JPH1171203A - 藍藻類選択的殺藻剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 水域の環境破壊、産業活動への妨害、人
間や動物の生命に対する脅威ともなっている有害藍藻類
を、その発生水域より選択的に除去し、当該水域におけ
るその他の生物には悪影響を及ぼさない殺藻剤およびそ
の製造法を提供する。 【解決手段】 β−シアノ−Ｌ−アラニンを有効成分と
する藍藻類選択的殺藻剤および微生物を用いてシアン化
化合物の非存在下においてβ−シアノ−Ｌ−アラニンを
製造する方法。本発明の藍藻類選択的殺藻剤を用いるこ
とにより、有害藍藻類を、同時に当該水域に棲息する他
の微細藻類に害を与えずに、その発生水域より有効に除
去することが可能となり、従来藍藻類の大発生により被
害を受けてきた各種産業に対する恩恵となるとともに、
環境保全や、安全な飲料水の確保にとり大きく貢献する
ものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は藍藻類選択的殺藻剤
に関するものであり、さらに詳しくは、湖沼・河川・海
洋などに大量発生する有害藍藻類に対し選択的な生育阻
害活性（以下「殺藻活性」と記述する。）を示す化学物
質を含有する殺藻剤および殺藻活性成分の微生物による
製造法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】藍藻類は広く自然界の水域に分布し、湖
沼・河川など淡水環境以外にも塩濃度の高い海洋や塩
湖、また、高酸性度・高温などの環境条件である温泉な
どからも発見されている生物の一群である。この藍藻類
は適当な栄養・温度その他の条件により比較的狭い水域
に大発生することが報告されているが、その「水の華」
・「赤潮」などといわれる大発生のメカニズムはまだ不
明の点が多い（秋山優ら編：「藻類の生態」 209〜 249
ページ（1986年発行、内田老鶴圃）、岡市友利編：「赤
潮の科学」 5〜36ページ（1987年発行、恒星社厚生
閣））。この大発生現象はあらかじめ予想されない時
期、場所、規模で起こることがあり、また、いったんこ
の大発生が実現すると極く少数、場合によってはただ一
種の藍藻類により当該水域に含まれる有機物・溶存ガス
などが消費されたり、またその組成に偏りを生じるなど
のために、付近の水域の生態系が乱され、ひいては深刻
な環境破壊につながることもある。また、養殖業などの
産業に対しても、その養殖水域に藍藻類の大発生が起こ
ることにより養殖場近辺の栄養分布、酸素濃度や、養殖
魚の餌となる微生物群の構成に変化を来たす結果、ある
いは藍藻の藻体そのものが物理的に養殖魚等の呼吸器を
覆うなどの結果、当該水域にて養殖魚の斃死など被害が
及ぶという報告例もある（日本水産学会編：「赤潮―発
生機構と対策」 124〜 138ページ（1980年発行、恒星社
厚生閣））。ダムなどを利用した水力発電所や農業用水
路などで大発生した藍藻類が取水口を塞ぐことにより正
常なプラントの運転や水路としての利用を妨げることも
知られている。さらに、我々人間が飲料水として利用し
ている淡水域に棲息する藍藻類のなかには、その代謝産
物として人間を始めとする動物に対して毒性を示す物質
を生産するものも知られている（日本水産学会編：「有
毒プランクトン―発生・作用機構・毒成分」 9〜21ペー
ジ（1982年発行、恒星社厚生閣））。事実、外国の例で
は、池や湖に藍藻類が大発生して、その代謝産物である
毒素のために家畜や野生動物に多数死亡例が報告され
（日本水産学会編：「有毒プランクトン―発生・作用機
構・毒成分」 123〜 132ページ（1982年発行、恒星社厚
生閣））、その代表的な毒素であるミクロシスチンは肝
臓毒、具体的にはプロテインフォスファターゼ1 および
2Aを阻害することにより肝癌を誘発するプロモーターで
あることが示されている（中野昌康編：「医学微生物学
の最先端」 239〜 251ページ（1997年発行、菜根出
版））。

【０００３】このように藍藻類の大発生は当該水域の環
境破壊のみならず、産業活動への妨害、人間や動物の生
命に対する脅威ともなっている。これまでこういった有
害藍藻を除去するために、人力および機械による物理的
回収や、藍藻を含む酸素発生型光合成を営む生物に広く
作用する除草剤・殺藻剤の散布などが一般的である。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】これまで有害藍藻類の
除去方法としては、物理的回収や、除草剤・殺藻剤の散
布などが一般的であったが、その発生が予想できなかっ
たり、間近の発生が予想されても抑止できないなどのた
め、前者では回収員や機械の調達が間に合わなかったり
コストがかさむなどの問題があり、後者では有害藍藻類
以外の当該水域にもともと棲息する植物等に悪影響を及
ぼすおそれがある。例えば、特開平 7-69811号公報には
有機酸、リン酸および重合リン酸類からなる群より選ば
れた少なくとも１種の酸と、有機酸の塩類、リン酸の塩
類および重合リン酸類の塩類からなる群より選ばれた少
なくとも１種の塩類からなる水溶液を用いて、海苔の養
殖時において発生する雑藻の繁殖を防除する殺藻剤につ
いての記述があるが、これらを用いて雑藻類を除去する
とき、その殺藻作用はアオノリ、アオサ、珪藻など広く
藻類一般に及ぶため、大発生したアオコなど藍藻類のみ
を選択的に除去することはできない。同様なことは除草
剤として用いられている3-（3',4'-ジクロロフェニル)-
1,1-ジメチル尿素（3-(3',4'-dichlorophenyl)-1,1-dim
ethylurea)などについても言え、この場合も酸素発生型
光合成を営む生物一般に対し到死作用を示すため、藍藻
類のみの選択的除去は達成されない。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、かかる事
情を鑑み、有害藍藻類をその発生水域より選択的に除去
し、当該水域におけるその他の動植物には悪影響を及ぼ
さない、さらには取り扱いが容易で安価な化学物質の探
索を行った。その結果、ビブリオ属(Vibrio sp.)に属す
る微生物の培養物中に藍藻類に対し選択的に殺藻活性を
示す物質が含まれることを見いだし、また、殺藻活性の
正体化合物がβ−シアノ−Ｌ−アラニン（β-cyano-L-a
lanine、以下「シアノアラニン」と記述する。）である
ことを見いだした。シアノアラニンは、公知の方法、例
えば、レスラーら著：ジャーナル・オブ・オーガニック
・ケミストリー誌第26巻3356〜3360ページ（1961年発
行）、あるいはアーノルドら著：ジャーナル・オブ・ア
メリカン・ケミカル・ソサエティー誌第 110巻第 7号22
37〜2241ページ（1988年発行）に記載される化学的方法
によって合成することができる。また、微生物を用いて
生産することも可能であり、該化合物を生産する能力の
ある微生物の例としては、ファードンら著：ネーチャー
誌第 206巻 110〜 112ページ（1965年発行）記載のクロ
レラ・ピレノイドーサ（Chlorella pyrenoidosa)、ブリ
スクら著：ジャーナル・オブ・バクテリオロジー誌第97
巻第１号 322〜 327ページ（1969年発行）記載のクロモ
バクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violac
eum)、カストリクら著：ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー誌第 244巻第15号4089〜4094ページ
（1969年発行）記載のバチルス・メガテリウム（Bacill
us megaterium)、サカイら著：アグリカルチュラル・ア
ンド・バイオロジカル・ケミストリー誌第45巻第 9号20
53〜2062ページ（1981年発行）記載のエンテロバクター
・スピーシーズ（Enterobacter sp.）などがあるが、こ
れらの微生物を用いた例ではいずれも基質としてシアン
化カリウムまたはシアン化ナトリウムなどシアン化化合
物を存在させてシアノアラニンの生産を確認している。
また、ダンニルら著：ネーチャー誌第208巻1206〜1207
ページ（1965年発行）に記載されるように大腸菌の菌体
抽出物もシアノアラニンの合成能を有することが知られ
ているが、この場合にも、シアン化化合物の添加により
その合成が認められるのみである。これに対し、本発明
者らが見いだしたビブリオ属（Vibrio sp.）に属する微
生物は培地に特別にシアン化化合物を添加しなくとも１
〜３日程度の培養により相当量のシアノアラニンの生産
が認められる。さらに本発明者らは海洋より採集された
多数の微生物をそれぞれの菌株毎に適当な培地を用いて
１〜３日程度培養させた時、該培養物を単に乾固するだ
けで、その乾固物は藍藻類に対し選択的に殺藻活性を示
すこと、および該乾固物中にシアノアラニンが存在する
ことを見いだした。さらに本発明者らは、シアノアラニ
ンが海産および淡水産の藍藻類に対して殺藻活性を示す
こと、および、種々の微細藻類の中で藍藻にのみ低濃度
で作用し、他の微細藻、具体的には緑藻、珪藻、渦鞭毛
藻に対しては殺藻活性を示さず、さらに、大型緑藻およ
び細菌類、真菌類に対しても到死活性を示さないという
選択毒性を示すことを見いだして、本発明を完成した。

【０００６】即ち、本発明の第一は、シアノアラニンを
有効成分として含有することを特徴とする藍藻類選択的
殺藻剤に関するものであり、また、本発明の第二は、ビ
ブリオ属に属し、藍藻類選択的殺藻活性を示す化合物シ
アノアラニン（β-cyano-L-alanine）を生産させる能力
を有する微生物を培地に培養し、培養物中にシアノアラ
ニンを生成蓄積させ、該生成蓄積したシアノアラニンを
採取することを特徴とするシアノアラニンの製造法に関
するものである。そして、上記ビブリオ属に属する微生
物としてはビブリオ・スピーシーズC-979 が挙げられ
る。

【０００７】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
シアノアラニンは化学的方法により合成することが可能
で、また、培地中にシアン化化合物を添加することによ
り微生物により生産されることも知られているが、本発
明によれば、培地中にシアン化化合物を加えないで微生
物を用いて生産することが可能である。シアノアラニン
の生産に用いる微生物としては、ビブリオ属に属し、シ
アノアラニン生産能を有する微生物であれば特に限定さ
れず、例えば、ベラウ共和国海域で採取された大型緑藻
ヨレヅタ(Caulerpa serrulata var. serrulata f. lat
a）表面から分離された C-979株や該菌株に由来する変
異株を挙げることができる。

【０００８】このC-979 株の菌学的性質は次の通りであ
る。なお、形態観察は、培地にビブリオ・スピーシーズ
C-979株を植菌し、30℃で24〜48時間培養した後に光学
顕微鏡および透過型電子顕微鏡を用いて行った。培地
は、マリンアガー（Bacto Marine Agar 2216, ディフコ
社製）あるいはマリンブロス（Bacto Marine Broth 221
6,ディフコ社製）を用いた。なお、本菌株は培地中の塩
化ナトリウム濃度が１％以下では菌の生育が認められな
いことから、生化学的性状の試験は75％人工海水を用い
て培地を作製するか、あるいは培地中に3％塩化ナトリ
ウムを添加することによって行った。

【０００９】ａ．形態 １）細胞の形および大きさ：桿菌、1.3-2.4 ×0.5-1.4
μｍ。 ２）細胞の多形性の有無：無し。 ３）運動性の有無、鞭毛の着生状態：有り、極毛、固体
培地で培養した場合、菌体周辺に鞭毛が観察される。 ４）胞子の有無：無し。 ５）グラム染色性：陰性。 ６）抗酸性の有無：無し。 ｂ．各培地における生育状態 １）マリンアガー平板培養 ：良好に生育、コロ
ニーは円形、凸円状、全縁湿光、乳白色。 ２）マリンアガー斜面培養 ：良好に生育、糸
状、乳白色。 ３）マリンブロス培養 ：良好に生育，均質
に濁る。 ４）マリンブロスゼラチン穿刺培養：液化する。 ５）リトマスミルク ：消化する。 ｃ．生理学的性質 １）硝酸塩の還元：還元する。 ２）MRテスト：陽性。 ３）VP反応：陰性。 ４）インドールの生成：生成しない。 ５）硫化水素の生成：生成しない。 ６）でんぷんの加水分解：分解する。 ８）無機窒素源の利用：利用する。 ９）色素の生成：無し。 １０）ウレアーゼ活性：陰性。 １１）オキシダーゼ活性：陽性。 １２）カタラーゼ活性：陽性。 １３）生育の範囲（温度、pH）：温度13〜41℃、20〜35
℃で最も良好に生育。pH 5〜10、最適生育pH範囲6 〜
9。 １４）酸素に対する態度：通性嫌気性。 １５）OF試験：発酵的にブドウ糖を分解する。 １６）糖類からの酸およびガスの生成の有無：基礎培地
はBaumann のBM培地を使用、25℃、３週間培養後。生成
の有無を表１に示す。

【００１０】

【表１】

【００１１】 １７）エスクリンの分解：分解する。 １８）アルギニンの分解：分解しない。 １９）ＤＮＡの分解：分解する。 ２０）好塩性：有り。生育塩濃度範囲1 〜7 ％。 ２１）β- ガラクトシダーゼ：陽性。 ２２）ＧＣ含量（モル％）：46.0。 ２３）イソプレノイドキノン：主たるキノン：Q-8。 マイナー成分：Q-6、Q-7、Q-9、MK-8、DMK-8。

【００１２】以上の菌学的性質からバージーズ・マニュ
アル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー第
８版の分類基準に従って公知の菌種と比較した。本菌株
は通性嫌気性グラム陰性桿菌で極鞭毛を有するが、寒天
培地上で培養したものでは周鞭毛も観察された。ブドウ
糖を発酵的に分解し、オキシダーゼ、カタラーゼが陽性
であることからビブリオ属に所属すると考えられ、ビブ
リオ・スピーシーズ（Vibrio sp.）と同定した。そし
て、この菌株をビブリオ・スピーシーズ（Vibriosp.)C-
979とし、平成 9年 7月31日付けで工業技術院生命工学
工業技術研究所にFERM P-16360として寄託した。

【００１３】次に培養法について述べる。本発明の培養
法においては通常の細菌の培養方法が一般に用いられ
る。培地としては資化可能な炭素源、窒素源、無機物お
よび必要な生育、生産促進物質を程よく含有する培地で
あれば合成培地、天然培地のいずれでも使用可能であ
る。炭素源としてはグルコース、澱粉、デキストリン、
マンノース、フラクトース、シュークロース、ラクトー
ス、キシロース、アラビノース、マンニトール、糖密な
どの糖類、酢酸等の有機酸、グリセリン等のアルコール
類などが単独または組み合わせて用いられる。窒素源と
しては塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸ナト
リウム、尿素、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥
酵母、コーン・ステープ・リカー、大豆粉、カザミノ酸
などが単独または組み合わせて用いられる。そのほか、
必要に応じて食塩、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、
炭酸カルシウム、燐酸二水素カリウム、燐酸水素二カリ
ウム、硫酸第一鉄、塩化カルシウム、硫酸マンガン、硫
酸亜鉛、硫酸銅などの無機塩類を加える。さらに使用菌
の生育やシアノアラニンの生産を促進する微量成分を適
当に添加することができる。

【００１４】培養法としては、液体培養法が最も適して
いる。培養温度は30℃が適当であり、培地のpHは 5〜10
で培養することができ、 6〜 9が望ましい。液体培養で
通常1〜 3日間培養を行うと、シアノアラニンが培養液
中に生成蓄積される。培養物中の生成量が最大に達した
ときに培養を停止する。

【００１５】培養物からのシアノアラニンの単離精製
は、微生物代謝産物をその培養物から単離精製するため
に常用される方法に従って行われる。例えば培養物を濾
過や遠心分離により培養濾液と菌体に分け、培養濾液を
酢酸エチルなどで洗浄する。洗浄後の水層を活性炭やイ
オン交換樹脂による精製、透析膜を用いた脱塩などの工
程を経て、シアノアラニンを得る。

【００１６】本発明のシアノアラニンの製造法は、特定
の微生物を用いることにより、安価な培地成分からＬ
体（光学活性体）のみを選択的に調製することができ、
有毒なシアン化化合物を添加する必要もないという利
点を有する。従って、化学合成法が多段の工程を必要と
し、しかもＬ体を選択的に調製するにはさらにコストを
要し、また、公知の微生物による調製法ではシアン化化
合物の添加を要するのに対し、本発明のシアノアラニン
の製造法は極めて有用である。

【００１７】本発明の藍藻類選択的殺藻剤は、シアノア
ラニンを有効成分とし、その有効成分濃度は、殺藻活性
を発揮できる範囲であれば特に限定されないが、 1〜 2
00μg/mlとするのが好ましい。本発明の殺藻剤に用いる
シアノアラニンは単に、シアノアラニンを生産する微生
物を適当な培地に培養し、その培養物を凍結乾燥もしく
はそのほかの方法により乾固状態にするのみでなんら精
製の操作を加えないで用いることが可能であるが、上記
の化学合成による方法、または微生物を用いて生産させ
る方法により高純度に調製されたものを用いることもで
きる。

【００１８】また、本発明の藍藻類選択的殺藻剤を用い
る藍藻類の殺藻方法としては特に限定されるものではな
く、如何なる操作によるものでもよい。例えば、本発明
のビブリオ属 C-979株培養物から精製されたシアノアラ
ニンを水溶液として用いてもよいが、その培養物を乾固
状態とした後、その水抽出物または水懸濁物を用い噴霧
などにより水面に散布するかまたは藍藻類が付着した魚
網、水中構築物等を取り出して殺藻剤溶液に浸漬するな
どの方法を採用することができる。

【００１９】

【実施例】以下に本発明を実施例により具体的に説明す
る。但し、本発明はこれら実施例により限定されるもの
ではない。 実施例１（シアノアラニンの調製） 本実施例では種菌としてビブリオ・スピーシーズ C-979
を用いた。該菌株を1000ml容量の三角フラスコ中のマリ
ンブロス200ml に植菌し、30℃で24時間回転振盪培養
（110rpm）した。このようにして得られた培養液 2.4リ
ットルを遠心分離し、菌体等の沈殿物を除去し、培養上
清を得た。得られた培養上清を同容量の酢酸エチルを用
いて分配抽出し、静置して下層である水層を集め、水層
中に飽和量溶解している酢酸エチルを減圧蒸留法にて除
去した。このようにして得られた酢酸エチルを含まない
培養上清処理液に対し、活性炭素（ナカライテスク社
製、塩酸処理済み）粉末250gを加えてよく撹拌し、室温
で静置した後に濾紙（アドバンテック東洋社製、No.2）
を用いた吸引濾過により活性炭素粉末を除去した。濾液
をおよそ 200mlとなるまで減圧濃縮して、その1/10容量
の１規定塩酸を加え、この酸性濃縮濾液をセルロースエ
ステル透析チューブ（スペクトラム社製、分画分子量10
0)中に封入した。このようにして酸性濃縮濾液を封入し
た透析チューブを5リットルの蒸留水を入れたビーカー
中に投じて、室温で蒸留水を常時撹拌した状態で放置
し、該濾液より無機塩類を脱塩除去した。この透析操作
は一夜継続したが、その途中で一度ビーカー中の水を新
しく調製した蒸留水と交換した。透析を終えた脱塩調製
液を 200mlのダウエックス（登録商標)・50Ｗ-x8 イオン
交換樹脂（ダウエックス社製、プロトン型）を充填した
カラム（内径4.3mm)に負荷して、殺藻活性成分を樹脂に
吸着させた。このカラムに約 500mlの蒸留水を通過させ
て樹脂を洗浄した。かかる後に 200mlの３規定アンモニ
アを通過させることにより、殺藻活性成分を樹脂より脱
着させ、溶離液を減圧濃縮した。ついで、移動層として
20mMの酢酸アンモニウムを用いたイオン交換高速液体ク
ロマトグラフィー（東ソー社製、TSKゲルDEAE-2SW、内径
7.8mm、長さ30cm）で精製し、殺藻活性を有するシアノア
ラニン16.4mgを得た。ここで得たシアノアラニンは文献
公知の理化学的性質を示し、改良マーフィー法（詳細は
原田健一ら著、テトラヘドロン・レターズ誌第37巻第17
号3001〜3004ページ（1996年発行）に掲載）によりその
立体構造はＬ体であることが確認された。

【００２０】実施例２（シアノアラニンの海産藍藻に対
する殺藻活性試験） 本実施例ではシアノアラニンの１％濃度の水溶液を調製
し、これをストック溶液として用いた。バイオアッセイ
に用いるためのシアノアラニンの定濃度溶液は、このス
トック溶液をメタノールで希釈することにより調製し
た。被検藍藻はF/2 培地（組成についてはギラードら
著：カナディアン・ジャーナル・オブ・ミクロバイオロ
ジー誌第 8巻 229ページ（1962年発行）に記載）で静置
し、2000lxの光量で12時間光を照射し、続く12時間光を
照射しない24時間サイクルの光条件で22℃で培養し、対
数増殖期にある藍藻をバイオアッセイに用いた。バイオ
アッセイは以下の手順で実施した。クリーンベンチ内の
滅菌条件下で定濃度のシアノアラニン溶液を96孔のポリ
スチレン製マイクロプレート（ファルコン社製、ガンマ
線滅菌）のウェルに10μl 投入し、その溶媒を風乾によ
り蒸発させた。新鮮なF/2 培地に植栽した藍藻をウェル
に200 μl 投入した。即ち、最初にウェルに投入した10
μl のシアノアラニン溶液が1000μg/mlであった場合、
このものの生理活性を 200μl の培地中で検定するので
あるから、このときは50μg/mlのシアノアラニンの生理
活性を検定したことになる。このようにしてシアノアラ
ニンを添加した培地で各種藍藻を22℃で静置培養した。
この時の光条件は上述した被検藍藻の培養と同じにし
た。培養を 3昼夜継続したとき、サンプルを添加してい
ないネガティブコントロールおよび除草剤である3-
（3',4'-ジクロロフェニル)-1,1-ジメチル尿素を10μg/
ml濃度で用いたポジティブコントロールを対照としてシ
アノアラニンの殺藻活性を判定した。用いた被検藍藻は
シネココッカス・スピーシーズ（Synechococcus sp. CS
IRO-94）、オシラトリア・アムフィビア（Oscillatoria
amphibia NIES-361）および本発明者らの属する研究室
で分離された未分類の藍藻IS80-1株ならびにIS 88-9株
である。各藍藻に対するシアノアラニンの殺藻活性を表
２にまとめた。本表および以下の表（表４を除く）にお
いて「＋」は殺藻活性が認められたもの、「±」は殺藻
活性がわずかに認められたもの、「−」は殺藻活性が認
められなかったものを示す。さらに、空欄は試験を実施
していないことを示す。本表より、シアノアラニンは藍
藻類に対し、0.4 〜10μg/mlの濃度で殺藻活性を示すこ
とがわかる。

【００２１】

【表２】

【００２２】実施例３（シアノアラニンの微細藻類に対
する殺藻活性試験） 実施例２と同じ方法で、被検藻類に藍藻およびその他の
微細藻類を用いて、シアノアラニンの殺藻活性を調べた
結果を表３にまとめた。用いた被検藻はオシラトリア・
アムフィビア、ブラキオモナス・サブマリナ（Brachiom
onas submarinaNIES-375)、プロロセントルム・ミカン
ス（Prorocentrum micans NIES-12)、および、スケルト
ネマ・コスタタム（Skeletonema costatum NIES-16）で
ある。本実施例の結果よりシアノアラニンは藍藻にのみ
選択的に殺藻活性を示し、他の微細藻類に対しては活性
を示さないことがわかる。

【００２３】

【表３】

【００２４】実施例４（シアノアラニンの淡水産藍藻に
対する殺藻活性試験） 本実施例では淡水産藍藻ミクロシスチス・エルギノーサ
（Microcystis aeruginosa）NIES-298株を被検藍藻とし
た。本株をCT培地（組成については西澤一俊ら編：「藻
類研究法」 294〜 305ページ（1979年発行、共立出
版））で培養し、室内で蛍光灯連続照射下に振盪培養し
た。培養継続中の藍藻を一部取り、遠心分離により藻体
のみを回収してCT培地を用いて洗浄・再懸濁し、自記分
光光度計（島津製作所社製、UV-2100型）で 665nmの波長
で 3.0の吸光度を示す藻体濃度に調製し、バイオアッセ
イに用いた。定濃度のシアノアラニン溶液を96孔のポリ
スチレン製マイクロプレート（コーニング社製、ガンマ
線滅菌）のウェルに20μl 投入し、その溶媒を風乾によ
り蒸発させた。上述方法で藻体濃度を調製した藍藻を 1
00μl と、新鮮なCT培地 100μl を、溶媒を風乾させた
ウェルに分注した。即ち、最初にウェルに投入した20μ
l のシアノアラニン溶液が 250μg/mlであった場合、こ
のものの生理活性を合計 200μl のCT培地中で検定する
のであるから、このときは25μg/mlのシアノアラニンの
生理活性を検定したことになる。また、665nm における
吸光度が 3.0になるよう濃度を調製した藍藻溶液を 100
μl と、新鮮なCT培地 100μl を混合してアッセイを開
始するが、この時のウェルの藻体量をマイクロプレート
リーダー（東ソー社製、MPR-A4iII型）で測定すると、お
よそ0.6であった。蛍光灯連続照射下にアッセイを開始
したマイクロプレートを静置して、６日後の藻体量をマ
イクロプレートリーダーで測定し、得られた 665nmにお
ける吸光度を比較して初期吸光度の1/ 2であれば「+
+」、初期吸光度の1/ 2以上で初期吸光度の値以下であ
れば「＋」とし、これらは殺藻活性があるものと判定し
た。また、初期吸光度と同程度であれば「±」とし、サ
ンプル（シアノアラニン）を入れない場合と同じ程度の
吸光度上昇が見られれば「−」と判定した。コントロー
ルとして3-（3',4'-ジクロロフェニル）-1,1- ジメチル
尿素および抗生物質コリスチン(colistin)を用いた。結
果を表４に示す。本表よりシアノアラニンのミクロシス
チス・エルギノーサNIES-298株に対する殺藻活性の強さ
はコリスチンと同程度であり、3-（3',4'-ジクロロフェ
ニル）-1,1-シ゛メチル尿素の 1／5 から1 ／2 程度であ
ることがわかる。

【００２５】

【表４】

【００２６】比較例１（各種アミノ酸類の海産藍藻に対
する殺藻活性試験） 本比較例ではシアノアラニンに替えて生体構成アミノ酸
などのアミノ酸類を用いて、実施例２の方法に準じて海
産藍藻オシラトリア・アムフィビアおよびシネココッカ
ス・スピーシーズに対する殺藻活性を調べた。結果を表
５に記す。本表より明らかなように試験に用いた25種類
のアミノ酸の藍藻に対する殺藻活性は一般に低い。

【００２７】

【表５】

【００２８】比較例２（各種薬剤の藍藻選択性） 本比較例ではシアノアラニンに替えて除草剤である3-
（3',4'-ジクロロフェニル）-1,1- ジメチル尿素および
抗生物質であるシクロプロジギオシン（cycloprodigios
in）を用いて、実施例３と同じ４種類の微細藻類および
海産藍藻シネココッカス・スピーシーズに対するこれら
薬剤の殺藻活性を試験した。試験方法は実施例２に準じ
た。結果を表６に示す。本表より、これらの薬剤は藍藻
に対してのみならず他の微細藻に対しても殺藻活性を有
し、藍藻選択的とはいえない。

【００２９】

【表６】

【００３０】実施例５（微生物のシアノアラニン生産
性） ベラウ共和国海域および本邦沖縄県海域において採集し
た細菌について、それぞれ10mlのマリンブロスで30℃で
撹拌振盪（110rpm）培養を開始し、24時間後に培養を終
了して、培養物の１mlを採取してこれを凍結乾燥した。
このようにして得られた凍結乾燥物に対し、0.3ml の60
％エタノール水溶液を加えて抽出を行い、抽出物の10μ
l を採取して96孔のポリスチレン製マイクロプレート
（ファルコン社製、ガンマ線滅菌）のウェルに投入し、
その溶媒を風乾により蒸発させた。実施例３にて用いた
４種類の微細藻を用いて実施例２に示した方法でそれぞ
れの細菌培養物のエタノール抽出物の殺藻活性を試験し
たところ、試験した1600株の細菌培養物のうち32につい
ては、藍藻に対して殺藻活性を示すが他の３種類の微細
藻には殺藻活性を示さなかった。これら32の培養物 9ml
を用いて、これを凍結乾燥させ、さらに 2mlの蒸留水お
よび0.2gの活性炭素粉末を加えてよく撹拌し、脂溶性物
質を活性炭素に吸着させた後、これを静置して、上澄み
の0.2ml を採取した。このようにして得られた菌体培養
物の活性炭処理液に対し、ダウエックス・50Ｗ-x8 イオ
ン交換樹脂（プロトン型）を0.1ml 加えてよく混和し、
該樹脂を多量の精製水で洗うことにより非吸着物を除去
し、しかる後に該樹脂に対して３規定のアンモニア水を
１ml加えることにより吸着物を脱着させた。このように
して得られたイオン交換樹脂処理液１mlを減圧下乾固さ
せた後 100μl の60％エタノール水溶液に再懸濁させ
て、溶解物を移動相にエタノール、28％アンモニア水お
よび水を容積比で18:1:4に混じた液を用い、かつ固定相
にシリカゲルを用いた薄層クロマトグラフィーによって
分析した。展開後、薄層を十分に風乾して、この薄層に
ニンヒドリンのメタノール溶液を噴霧し、ドライヤーで
弱く乾燥加熱したところ、標準サンプルであるシアノア
ラニンは相対移動度がおよそ0.75の位置に青緑色の特徴
的な発色を示した。試験に用いた32の培養物のうち31に
ついては同じ相対移動度の位置にシアノアラニンと考え
られる発色が認められた。本試験法において培養物から
上述の処理を経て得た60％エタノール再懸濁液を薄層ク
ロマトグラフィーにて展開した場合、シアノアラニンと
考えられる発色スポット以外のニンヒドリン発色スポッ
トは全てベージュ色ないし黄色を呈し、かつ相対移動度
が全てシアノアラニンよりも小さいのでシアノアラニン
の検出は極めて容易である。本実施例より海域より採集
された細菌のマリンブロスによる培養液中に殺藻活性物
は1600株中32株と、比較的広く存在し、またその殺藻活
性を示す化合物がシアノアラニンであるものが培養物32
の中で31と極めて高率に存在することが分かる。また、
殺藻活性化合物を生産する細菌についてはそのマリンブ
ロス培養物を単に凍結乾燥したのみで、殺藻剤として利
用できることがわかる。

【００３１】実施例６（シアノアラニンの大型緑藻に対
する生理活性） シアノアラニンをメタノールに溶解させ、直径35mmプラ
スチックシャーレにおける培地中の最終濃度が 50ppmに
なるように該シャーレの底に所定量塗布した。常温乾燥
後、シャーレ１枚あたり、2.0cm ×2.0cm の大型緑藻ボ
タンアオサ（Ulva conglobata)葉状体を培養温度20〜23
℃、照度3000lx、14時間光を照射し、続く10時間光を照
射しない24時間サイクルの光条件で５日間、５mlのプロ
バゾリ栄養補強海水培地（PES 、組成については西澤一
俊ら編：「藻類研究法」 281〜293 ページ（1979年発
行、共立出版））により培養し、該緑藻の到死活性を調
べた。その結果シアノアラニンは葉状体に対して到死活
性を示さなかった。

【００３２】実施例７（シアノアラニンの各種微生物に
対する生理活性） シアノアラニンの、カンジダ・アルビカンス（Candida
albicans）、連鎖球菌（Enterococcus hirae）、緑膿菌
（Pseudomonas aeruginosa）、黄色ブドウ球菌（Staphy
lococcus aureus)、大腸菌（Escherichia coli）、枯草
菌（Bacillus subtilis)、変形菌（Proteus vulgari
s）、赤痢菌（Shigella sonnei)、肺炎桿菌（Klebsiell
a pneumoniae)の各微生物に対する最小生育阻止濃度を
調べたところいずれの菌に対しても83μg/ml以上であっ
た。この結果より、シアノアラニンはこれらの微生物に
対して毒性が低いことがわかる。

【００３３】

【発明の効果】本発明により微生物の培養物から、ある
いは他の方法で取得したシアノアラニンを用いることに
より、有害藍藻類を、同時に当該水域に棲息する他の微
細藻類に害を与えずに、その発生水域より有効に除去す
ることが可能となり、従来藍藻類の大発生により被害を
受けてきた各種産業に対する恩恵となるとともに、環境
保全や、安全な飲料水の確保にとり大きく貢献するもの
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:63） (72)発明者 持田 顕一 静岡県清水市袖師町1900番地 株式会社海 洋バイオテクノロジー研究所清水研究所内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】β−シアノ−Ｌ−アラニンを有効成分とす
   ることを特徴とする藍藻類選択的殺藻剤。
2. 【請求項２】ビブリオ属に属し、β−シアノ−Ｌ−アラ
   ニンを生産する能力を有する微生物を用いて、シアン化
   化合物を添加しない培地に培養し、培養物中にβ−シア
   ノ−Ｌ−アラニンを生成蓄積させ、該生成したβ−シア
   ノ−Ｌ−アラニンを採取することを特徴とするβ−シア
   ノ−Ｌ−アラニンの製造法。
3. 【請求項３】ビブリオ属に属する微生物が、ビブリオ・
   スピーシーズ C-979である請求項２記載のβ−シアノ−
   Ｌ−アラニンの製造法。