电镜下观察，该菌的主要形态学特征为：革兰氏阴性，无芽孢，杆状，无鞭毛，不运动(图1)。该菌严格好氧，最适生长温度为25-30℃，最适生长pH为7.0，在R2A培养基上培养三天后，呈现黄色圆形菌落，边缘光滑凸起，菌落直径约1.5-1.8mm。

基于菌株CW574的形态特征和16S rDNA序列(SEQ ID No.1)，参考《常见细菌系统鉴定手册》，将该菌株鉴定为藤黄单胞菌(Luteimonas sp.)。该菌株于2015年6月14日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072)，保藏编号为CCTCC NO：M 2015374。

体外试验表明，菌株CW574在短时间具有显著的赭曲霉毒素(OTA)和黄曲霉毒素B1(AFB1)的降解效果。在OTA终浓度为20μg/L的液体培养基中，菌株CW574处理48h，对OTA的降解率为90.1％；在AFB1终浓度为20μg/L的液体培养基中，菌株CW574处理48h，对AFB1的降解率为85.5％。用菌株CW574处理毒素污染的饲料(终浓度20μg/kg)，48h对OTA降解率为48.3％，AFB1降解率为52.1％。

降解菌株酶学特征检测结果显示，菌株CW574对OTA和AFB1的降解机理主要为胞内酶促降解作用，胞外粗酶液处理48h对OTA(终浓度20μg/L)的降解率为17.7％；对AFB1(终浓度20μg/L)的降解率为40.6％。

本发明还提供含有藤黄单胞菌CW574的菌剂及其复合微生物菌剂。

本发明还提供由藤黄单胞菌CW574或所述菌剂制备的黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A双功能生物降解剂。

优选地，所述生物降解剂中活性成分为由所述菌剂制备的粗酶液。

更优选地，所述生物降解剂中活性成分为菌株CW574的发酵液、菌株CW574发酵液经离心所得上清液或菌体裂解液。

其中，菌株CW574的发酵培养基为：胰蛋白胨17.0g/L，大豆胨3.0g/L，葡萄糖2.5g/L，NaCl 5.0g/L，K₂HPO₄ 2.5g/L，以水配制。发酵条件为：30℃，180r/min振荡培养48h。

本发明还提供藤黄单胞菌CW574、所述菌剂和所述生物降解剂在黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A生物降解中的应用。

本发明还提供藤黄单胞菌CW574、所述菌剂和所述生物降解剂在霉变食品原料或饲料脱毒处理中的应用。

其中，所述霉变食品原料或饲料中黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A的含量分别为20μg/kg及以下，但不局限于20μg/kg及以下浓度。

本发明进一步提供藤黄单胞菌CW574或所述菌剂在制备黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A双功能高效生物降解剂中的应用。

与现有的黄曲霉毒素降解菌相比，本发明的藤黄单胞菌CW574能够在低浓度黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A污染条件下达到极佳的降解效果。根据国家食品及饲料卫生标准规定，谷物类农产品黄曲霉毒素含量必须低于20μg/kg，赭曲霉毒素含量不得超过5μg/kg，饲料中的赭曲霉毒素A也不得超过100μg/kg(GB 2761-2011，GB13078.2-2006)。实际上，动物毒理实验表明，连续喂养含有20μg/kg毒素的饲料，就可以对大鼠的内脏器官造成严重的伤害(Wei et al.,2014DOI 10.1002/jsfa.6649)。因此，菌株CW574对低浓度AFB1和OTA具有高效的降解脱毒能力，在食品/饲料生物脱毒应用方面具有实质性的应用价值和重大意义。

附图说明

图1为本发明菌株CW574的电子显微镜照片。

图2为本发明实施例2和3中菌株CW574发酵液对曲霉毒素的动态降解曲线。

图3为本发明实施例2中菌株CW574粗酶液对曲霉毒素的动态降解曲线。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A降解菌的筛选、鉴定和培养

1、菌株的筛选

样品采集自受多环芳烃严重污染的土壤(炼油厂、汽车修理厂附近)和受真菌毒素严重污染的霉烂食品。取采集样品0.5g加入150mL富集培养基中(OTA和AFB1含量各为20μg/L左右)，在30℃恒温培养箱中富集培养7天。第一次富集培养结束后，取5mL富集培养液接种到150mL新鲜的OTA和AFB1富集培养基中，将OTA和AFB1的浓度提高到30μg/L，在相同条件下继续富集培养7天。以相同的富集方法完成第三次富集培养实验，提高OTA和AFB1的浓度至50μg/L。富集培养结束后，用无菌水将富集培养液作梯度稀释，将梯度稀释液分别涂布于OTA或AFB1固体分离培养基，30℃条件下培养3天。培养结束后，挑取培养皿单菌落接种于含有OTA和AFB1各20μg/L的富集培养基内进行降解测试培养48h，同时设置不接菌的阴性对照。降解培养结束后，培养液经二氯甲烷提取，按照国家标准高效液相色谱荧光检测法(HPLC-FLD，参照中华人民共和国国家标准GB/T 25220-2010和GB/T 18979-2003进行)检测培养液中两类毒素残留浓度，与对照相比计算降解率。最终，分离获得一株在低浓度OTA和AFB1条件下(OTA和AFB1含量≤20μg/L)仍保持高效降解率的菌株CW574。

其中，富集培养基为：葡萄糖5.0g/L，蛋白胨5.0g/L，酵母粉2.5g/L，柠檬酸铵1.0g/L，NaAc·3H₂O 2.5g/L，MnSO₄·4H₂O 0.05g/L，K₂HPO₄ 1.0g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，吐温-800.5mL，OTA添加浓度20-50μg/L，AFB1添加浓度20-50μg/L，调pH至6.2-6.5。

分离培养基为：葡萄糖10.0g/L，蛋白胨10.0g/L，酵母粉5.0g/L，柠檬酸铵2.0g/L，MgSO₄·7H₂O 0.58g/L，NaAc·3H₂O 5.0g/L，MnSO₄·4H₂O 0.28g/L，吐温-80 1.0mL,调pH至6.2-6.5。

上述培养基在120℃条件下高压灭菌15min，使用前添加无菌OTA和AFB1毒素标准溶液至规定浓度，固体培养基按以上配方加2.0％的琼脂粉。

2、菌株CW574的鉴定

菌株CW574的主要形态学特征为：革兰氏阴性，无芽孢，杆状，无鞭毛，不运动(图1)。该菌严格好氧，最适生长温度为25-30℃，最适生长pH为7.0，在R2A培养基上培养三天后，呈现黄色圆形菌落，边缘光滑凸起，菌落直径约1.5-1.8mm。

16S rDNA鉴定：利用细菌的16S rDNA通用引物(27F5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')，提取菌株CW574的基因组DNA作为模板，进行PCR扩增，并对扩增产物进行测序。菌株CW574的16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示。

3、菌株的培养

最适固体培养基为：胰蛋白胨17.0g/L，大豆胨3.0g/L，葡萄糖2.5g/L，NaCl 5.0g/L，K₂HPO₄ 2.5g/L，琼脂20.0g/L。最适液体培养基为上述配方中不含琼脂。

最适培养条件为：30℃，180r/min振荡培养48h。

实施例2高效液相色谱法检测菌株CW574的降解特性

降解菌株降解动态检测：将降解菌株CW574在最适固体培养基上连续活化2代，接种于4mL液体培养基过夜培养，获得新鲜菌液。将50μL新鲜菌液分别接种于4mL OTA测试培养基(含20.0μg/L OTA)和AFB1测试培养基(含20.0μg/L AFB1)，将接种后的试管振荡培养0h、12h、24h和48h，每个降解实验设置3个重复。以大肠杆菌K12(E.coli K12)为阴性对照菌株。培养结束后混匀，8000r/min离心10min后，分别收集上清液和菌体沉淀。

降解上清液分别经过OTA免疫亲和柱与AFB1免疫亲和柱，甲醇洗脱，收集洗脱液于玻璃进样瓶中，按照国家标准检测方法(GB/T 25220-2010和GB/T 18979-2003)进行OTA和AFB1残留量的高效液相色谱荧光检测(HPLC-FLD)。离心后的菌体沉淀，采用色谱纯的甲醇进行重悬混匀，剧烈震荡10min提取细胞吸附的残留毒素，离心后弃沉淀，上清液过0.22μm滤膜后通过HPLC-FLD进行细胞吸附的残留毒素检测。

降解菌株酶学特征检测：将降解菌株CW574在最适固体培养基上连续活化2代，将活化后的菌株接种于50mL液体培养基中过夜培养，获得OD₆₀₀＝0.8的新鲜菌液。将菌液混匀，分装于50mL离心管中，10000r/min离心15min，弃沉淀。准确量取培养上清液40mL于无菌的洁净三角瓶中，分别添加赭曲霉毒素A/黄曲霉毒素B1，使其终浓度达到20μg/L。将配制好的三角瓶30℃避光静置培养，于0h、12h、24h和48h取样检测OTA/AFB1的残留浓度。每个降解实验设置3个重复，并以E.coli K12为阴性对照菌株。将取出的样本分装于2mL离心管中，离心，弃沉淀。上清液分别经过OTA免疫亲和柱与AFB1免疫亲和柱，甲醇洗脱，收集洗脱液于玻璃进样瓶中，分别进行OTA和AFB1残留量检测。

HPLC检测OTA条件为：流动相：乙腈：水：乙酸(体积比96:102:4)，荧光检测器：激发波长333nm，发射波长460nm，流速：1.0mL/min，进样量：20μl，色谱柱：C₁₈色谱柱(4.6×250mm，填料直径5μm Waters)；HPLC检测AFB1条件为：流动相：甲醇:水(体积比45:55)，荧光检测器：激发波长360nm，发射波长420nm，流速：0.8mL/min，进样量：20μl，色谱柱：C₁₈色谱柱(4.6×250mm,填料直径5μm Waters)，0.05％碘溶液柱后衍生法。

菌株CW574对曲霉毒素的动态降解曲线如图2所示，实验结果表明，CW574菌株处理12h，对OTA的降解率为53.1％，处理48h降解率达到90.1％；处理12h对AFB1的降解率为42.5％，处理48h后降解率超过85.5％。用菌株CW574处理毒素复合污染的饲料(终浓度分别为20μg/kg)，48h对OTA降解率为48.3％，AFB1降解率为52.1％。

降解菌株酶学特征检测结果如图2所示，菌株CW574对OTA和AFB1的降解机理主要为胞内酶促降解作用，胞外粗酶液处理48h对OTA(终浓度20μg/L)的降解率为17.7％；对AFB1(终浓度20μg/L)的降解率为40.6％。

实施例3菌株CW574在玉米豆粕型饲料脱毒处理中的应用

1、实验材料

菌种活化培养基Ⅰ：胰蛋白胨17.0g/L，大豆胨3.0g/L，葡萄糖2.5g/L，NaCl 5.0g/L，K₂HPO₄ 2.5g/L，琼脂20.0g/L。

菌种活化培养基Ⅱ：蛋白胨5.0g/L，牛肉膏30.0g/L，NaCl 5.0g/L，pH 7.0-7.2。

上述培养基均在120℃下高压灭菌15min，实验饲料为玉米豆粕型日粮。

2、实验方法

向50mL磷酸盐缓冲液中加入适量OTA和AFB1标准储备液，混匀后立即倾注于100g已粉碎好的饲料样品中，搅拌均匀，使OTA和AFB1的终浓度分别达到40.0μg/kg，饲料于阴凉通风处晾干待用。在固体活化培养基Ⅰ上连续活化待测菌种2代，将活化后的菌种接种于150mL液体活化培养基Ⅱ培养48h，获得OD₆₀₀＝1.0的新鲜菌液。取100mL新鲜菌液与100g制备好的复合污染饲料混合均匀，将配制好的样品在35℃条件下培养，于0h、12h、24h和48h取样，每个降解实验设置3个重复。同时，以100mL新鲜空白培养基与100g制备好的污染毒素混合均匀混合作为阴性对照处理。处理组和空白对照组每次取样15g，立即进行OTA和AFB1提取和分析。

毒素的提取与纯化。称取10g培养后的样品于150mL具塞三角瓶内，加入1g NaCl和20mL甲醇-水混合液(体积比4:1)，常温震荡提取30min，取下瓶塞经曹纹滤纸过滤于干净的杯子中(或在3000r/min下常温离心5min)，准确移取5.0mL上清液并加入20mL纯水稀释混匀，经玻璃纤维滤纸过滤1-2次至滤液澄清，进行免疫亲和柱纯化操作。

准确移取10.0mL(代表1.0g样品)上述澄清滤液，注入玻璃注射器中，调节压力使溶液以1-2滴/秒的流速缓慢通过免疫亲和柱，直至有部分空气通过柱体，以10mL纯水淋洗柱子(重复一次)，弃去全部流出液并使部分空气通过柱体。准确加入1.5mL甲醇洗脱，流速为1滴/秒，收集洗脱液于玻璃进样瓶中，进行HPLC-FLD检测。

菌株CW574对曲霉毒素的降解效率如图3所示，实验结果表明，菌株CW574处理毒素复合污染的饲料(终浓度分别为20μg/Kg)，48h对OTA降解率为48.3％，对AFB1降解率为52.1％。说明菌株CW574对复杂基质中低浓度的黄曲霉毒素B1的降解效果较好，对赭曲霉类毒素A的降解效果次之。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.藤黄单胞菌（Luteimonas sp.）CW574，其保藏编号为CCTCC NO：M 2015374。

2.含有权利要求1所述藤黄单胞菌CW574的菌剂。

3.由权利要求1所述藤黄单胞菌CW574或权利要求2所述菌剂制备的黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A双功能生物降解剂, 其活性成分为藤黄单胞菌CW574的发酵液或菌体裂解液；其中，所述发酵液含有藤黄单胞菌CW574。

4.权利要求1所述藤黄单胞菌CW574或权利要求2所述菌剂或权利要求3所述生物降解剂在黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A生物降解中的应用。

5.权利要求1所述藤黄单胞菌CW574或权利要求2所述菌剂或权利要求3所述生物降解剂在含有黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A的霉变食品原料或饲料脱毒处理中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述霉变食品原料或饲料中黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A的含量分别为20µg/kg及以下。

7.权利要求1所述藤黄单胞菌CW574或权利要求2所述菌剂在制备黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A双功能生物降解剂中的应用。