JPH05146298A - ３−ヒドロキシ−２−メチル−４−ピリドンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 種々の生理活性を有する抗生物質３−ヒドロ
キシ−２−メチル−４−ピリドンの製造法を提供する。 【構成】 ストレプトミセス属に属する３−ヒドロキシ
−２−メチル−４−ピリドン生産菌を培養し次式（Ｉ） で表される３−ヒドロキシ−２−メチル−４−ピリドン
を培養物から採取することを特徴とする抗生物質３−ヒ
ドロキシ−２−メチル−４−ピリドンの製造法，式
（Ｉ）の化合物を有効成分とする水産用の医薬品及び前
記の製造法で使用されるストレプトミセスＭＪ２１０−
７２万６株。 【効果】 この化合物は養殖中の魚介類に感染する菌に
対して優れた抗菌作用をもつ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は種々の生理活性を有する
抗生物質３−ヒドロキシ−２−メチル−４−ピリドンの
製造法に関する。また本発明は３−ヒドロキシ−２−メ
チル−４−ピリドンを生産できる特性を持つ新規な微生
物、ストレプトミセス ＭＪ２１０−７２Ｆ６株に関す
る。

【０００２】さらに本発明は３−ヒドロキシ−２−メチ
ル−４−ピリドンを有効成分とする水産用の医薬品に関
する。

【０００３】

【従来の技術】水族の養殖において、ときには自然の水
圏では普通みられない、いろいろな細菌感染症の病害が
発生し産業規模で大きな被害を養殖中の魚介類に生ず
る。そこで、従来使用されている水産用の医薬品とは異
なる化学構造上の骨格を有し且つ優れた抗菌活性と性質
を示す化合物を発見または創製することは常に要望され
ており、そのための研究が行われている。

【０００４】他方、３−ヒドロキシ−２−メチル−４−
ピリドンが種々な生理活性をもつことが知られている
〔「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ
ａｌＳｃｉｅｎｃｅ」６９巻１０７４〜１０７６頁（１
９８０）参照〕が、その合成的製造法は特開昭５９−１
６１３５９号公報に記載される。

【０００５】しかし、この化合物が抗菌活性を有するこ
とは今まで知られていなかった。

【０００６】

【発明が解決すべき課題】本発明は、上記の要望に応え
ることができて養殖中の魚介類の細菌性感染症に対して
優れた活性をもつ抗生物質及びそれの効率的な製造法を
提供することを目的にするものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは前記
の要望をみたす有用な抗生物質を発見すべく研究を行
い、その結果、新規な微生物として、ストレプトミセス
属に属する菌株を分離することに成功し、またこの菌株
が従来使用されている水産用の抗菌剤とは異なる化学構
造上の骨格を有して且つ魚介類の細菌性感染症に優れた
抗菌作用をもつ抗生物質を産生することを見いだした。
そして、この物質を単離することに成功した。本物質を
分析することにより、下記の式（Ｉ）により表されるこ
とを知見した。

【０００８】

【０００９】しかして、本発明はストレプトミセス属に
属する微生物を培養することからなる３−ヒドロキシ−
２−メチル−４−ピリドンの製造法および本物質を生産
する特性をもつ新規な微生物、ならびに本物質を有効成
分とする抗菌剤を提供するものである。

【００１０】すなわち、第１の本発明によると、ストレ
プトミセス属に属する前記の式（Ｉ）の３−ヒドロキシ
−２−メチル−４−ピリドンの生産菌を培養し、培養物
から３−ヒドロキシ−２−メチル−４−ピリドンを採取
することを特徴とする式（Ｉ）の抗生物質３−ヒドロキ
シ−２−メチル−４−ピリドンの製造法が提供される。

【００１１】３−ヒドロキシ−２−メチル−４−ピリド
ンは後記の生物学的性質を有する。３−ヒドロキシ−２
−メチル−４−ピリドンは、養殖中の魚類に感染する有
害細菌パスツレラ ピスシシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌ
ａ ｐｉｓｃｉｃｉｄａ）に対して、特に強い抗菌活性
を示す。

【００１２】試験例１ 各種の微生物に対する３−ヒドロキシ−２−メチル−４
−ピリドンの抗菌スペクトルは日本化学療法学会標準法
に基づき、ミュラ・ヒントン寒天培地上で倍数希釈法に
よって測定した。その結果を表１にしめす。

【００１３】 表 １ 最小発育阻止濃度 供 試 菌 (MIC)( μg/ml) スタフィロコッカス アウレウス FDA 209P ＞１００ ミクロコッカス ルテウス PCI 1001 ＞１００ バチルス ズブチリス PCI 219 ＞１００ コリネバクテリウム ボビス 1810 ＞１００ エシエリヒア コリ NIHJ ＞１００ シゲラ ディセンテリエ JS 11910 １００ サルモネラ ティフィ T-63 ＞１００ プロテウス ブルガリス OX 19 ＞１００ セラチア マルセッセンス ＞１００ シュウドモナス エルギノサ A3 １００ クレブシエラ ニュウモニェ PCI 602 ＞１００ マイコバクテリウム スメグマティス ATCC 607 ＞１００ カンジダ アルビカンス 3147 ＞１００ エロモナス パンクタータ IAM 1646* １００ エロモナス サルモネシダ ATCC 14174* １００ エロモナス sp. (AT444)* １００ ビブリオ アンギラルム NCMB-6* １００ シュウドモナス フルオレッセンス* ＞１００ シュウドモナス ラクリマンス* １００ エルウィニア アロイデ* ＞１００ コマモナス テリゲナ IFO 12685* ＞１００ パスツレラ ピスシシダ sp. 6395** １２．５ （注） ＊ これらの被検菌については、２７℃で測定した。

【００１４】** 当被検菌については、三分の一希釈濃
度のブレイン ハート インフュージョン（Ｄｉｆｃｏ
社製）、食塩２％、寒天２％を含む培地で測定した。

【００１５】本発明の方法で使用する３−ヒドロキシ−
２−メチル−４−ピリドン生産菌は本物質を生産する能
力を有するものであれば、その種を問わず広範な微生物
から選ぶことができる。かかる微生物のうち、３−ヒド
ロキシ−２−メチル−４−ピリドン生産菌の具体的な好
適の一例は、本発明者らにより平成２年に微生物化学研
究所において東京都文京区の土壌より分離された放線菌
で、ＭＪ２１０−７２Ｆ６株の菌株番号が付された菌株
である。

【００１６】以下にＭＪ２１０−７２Ｆ６株の菌学的諸
性質について記載する。

【００１７】１．形態 ＭＪ２１０−７２Ｆ６株は、分枝した基生菌糸より直状
の気菌糸を伸長する。らせん形成、輪生枝および胞子の
うは認められない。気菌糸の先端には１０個以上の胞子
の連鎖を認め、胞子の大きさは約０．６〜０．８×１．
０〜１．２ミクロンであった。なお、胞子の表面は平滑
である。

【００１８】２．各種培地における生育状態 色の記載について［ ］内に示す標準は、コンティナー
・コーポレーション・オブ・アメリカのカラー・ハーモ
ニー・マニュアル（Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ Ｃｏｒｐｏｒ
ａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａのｃｏｌｏｒ ｈａ
ｒｍｏｎｅｙｍａｎｕａｌ）を用いた。

【００１９】（１）シュクロース・硝酸塩寒天培地（２
７℃培養） 無色の発育上に、明るい茶灰［３ｄｃ，Ｎａｔｕｒａｌ
〜３ｉｇ，ＢｅｉｇｅＢｒｏｗｎ］の気菌糸を着生し、
溶解性色素は認められない。

【００２０】（２）グルコース・アスパラギン寒天培地
（２７℃培養） うす黄［２ｇｃ，Ｂａｍｂｏｏ］の発育上に、白〜明る
い灰［２ｆｅ，Ｃｏｖａｒｔ Ｇｒａｙ］の気菌糸を着
生し、溶解性色素は認められない。

【００２１】（３）グリセリン・アスパラギン寒天培地
（ＩＳＰ−培地５、２７℃培養） うす黄茶［２ｌｅ，Ｍｕｓｔａｒｄ］の発育上に、白〜
茶灰［５ｆｅ，Ａｓｈｅｓ］の気菌糸を着生し、溶解性
色素はわずかに茶色味をおびる。

【００２２】（４）スターチ・無機塩寒天培地（ＩＳＰ
−培地４、２７℃培養） 無色の発育上に、白〜明るい茶灰［３ｆｅ，Ｓｉｌｖｅ
ｒ Ｇｒａｙ］の気菌糸を着生する。溶解性色素は認め
られない。

【００２３】（５）チロシン寒天培地（ＩＳＰ−培地
７、２７℃培養） うす茶［３ｌｅ，Ｃｉｎｎａｍｏｎ］の発育上に、白〜
明るい茶灰［３ｆｅ，Ｓｉｌｖｅｒ Ｇｒａｙ］の気菌
糸を着生し、溶解性色素はわずかに茶色味をおびる。

【００２４】（６）栄養寒天培地（２７℃培養） 発育はうす黄［２ｇｃ，Ｂａｍｂｏｏ］、気菌糸は着生
せず、溶解性色素は認められない。

【００２５】（７）イースト・麦芽寒天培地（ＩＳＰ−
培地２、２７℃培養） うす黄茶［２ｌｅ，Ｍｕｓｔａｒｄ］の発育上に、茶灰
［５ｆｅ，Ａｓｈｅｓ］の気菌糸を着生し、溶解性色素
は認められない。

【００２６】（８）オートミール寒天培地（ＩＳＰ−培
地３、２７℃培養） うす黄の発育上に、明るい茶灰［３ｆｅ，Ｓｉｌｖｅｒ
Ｇｒａｙ］の気菌糸を着生し、溶解性色素はわずかに
黄色味をおびる。

【００２７】（９）グリセリン・硝酸塩寒天培地（２７
℃培養） 無色〜うす黄の発育上に、白の気菌糸をうっすらと着生
し、溶解性色素は認められない。

【００２８】（10）スターチ寒天培地（２７℃培養） うす黄の発育上に、白〜茶灰［４ｌｉ，Ｂｅａｖｅｒ］
の気菌糸を着生する。溶解性色素は認められない。

【００２９】（11）リンゴ酸石灰寒天培地（２７℃培
養） 無色の発育上に、白の気菌糸をうっすらと着生し、溶解
性色素は認められない。

【００３０】（12）セルロース（ろ紙片添加合成液、２
７℃培養） 発育は無色、茶灰の気菌糸をわずかに着生し、溶解性色
素は認められない。

【００３１】（13）ゼラチン穿刺培養 １５％単純ゼラチン培地（２０℃培養）では、発育はう
す黄、茶白の気菌糸をわずかに着生し、溶解性色素は黄
色味をおびる。グルコース・ペプトン・ゼラチン培地
（２７℃培養）の場合、発育はうす黄、気菌糸は着生せ
ず、溶解性色素は認められない。

【００３２】（14）脱脂牛乳（３７℃培養） 発育はうす黄茶、気菌糸は着生せず、溶解性色素も認め
られない。

【００３３】３．生理的性質 （１）生育温度範囲 グルコース・アスパラギン寒天培地（グルコース１．０
％、アスパラギン０．０５％、リン酸二カリウム０．０
５％、紐寒天３．０％、ｐＨ７．０）を用い、６℃、２
０℃、２４℃、２７℃、３０℃、３７℃、５０℃の各温
度で試験した結果、６℃、５０℃を除き、そのいずれの
温度でも発育したが、生育至適温度は２７℃付近と思わ
れる。

【００３４】（２）ゼラチンの液化（１５％単純ゼラチ
ン培地、２０℃培養：グルコース・ペプトン・ゼラチン
培地、２７℃培養） １５％単純ゼラチン培地およびグルコース・ペプトン・
ゼラチン培地のいずれの場合も培養後１２日目頃より液
化が始まるが、その作用は中等度〜弱い方である。

【００３５】（３）スターチの加水分解（スターチ・無
機塩寒天培地およびスターチ寒天培地、いずれも２７℃
培養） いずれの培地においても培養後３日目頃より、水解性が
認められその作用は中等度である。

【００３６】（４）脱脂牛乳の凝固・ペプトン化（脱脂
牛乳、３７℃培養） 培養後７日目頃より凝固状を呈し、凝固完了後、ペプト
ン化が始まる。ペプトン化は培養後３週間を経過して
も、その完了をみられなかった。その作用は中等度であ
る。

【００３７】（５）メラニン様色素の生成（トリプトン
・イースト・ブロス、ＩＳＰ−培地１；ペプトン・イー
スト・鉄寒天培地、ＩＳＰ−培地６；チロシン寒天培
地、ＩＳＰ−培地７：いずれも２７℃培養） トリプトン・イースト・ブロスでは陽性、ペプトン・イ
ースト・鉄寒天培地およびチロシン寒天培地では陰性で
ある。

【００３８】（６）炭素源の利用性（プリドハム・ゴド
リーブ寒天培地、ＩＳＰ−培地９、２７℃培養） Ｄ−グルコースを利用して発育し、Ｌ−アラビノース、
Ｄ−キシロース、Ｄ−フルクトース、シュクロース、イ
ノシトール、ラムノース、ラフィノース、Ｄ−マンニト
ール、ラクトースは利用しない。

【００３９】（７）リンゴ酸石灰の溶解（リンゴ酸石灰
寒天培地、２７℃培養） 陰性である。

【００４０】（８）硝酸塩の還元反応（０．１％硝酸カ
リウム含有ペプトン水、ＩＳＰ−培地８、２７℃培養） 陰性である。

【００４１】（９）セルロースの分解（ろ紙片添加合成
液、２７℃培養） ４０日間培養の観察では分解は認められない。

【００４２】以上の性状を要約すると、ＭＪ２１０−７
２Ｆ６株の形態は、分枝した基生菌糸より、直状の気菌
糸を伸長し、らせん形成、輪生枝および胞子のうは認め
られない。気菌糸の先端には１０個以上の胞子を連鎖
し、胞子の表面は平滑である。種々の培地で、無色〜う
す黄茶の発育上に、明るい茶灰の気菌糸を着生し、溶解
性色素は認められない。生育至適温度は２７℃付近であ
る。メラニン様色素の生成はトリプトン・イースト・ブ
ロスでは陽性、ペプトン・イースト・鉄寒天培地および
チロシン寒天培地では陰性である。スターチの水解性は
中等度、蛋白分解力は中等度〜弱い方である。

【００４３】また、細胞壁に含まれる２，６−ジアミノ
ピメリン酸はＬＬ−型であった。

【００４４】これらの性状より、ＭＪ２１０−７２Ｆ６
株は、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）
属に属する微生物であると考えられる。

【００４５】なお、ＭＪ２１０−７２Ｆ６株は工業技術
院微生物工業技術研究所に寄託申請し、平成３年８月１
４日、微工研菌寄第１２４２９号として受託された。

【００４６】従って、第２の本発明においては、３−ヒ
ドロキシ−２−メチル−４−ピリドンを生産する新規な
特性をもち且つ前記の菌学的性質を有するストレプトミ
セスＭＪ２１０−７２Ｆ６株が微生物として提供され
る。

【００４７】本発明の方法において、３−ヒドロキシ−
２−メチル−４−ピリドンを製造するにあたっては、３
−ヒドロキシ−２−メチル−４−ピリドンを生産する能
力を有するストレプトミセス属に属する微生物、特に前
記のＭＪ２１０−７２Ｆ６株の培養を栄養培地中で約１
５°〜４０℃、好ましくは約２０°〜３７℃の温度で好
気的深部条件下に撹はんしながら行うのが好ましい。

【００４８】このような培養に用いる栄養培地は砂糖、
でんぷん、グリセリン、デキストリンおよび糖みつのよ
うな資化性炭素源、コーン・スティープ・リカー、大豆
粉、綿実粉、ペプトン、肉エキスおよびソイペプトンの
ような有機窒素源、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウ
ムおよび塩化アンモニウムのような無機窒素源を含有す
る。発酵の間に過剰の泡立ちが生じた場合、植物油また
はシリコーンのような消泡剤を発酵培地に加えることが
できる。発酵のｐＨが変化したら炭酸カルシウムのよう
な緩衝剤を加えても良い。深部生育用タンク中の培地の
通気は１分当りブロス１容量に対し新鮮な空気約１／２
ないし２容量の割合を維持するのが好ましい。撹はんは
発酵工業において一般によく知られた撹はん手段によっ
ておこなわれる。

【００４９】３−ヒドロキシ−２−メチル−４−ピリド
ンの生産のための種母は寒天培地上、３−ヒドロキシ−
２−メチル−４−ピリドンの生産菌株の斜面培養から得
られた生育物を使用する。この生育物を振とうフラスコ
または種母タンクのいずれに接種する場合にも使用で
き、あるいは種母タンクに振とうフラスコから接種して
もよい。

【００５０】この生産菌の生育は通常３〜６日で最高に
達する。しかし使用する装置、通気、撹はん速度等によ
って最高の生育に達する速度は変化する。一般に、発酵
は充分な抗微生物活性が培地に付与されるまで行う。こ
の生産力価の経時変化は例えばパスツレラ ピスシシダ
（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｐｉｓｃｉｃｉｄａ）を試
験菌とする円筒平板法により測定できる。

【００５１】３−ヒドロキシ−２−メチル−４−ピリド
ンの採取及び単離法としては、微生物の生産する代謝産
物を採取するのに通常用いられる手段を適宜利用すれば
よい。例えば、不純物との溶解性の差を利用する手段、
各種吸着剤にたいする吸着親和性の差を利用する手段、
水と混ざらない溶媒による抽出等が単独あるいは組み合
わせて利用できる。

【００５２】原則的には、下記の採取方法によるのが好
ましい。すなわち、培養物から菌体をろ別する。そのろ
液を合成吸着樹脂ダイヤイオンＨＰ−２０のカラムを通
過させた後、カラムを水洗する。この通過液とカラム水
洗液を合わせてから、含有される３−ヒドロキシ−２−
メチル−４−ピリドンを活性炭に吸着させ、水洗し、
０．１Ｍ塩酸−アセトン（１：１）溶液で溶出させる。
活性を示す溶出液を蒸発乾固する。更に純度を高めるた
めに、遠心液液分配クロマトグラフィー（ＣＰＣ）によ
る精製にかけ、溶媒を除去して３−ヒドロキシ−２−メ
チル−４−ピリドンを単離する。

【００５３】さらに、第３の本発明では、前記の式
（Ｉ）の３−ヒドロキシ−２−メチル−４−ピリドンを
有効成分とする抗菌剤、特に水産動物用の抗菌剤が提供
される。

【００５４】この抗菌剤においては、有効成分化合物は
製薬学的に許容できる常用の固体または液体担体、たと
えばエタノール、水、デンプン等と混和できる。

【００５５】第３の本発明による抗菌剤は、養殖中の各
種魚介類に感染する細菌を防除するのに有効である。

【００５６】以下に、実施例により本発明をさらに詳細
に説明する。

【００５７】実施例１ グリセロール２％、デキストリン２％、ソイペプトン１
％、イーストエキス０．３％、硫酸アンモニウム０．２
％、炭酸カルシウム０．２％、シリコン１滴を含む液体
培地（ｐＨ７．４に調製）１リットルを三角フラスコ
（５００ｍｌ容）に１１０ｍｌずつ分注し、常法により
１２０℃で２０分間滅菌したものに寒天斜面培地に培養
したストレプトミセスＭＪ２１０−７２Ｆ６株（微工研
菌寄第１２４２９号）を接種し、２７℃で４日間振とう
培養した。

【００５８】このようにして得られた培養液をろ過し、
そのろ液（１０２０ｍｌ）のダイヤイオンＨＰ−２０
（８０ｍｌ）の通過液および水洗液（併せて１１３０ｍ
ｌ）を活性炭１０ｇに吸着させた。水洗（２５０ｍｌ）
後、０．１Ｍ塩酸−アセトン（１：１）溶液で展開し、
活性画分（４．３ｇ）を再び活性炭４ｇに吸着させた。
水洗（１００ｍｌ）後、０．１Ｍ塩酸−アセトン（１：
１）溶液で展開し、活性画分を濃縮乾固し１．６ｇの粗
粉末を得た。

【００５９】この粗粉末を遠心液クロマトグラフィーに
より１−ブタノール−水の溶媒系を用いて精製し３−ヒ
ドロキシ−２−メチル−４−ピリドン１００ｍｇを得
た。さらに高純度の３−ヒドロキシ−２−メチル−４−
ピリドンは水より結晶化することにより得られた。本物
質の赤外吸収スペクトル、質量スペクトル、プロトン核
磁気共鳴スペクトル、融点および元素分析は既知の３−
ヒドロキシ−２−メチル−４−ピリドンのもの〔Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ，２６巻，７７６〜７８１頁（１９６４）及びＪｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ，６９巻，１０７４〜１０７６頁（１９８
０）に記載される〕と完全に一致した。

フロントページの続き (72)発明者 高橋 良和 東京都多摩市桜ケ丘３丁目２番地の３ (72)発明者 澤 力 神奈川県綾瀬市綾西四丁目６番７号

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ストレプトミセス属に属する３−ヒドロ
   キシ−２−メチル−４−ピリドン生産菌を培養し、次式
   （Ｉ） で表される３−ヒドロキシ−２−メチル−４−ピリドン
   を培養物から採取することを特徴とする抗生物質３−ヒ
   ドロキシ−２−メチル−４−ピリドンの製造法。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の式（Ｉ）で表される３
   −ヒドロキシ−２−メチル−４−ピリドンを生産する特
   性を持つストレプトミセス ＭＪ２１０−７２Ｆ６株。
3. 【請求項３】 請求項１に記載の式（Ｉ）で表される３
   −ヒドロキシ−２−メチル−４−ピリドンを有効成分と
   する水産用の医薬品。