KR830001103B1

KR830001103B1 - 항생물질 sb-72310의 제조방법

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Publication number: KR830001103B1
Application number: KR1019790003142A
Authority: KR
Inventors: 아끼라 이마다; 가즈히꼬 긴다까; 고노미 하이바라
Original assignee: 다쓰오까 스에오; 다께다야꾸힝고오교가 부시끼가이샤
Priority date: 1979-09-12
Filing date: 1979-09-12
Publication date: 1983-06-11
Also published as: KR830001369A

Abstract

내용 없음.

Description

항생물질 SB-72310의 제조방법

제1도는 항생물질 SB-72310의 적외선 흡수 스펙트럼(KBr 법)을,

제2도는 항생물질 SB-72310의 나트륨염의 적외선 흡수 스펙트럼(KBr 법)을 각각 나타냄.

본 발명은 하기 일반식의 신규 항생물질 SB-72310 및 그 염의 제조법에 관한 것이다.

본 발명자들은 신규인 항생물질의 탐색을 목적으로 하여 다수의 미생물을 토양으로부터 분리하고 그 산생하는 항생물질을 분리탐색하였던 바 어떤 종류의 미생물이 신규인 항생물질을 산생한다는 것과 그 미생물이 슈도모나스속에 속한다는 것과 그 미생물을 적당한 배지에 배양함으로써 그람 양성 세균 및 그람 음성 세균에 대하여 항균력을 나타내는 형생물질을 배지 중에 축적할 수 있는 것 등을 알았으며, 이 항생물질을 단리하고 그 물리학적 및 생물학적 제성질로부터 당해 항생물질이 신규인 항생물질이라는 것을 확인하고 이를 항생물질 SB-72310이라 칭하기로 하였다.

그리고, 항생물질 SB-72310의 생산 조건에 관해서도 검토를 하였으며, 항생물질 SB-72310 생산균의 자화(資化)할 수 있는 유황 화합물을 배지에 첨가하여 배양하는 것에 따라 항생물질 항생물질 SB-72310의 생산량이 현저히 증대한다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 이들의 발견에 의거하여 더욱 연구를 거듭한 결과 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 1, 항생물질 SB-72310 및 그 염 2, 슈도모나스속에 속하는 항생물질 SB-72310 생산균을 배지에 배양하고 배양물 중에 항생물질 SB-72310을 생성 축적시키고 이를 채취함을 특징으로 하는 항생물질 SB-72310의 제조방법이다.

그리고, 본원에서는 항생물질 SB-72310을 간단히 SB-72310이라 칭하는 수도 있다.

본 발명에서 사용하는 항생물질 SB-72310생산균으로서는 슈도모나스 속에 속하며 항생물질 SB-72310을 산생하는 능력을 갖는 것이라면 여하한 미생물이더라도 좋다.

항생물질 SB-72310 생산균의 예로서는, 예를들면 본 발명자들에 의해서 일본국 효고껜 니시미야시의 토양에서 채취한 슈도모나스속 SB-72310 주(이하, 「SB-72310주」라 약칭하는 수도 있다)를 예기할 수 있다.

슈도모나스속 SB-72310주의 균학적 성상은 하기와 같다.

(a) 형태

육즙 한천 사면상에서 28, 2일간 배양후의 관찰에서 세포는 직경 0.8~1.1μ, 길이 1.6~4.1μ간상으로서 다형성을 나타내지 않는다. 운동성이 있으며 극편모를 갖는다. 포자를 형성치 않으며, 또 세포 저장물로서 폴리-β-히드록시낙산을 축적한다〔R.Y. 스테이니어(stanier), 저어널, 오브·제네럴·마이크로바이올로지(Journal of Gen eral Microbiology)제 43권, 제159페이지,1966년〕·그람 염색은 음성으로서, 항산성을 나타내지 않는다.

(b) 각종 배지상에서의 생육 상태

28℃로서 배양하고, 1내지 14일간에 걸쳐서 관찰하였다.

① 육즙 한천 평판 배양 : 3일간 배양으로 직경 1내지 3mm의 원형, 융기상, 전녹색인 집락을 형성한다.

표면은 평활, 불투명, 회백색을 나타낸다. 확산성 색소는 생성치 않는다.

② 육즙 한천 사면 배양 : 중정도의 사상(系狀)의 생육을 나타내며, 불투명, 회백색을 나타낸다.

③ 육즙 액체 배양 : 혼탁상으로 생육되고 소량의 침전을 생기게 하고 균막을 형성한다.

④ 육즙 젤라틴 천자 배양 : 액화한다.

⑤ 리트머스. 밀크 펩톤화한다.

(c) 생리적 성질

① 초산염의 환원 : 양성 ⑨ 무기물질의 이용

② 탈질(脫窒)반응 : 음성 i) 초산칼륨 : 양성

③ MR(메틸레드)테스트 : 음성 ii) 황산암모늄 : 양성

④ VP(포게스, 프로스카우어)테스트 : 음성 ⑩ 색소의 생성 : 볼 수 없었다.

⑤ 인돌의 생성 : 음성 ⑪ 우레아제 : 양성

⑥ 황화수소의 생성 : 음성 ⑫ 옥시다제 : 양성

⑦ 전분의 가수분해 : 음성 ⑬ 카타라제 : 양성

⑧ 구연산의 이용 : 양성 ⑭ 생육의 범위

i) pH : pH4.0~8.85에서 생육하지만, 제일 적당한 pH는 4.5~7.0.

ii) 온도 : 8~42℃에서 생육되지만 제일 적당한 온도는 24~36℃.

⑮ 산소에 대한 태도 : 호기적

O-F(옥시다티브-퍼멘타티브)테스트 〔휴·레이프슨(Hugh leifson)법〕 : 산화적

당으로부터 산 및 가스의 생성 : L-아라비노스, D-크실로스, D-글루코스, D-만노스, D-프락토스, D-갈락토스, 맥아당, 서당, 트레하로스, D-소르비트, D-만니트, 이노시트 및 글리세린을 각각 1w/v% 함유한 펩톤수로서 미약한 산의 생성이 보이지만, 가스의 생성은 보이지 않았다.

각종 탄소원의 이용성 : 각종 탄소원을 함유한 무기염배지(인산 2칼륨 0.7w/v%, 인산 1칼륨 0.3w/v%, 황산 암모늄 0.1w/v%, 식염 0.1w/v%, 황산 마그네슘 7수염 0.1w/v%)로서 14일간 배양한 결과를 제 1표에 나타냄.

[제 1표 ]

각종 탄소원의 이용성

주 : + : 생육 있음.

± : 미약한 생육 있음

- : 생육 없음

그 밖의 성질

ⅰ) 말론산의 이용성 : 양성 c) 오르니틴 : 음성

ⅱ) 페닐알라딘의 탈아미노 반응 : 음성 ⅳ)아르기닌, 디히드로라제 활성 : 음성

ⅲ)데카르복시라제 활성 ⅴ)에스크린(esculin)의 가수분해성 : 양성

a)아르기닌 : 양성 ⅵ)트윈(Tween)80의 가수분해성 : 양성

b)리진 : 음성 ⅶ) DNA의 GC(구아닌-시토신)함량 : 64.3몰%

이상과 같은 균학적 성질을 갖는 SB-72310주를 버지스메뉴엘 오브 디터미나티브 박테리오로지 제 7판 및 제 8판의 기재와 대조해 보면, SB-72310주는 그람 음성간 균으로서 호기성이며, 극편모를 가지고 운동성이 있으며, 옥시다아제 양성, 카타라제 양성이라는데서 슈도모나다세(Pseudomonadaceae)과에 속한다는 명백하다. 더우기,영양 요구성이 없고, 폴리-β-히드록시낙산을 축적한다는 것, 또 아르기닌, 디히드로라제를 갖는다고 하는 등의 성질에서 검색하면 슈도모나스. 슈도알칼리게네스(Pseudomonas pseudoalcaligenes), 슈도모나스.슈도말레이(P . pseudomallei), 슈도모나스. 말레이(P. mallei)및 슈도모나스. 카리오필리(P. caryophylli)에 연분이 가까운 것이라 생각된다. 그러나, 슈도모나스. 슈도알칼리게네스는 탄수화물로서는 프락토스 이외는 이용할 수 없다고 하는 점에서, 슈모도나스. 슈도말레이는 대부분의 주에서 탈질이 인정된다는 것과, 또 전분을 가수분해하는 것, 및 영양원의 자화성인 점에서, 슈모도나스. 말레이는 비운동성이라는 것, 및 탈질이보인다는 점에서, 슈도모나스. 카리오필리는 황녹색의 비형광 수용성 색소를 발생하고, 탈질을 행하는 점에서 어는 것이 고간에 SB-72310주와는 명백하게 구별된다.

따라서, 본 균주는 슈도모나스속의 신종에 속한다고 생각된다. 그래서, SB-72310주의 생육 최적 pH가 4.5~7.0이란 것과 슈도모나스속 세균으로서는약간 낮은 특징에 의거하여 본균을 슈도모나스. 메소아시도필라(Pseudomonas mesoacidophila)라 명명하였다.

그리고, 본 균주 SB-72310주는 공업 기술원 미생물 공업기술소(일본)에 FERM-P No.4653으로서 재단법인 발효 연구소(일본)에 IFO 13884로서, 더 아메리칸 타입 컬취 콜렉숀(U.S.A)에 ATCC-31433으로서 각각 기탁되고 있다.

본 발명에 쓰여지는 슈도나스속 세균은 일반적으로 그 성상이 변화되기 쉽고, 예를들면 자외선, X선, 화학약품(예, 니트로소구아니진, 에틸메타설폰산)등을 사용하는 인공 변이 수단으로 용이하게 변이될 수 있는 것이며, 어떤 변이주 이더라고 본 발명의 대상으로 하는 SB-72310의 생산능력을 갖는 것은 모두 본 발명에 사용할 수 있다.

SB-72310 생산균의 배양에 즈음해서는, 그 탄소원소로서는, 예를 들면 글루코스, 슈크로스, 말토스, 페당밀, 글리세롤, 유지류(예, 대두유, 올리브유 등), 유기산류(예, 구연산, 호박산, 글루콘산 등)등의 균이 자화할 수 있는 것이 알맞게 쓰여진다. 질소원으로서는, 예를 들면 대두분, 면실분, 코온 스티이프 리커, 건조효모, 효모에키스, 육에키스, 펩톤, 요소, 황산 암모늄, 초산 암모늄, 염화 암모늄, 인산 암모늄 등의 유기질소 화합물이나 무기질소 화합물을 이용할 수 있다. 무기염으로서는 예를들면 염화나트륨, 염화칼륨, 탄산칼륨, 황산마그네슘, 인산 1칼륨, 인산 2나트륨 등의 보통 세균의 배양에 필요한 무기 염류 단독 혹은 적당하게 조합되어 사용된다.

슈도모나스 속에 속하는 항생물질 SB-72310 생산균의 자화할 수 있는 유황 화합물, 예를들면 황산염(예 황산 암모늄 등), 티오 황산염(예, 티오황산암모늄 등), 아황산염(예, 아황산암모늄)등의 무기 유황 화합물, 함황아미노산(예, 시스틴, 시스테인, L-티아졸리딘-4-카르본산), 히포타우린, 함황펩티드(예, 글루타티온)등의 유기 유황 화합물 또는 이들의 혼합물을 배지에 첨가하면 목적물의 생성량이 증대한다는 것이 발견되었다. 이 유황화합물을 배지에 첨가할 때의 농도는 0.01~1.0w/v%, 더바람직하기로는 0.02~0.5w/v%이다. 이 유황 화합물을 배지 중에 첨가하여 배양하면, SB-72310의 생산량이 증대하고 공업상 매우 유리하다.

또, 황산철 1철, 황산동 등의 중금속류, 비타민 B₁, 비오틴등의 비타민류 등도 필요에 따라 첨가된다. 다시 실리콘 오일이나 폴리알킬렌글리콜에테르 등의 소포체나 계면 활성제를 배지에 첨가하여도 좋다.그 밖에 균의 발육을 도우며, SB-72310의 생산을 촉진할 만한 유기물이나 무기물을 알맞게 첨가하여도 좋다.

배양 방법으로서는, 일반적인 항생물질의 생산 방법과 똑같이 행하게 되고, 고체 배양이나 액체 배양이더라도 된다. 액체 배양의 경우는 정치 배양, 교반배양, 진탕 배양, 통기 배양 등 어느 것을 실시하여도 좋지만 특히 통기 교반 배양이 바람직하다. 또, 배양 온도는 대략 15°~35°의 범위가 좋고, 배지의 pH는 약 4~8의 범위에서 대략 8시간 168시간, 바람직하게는 24시간~144시간 배양한다.

생성된 SB-72310은 주로 배양 여액 중에 존재하므로 배양물을 원심 분리 혹은 여과에 의하여 상청액과 군체별로 분리하고, 그 상청액에서 정제하는것이 유리하다. 그러나, 배양물에서 직접으로 정제하는 것도 가능하다.

본 물질의 역가 측정은, 예를들면 코마모나스 테리게나(Comamonas terrigen a) IFO 12685주를 시험균으로 하여 SB-72310을 표준품으로서, TSA〔 트립티카아제 소이 아가, Baltimore Biologicals, Laboratories (U.S.A) 제〕배지를 사용하는 실린더법, 페이터디스크법에 의하여 실시할 수 있다.

SB-72310을 채취하자면, 미생물이 생산하는 대사산물을 채취하는데 보통 쓰여지는 수단을 알맞게 이용할 수 있다. 예를들면 원심분리에 의해서 균체를 제거한 다음, 그 여액에서 일반적으로 유효물질을 분리,채취, 정제하는 방법을 사용한다. 즉 적당한 용매에 대한 용해성 및 용해도의 차이, 용액으로부터의 석출법 및 석출 속도의 차이, 여러가지의 흡착 친화력의 차이, 이온 교환체에 의한 이온 교환 크로마토그래피 혹은 감압농축, 동결건조, 결정화, 재결정, 건조 등의 수단이 단독 혹은 임의의 순서에 짜맞추어서 또는 반복해서 사용하고, 이용된다.

그 일예를 나타내면 다음과 같다. 즉 배양 종료후 배양액을 여과하고, 얻어지는 여액을 활성탄 컬럼에 통과시키고, 흡착되는 SB-72310을 친수성 유기 용매계를 사용하여 용출시킨다. 친수성 유기 용매계로서 쓰여지는 것에는, 아세톤, 메틸에틸케톤, 메틸이소부틸케톤 등의 저급 케톤류, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 프로판올, 부탄올 등의 저급 알코올류의 단독 또는 혼합 용매와 물과의 혼합 용액을 들 수 있다. 또, 이온 교환수지로서는 당해 물질이 산성 물질이기 때문에, 음이온 교환수지〔 암버라이트 IRA-400,402,미국 암버라이트사 제조 다우엑스-1. 미국 다우 앤드 케미칼사 제조 다이아이온 SA-21A, 미씨비시가세이제조〕등의 Cl-형 등이 유리하게 이용할 수 있다. 흡착된 당해물질의 용출에는 식염등의 수용액을 사용하고 유효물질을 용출한다. 용출액의 탈염에는 재차 활성탄의 컬럼 크로마토그 래피를 행한다. 다음에 유효 물질을 용출한 용출액을 농축한 후, 아세톤 등을 가하여 석출하는 침전을 여취한 다음, 아세톤, 에테르등으로서 세정한 후 건조하면 담갈색의 분말이 얻어진다. 얻어진 분말을 다시 정제하자면, DEAE-세파덱스(스웨덴 파르마시아사제)의 컬럼 크로마토그래피가 유리하게 이용될 수 있다. 즉, DEAE-세파덱스 A-25를 인산 완충액(pH 6.6)으로서 세정한 후, 앞서 얻어진 분말을 물에 용해한 액을 통과, 흡착시키고, 그 완충액으로 세정한 후, 0.5w/v%의 식염을 함유한 완충액으로 용출한다. 얻어진 유효 획분을 pH 3.0으로 조정한 후, 재차 활성한 컬럼에 통과시키고, 수세, 20v/v% 메탄올수로서 세정한다. 이어서, 함수 아세톤으로서 용출하고, 유효 획분을 감압 농축 후, 아세톤을 가하면 SB-72310이 얻어진다. 또, 본품은 금속염 및 암모늄염을 형성한다. 금속염으로서는, 예를 들면 나트늄염, 칼륨염, 리튬염 등을 들 수 있다.

후술하는 실시예 1에서 SB-72310의 물리화학적 성질은 다음과 같다.

(6) 자외선 흡수 스펙트럼

말단 흡수만이(210nm 이상으로 특이한 흡수를 나타내지 않음)

(7) 적외선 흡수 스펙트럼(제 1도)

취화 칼륨정에 의한 흡수 스펙트럼의 주요 피이크는 다음과 같다.

3440(s),2920(m), 2850(m),2600(w),1770(s),

1650(s),1530(s),1458(m),1390(w),1340(w),

1280(sh),1240(s),1210(sh), 1180(m), 1118(w),

1043(s), 792(w), 632(cm^-1)

(단, s,m,w는 강, 중, 약을 , sh는 숄더를 나타냄.)

(8) 용매에 대한 용해성

석유 에테르, 헥산, 디에틸에테르, 벤젠, 초산에틸, 클로로포름에는 불용, 에탄올, 피리딘, 아세톤에는 난용, 메탄올, 디메틸 설폭시드에는 가용, 물에는 잘 녹음.

(9) 정색반응

닌히드린, 과망간산칼륨 시약에는 양성, 염화제 2철 폐리시안화칼륨 시약. 사까구찌 반응, 모닛슈시약에는 음성, 에르리히시약에는 의양성.

(10) 염기성, 산성, 중성의 구별 : 산성물질

(11) 핵자기 공명 스펙트럼(디메틸설폭시드 중 100MHz) δ3.31ppm에 O-CH₃의 시그널을 보게 된다.

(12) 안정성

pH3-pH7의 수용액은 60℃, 10분간의 가열에는 안정, pH8.5 이상에서는 불안정.

후술하는 실시예 2에서 얻어진 SB-72310 나트륨염의 물리학적 성상은 다음과 같다.

(1) 융점 : 110℃이상이다.

(2) 외관 분색 분말

(3) 원소분석치 : (%)

5염화인상에서 40℃, 6시간 감압 건조시킨 것.

C 31.75 31.68 C 7.16 7.10

H 5.19 5.11 Na 5.01 4.95

N 12.68 12.57

(4) 분자량

분자중 Na 를 1몰 함유한다고 한다면

438±5(적정법에 의함) 계산치 C 31.72 : H5.10 :

추정 분자식(상기한 실측치에서) N 12.33 : S 7.06 :

C₁₂H₁₉N₄SO₉Na.2H₂O Na 5.06 :

(5) 비선광도 :

〔α〕_D ²³+8.5。±5℃(c=0.91, H₂O)

(6) 자외선 흡수 스펙트럼 : 말단 흡수만이

(7) 자외선 흡수 스펙트럼 : (제 2도)

3430(s),3250(sh),3000(m),1770(s),1640(s),

1530(s),1450(w),1405(w),1343(w),1280(sh),

1245(s),1180(w),1118(w), 1050(s),820(w),

785(w),632(w), (cm^-1)

단, s,m,w는 강, 중, 약을, sh는 숄더를 각각 나타냄)

(8) 용매에 대한 용해성 :

석유 에테르, 헥산, 디에틸에테르, 벤젠, 초산에틸, 클로로포름, 아세톤에는 불용, 메탄올, 에탄올, 피리딘에는 난용, 메탄올, 디메틸설폭 시드에는 가용, 물에는 쉽게 녹음.

(9) 정색반응 :

닌히드린, 과망간산칼륨 시약에는 양성, 염화2제철폐리시안화칼륨 시약, 사까구찌 반응, 모릿슈 시약에는 음성, 에르리히 시약에는 의양성.

(10) 안정성

pH 3~pH 7의 수용액은 60℃, 10분간 가열에는 안정, pH 8.5 이상에서는 불안정.

SB-72310 의 유리형의 것을 염으로 하자면, 예를들면 유리산의 수용액에 약몰당량의 수산화나트륨을 첨가하고 동결 건조하면 나트륨염이 얻어진다.

또, SB-72310의 염을 유리형의 것으로 하는데는 예를들면 SB-72310 나트륨염의 수용액에 약 1N의 염산을 가하여 pH 약 3.0으로 한 후 활성탄으로 탈염 조작을 행하면 유리형이 얻어진다.

다음에 SB-72310의 생물학적 성상에 대하여 설명하겠다. SB-72310 및 그 나트륨염의 각종 미생물에 대한 항균 스펙트럼은 제 2표에 나타낸 바와 같다. 이 표에서 명백한 것처럼 항생물질 SB｜72310은 그람 양성균 및 음성균에 유효하다.

항생물질 SB-72310 나트륨염의 급성 독성은 마우스에 대한 정맥내 투여로서 500mg/kg에서는 사망예를 볼 수 없었고, 저독성이다.

[제 2 표]

SB-72310의 항균 스펙트럼(페이터디스크법에 의한 저지 원경 mm)(10mg /ml액을 25μι직경 8mm의 페이퍼디스크에 흡수시켰다.

주 ; 배지 ; 트립티카아제-소이-브로스-아가

본 발명에 의하여 얻어지는 SB-72310은 상기한 항균 스펙트럼을 명백한 것처럼 그람 음성균, 그람 양성균에 대하여 항균력을 나타냄. 따라서 포유동물(예, 마우스, 랫트, 개, 사람) 및 가금류(예, 닭, 오리)의 상기한 세균의 감염증의 치료에 사용할 수 있다.

SB-72310을 예를들어, 대장균 감염증의 치료약으로 사용하자면, 예를들어 SB-72310을 생리적 식염수에 용해하여 주사제로서 비경구적으로 피하 또는 근육내에 15~60mg/kg(체중)/일 투여한다. 또 경구제로서 항생물질 SB-72310을 젖당과 혼합하여 캅셀제로 하고, 60~400mg/kg/일(SB-72310으로서) 투여한다.

또, 본 발명에 의해 얻어지는 SB-72310은 살균제로 사용할 수 있다. 예를 들면, SB-72310을 0.1~1.0w/v%의 농도로서 증류수에 용해시킨 액제, 또는 와셀린, 라놀린을 기본제로하고, 1g당 SB-72310을 15~60mg을 함유한 연고제로 하여, 상기한 동물의 손, 발, 눈, 귀 등의 살균, 소독에 사용할 수 있다.

또, SB-72310을 새로운 의약품의 합성 중간체로서도 매우 유망한 화합물이다.

이상과 같은 제성질을 갖는 항생물질 SB-72310을 이미 알려진 항생물질과 비교해 보면, 먼저 수용성 산성물질로서 S를 함유하는 항생물질로서는, 페니실린류, 세파로스스포린류를 들 수 있는데, 본 품은 자외부 흡수를 나타내지 않는데서 세파로스포린류와는 다르며, 또 본품의 NMR 스펙트럼으로서 O-메틸의 시그널이 인정된다는 것 및 산 가수분해에 의해서 글라타민산이 검출되는 것에서 천연적으로 얻어지고 있는 페니실린류, 세파로스 포린류와는 일치되지 않는다는 것이 명백하다.

또, 슈도모나스속 세균에 의해서 산생되는 항생물질로서는 수많은 것이 알려지고 있으나, 수용성 산성 물질로서 S를 함유하는 항세균성 항생물질은 전혀 알려지고 있지 않다. 또, 슈도모나스속 세균 이외의 미생물이 산생하는 이미 알려진 항생물질 중 어는 것과도 물리 화학적 및 생물학적 성상을 달리하고 있다. 따라서, 본 항생물질은 신규 화합물인 것으로 판단된다.

다음에 실시예를 가지고 더 상세하게 본 발명의 내용을 설명하겠으나, 이것에 의해서 본 발명이 한정되는 것은 아니다. 퍼센트는 특별한 이유가 없는 한 중량/용량 5%를 나타냄.

[실시예 1]

영양 한천 사면상에 생육시킨 슈도모나스 메소 아시도필라 SB-72310(FERM-P No.4653 : IFO 13884 : ATCC 31433)의 균주를 글루코오즈 1%, 폴리펩톤(다이고에이요 가가꾸사제 0.5%, 육에키스 0.5%, 식염 0.5%PH 7.0)로서 된 배지 500ml을 함유한 2ι들이 사까구찌 프라스크 2개에 접종하여 28℃로서 48시간왕복 진탕 배양하고 그 배양물을 종배양물로 사용한다.

다음에 슈크로오즈 1.5%, 효모에키스 0.3%, 황산암모늄 0.2%, 인산 제 1칼륨 0.6%, 인산 제 2 칼륨 0.3%, 황산마그네슘 0.05%, 식염 0.05%로서 된 배지 120ι을 200ι 들이 스테인레스 제 발효조에 넣고 120℃로서 20분간 증기 멸균시킨 다음 전기한 종 배양물을 접종하였다. 이어서, 온도 28℃, 통기량 120ι/분, 교반 회전수 180r.p.m의 조건하에서 78시간 배양하였다. 이 배양물을 샤플레스(Sharpless)원심분리기에 걸어서 균체를 분리하고 상청액 110ι를 얻었다. pH 4.2 로 조정한 다음 활성탄(크로마토용「시라시기」다께다야꾸 힝고오교제)15ι를 충전시킨 컬럼에 통하게 하고 활성 물질을 흡착시켜 물 45ι로서 세척한 후, 50w/v% 아세톤수 45ι 로서 용출시켰다. 용출액을 10ι몫으로 분획하고 코마모나스 테리게나 IFO 12685를 피검균으로 하여 유효 획분을 조사하고, 획분 No.2~3을 모아서 물 20ι를 가한 후 다우엑스-1(Cl)(미국 다우앤드 케미칼사제)10ι를 채운 컬럼에 통과시켰다. 물 25()로서 세척한 후 5% 식염수 50ι로서 용출시켰다. 유효 획분을 모아 pH 4.0 으로 조정한 후 재차 활성탄 컬럼(8ι)에 통하게 하고, 물 24ι로서 세척 후 20v/v%메탄올수로서 용출을 행하였다. 유효 획분을 50ml까지 감압 농축한 후 아세톤 200ml를 가하고 석출한 침전을 여취 아세톤 50ml, 에테르 100ml로서 세척 후 감압 건조하면 조물질 12g이 얻어졌다. 여기에 얻어진 조물질 10g을 M/100 인산 완충액 (pH 6.6)500ml에 용해한 후, 그 완충액으로 완충화 된 DEAE-Sephadex A-25(스웨덴 팔마시아사 제조)컬럼 200ml에 통과시켜 흡착시켰다. 그 완충액 400ml로서 컬럼을 세척 후 0.5% 식염을 첨가한 그 완충액으로서 용출을 행하였다. 유효 획분을 모으고, 1N-염산을 첨가하여 액성을 pH 3.2로 조정한 후 활성탄 컬럼 60ml에 통과시켰다. 동 컬럼을 물 200ml, 20v/v% 메탄올수 100ml로서 세척한 후, 50v/v% 아세톤수로서 용출을 행하고 유효 획분을 모아서 감압하에 놓축한 후 메탄올 5ml를 가하여 용해하고 아세톤 100ml를 가하여 찬곳에 방치하였다. 석출한 침전을 여취하고 에테르로서 세척 후, 5산화인 상에서 감압하 40℃로 6시간 건조하면 3.8g의 분말이 얻어졌다. 그 적외선 흡수 스펙트럼을 제 1도에 나타냄.

원소 분석치 C34.40, H5.56, N 13.30 S 7.56(w/w%).

[실시예 2]

실시예 1에서 얻어진 SB-72310 유리산 2.0g을 물 45ml에 용해 후, 냉각해 가면서 1N- 수산화나트륨 약 4.5ml를 가한 후 pH를 측정해 가면서 주의하여 1N- 수산화나트륨을 가하여 pH 6.5로 조종한 후 동결건조를 행하여 백색 분말 SB-72310모노나트륨염 2.1g이 얻어졌다. 본품을 40℃로 6시간 감압 건조한 것의 적외선 흡수 스펙트럼을 제 2도에 나타낸다. 또, 원소분석치는 C 31.75 ; H 5.19 ; N 12.68 ; Si 7.16 ; Na 5.01(w/w%)이었다.

[실시예 3]

영양 한천 사면상에서 생육 시킨 슈도모나스 메소아시도필라의 SB-72310(FERM-O No.4653 ; IFO13884 : ATCC31433)의 균체를 글리세린 3%, 글로코오즈 0.1%, 폴리펩톤(대이고 에이요까가꾸사제) 0.5%, 육에키스 0.5%, 식염 0.5% (pH 6.5)로서 된 배지 40ml를 200ml 삼각 프라스크에 접종하여 28℃로서 48시간 회전식 진탕 배양기상에서 배양한 것을 종배양물로 한다.

다음에 종배양물 1ml을 200ml 삼각프라스크내의 여러가지의 유황 화합물을 함유한 전술한 배지 40ml에 이식하여 28℃로서 96시간 회전 진탕 배양하였던 바, 제 3표에 나타낸 바와 같이 SB-72310의 생산량의 증대가 확인되었다.

[제 3표 ]

SB-72310의 생산량

Claims

항생물질 SB-72310이 배양브로스 중에서 실제로 동화하여 축적될 때까지, pH4~8 및 15~30℃의 호기성 조건하 동화할 수 있는 탄소원 및 소화할 수 있는 질소원을 함유하는 배양 배지에서 슈도모나스 메소아시도필라 SB-72310(ATCC 31433)의 특징을 갖는 미생물을 배양하여 이로부터 항생물질 SB-72310을 회수함을 특징으로 하는 하기식으로 표시되는 항생물질 SB-72310의 제조방법.