CN103667135A

CN103667135A - 一株寡养单胞菌及其应用

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Publication number: CN103667135A
Application number: CN201310661616.9A
Authority: CN
Inventors: 杨虹; 林升钦; 柳向龙; 谭晶
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2013-12-09
Filing date: 2013-12-09
Publication date: 2014-03-26
Anticipated expiration: 2033-12-09
Also published as: CN103667135B

Abstract

本发明提供了一株寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)，命名为寡养单胞菌F6，保藏号为CGMCC NO.6547。从寡养单胞菌F6的代谢产物中分离纯化并鉴定了两种溶藻活性物质，分别是环(甘氨酸-脯氨酸)和对苯二酚。环(甘氨酸-脯氨酸)抑制铜绿微囊藻9110的半数有效浓度为9.5mg/L，而对聚球藻BN60无抑制效果；对苯二酚抑制铜绿微囊藻9110和聚球藻BN60的半数有效浓度分别为0.96mg／L和5.6mg／L。寡养单胞菌F6及其溶藻活性物质(环(甘氨酸-脯氨酸)和对苯二酚)可用于新型杀藻剂的开发和生产，最终应用于淡水蓝藻水华的控制。

Description

一株寡养单胞菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物，尤其涉及一株寡养单胞菌及其应用。

背景技术

因日益加剧的水体富营养化而频发的蓝藻水华造成了严重的环境和经济问题，因此受到人们的广泛关注。在中国，许多淡水湖泊(如太湖、滇池、巢湖等)都受到蓝藻水华的严重影响。因此，有效地控制蓝藻水华显得非常必要。

目前，控制蓝藻水华的方法主要有物理方法、化学方法和生物方法。物理方法主要有人工捕捞、机械除藻等。化学方法主要包括加入杀藻化学物质硫酸铜、除草剂等。但是，物理方法和化学方法由于高成本、二次污染以及对淡水生态系统的潜在危害从而限制其有效使用。因此，生物方法因其高效性、专一性以及环境友好等优点而受到越来越多的关注。

溶藻细菌是一类能杀死藻类细胞的细菌的总称，由于其能有效地杀死造成蓝藻水华中的蓝藻，故被广泛认为可应用于蓝藻水华的控制。此外，溶藻细菌分泌的溶藻活性物质也可作为化学杀藻剂的替代品。因此，从自然水体中筛选出具有抑制甚至灭杀蓝藻水华中优势藻株的溶藻细菌，分离纯化并鉴定其溶藻活性物质，对于开发新型杀藻剂具有重要的实践价值，最终可应用于控制蓝藻水华。

发明内容

本发明的目的，就是为了提供一株寡养单胞菌。

本发明中涉及的寡养单胞菌，拉丁文名为：Stenotrophomonas sp.，此菌株为革兰氏阴性菌，菌体直或略弯，单个或成对排列。专性需氧。在牛肉膏蛋白胨培养基平板上菌落中等大小，圆形，黄色或棕黄色不透明。化能异养菌。最适生长温度为35℃，4℃不生长。经16S rRNA基因序列分析和同源性比较，其与某寡养单胞菌菌株有97％的同源性，故鉴定为寡养单胞菌属细菌，命名为寡养单胞菌F6，此菌株的16S rRNA基因序列在GenBank中的登录号为HQ998863。

本发明提供的寡养单胞菌F6保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC NO.6547，保藏日期2012年9月14日。保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，邮编：100101电话：+86-010-64807596。

本发明的技术方案是：一株寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)，命名为寡养单胞菌F6，保藏号为CGMCC NO.6547。

上述寡养单胞菌F6用于控制蓝藻水华。

上述应用，是通过将寡养单胞菌F6接种于pH7.0的无菌牛肉膏蛋白胨培养基中，在30℃、200rpm条件下发酵24h得到其发酵液，应用于溶藻。

上述应用，是通过将寡养单胞菌F6的发酵液经过12000g离心20min后再用0.22μm孔径的微孔滤膜过滤后得到其无菌发酵液，应用于溶藻。

上述应用，是将寡养单胞菌F6的发酵液经过乙酸乙酯萃取后得到的萃取物，应用于溶藻。

上述应用，是将从寡养单胞菌F6的萃取物中分离得到的两种溶藻活性物质环(甘氨酸-脯氨酸)和对苯二酚，应用于溶藻。

本发明还提供了寡养单胞菌F6的溶藻活性物质的制备方法，将寡养单胞菌F6的发酵液萃取物通过WatersμBondapak^TMC18制备柱、Dikma Supersil C18-EP半制备柱和分析柱等色谱柱，以水和甲醇(或水和乙腈)为流动相的高效液相色谱(HPLC)技术，可分离纯化得到两种溶藻活性物质F6-A和F6-B。

本发明还提供了溶藻活性物质的鉴定方法，利用气质联用(GC-MS)、紫外光谱扫描、核磁共振氢谱(¹H NMR)等技术分析两种溶藻活性物质，鉴定得到F6-A为环(甘氨酸-脯氨酸)，F6-B为对苯二酚。

本发明的主要效果及优点是：

1、菌种筛选方法简单，可重复性高。筛选到的寡养单胞菌F6溶藻效果具有广谱性，尤其对太湖水华中的优势藻株聚球藻和铜绿微囊藻具有很强的溶藻效果。研究结果表明寡养单胞菌F6的发酵液、无菌发酵液和发酵液的乙酸乙酯萃取物对铜绿微囊藻具有很强的溶藻效果。

2、寡养单胞菌F6的溶藻活性物质环(甘氨酸-脯氨酸)和对苯二酚对太湖水华中的优势藻株铜绿微囊藻和聚球藻都具有很强的溶藻效果。

3、寡养单胞菌F6及其溶藻活性物质均具有很强的溶藻效果，对环境友好，不会造成二次污染，在控制蓝藻水华方面具有很好的应用前景。

附图说明

图1为寡养单胞菌F6对铜绿微囊藻9110的溶藻效果图。

图2为不同方式处理后的寡养单胞菌F6发酵液的溶藻效果图。

图中：A、B、C、D分别为寡养单胞菌F6发酵液、高温处理后的发酵液、无菌发酵液、去上清的菌细胞液对铜绿微囊藻9110的溶藻效果(6天)。

图3为寡养单胞菌F6发酵液和牛肉膏蛋白胨培养基的乙酸乙酯萃取物的琼脂平板实验图。

图中：a为寡养单胞菌F6发酵液的乙酸乙酯萃取物的溶藻效果，b为牛肉膏蛋白胨培养基的乙酸乙酯萃取物的溶藻效果(作对照)。

图4为寡养单胞菌F6的溶藻活性物质F6-A的GC-MS分析得到的质谱图(EI)(a)、NMR氢谱(b)、紫外扫描光谱(c)和化学结构图(d)。

图5为寡养单胞菌F6的溶藻活性产物F6-B的GC-MS分析得到的质谱图(EI)(a)、NMR氢谱(b)、紫外扫描光谱(c)和化学结构图(d)。

图6为不同浓度的环(甘氨酸-脯氨酸)和对苯二酚对对数期的铜绿微囊藻9110和聚球藻BN60的溶藻效果示意图。

具体实施方式

下面用实施例详述本发明，但本发明的保护范围并不局限于此。

1.溶藻细菌的筛选

将太湖梅梁湾水域采集的自然水样1mL接种于100mL牛肉膏蛋白胨培养基中富集培养24h(30℃，200rpm条件下发酵培养)，将10mL培养液加入到100mL培养至对数期的铜绿微囊藻9110(分离自太湖)的藻液(藻细胞密度约1×10⁷个／mL)中。一周后取黄化藻液用梯度稀释法涂布于牛肉膏蛋白胨培养基平板上，30℃培养过夜，取菌落密度适中的平板，根据菌落形态的差异从平板中挑选一系列菌株。

将挑选出来的菌株按照1％的比例接种入100mL牛肉膏蛋白胨培养基中，30℃、200rpm条件下培养24h，随后将各菌株的10mL菌液分别加入100mL对数期的铜绿微囊藻9110藻液中(藻细胞密度约1×10⁷个／mL)。另外将10mL无菌牛肉膏蛋白胨培养基加入100mL藻液中作为对照。所有实验组和对照组的藻液均放置于光照培养箱中培养6天后测定铜绿微囊藻9110细胞密度，计算其溶藻率。选取了其中溶藻率最高的一株菌株进行后期研究，该菌株命名为F6。

藻液培养条件：铜绿微囊藻9110用BG11液体培养基培养，放置于光照培养箱中，25℃，光照强度40μmol photons m^-2s^-1，光暗周期比为12∶12。

溶藻率计算方法：溶藻率＝(对照组藻细胞密度-实验组藻细胞密度)／对照组藻细胞密度×100％。其中使用血球板计数法测定铜绿微囊藻的藻细胞密度。

图1所示为寡养单胞菌F6对铜绿微囊藻9110的溶藻效果。加入寡养单胞菌F6后，铜绿微囊藻9110的细胞密度随时间不断下降，而对照中的铜绿微囊藻9110细胞密度随时间不断上升，6天后的溶藻率为93.7％。

2.F6菌株的鉴定

应用形态观察、染色、16s rRNA基因序列分析等方法对溶藻效果最强的菌株F6进行鉴定。此菌株为革兰氏阴性菌，菌体直或略弯，单个或成对排列。专性需氧。在牛肉膏蛋白胨培养基平板上菌落中等大小，圆形，黄色或棕黄色不透明。化能异养菌。最适生长温度为35℃，4℃不生长。经16s rRNA基因序列分析和同源性比较，得知其与GenBank中某寡养单胞菌属菌株有97％的同源性，故鉴定为寡养单胞菌属细菌，命名为寡养单胞菌F6。该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.6547，保藏日期为2012年9月14日。该菌株的16S rRNA基因序列在GenBank的登录号为HQ998863。

3.寡养单胞菌F6对不同藻类的溶藻效果

将寡养单胞菌F6按照1％的接种量接种于灭菌后的牛肉膏蛋白胨培养基中，30℃、200rpm条件下摇床发酵24h得到其发酵液。将9份培养好的10mL寡养单胞菌F6发酵液分别加入到不同藻类(见表1)的100mL藻液中(所有藻类均已培养至对数期)，同时将等量的无菌牛肉膏蛋白胨培养基加入9种藻液中(100mL)作为对照。所有实验组和对照组均置于光照培养箱中培养6天后，分别测定所有实验组和对照组藻液的叶绿素浓度(对于铜绿微囊藻，测定其藻细胞密度)，计算其溶藻率。每个样品均有三个平行样，以平均值±标准差形式表示。

本实验中涉及的藻株中有6株分离自太湖梅梁湾水域，其余3株购自武汉淡水藻种库。实验结果表明，寡养单胞菌F6对所有测试藻株都具有溶藻效果，尤其对太湖水华中的优势藻株铜绿微囊藻和聚球藻具有很强的溶藻效果(见表1)。此结

果表明寡养单胞菌F6的溶藻能力具有广谱性，是一株具有应用前景的溶藻细菌。

表1寡养单胞菌F6对不同藻株的溶藻效果

注：表中用星号(*)标注的藻株都是分离自太湖梅梁湾水域，其余藻株购买自武汉淡水藻种库。

4.寡养单胞菌F6溶藻方式的研究

将寡养单胞菌F6按照步骤3发酵得到其发酵液。此发酵液经过121℃高温高压处理21min，得到高温处理后的发酵液。寡养单胞菌F6发酵液经过12000g离心20min后再用0.22μm孔径的微孔滤膜过滤后得到其无菌发酵液。寡养单胞菌F6发酵液经5000g离心20min后弃上清，再用无菌高纯水冲洗沉淀细胞并离心3次，最后以等体积的高纯水重悬沉淀的细胞获得去上清的菌细胞液。将10mL发酵液、10mL高温处理后的发酵液、10mL无菌发酵液、10mL无上清的菌细胞液分别加入到100mL对数期的铜绿微囊藻9110藻液中(藻细胞密度在1×10⁷个／mL)。另外将等体积的无菌牛肉膏蛋白胨培养基加入100mL铜绿微囊藻9110藻液中作为对照。所有实验组和对照组铜绿微囊藻9110藻液均置于光照培养箱培养，6天后测定所有藻液的藻细胞密度，计算其溶藻率。

实验结果如图2所示，图中A、B、C、D分别为寡养单胞菌F6发酵液、高温处理后的发酵液、无菌发酵液、去上清的菌细胞液的溶藻率(6天)。寡养单胞菌F6发酵液的溶藻率(6天)为93.7％，此外无菌发酵液的溶藻率(6天)为89.4％，而去上清的菌细胞液的溶藻率(6天)仅为6.7％，表明寡养单胞菌F6主要是通过分泌胞外溶藻活性物质来溶藻。另外，高温处理后的寡养单胞菌F6发酵液的溶藻率(6天)为82.50％，表明寡养单胞菌F6分泌的溶藻活性物质为非蛋白质类物质。

5.寡养单胞菌F6发酵液乙酸乙酯萃取物的制备方法

将寡养单胞菌F6按照步骤3发酵获得其发酵液。将乙酸乙酯按照1∶1的体积比与寡养单胞菌F6发酵液混合，放入摇床振荡24h，用分液漏斗分离获取上层的有机萃取液。随后用旋转蒸发仪和离心干燥机将萃取液中的乙酸乙酯蒸干，加入高纯水溶解(溶解比例为100mL萃取液：1mL高纯水)，最后使用0.45μm孔径的针头式过滤器过滤得到寡养单胞菌F6的乙酸乙酯萃取物用于下一步操作。

为了检验乙酸乙酯中能否萃取出溶藻活性物质，取处理好的200μL寡养单胞菌F6发酵液的乙酸乙酯萃取物滴入铜绿微囊藻琼脂平板上的白色圆纸片，此外将牛肉膏蛋白胨培养基按照以上步骤相同处理后作为对照。琼脂平板放入光照培养箱中培养，通过观察白色圆纸片周围溶藻圈的有无来判断萃取物是否具有溶藻活性。

铜绿微囊藻琼脂平板的制作方法：向平板中倒入适量的BG11固体培养基(琼脂含量1.5％，约30mL／块平板)，待其凝固后备用。将培养好的铜绿微囊藻藻液5000g离心20min后弃上清，将收集到的藻细胞加入至灭菌后的BG11软琼脂固体培养基中(1％琼脂，置于53℃水浴中防止凝固)，摇匀后倒入预制的BG11固体平板(约20mL／块平板)，待其凝固后置于光照培养箱中培养并备用。

实验结果如图3所示，其中a为寡养单胞菌F6发酵液乙酸乙酯萃取物的溶藻效果，b为牛肉膏蛋白胨培养基乙酸乙酯萃取物的溶藻效果(作为对照)。图3-a中琼脂平板上出现的溶藻菌说明寡养单胞菌F6发酵液的乙酸乙酯萃取物中含有溶藻活性物质，而图3-b中的琼脂平板上无溶藻圈说明溶藻活性物质是由寡养单胞菌F6分泌的。因此，本发明应用乙酸乙酯萃取寡养单胞菌F6的溶藻活性物质。

6.寡养单胞菌F6的溶藻活性物质的分离纯化

应用HPLC技术分离纯化寡养单胞菌F6的溶藻活性物质，最终获得两种溶藻活性物质F6-A和F6-B，其具体步骤如下：

将寡养单胞菌F6发酵液的乙酸乙酯萃取物通过Waters公司的μBondapak^TMC18制备柱(以甲醇和水为流动相)除去大部分不具有溶藻活性的杂质，得到两个含有溶藻活性物质的馏分A和B。再应用Dikma公司的Supersil C18-EP半制备柱和分析柱(以甲醇和水为流动相)、Agilent公司的Zorbax Hilic Plus分析柱(以乙腈和水为流动相)进一步纯化馏分A和B，最终得到两种溶藻活性物质F6-A和F6-B，用于结构鉴定。

7.寡养单胞菌F6的溶藻活性物质的鉴定

应用GC-MS、1H NMR和紫外光谱扫描等技术鉴定溶藻活性物质F6-A和F6-B的化学结构，其具体过程如下：

将溶藻活性物质F6-A进行GC-MS分析。得到的质谱图如图4-a所示，将其与，NIST质谱数据库的质谱数据比对分析，结果显示其与环(甘氨酸-脯氨酸)的质谱图高度相似(＞95％)，故初步鉴定F6-A为环(甘氨酸-脯氨酸)。

将溶藻活性物质F6-A进行1H NMR分析，得到的结果如图4-b所示：¹H NMR(400MHz，D₂O)：δ4.22(s，1H)，4.06(dd，J＝17.3，2.7Hz，1H)，3.77(d，J＝17.3Hz，1H)，3.44(dd，J＝8.7，4.8Hz，2H)，2.23(t，J＝5.1Hz，1H)，2.06-1.63(m，3H)；δ4.70ppm属于溶剂D₂O中氢原子的化学位移信号。

将溶藻活性物质F6-A经过紫外光谱扫描。结果如图4-c所示，其含有一个紫外吸收峰，位于258nm。

经过GC-MS、紫外光谱和1H NMR分析，可以确定溶藻活性物质F6-A为环(甘氨酸-脯氨酸)，其化学结构如图4-d所示(其中A、B、C、D、E、F、G为与图4-b相对应化学位移的氢原子)。

将溶藻活性物质F6-B进行GC-MS分析。得到的质谱图如图5-a所示，将其与NIST质谱库中的质谱数据进行比对分析，但结果显示其与对苯二酚和间苯二酚的质谱图高度相似(＞95％)，故不能确定F6-B的化学结构。

将溶藻活性物质F6-B进行1H NMR分析，得到的结果如图5-b所示：¹H NMR(400MHz，CD₃OD)：δ6.86(s，1H)；δ3.41ppm、δ4.81ppm分别属于溶剂氘代甲醇(CD₃OD)、杂物H₂O中氢原子的信号。

将溶藻活性物质F6-B进行紫外光谱扫描。结果如图5-c所示，其含有两个紫外吸收峰，分别位于220nm和290nm。

经过GC-MS、紫外光谱和¹H NMR分析，可以确定溶藻活性物质F6-B为对苯二酚，其化学结构如图5-d所示。

8.不同浓度的溶藻活性物质对铜绿微囊藻和聚球藻的溶藻效果

将溶藻活性物质环(甘氨酸-脯氨酸)、对苯二酚用高纯水溶解并稀释成一系列浓度，分别加入对数期的铜绿微囊藻9110和聚球藻BN60藻液中至一定的终浓度(环(甘氨酸-脯氨酸)：3.8，7.6，19，38，76mg/L；对苯二酚：0.1，0.5，5，10，50，100mg／L。)。另外将等量的无菌高纯水加入两种藻液中作为对照。所有处理组和对照组藻液均置于光照培养箱中培养4天，分别测定铜绿微囊藻9110的藻细胞密度和聚球藻BN60的叶绿素浓度，计算其溶藻率。

实验结果如图6所示，环(甘氨酸-脯氨酸)对铜绿微囊藻9110具有较强的溶藻效果，其半数有效浓度为9.5mg／L，而对聚球藻BN60没有任何的效果(图6-a)；对苯二酚对铜绿微囊藻9110和聚球藻BN60具有很强的溶藻能力，其半数有效浓度分别为0.96mg／L和5.6mg／L(图6-b)。

Claims

1.一株寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)，命名为寡养单胞菌F6，保藏号为CGMCC NO.6547。

2.寡养单胞菌F6在控制蓝藻水华中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：通过将寡养单胞菌F6接种于pH7.0的无菌牛肉膏蛋白胨培养基中，在30℃、200rpm条件下发酵24h得到其发酵液，应用于溶藻。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：通过将寡养单胞菌F6的发酵液经过12000g离心20min后再用0.22μm孔径的微孔滤膜过滤后得到其无菌发酵液，应用于溶藻。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于：将寡养单胞菌F6的发酵液经过乙酸乙酯萃取后得到的萃取物，应用于溶藻。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：将从寡养单胞菌F6的萃取物中分离得到的两种溶藻活性物质环(甘氨酸-脯氨酸)和对苯二酚，应用于溶藻。