CN114513955A - 绿色大型藻类水华的控制 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及绿色大型藻类水华的控制。更具体地说，石莼属藻类水华可以通过地中海海水中所含的活有效成分来控制。发明人已经观察到在特定地点收集的(例如在北纬43°14'和东经5°21'处或在北纬43°09'和东经5°36'处收集的)地中海海水能够促使石莼死亡，而不排放有毒的酸性蒸汽，例如H2S蒸汽。总之，本发明人提供的数据表明，所述海水包含作为促使石莼属死亡，特别是石莼死亡的原因的活微生物。更准确地说，本发明人提供的实验数据表明，促使石莼死亡并因此促进石莼水华的控制的微生物是病毒。

Description

绿色大型藻类水华的控制
技术领域
本发明涉及绿色大型藻类水华的控制。更具体地，石莼(Ulva lactuca)绿藻水华可以由从地中海收集的海水中包含的活微生物控制，更具体地说是由病毒控制。
背景技术
微藻(或海藻)根据其中的色素主要分为三类：褐藻、红藻和绿藻。所有这些微藻都含有大量碳水化合物(高达60％)、中/大量蛋白质(10％至47％)和少量脂质(1％至3％)，以及不同含量的矿物灰分(7％至38％)。随着可用土地和淡水资源的减少，微藻成为生产有价值的生物质的有吸引力的替代品，可与陆地作物相媲美。在受控和可持续的培养系统下培养微藻可能是未来提供满足市场发展需求的生物质的首选方法。
高碳水化合物部分包括多种易溶多糖，如褐藻中的海带多糖、褐藻胶、甘露醇或岩藻多糖，红藻中的淀粉、甘露聚糖和硫酸半乳聚糖以及绿藻中的石莼聚糖。褐藻胶是褐藻的主要结构聚合物之一，它为暴露于流动水中的标本提供稳定性和柔韧性，并且是海藻生物质中发现的与工业相关的碳水化合物之一，如同通常用作增稠剂、胶凝剂或乳化剂的其他水胶体如琼脂和卡拉胶。从海藻中获得的各种其他非碳水化合物产品包括蛋白质、脂质、酚类、萜类化合物和矿物质例如碘、钾碱和磷，它们是对动物和人类营养都有用的成分。
微藻对人类营养的兴趣在于它们的高矿物质浓度(如钙、镁和钾)和谷氨酸，这使得它们也可用作增味剂。藻类还可以帮助解决食品行业目前面临的最大挑战之一。事实上，与食盐相比，海藻的钠含量较低，因此可以作为替代品，以防止与氯化钠摄入过多相关的健康风险。微藻也是当今广泛探索用于制造越来越多的药品的有效成分的来源。硫酸多糖的胶凝特性是众所周知的，它们的治疗应用正在开发中。微藻多糖、色素、蛋白质、氨基酸和酚类化合物是潜在的保健和预防慢性病的功能性食品成分，在制药行业的应用前景越来越大。
与经济利益每年增长的微藻相反，大型藻类仍然是一种危害，特别是对海洋环境以及人类和动物的健康而言。事实上，大型藻类水华会破坏海洋生态系统并对当地旅游业产生负面影响。石莼水华的情况尤其如此。
石莼是属于绿藻门的大型藻类，Linnaeus于18世纪在波罗的海首次对其描述。石莼藻由双层细胞结构组成，其菌体一般呈扁平的刀片状外观。它能够在例如岩石等固定物上生长或者自由漂浮生长。石莼藻具有通过两种方法繁殖的能力，一种是有性繁殖，另一种是从藻体碎片繁殖，这在大型藻类中很少见。这两种方法通过覆盖水面提供了快速增殖的能力，从而降低了其他藻类物种的生物多样性。石莼是多态物种，与水的盐度或与细菌共生的程度有关。
石莼主要入侵海滩，其生物降解可产生有毒的酸性蒸汽(主要是H2S)，由于石莼生物降解导致动物死亡(据报道，2009年一匹马在法国西部的布列塔尼海岸死亡)，也可能导致人类死亡。
在19世纪末的贝尔法斯特(爱尔兰北部)首次描述了石莼水华。从1930年代开始，人们在威尼斯外海鸫湖对石莼水华进行了很好的研究并在1990年代之后观察到了无法解释的减少。自1980年代以来，世界各地均观察到石莼水华，从加利西亚(西班牙)到东京湾(日本)，包括美洲大陆和澳大利亚的海岸。然而，迄今为止世界上最大的事件仍然是从2007年开始连续十年在黄海观测到的绿潮，其覆盖了黄海10％的表面。在欧洲，布列塔尼北部海岸拥有最大的石莼水华。现在人们承认，石莼水华主要是人类活动的结果，这主要是因为海水中微量的氮和磷含量的不断增加。此外，在贝尔法斯特和威尼斯周围海域观察到的绿潮与越来越多的人类废物的排放有关。
据报道，改变水的温度可能会影响藻类的增殖，如在文献KR20040037467中所述。其他人还报道称，微生物特别是细菌可用于杀死湖泊和河流中的增殖藻类(参见，例如，KR20180119021)。最后，JPH1171203公开了β-氰基丙氨酸被证明可以作为杀藻剂以有效促使对海洋环境中的蓝绿藻的控制。
迄今为止，从海水或海岸线例如海滩收集绿藻是应对石莼水华的唯一解决方案。
因此，有必要提供一种在海水中或被石莼属(Ulva)污染的海岸线土地中控制和/或根除石莼属特别是石莼种的藻类水华的方法。
还需要以安全的方式控制石莼属水华，特别是不排放有毒的酸性蒸汽，例如H2S蒸汽。
发明内容
本发明的一个方面涉及一种用于在有需要的海洋环境中控制和/或防止石莼属藻类水华的方法，其包括使所述海洋环境与从地中海收集的海水接触的步骤。在某些实施方案中，石莼属藻类是石莼种的藻类。在一些实施方案中，海水是在北纬43°14'和东经5°21'、北纬43°09'和东经5°36'、北纬43°18'和东经5°17'、北纬43°14'和东经5°17'或北纬43°15'和东经5°19'处收集的。在一个实施方案中，海水是在北纬43°14'和东经5°21'处收集的，或者在北纬43°09'和东经5°36'处收集的。在某些实施方案中，海水包含能够促使石莼属藻类死亡的活微生物。在一些实施方案中，所述活微生物是病毒。
在另一个方面，本发明还涉及一种用于在有需要的海洋环境中控制和/或防止石莼属藻类水华的方法，其包括使所述海洋环境与源自从地中海收集的海水的一种或多于一种活微生物接触的步骤。在一些实施方案中，石莼属藻类是石莼种的藻类。在某些实施方案中，海水是在北纬43°14'和东经5°21'、北纬43°09'和东经5°36'、北纬43°18'和东经5°17'、北纬43°14'和东经5°17'，或北纬43°15'和东经5°19'处收集的。在一个实施方案中，海水是在北纬43°14'和东经5°21'处收集的，或者在北纬43°09'和东经5°36'处收集的。在一些实施方案中，所述活微生物是病毒。
本发明的另一方面涉及源自从地中海收集的海水的一种或多于一种活微生物用于在海洋环境中控制和/或防止石莼属藻类水华的用途。在某些实施方案中，石莼属藻类是石莼种的藻类。在一些实施方案中，海水是在北纬43°14'和东经5°21'、北纬43°09'和东经5°36'、北纬43°18'和东经5°17'、北纬43°14'和东经5°17'或北纬43°15'和东经5°19'处收集的。在一个实施方案中，海水是在北纬43°14'和东经5°21'处收集的，或者在北纬43°09'和东经5°36'处收集的。某些实施方案中，所述活微生物是病毒。
定义
在本发明中，下列术语具有以下含义：
-数字前面的“约”包括该数字值的正负10％或少于10％。应当理解，术语“约”所指的值本身也是具体且优选地公开的。
-“水华”是指种群的快速和过度增长。通过扩展，“藻华”是指在给定的海洋环境中藻类的快速和过度生长。在实践中，绿藻水华可能是“绿潮”的原因，这是指由于在给定周边存在过量绿藻而导致海水呈绿色。如本文所用，“藻华”被认为是一种污染物质，因为受污染的水特别是海水，以及海岸线区域特别是海岸和海滩，由于藻类降解时释放的有毒蒸汽，可能会对动物和人类造成生命威胁。
-“海洋环境”是指来自海水的生态系统，包括广海(或深海)、海岸、河口、海岸线。实际上，海岸线包括与海洋直接接触的任何陆地或地表，例如岩石、海滩。
-“控制”是指为防止或减缓(减轻)特定有害现象而采取的包括预防性的或防止的步骤的两个步骤。需要这些步骤的环境包括已经经历过所述特定有害现象的环境以及容易经历特定有害现象的环境或要防止特定有害现象的环境。如果在接收到根据本发明从地中海收集的有效量的海水后，环境显示出与所述特定有害现象相关的一个或多于一个参数的可观察和/或可测量的减少或缺失；环境质量更好，则成功地“控制”了特定有害现象。可通过本领域技术人员熟悉的常规程序容易地测量用于评估环境中成功控制和改善的上述参数。在一个实施方案中，特定的有害现象是大型藻类水华，特别是石莼水华。
-“预防”是指防止特定有害现象的至少一个参数发生和/或降低特定有害现象的至少一个参数发生的机会。
“活微生物”是指能够在合适的条件下进行分裂的微生物，例如原生动物、细菌或病毒。在一个实施方案中，活微生物是病毒。
“促使死亡”是指杀死目标的能力。引申“促使藻类死亡”意指藻类被杀死或降解。在实践中，死藻不再能够生长、传播和促进绿潮。在一个实施方案中，藻类的死亡可以在藻类组织的增白或漂白之前。
如本文所用，表述“石莼藻类”和“石莼属藻类”旨在指代相同的主题并且可以相互替代。
具体实施方式
发明人观察到，在黄海或布列塔尼中观察到的主要是石莼的水华不会在地中海发生。然而，当考虑到石莼的存在、没有明显的潮汐(水停滞)以及存在丰富的氮和磷来源时，应该预计地中海中存在石莼水华。发明人出人意料地表明，通过使用来自地中海的一个或多于一个选定地点的海水来控制布列塔尼石莼水华是可行的。更准确地说，本发明人在本文中提供的实验数据表明海水含有促使石莼死亡并因此控制石莼水华的微生物，并且该微生物是病毒。
本发明的一个方面涉及一种用于在有需要的海洋环境中控制和/或防止石莼属藻类水华的方法，包括使所述海洋环境与从地中海收集的海水接触的步骤。
另一方面，本发明还涉及从地中海收集的海水用于在有需要的海洋环境中控制和/或防止石莼属藻类水华的用途。
本发明的另一方面涉及一种用于在海洋环境中控制和/或防止石莼属藻类水华的方法，其包括使所述海洋环境与从地中海收集的海水接触的步骤。
另一方面，本发明还涉及从地中海收集的海水用于在海洋环境中控制和/或防止石莼属藻类水华的用途。
在某些实施方案中，石莼属藻类选自Ulva acanthophora、Ulva anandii、Ulvaarasakii、Ulva armoricana、Ulva atroviridis、Ulva beytensis、Ulva bifrons、Ulvabrevistipita、缅甸石莼(Ulva burmanica)、加利福尼亚石莼(Ulva californica)、Ulvachaetomorphoides、条浒苔(Ulva clathrate)、扁浒苔(Ulva compressa)、砺菜、Ulvacornuta、Ulva covelongensis、Ulva crassa、Ulva crassimembrana、Ulva curvata、Ulvadenticulate、Ulva diaphana、Ulva elegans、浒苔石莼(Ulva enteromorpha)、Ulvaerecta、Ulva expansa、裂片石莼、曲浒苔(Ulva flexuosa)、Ulva geminoidea、Ulvagigantea、Ulva grandis、Ulva hookeriana、Ulva hopkirkii、Ulva howensis、Ulvaindica、Ulva intestinalis、Ulva intestinaloides、Ulva javanica、Ulva kylinii、石莼、Ulva laetevirens、Ulva laingii、线形石莼(Ulva linearis)、长石莼(Ulva linza)、Ulva lippii、Ulva litoralis、Ulva littorea、Ulva lobate、Ulva marginata、Ulvamicrococca、易变石莼(Ulva mutabilis)、Ulva neapolitana、Ulva nematoidea、Ulvaohnoi、Ulva olivascens、Ulva pacifica、Ulva papenfussii、Ulva parva、Ulvapaschima、Ulva patengensis、Ulva percursa、孔石莼、Ulva phyllosa、Ulva polyclada、Ulva popenguinensis、Ulva porrifolia、Ulva procera、丰盛石莼、浒苔种(Ulvaprolifera)、Ulva pseudocurvata、假缘管浒苔(Ulva pseudolinza)、Ulva pulchra、Ulvaquilonensis、Ulva radiata、Ulva ralfsii、Ulva ranunculata、网石莼(Ulvareticulata)、Ulva rhacodes、硬石莼、Ulva rotundata、Ulva saifullahii、Ulvascandinavica、Ulva serrata、Ulva simplex、Ulva sorensenii、多刺石莼、狭叶石莼、Ulvasublittoralis、Ulva subulata、Ulva taeniata、Ulva tanneri、Ulva tenera、Ulvatorta、Ulva tuberosa、Ulva uncialis、Ulva uncinate、Ulva uncinate、Ulva usneoides、Ulva utricularis、Ulva utriculosa、Ulva uvoides和Ulva ventricosa种的藻类。
在一些实施方案中，石莼属藻类选自Ulva armoricana和石莼种的藻类。在一个实施方案中，石莼属藻类是石莼种的藻类。
在本发明的范围内，石莼种的藻类也可以指浒苔属(Enteromorpha)的藻类。
在本发明的范围内，“有需要的海洋环境”是指经历或倾向于经历石莼水华的海水生态系统。
在一些实施方案中，海洋环境可限于海水，特别是深海、海岸、河口等。
在实践中，评估海洋环境是否需要控制和/或防止石莼属藻类水华可以通过测量以下一个或多于一个参数来进行，参数包括平均海水盐度、平均海水表面温度和所述环境中石莼的平均浓度。
说明性地，测量平均海水盐度，即每kg海水的盐浓度(以克为单位)，可以通过现有技术中已知的任何方法进行。适用于测量海水盐度的方法的非限制性实例包括电导率(EC)的测量、总溶解固体(TDS)的测量。在一些实施方案中，需要控制和/或防止石莼属藻类水华的海洋环境可具有包含约30g/kg海水至约40g盐每kg海水的平均盐度。在本发明的范围内，表述“每kg海水约30克至约40克盐”包括每kg海水30克盐、每kg海水31克盐、每kg海水32克盐、每kg海水33克盐、每kg海水34克盐、每kg海水35克盐、每kg海水36克盐、每kg海水37克盐、每kg海水38克盐、每kg海水39克盐和每kg海水40克盐。
说明性地，可以通过现有技术中已知的任何方法来测量平均海水表面温度。适用于测量平均海水表面温度的方法的非限制性实例包括卫星微波辐射计、红外(IR)辐射计、原位浮标。在一些实施方案中，需要控制和/或防止石莼属藻类水华的海洋环境可具有约12℃至约25℃，优选约14℃至约20℃的平均表面温度。在本发明的范围内，表述“从约12℃至约25℃”包括12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃和25℃。
说明性地，测量石莼属藻类的平均浓度可以通过本领域已知的任何方法进行。在实践中，海水中藻类的生物质可以通过任何一种成熟的方法来评估，例如HambrookBerkman,J.A.和Canova,M.G.(2007,Algal biomass indicators(ver.1.0):U.S.Geological Survey Techniques of Water-Resources Investigations,book 9,chap.A7,section 7.4)中公开的方法。适用于测量藻类生物质的方法的非限制性实例包括作为无灰干质量的碳生物质的测量、颗粒有机碳(POC)的测量或海水样品中叶绿素a的量化。
在一些实施方案中，可以在海水中，特别是在搁浅在海岸线上之前，特别是在岩石上或海滩上控制石莼绿藻水华。
在一些其他实施方案中，石莼绿藻水华可以在海岸线上得到控制，海岸线包括与海直接接触的任何陆地或地表，例如岩石、海滩。
在实践中，根据本发明的海水可以与位于海岸线上的石莼属藻类接触。在一些实施方案中，石莼藻在其自然生物降解之前被杀死。在实践中，当排放大量有毒的酸性蒸汽，特别是H2S蒸汽时，就会开始自然生物降解。说明性地，死亡后，绿藻可以在其最终毁灭之前被安全移除和/或储存。
在某些实施方案中，海水促使石莼属藻类的死亡。在一些实施方案中，石莼属藻类的死亡是在不排放酸蒸汽、特别是不排放H2S蒸汽的情况下实现的。
在一些实施方案中，海水是在北纬43°14'和东经5°21'、北纬43°09'和东经5°36'、北纬43°18'和东经5°17'、北纬43°14'和东经5°17'或北纬43°15'和东经5°19'处收集的。
在一个实施方案中，海水是在北纬43°14'和东经5°21'或北纬43°09'和东经5°36'处收集的。
在一个实施方案中，海水是在北纬43°14'和东经5°21'处收集的。在一个实施方案中，海水是在北纬43°09'和东经5°36'处收集的。在一个实施方案中，海水是在北纬43°18'和东经5°17'处收集的。在一个实施方案中，海水是在北纬43°14'和东经5°17'处收集的。在一个实施方案中，海水是在北纬43°15'和东经5°19'处收集的。
在实践中，海水可以是从表面至最多30m的深度收集的。在本发明的范围内，表述“最多30m”包括1cm、5cm、10cm、15cm、20cm、30cm、40cm、50cm、60cm、70cm、80cm、90cm、1m、1.5m、2m、2.5m、3m、3.5m、4m、4.5m、5m、5.5m、6m、6.5m、7m、7.5m、8m、9m、10m、11m、12m、13m、14m、15m、16m、17m、18m、19m、20m、21m、22m、23m、24m、25m、26m、27m、28m、29m和30m。
在某些实施方案中，海水是在约10cm至约10m，优选约50cm至约2m的深度处收集的。
在一些实施方案中，海水是在春季收集的，特别是从三月20日至六月21日，更特别是从五月20日至六月20日收集的。
在一些实施方案中，收集的海水样品是在约4℃至约30℃、优选约10℃至约20℃、更优选约20℃的温度下保存的。在本发明的范围内，表述“约4℃至约30℃”包括4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃和30℃。
在实践中，在收集的海水样品用于促使石莼属藻类死亡之前，收集的海水样品可以保存至多50天，优选至多30天，更优选至多10天。在本发明的范围内，表述“至多50天”涵盖50天、49天、48天、47天、46天、45天、44天、43天、42天、41天、40天、39天、38天、37天、36天、35天、34天、33天、32天、31天、30天、29天、28天、27天、26天、25天、24天、23天、22天、21天、20天、19天、18天、17天、16天、15天、14天、13天、12天、11天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天和1天。
在某些实施方案中，海水包含能够促使石莼属藻类死亡的活微生物。
在一些实施方案中，石莼属藻类的死亡可以通过藻类的绿色组织脱色成白色组织来评估。如本文所用，藻类的绿色组织脱色成白色组织也可称为藻类绿色组织的“漂白”。在实践中，死亡(坏死)白色组织的观察可以通过视觉评估或通过光学显微镜进行评估。在某些实施方案中，在根据本发明的海水与石莼藻接触后约1天至约15天，优选在日光和/或约20℃至约30℃的温度下，可以观察到白色组织。在本发明的范围内，表述“约1天至约15天”包括1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天和15天。在本发明的范围内，表述“约20℃至约30℃”涵盖20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃和30℃。
在实践中，所述活微生物选自原生动物、细菌和病毒。
在一些实施方案中，可以浓缩、分离和/或表征根据本发明的微生物。
在一些实施方案中，可以从根据本发明的海水中纯化根据本发明的微生物。如本文所用，术语“纯化的”是指允许将作为有效成分的根据本发明的微生物与根据本发明的海水的其他活的生物分离的步骤。其他活的生物可以包括藻类、浮游植物等。
微生物的浓缩、分离和表征可以通过现有技术中的任何合适的技术进行。
在一些实施方案中，可以使用例如膜过滤器、赛氏过滤器、烧结玻璃过滤器和/或烛形过滤器从收集的海水样品中过滤微生物。在实践中，过滤器可以具有约0.01μm至约10μm的孔径。在本发明的范围内，表述“约0.01μm至约10μm”包括0.01μm、0.02μm、0.03μm、0.04μm、0.05μm、0.06μm、0.07μm、0.08μm、0.09μm、0.1μm、0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm和10μm。
在一些实施方案中，可以通过使用约1μm至约10μm的孔径的过滤器来过滤变形虫。在一些实施方案中，可以通过使用孔径为约0.05μm至约10μm、优选约0.1μm至约8μm的过滤器过滤细菌。在一些实施方案中，可以通过使用孔径为约0.01μm至约1.5μm、优选约0.1μm至约1μm的过滤器过滤病毒。
在某些实施方案中，微生物可以通过差速离心，任选地在聚乙二醇(PEG)沉淀之后进行离心分离。人员可以参考Lawrence和Steward(Purification of viruses bycentrifugation.2010；Manual of aquatic viral ecology；Chapter 17,166-181)公开的方案。
微生物的表征可以通过现有技术中已知的任何合适的技术进行。说明性地，可以在从微生物中提取核酸之后进行微生物全基因组的下一代测序(NGS)。在实践中，可以使用例如QIAamp Viral RNA Mini Kit
Figure BDA0003584166900000091
或Pure
Figure BDA0003584166900000092
viral RNA/DNA Mini Kit
Figure BDA0003584166900000093
来提取病毒核酸。可以使用例如Illustra细菌基因组Prep Mini Spin Kit(GE Health Life
Figure BDA0003584166900000094
)或
Figure BDA0003584166900000095
Microbiome DNA Enrichment Kit(NewEngland
Figure BDA0003584166900000096
)提取细菌基因组核酸。
在一个实施方案中，活微生物是原生动物，特别是变形虫。
如本文所用，术语“原生动物”包括海洋原生动物，其涵盖辐管足类(actinopods)，例如放射虫、太阳虫目动物、acantharean；有孔虫，如单室目(monothalames)、polypthalames；变形虫；比如裸变形虫(gymnamoebians)，thecamoebians。在本发明的范围内，表述“海洋原生动物”包括海洋变形虫。
海洋阿米巴的非限制性实例包括Clydonella属的变形虫；Lingulamoeba属的变形虫，例如L.leei；马氏虫属(Mayorella)的变形虫，例如M.gemmifera；Neoparamoeba属的变形虫，例如N.branchiphila；Vannella属的变形虫，例如V.aberdonica、V.miroides；Vermistella属的变形虫，例如V.Antarctica；Vexillifera属的变形虫，例如V.minutissima、V.tasmaniana。
在一个实施方案中，活微生物是细菌，特别是海洋细菌。海洋细菌的非限制性实例包括芽孢杆菌(Bacillus)属的细菌，例如巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)；黄杆菌(Flavobacterium)属的细菌，例如Formosa agariphila；嗜盐单胞菌(Halomonas)属的细菌，例如H.profundus、热液口盐单胞菌(H.hydrothermalis)；假单胞菌(Pseudomonas)属的细菌，例如P.guezennei；噬糖菌(Saccharophagus)属的细菌，例如S.degradans；弧菌(Vibrio)属的细菌，例如V.azureus、解蛋白弧菌(V.proteolyticus)。
在一个实施方案中，活微生物是病毒。在某些实施方案中，病毒属于拟菌病毒科(Mimiviridae)。在一些实施方案中，属于拟菌病毒科的病毒属于餐厅虫病毒(Cafeteriavirus)属、克洛斯新病毒(Klosneuvirus)属、拟菌病毒(Mimivirus)属、图邦病毒(Tupanvirus)属等。在一些实施方案中，微生物是病毒。
在一些实施方案中，根据本发明从地中海收集的海水中的病毒通过孔径为约0.2μm的过滤器过滤。换言之，理解为病毒通过孔径为约0.2μm的过滤器并且不被所述过滤器截留。
在某些实施方案中，根据本发明从地中海收集的海水中存在的病毒有利地用芳香族化合物染色，特别是用SYBR Gold染料(意思是N',N'-二甲基-N-[4-[(E)-(3-甲基-1,3-苯并噻唑-2-亚基)甲基]-1-苯基喹啉-1-
Figure BDA0003584166900000097
-2-基]-N-丙基丙烷-1,3-二胺)。SYBR Gold染料优先与DNA结合。这种染料广泛用于病毒学，用于对海水和其他水生样品中存在的病毒样颗粒(VLP)进行染色和可视化。
在一些实施方案中，根据本发明从地中海收集的海水中的病毒量为约105PFU/ml至约109PFU/ml，特别是约106PFU/ml至约108PFU/ml。
如本文所用，表述“约105PFU/ml至约109PFU/ml”包括105PFU/ml、5×105PFU/ml、106PFU/ml、5×106PFU/ml、107PFU/ml、5×107PFU/ml、108PFU/ml、5×108PFU/ml和109PFU/ml。
如本文所用，PFU代表“噬斑形成单位”，是指能够在细胞单层中形成噬斑的病毒颗粒的数量。
本发明的另一方面涉及一种用于控制和/或防止有需要的海洋环境中石莼属藻类水华的方法，包括使所述海洋环境与源自从地中海收集的海水的一种或多于一种活微生物接触的步骤。
本发明的另一方面还涉及源自从地中海收集的海水的一种或多于一种活微生物用于在有需要的海洋环境中控制和/或防止石莼属藻类水华的用途。
另一方面，本发明还涉及源自从地中海收集的海水的一种或多于一种活微生物用于在海洋环境中控制和/或预防石莼属藻类水华的用途。
在另一个方面，本发明还涉及源自从地中海收集的海水的一种或多于一种活微生物用于在有需要的海洋环境中控制和/或防止石莼属藻类水华的方法中的用途。
本发明的另一个方面还涉及源自从地中海收集的海水的一种或多于一种活微生物在用于在海洋环境中控制和/或防止石莼属藻类水华的方法中的用途。
在一些实施方案中，控制和/或防止石莼属藻类水华的病毒的有效剂量为约1×101PFU/m2至约1×1012PFU/m2的待处理海洋环境。在某些实施方案中，有效剂量范围为的约1×102PFU/m2至1×108PFU/m2的待处理海洋环境，优选约1×102PFU/m2至约1×108PFU/m2的待处理海洋环境。
在本发明的范围内，术语“约1×101PFU/m2至约1×1012PFU/m2的待处理海洋环境”包括1×101PFU/m2、1×102PFU/m2、1×103PFU/m2、1×104PFU/m2、1×105PFU/m2、1×106PFU/m2、1×107PFU/m2、1×108PFU/m2、1×109PFU/m2、1×1010PFU/m2、1×1011PFU/m2和1×1012PFU/m2的待处理海洋环境。
附图说明
图1A至图1C是浒苔属藻类的照片。图1A：2018年十一月在布列塔尼北部海岸(北纬48°46'，西经3°06')的特里厄峡湾(TR)水华后采集的绿色管状藻，以前称之为浒苔属。图1B：用2018年六月在马赛湾(北纬43°18'东经5°16'E或图2中的地点X(RS))采集的海水在20℃和日光照射下孵育一个月，管状形态消失。图1C：在20℃和日光照射下三个月后，“浒苔属”变成了典型的石莼。
图2是显示用马赛湾的不同海水样品对布列塔尼石莼体外增殖进行统计分析的示意图。2018年六月在马赛湾的三个不同地点采集的海水样品。X(RN)为北纬43°18'，东经5°16'；Y(RS)为北纬43°15'，东经5°19'，Z(PR)为北纬43°14'，东经5°21'。海水样品被分成三组试管(n＝36)。将2018年六月在Brehec(布列塔尼北海岸北纬48°43'西经2°06')采集的布列塔尼石莼切割成1cm2的小块，放入对应于采样前一天(D1)采集的马赛湾地点X、Y、Z的三组试管。石莼的增殖在25℃下用海水在用胶带封闭以诱导缺氧的50ml试管中的进行。在对应于广海的X地点处观察到25个试管/36(69％)的增殖，而在Y地点处观察到14个试管/36(39％)的增殖和在离海岸最近的Z地点处仅观察到1个试管/36(2.7％)的增殖(见插入的图表)。在石莼可以增殖的试管中，1周后达到汇合并检测到酸度。在石莼不能生长且石莼在5天后变白的试管中未观察到酸度。来自Z地点的海水保持D30至D180，然后再次与布列塔尼石莼一起孵育，在D30的12个试管/36(33％)和D180的36个试管/36(100％)中观察到增殖(参见插入图表)。
图3A至图3D是显示与三种不同状态下的石莼的光学显微术比较的照片。图3A：石莼在20℃和日光照射下用来自于马赛湾Z地点的海水孵育五天后变成白色。图3B：白色石莼的光学显微术(10X)。石莼组织不受影响具有石莼属细胞的规则组织。图3C：健康石莼的光学显微术(10X)。图3D：石莼在酸性生物降解后的光学显微术(10X)。石莼组织被破坏而释放尽试管缺氧但仍保持绿色的叶绿素。使用与Nikon Eclipse Ti L100显微镜连接的NikonD3100相机(尼康，东京，日本)拍摄。
图4A至图4D是显示SYBR染色后荧光显微术的照片和图表。图4A至图4C：诱导漂白的来自地中海的海水在没有石莼属(图A)和有石莼属(图B和C)的情况下孵育。图4D：显示病毒样颗粒量，以颗粒数/ml表示。海水在0.2μm下过滤。
实施例
通过以下实施例进一步说明本发明。
实施例：鉴定促使石莼死亡的海水样品
1)材料和方法
a)石莼多态性
绿藻采集于布列塔尼北部海岸的特里厄峡湾(北纬48°46’，西经3°06’)。使用来自马赛湾(法国南部普罗旺斯)的海水样品进行体外增殖。2018年11月，在布列塔尼北部海岸的特里厄峡湾(北纬48°46’，西经3°06’)水华后，收集了以前称为浒苔属的绿色管状藻。用2018年6月在马赛北部湾(北纬43°18’东经5°16’；RN)采集的海水在20℃和在日光照射下孵育1个月。
b)石莼增殖
海水样品是于春季(2018年、2019年和2020年的六月)在八个不同地点的表面采集的，包括马赛的三个不同地点(图2)、普罗旺斯的2个地点和布列塔尼的3个地点(见表1)。海水样品被分成三组试管(n＝36)。将2018年六月在Brehec(布列塔尼北海岸北纬48°43’西经2°6’O)采集的布列塔尼石莼切割成1cm2的块并放入采样前一天(D1)采集的马赛湾地点X、Y、Z对应的三组猎鹰试管(50ml)。酸度使用Crison pH计(巴塞罗那，加泰罗尼亚)进行测试。在任何测量之前校准pH计。硝酸盐使用METRHOM色谱离子装置(瑞士伯尔尼)用Metrosep柱Asupp 5 150/4mm以3.2mM Na2CO3/1mM NaHCO3作为洗脱剂进行测量。海水被稀释至1/8并使用标样来校准硝酸盐的量。
c)光学显微镜
在汇合前、酸性生物降解后以及用马赛湾的Z(PR)地点收集水样培养五天后的白色石莼上进行光学显微镜检查(10X)。使用与Nikon Eclipse Ti L100显微镜(Nikon，Tokyo，Japan)连接的Nikon D3100相机拍摄照片。
d)二极管阵列检测高效液相色谱法(DAD HPLC)
海水样品以0.2μm过滤，并在带有反相(C8)柱的Beckman HPLC系统金装置上使用H2O 0.1％TFA(A)和CH3CN 0.1％TFA(B)进行分析。梯度为40分钟内从10％到50％B，然后10分钟为90％B和10分钟为10％B。二极管阵列检测器Beckman装置连接在注射器之后。流速为0.8ml/min
e)SYBR染色后的荧光显微镜检查
使用真空过滤系统将不含以及含石莼样品的地中海海水通过0.22μm膜过滤器(
Figure BDA0003584166900000121
目录号SLGP033RS)过滤以除去细胞，然后通过0.02μm阳极圆盘过滤器(
Figure BDA0003584166900000131
目录号WHA68096002)收集病毒颗粒。
然后在室温下用与DNA特异结合的SYBR Gold染料(N’,N’-二甲基-N-[4-[(E)-(3-甲基-1,3-苯并噻唑-2-亚基)甲基]-1-苯基喹啉-1-
Figure BDA0003584166900000132
-2-基]-N-丙基丙烷-1,3-二胺)(
Figure BDA0003584166900000133
目录号S11494)将过滤器染色，在黑暗中放置15分钟，然后用0.02μm过滤的500μL无菌mQ水洗涤3次。用落射荧光显微镜Leica SP2观察染色的病毒样颗粒。
2)结果
a)布列塔尼石莼可以在地中海生长，并且在盐度方面具有不同的表型
石莼天然存在于马赛湾(法国南部普罗旺斯)，每年冬天都会出现。石莼属从二月到三月迅速生长，然后在春季迅速消失。正如在布列塔尼观察到的那样，在马赛湾从未报告过石莼水华，而这个海湾的磷酸盐和氮含量很高，而且是浅滩。第一个假说可能是布列塔尼石莼能够容易在布列塔尼增殖，但不能在地中海生长，更具体地说，与布列塔尼的海水相比，地中海硝酸盐浓度较低。选择了马赛附近的五个地点并收集了海水样品，并与布列塔尼的三个地点进行了比较(表1)。
表1：来自布列塔尼和普罗旺斯的春季海水(n＝7)
Figure BDA0003584166900000134
*使用春季收集的海水样品在体外对布列塔尼石莼属进行漂白的统计分析。所有实验(n＝8)均使用2018年、2019年和2020年在布列塔尼北部特里厄峡湾(TR)收集的布列塔尼石莼属进行。将石莼属切成1cm2的小块，放入用胶带封闭的试管(n＝25)中的海水(40ml)中，放置于平均温度为25℃的日光下。
马赛湾位于罗纳河河口20公里处，西北风(密斯塔和塔蒙达那)经常从罗纳河吹向马赛。表1显示RN的pH值和电导率(主要与盐度有关)较低，这可能是由于罗纳河的影响。表1显示，在布列塔尼(BR和PO)和普罗旺斯(RN、WF、RS)的开阔沿海海水中硝酸盐的浓度相当。然而，布列塔尼峡湾(TR)或普罗旺斯的卡兰克(MU)和码头(PR)的硝酸盐浓度可能要高得多。
如上所示，布列塔尼石莼可以在来自马赛的海水中快速生长(图1)。石莼多态性用以前称为浒苔属(图1A)的绿色管状藻类进行了测试，该藻类采集于潘波尔市(北布列塔尼)附近的特里厄峡湾，在20℃±10℃和日光照射3个月后成为典型的石莼(图1C)。该实验说明了盐度在石莼多态性中的重要性，如前所述(Rybak,Ecological Indicators,2018,85,253-261)。
b)布列塔尼石莼的增殖在马赛湾的水取样地点和时间上有所不同
当石莼达到了汇合诱导特征是产生H2S的缺氧时，海滩上会发生自然生物降解。对于这种生物降解，石莼属会因脱水而变白。然而，这种现象与我们观察到的在马赛收集的海水中培养的布列塔尼石莼不同。布列塔尼石莼在一天之内的某个时候迅速变白(漂白)而没有脱水。为了模拟这种自然过程，在用胶带封闭以诱导缺氧的50ml试管的海水中进行石莼的增殖。
对在布列塔尼的三个不同地点和普罗旺斯的五个地点包括马赛湾收集的海水样品进行了统计分析(表1和图2)。海水样品被分成八组试管(n＝36)。将布列塔尼石莼切成1cm2的块，放入在采样前一天(D1)收集的对应于马赛湾的地点X(RN)、Y(RS)和Z(PR)，普罗旺斯的PR和MU，TR和BR(北布列塔尼)和PO(南布列塔尼)的八组试管中。
当春天石莼属的增殖最高时在布列塔尼收集的海水中没有观察到漂白现象。关于普罗旺斯的五个不同地点，可能发生增殖的试管的数量并不相同。在对应于广海的X地点处观察到25个试管/36(69％)发生增殖，而在Y地点处观察到14个试管/36发生增殖和在最近的海岸Z地点处仅1个试管/36发生增殖。对于石莼无法生长的试管，在20℃的日光下，石莼在五天内变为白色，未检测到酸度，如图3A所示。这种石莼白色表型与在布列塔尼观察到的当石莼在退潮时停留在岸边的白色脱水石莼不同。对于石莼可增殖的试管，一周后达到汇合，按照石莼生物降解的常规过程观察酸度(Dominguez and Loret,Mar Drugs.2019Jun14；17(6).Pii:E357)。正如在自然条件下观察到的那样，石莼在生物降解下仍保持绿色。来自Z地点的海水(图2)保存D30到D180，然后再次与布列塔尼石莼一起孵育，在D30的2个试管/36和D180的36个试管/36中观察到增殖(图2)。促使布列塔尼石莼细胞死亡的有效成分不是从D1到D180产生相同效果的污染物。其他布列塔尼藻类(主要是棕色)不受马赛湾海水的影响(数据未显示)。
c)与三种不同状态的石莼的光学显微术比较表明，白色石莼的组织没有被破坏
图3A示出了白色石莼在组织水平上用光学显微术进行了研究。图3B示出了，与健康石莼相比，石莼的白色组织不受影响具有石莼细胞的规则组织，所述健康石莼具有由细胞质中存在使细胞呈绿色的叶绿素的紧密细胞组成的叶状体(图3C)。图3B中的白色表示细胞已经死亡，但这种死亡不是由破坏藻类组织的组织结构的大型捕食者或环境条件造成的，如图3C所示。这不是可以提供白色的孢子形成。从这些初步实验中得出的主要解释是，对石莼有特异性的微生物控制了地中海石莼的水华。只有微生物攻击，特别是病毒攻击，才能解释石莼细胞在没有组织损伤的情况下的迅速死亡。而且，这一假设得到了证实。事实上，当海水在0.2微米过滤时，石莼仍然会变白，这表明漂白活性不是由于大小超过0.2μm的浮游生物、变形虫或细菌造成的。
d)二极管阵列检测与高效液相色谱法相结合(DAD HPLC)
将诱导漂白的地中海海水在0.2μm下过滤，然后使用DAD HPLC进行分析，该HPLC可以对用乙腈梯度在不同时间从疏水C8柱洗脱的每个实体进行紫外光谱分析。5分钟到45分钟洗脱的大多数峰的特征在于在243nm处具有最大吸收，并且对应于称为胶体的有机大分子的紫外光谱特征。DAD HPLC运行的3D视图显示胶体是在0.2μm下过滤的海水的主要成分。三个峰具有不同的紫外光谱特征。位于第3.5分钟的用红色箭头指示的峰可能对应于病毒颗粒的存在，并且特征是由于核酸和芳香族氨基酸的266nm处的第一个最大吸光度。其他两个峰对应于第6分钟的游离核酸和第45分钟的游离蛋白质，特征分别是260nm和280nm处的最大吸光度。当将布列塔尼石莼添加到地中海海水中5天后，并且当发生漂白时，对应于病毒的峰值显著增加，在266nm处具有7mAU至32mAU的最大吸光度。有趣的是，这个与病毒颗粒一致的峰增加了78％，而胶体峰减少了(可能是由于石莼属的进食)。
e)病毒样颗粒染色和荧光显微镜
不含和含石莼的地中海海水在0.2μm下过滤，然后用称为SYBR Gold染料(意思是N’,N’-二甲基-N-[4-[(E)-(3-甲基-1,3-苯并噻唑-2-亚基)甲基]-1-苯基喹啉-1-
Figure BDA0003584166900000151
-2-基]-N-丙基丙烷-1,3-二胺)的芳香族化合物染色，其优先与DNA结合。这种染料广泛用于病毒学，用于对海水和其他水生样品中存在的病毒样颗粒(VLP)进行染色和可视化。有数百篇已发表的报告使用这种方法对生物样品中的病毒进行计数和检测(Shibata等人，AquatMicrob Ecol.2006,43,223–231)。图4A至图4C显示SYBR染色后的荧光显微术，结果显示当将石莼添加到海水中时，病毒产量很高。当石莼仍然是绿色的时候，这种高的病毒产量已经很重要了。然而，当石莼变成白色时，病毒丰度达到6.5×108个病毒/ml，这是非典型病毒的高浓度(图4D)。该实验表明，当石莼被漂白时，以更高的速度有效地产生和释放病毒。
3)讨论
全世界海水和地中海的平均硝酸盐浓度为约1μM。如果硝酸盐浓度是马赛的石莼没有增殖的原因，那么人们可以预期布列塔尼北海岸的硝酸盐浓度高达100μM，在布列塔尼北海岸的绿潮在西欧尤其是春季是最重要的，但情况并非如此，河流或峡湾除外(表1)。硝酸盐浓度可随季节变化。在布列塔尼北部海岸，罗斯科夫海洋站的平均值为5μM，2018年和2019年冬季接近10μM，夏季达到1μM(Service d’Observation en Milieu Littoral(SOMLIT),INSU-CNRS,Roscoff and Marseille”http://somlit-db.epoc.u-bordeaux1.fr/bdd.php)。其他参数，如pH值和电导率，也因罗斯科夫的季节而异(见http://somlit-db.epoc.u-bordeaux1.fr/bdd.php)。英国北海岸BR的数据(表1)在罗斯科夫观察到的硝酸盐浓度范围内，在马赛观察到相同的季节变化(http://somlit-db.epoc.u-bordeaux1.fr/bdd.php)。在西班牙西部的加利西亚也观察到了这种季节变化(Villares等人,Bol.Inst.Esp.Oceanogr.1999,15,337-341)。同样重要的是要指出石莼属的绿潮的起源不一定来自布列塔尼海岸。在北大西洋中部观察到石莼属的增殖，由于北大西洋占主导地位的西风，石莼属漂流到布列塔尼。叶绿素异常在北大西洋似乎越来越频繁，绿潮的主要原因可能主要是由于全球变暖。没有对硝酸盐浓度进行连续调查，因为其目的是为了与相同的分析方法进行比较，并且仅在春季马赛的硝酸盐浓度比布列塔尼北部海岸低得多的情况下进行比较，以解释石莼属没有增殖。情况并非如此，IFREMER于2007年和2008年在马赛湾进行的非常有趣的调查表明，马赛附近广海的硝酸盐浓度可能与北布列塔尼海岸高于8μM且2008年6月测量了3次的硝酸盐浓度一样高(Young等人，PLoS One.2016,11(5):e0155152)。此外，关于营养浓度，叶绿素活性似乎异常低(0.2μg/ml)，并且可以在很短的时间内增长至1μg/ml，这可能通过控制增殖的病毒裂解来解释(Young等人，PLoSOne.2016,11(5):e0155152)。
众所周知，病毒参与控制微藻水华，但迄今为止尚未证明大型藻类有这种情况。最近在美国观察到微藻水华的病毒控制，在东海岸的抑食金球藻(Moniruzzaman等人，FrontMicrobiol.2018,9,752-758)或夏威夷的周氏扁藻(Schvarcz and Steward,Virology2018,518,423-433)这两种微藻诱导有害的水华。这两种情况下，都是由于最近发现的称为巨型病毒的病毒。巨型病毒最初是在变形虫中发现的(La Scola等人，Science 2003,299,2033-2038)。有趣的是，在图3B的显微镜中检测到了移动的变形虫。虽然自一个世纪以来已知的大多数病毒的大小均<400nm，例如HIV为160nm，最小的病毒(感染猪的细小病毒科)为20nm，但巨型病毒的大小可达1μm。从那时起，世界各地发现了感染许多物种，特别是海洋物种的巨型病毒(Abergel等人，FEMS Microbiol Rev 2015,39,779-796)。
石莼水华仍将是随着全球变暖而增加的麻烦的根源。然而，有一个名为“杀死赢家”的自然法则假设可能会打断这个石莼的成功故事。当物种出现增殖时，这个物种的捕食者似乎控制着这种增殖。在最强大的天然捕食者中，最大的不一定是最有效的。石莼特有的捕食者的出现可能是地中海捕食者，例如病毒、海洋细菌和变形虫浓度高的结果。病毒是海水中最丰富的生物实体，即使在深海(1000m至2000m)区域也可以找到，而地中海似乎在上层(5m)区域具有最高浓度。如果原核生物和单细胞藻类似乎是主要的病毒宿主，那么从病毒部分获得的序列中只有9％具有可识别的病毒来源，并且未对巨型病毒特异性序列进行研究。捕食者的动力学在温度方面可能有所不同，这可以解释为什么当温度达到15℃时，马赛湾的石莼会在春天消失。
描述本发明的实验表明，可以用来自马赛湾的水样品控制布列塔尼石莼的增殖。这种控制是由微观的活有效成分制成的，它的浓度在马赛湾的不同地点是不一样的。重要的是，连续3年(2018年、2019年、2020年)春季在马赛湾同一地点(PR)采集的样品都能够实现石莼漂白，这表明微生物，特别是病毒，在这种海洋环境中不断重新恢复。

Claims (16)

1.一种用于在有需要的海洋环境中控制和/或防止石莼属藻类水华的方法，包括使所述海洋环境与从地中海收集的海水接触的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中石莼属藻类是石莼种的藻类。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中海水是在北纬43°14'和东经5°21'处、在北纬43°09'和东经5°36'处、在北纬43°18'和东经5°17'处、在北纬43°14'和东经5°17'处或在北纬43°15'和东经5°19'处收集的。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中海水是在北纬43°14'和东经5°21'处或在北纬43°09'和东经5°36'处收集的。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中海水包含能够促使石莼属藻类死亡的活微生物。
6.根据权利要求5所述的方法，其中活微生物是病毒。
7.一种用于控制和/或防止有需要的海洋环境中石莼属藻类水华的方法，包括使所述海洋环境与源自从地中海收集的海水的一种或多于一种活微生物接触的步骤。
8.根据权利要求7所述的方法，其中石莼属藻类是石莼种的藻类。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中海水是在北纬43°14'和东经5°21'处、在北纬43°09'和东经5°36'处、在北纬43°18'和东经5°17'处、在北纬43°14'和东经5°17'处或在北纬43°15'和东经5°19'处收集的。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的方法，其中海水是在北纬43°14'和东经5°21'处或在北纬43°09'和东经5°36'处收集的。
11.根据权利要求7至10中任一项所述的方法，其中活微生物是病毒。
12.源自从地中海收集的海水的一种或多于一种活微生物用于在海洋环境中控制和/或防止石莼属藻类水华的用途。
13.根据权利要求12所述的用途，其中石莼属藻类是石莼种的藻类。
14.根据权利要求12或13所述的用途，其中海水是在北纬43°14'和东经5°21'处、在北纬43°09'和东经5°36'处、在北纬43°18'和东经5°17'处、在北纬43°14'和东经5°17'处或在北纬43°15'和东经5°19'处收集的。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的用途，其中海水是在北纬43°14'和东经5°21'处或在北纬43°09'和东经5°36'处收集的。
16.根据权利要求12至15中任一项所述的用途，其中活微生物是病毒。
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