NO152451B - Fremgangsmaate for fremstilling av fosfonsyrederivater - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av hittil ukjente hydroksyaminohydrokarbon-fosfonsyrederivater og salter derav, hvilke forbindelser har antimikrobiell virkning mot forskjellige patogene mikroorganismer. Med de nye forbindelser kan det fremstilles farmasøytiske preparater som kan anvendes til terapeutisk behandling av infeksjonssykdommer hos mennesker og dyr.

De nye hydroksyaminohydrokarbon-fosfonsyrederivater og salter derav fremstilles ved en fermenteringsprosess ved dyrkning av stammer som tilhører arten Streptomyces lavendulae i et næringsmedium.

Hydroksyaminohydrokarbon-fosfonsyrederivatene kan illu-streres ved den generelle formel I"

hvor A' betegner trimetylen eller trans-l-propenylen.

Forbindelsene med formel I" fremstilles ved å dyrke en mikroorganisme som hører til arten Streptomyces lavendulae i et vandig næringsmedium inneholdende assimilerbare kilder for karbon og nitrogen under aerobe betingelser, (f.eks. rystekultur eller submers kultur).

Foretrukne karbonkilder i næringsmediet er karbohydrater så som glukose, fruktose, glycerol og stivelse. Andre anvendelige kilder er laktose, arabinose, xylose, dekstrin og melasse.

Foretrukne nitrogenkilder er gjærekstrakt, pepton, glutenmel, bomullsfrømel, soyabønnemel, maisstøpevæske, tørret gjær eller hvetekim, samt uorganiske og organiske nitrogenforbind-elser så som ammoniumsalter (f.eks. ammoniumnitrat, ammonium-sulfat eller ammoniumfosfat), urinstoff eller aminosyre.

Selv om karbon- og nitrogenkildene fordelaktig anvendes

i kombinasjon, behøver de ikke anvendes i sin rene form, da mindre rene materialer, som inneholder spor av vekstfaktorer og betydelige mengder mineralnæringsstoffer, også er egnet til bruk. Om ønsket kan det settes mineralsalter til mediet, f.eks. kalsiumkarbonat, natrium- eller kaliumfosfat, natrium- eller kaliumklorid, magnesiumsalt eller kobbersalt. Om nødvendig kan det, særlig når kulturmediet skummer betydelig, tilsettes et anti-

skummemiddel, f.eks. flytende.parafin, fete oljer, vegetabilske oljer, mineraloljer og silikoner.

Som i de foretrukne metoder for produksjon av andre antibiotika i store mengder, foretrekkes submerse aerobe dyrkningsbetingelser for fremstilling av forbindelsen med formel I" i store mengder. Til produksjon av små mengder anvendes en rystekultur eller en overflatekultur i en kolbe eller flaske. Når dyrkingen foretas i store tanker, foretrekkes det å anvende den vegetative form av organismen til podning i produksjonstankene for å unngå vekstforsinkelse ved fremgangsmåten til fremstilling av forbindelsen med formel I". Det er derfor ønskelig først å fremstille et vegetativt podestoff av organismen ved poding av

en relativt liten mengde kulturmedium med sporer eller mycelium av organismen og dyrke dem, og overføre det dyrkede, vegetative podestoff aseptisk til store tanker.

Det medium hvor det vegetative podestoff fremstilles,

kan i det vesentlige være det samme som eller forskjellig fra det medium som anvendes ved fremstillingen av forbindelsen med formel I".

Agitasjon og lufting av kulturblandingen kan utføres på mange forskjellige måter. Agitasjon kan tilveiebringes ved hjelp av en rører eller ved lignende mekanisk agitasjonsutstyr, ved rotasjon eller rysting av fermenteringsbeholderen, ved hjelp av forskjellig pumpeutstyr eller ved å lede steril luft gjennom mediet. Luftingen kan utføres ved å lede steril luft gjennom fermenteringsblandingen.

Fermenteringen utføres vanligvis ved en temperatur mellom ca. 20 og 40°C, fortrinnsvis ved 3C°C i et tidsrom mellom 50 og 100 timer.

Forbindelsen med formel I" kan isoleres fra kulturmediet ved konvensjonelle metoder som vanligvis anvendes til isolering av andre kjente antibiotika.

Vanligvis finnes størsteparten av den fremstilte forbindelse med formel I" i kulturvæsken, og kan således skilles fra det ved filtrering eller sentrifugering av dyrkningsvæsken erholdte filtrat ved en konvensjonell metode, f.eks. ved inndampning under redusert trykk, lyofilisering, oppløsningsmiddel-ekstraksjon, pH-justering, behandling med en harpiks (f.eks. anion- eller kationbytterharpiks eller ikke-ionisk adsorpsjons-harpiks), behandling med et adsorpsjonsmiddel (f.eks. aktivt kull, silisiumdioksyd, silikagel, cellulose eller aluminiumoksyd), krystallisering eller omkrystallisering.

Fremstilling av forbindelsen med formel I" hvor A<1> er

-CH2-CH2-CH2-/ dvs. 3-(N-formyl-N-hydroksyamino)-propylfosfon-syre (herefter kalt FR-31705), og/eller forbindelsen med formel I" hvor A' er trans-l-propenylen, dvs. 3-(N-formyl-N-hydroksy-amino) trans-l-propenylf osf onsyre (herefter kalt FR-900136) beskrives i det følgende: Antibiotikumet FR-31705 og/eller antibiotikumet FR-900136 kan fremstilles ved fermentering av en antibiotikum FR-31705-og/eller antibiotikum FR-900136-produserende stamme tilhørende Streptomyces lavendulae i et næringsmedium.

1) Mikroorganismen:

Den mikroorganisme som kan anvendes for fremstilling

av de hittil ukjente antibiotika FR-31705 og/eller FR-900136,

er en stamme av Streptomyces lavendulae som nylig er isolert fra en jordprøve innsamlet ved Fukue city, Nagasaki prefecture,

Japan.

En kultur av den levende organisme er deponert i

The American Type Culture Collection under ATCC nr. 31279 og i Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science

and Technology, Japan, under nr. 3808.

Det er klart at fremstillingen av FR-31705 og FR-900136 ikke er begrenset til anvendelse av de spesifikt her beskrevne organismer som bare er angitt som eksempler. Det kan anvendes både en kunstig mutant og en naturlig mutant. En slik kunstig mutant kan fremstilles fra den beskrevne mikroorganisme på konvensjonell måte som angitt ovenfor.

1) Mikrobiologiske egenskaper.

Streptomyces lavendulae ATCC 312 79 har følgende morfologiske, dyrkningsmessigeog fysiske egenskaper:

1. Morfologiske egenskaper:

Kulturens morfologi undersøkes mikroskopisk med det mycelium som er dyrket på glycerol-asparagin-agar, gjær-maltekstrakt-agar, havremel-agar og uorganiske-salter-stivelse-agar.

1) Forgreningstype av sporedannende hyfer:

Monopodial forgrening

2) Form av sporedannende hyfer:

Retinaculiaperti: åpent øye, krok og leilighetsvis rectus og spiral.

3) Antall sporer:

10-50 sporer.

4) Overflateutseende og sporestørrelse:

Glatt, 0,5-1,2 x 1,4-2,0 mikro-meter

5) Forekomst av zoo-spore:

Ikke observert

6) Forekomst av sporangium:

Ikke observert

7) Dannelse av sporer:

I luft-mycelium

8) Fragmentering av substratmycelium:

Ikke observert

2. Dyrkningsegenskaper:

Stammen har de nedenfor angitte dyrkningsegenskaper når den dyrkes på medier som angitt nedenfor ved 30°C i 10-14 dager:

3. Fysiologiske egenskaper:

1) Temperaturområde for vekst (på Bennetts agar): 12-40°C, optimum: 26°C. 2) Gelatinsmeltning (på glukose-pepton-gelatin-stikkultur):

Negativ

3) Stivelseshydrolyse (på stivelse-uorganiske salter-agar):

Positiv.

4) Koagulering og peptonisering av skummet melk:

Koagulering: negativ

Peptonisering:langsomt peptonisert .

5) Produksjon av melanoidt pigment:

a) Positiv på pepton-gjær-jern-agar

b) Negativ på tyrosin-agar.

6) Mønster for karbonkildeutnyttelse (på Pridham-Gottlieb-agar):

De.ovenfor angitte mikrobiologiske egenskaper viser

at stammen ATCC 31279 hører til slekten Streptomyces. Som et resultat av undersøkelser av den stamme som har egenskaper som angitt ovenfor i litteraturen "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 8. utg. (1975), 'The Actinomycetes", bind II (1961)

av S.A. Waksman og "The International Streptomyces Project Reports" av E. B. Shirling og D. Gottlieb (jfr. International Journal of Systematic Bacteriology, bind 18, side 69-189 og 279-392 (1968), bind 19, side 391-512 (1969) og bind 22, side 26.5-394 (1972)),

er det bekreftet at de mikrobiologiske egenskaper av stammen'

ATCC 312 79 er identiske méd egenskapene til Streptomyces lavendulae.

Denne observasjon er også bekreftet ved sammenligning

av de mikrobiologiske egenskaper av stammen ATCC 31279 og av en type-kultur, Streptomyces lavendulae IAM 0009.

Som et resultat av den ovenfor angitte undersøkelse er. stammen blitt betegnet Streptomyces lavendulae.

2) Fermentering:

Fermentering for fremstilling' av antibiotikumet FR-31705 og antibiotikumet FR-900136 kan utføres på vanlig måte som angitt ovenfor, og isolering av disse antibiotika kan vanligvis også utføres ved konvensjonelle metoder. Som ovenfor nevnt inneholder dyrkningsvæsken både antibiotikumet FR-31705 og antibiotikumet FR-900136, og disse to antibiotika kan derfor adskilles på konvensjonell måte, f.eks. kroma.tografisk. Nedenfor er .angitt et eksempel på en adskillelsesmetode.

Trinn a':

Filtratet surgjøres på vanlig måte (f.eks. innstilles på pH-verdi 2,0), og oppløsningen ledes gjennom en kolonne av et egnet adsorpsjonsmiddel, f.eks. aktivt kull. Elueringen utføres med et vandig oppløsningsmiddel (f.eks. metanol eller aceton).

Trinn b':

Eluatet ledes gjennom en kolonne av en anionebytterharpiks (f.eks. "DEAE-Sephadex" eller "Duolite" A-6). Elueringen utføres med f.eks. en vandig natriumkloridoppløsning (f.eks. 0,3M) og en vandig ammoniakkoppløsning (f.eks. 0,2N).

Trinn c<1>:

Eluatet underkastes kolonnekromatografi under anvendelse av cellulose med et egnet fremkallingsmiddel (f.eks. vandig propanol). FR-31705 kan utskilles f.eks. ved fremkalling med 97%ig vandig propanol, og FR-900136 kan utskilles ved fremkalling med 95%ig vandig propanol.

Antibiotika FR-31705 og FR-900136 som er dannet i dyrkningsvæsken eller utskilt fra dyrkningsvæsken, kan isoleres i den frie form, dvs. FR-31705 per se. Disse antibiotika kan også isoleres i form av sine alkalimetall- eller jordalkalimetall-salter ved behandling av en oppløsning inneholdende de nevnte antibiotika med en alkalimetall- eller jordalkalimetallforbindelse (f.eks. natrium- eller kaliumhydroksyd eller kalsiumkarbonat), f.eks. ved ekstraksjons-, isolerings- eller rensingsprosessen.

De antibiotika som er erholdt i fri form, kan også omdannes til sine salter med baser, f.eks. med en uorganisk base (f.eks. natriumhydroksyd, kaliumhydroksyd, kalsiumhydroksyd eller ammoniakk) eller en organisk base (f.eks. etanolamin, trimetylamin eller dicykloheksylamin) på konvensjonell måte.

Saltene av disse antibiotika kan lett omdannes til den frie form ved behandling med en syre, f.eks. en mineralsyre (f.eks. saltsyre) på vanlig måte.

3) Antibiotika FR-31705 og FR-900136:

3)-l Antibiotikum FR-31705

Antibiotikumet FR-31705 har, fremstilt på den ovenfor beskrevne måte i form av sitt monokaliumsalt, nedenstående fysiske og kjemiske egenskaper:

a) Elementæranalyse: C 21,62, H 4,07, N 6,36, K 17,99.

b) Smeltepunkt: 202-204°C (spaltning)

c) IR-absorpsjonsspektrum (nujol):

v mak, s •= 2950, 2925, 2850, 2550, 2380, 1650, 1460, 1410, 1395,

1375, 1320, 1300, 1260, 1220, 1190, 1150, 1120, 940, 890, 810,

785 og 700 cm"<1.>

d) NMR-spektrum (i D20):

6 (ppm): 1,25-2,3 (4H, m), 3,65 (2H, t, J=6Hz), 8,00 (s)

8,35 (s)} <1>H

Ved analyse av de ovenfor angitte fysiske og kjemiske egenskaper, og som resultat av ytterligere undersøkeler for identifikasjon av den kjemiske struktur, er den kjemiske struktur til antibiotikum FR-31705 identifisert og fastsatt som følger:

[3-(N-formyl-N-hydroksyamino)propylfosfonsyre].

3)-2. Antibiotikum FR-900136

Antibiotikum FR-900136 har, fremstilt ved den ovenfor beskrevne måte i form av sitt moriokaliumsalt, nedenstående fysiske og kjemiske egenskaper:

a) Elementæranalyse: C 21,32, H 3,26, N 6,00, H20 1,49

b) Smeltepunkt 178-180°C (spaltning)

c) IR-absorpsjonsspektrum (nujol) :

v . = 2960, 2930, 2870, 2600, 2350, 1660, 1530, 1460, 1440,

maks.

1400, 1380, 1365, 1290, 1250, 1180, 1125, 1070, 1010, 980, 960, 950, 890, 830, 780 og 700 cm"<1>.

d) NMR-spektrum (i D2O): ,

6 (ppm) = 4,30 (2H, m), 6,01 (1H, m), 6,38 (1H, m, 8,02 (s)

8,38 (s) } <1>H

Fra analysen av de ovenfor angitte fysiske og kjemiske egenskaper og som resultat av ytterligere undersøkelser for identifikasjon av den kjemiske struktur, er den kjemiske struktur av'antibiotikum FR-900136 identifisert og fastsatt som følger:

[3-(N-formyl-N-hydroksyamino)trans-1-

propenylfosfonsyre].

Biologiske egenskaper av hydroksyaminohydrokarbonfosfonsyre-derivatene;

Antimikrobiell virkning:

De nye forbindelser, hydroksyaminohydrokarbonfosfonsyre-derivatene med formel I" og salter derav, har vist seg å ha kraftig antibakteriell virkning mot patogene mikroorganismer, f.eks. grampositive og gramnegative bakterier, herunder slektene Bacillus, Sarcina/ Escherichia, Proteus, Salmonella, Pseudomonas, Shigella og Enterobacter. De nye forbindelsene kan derfor anvendes til behandling av infeksjonssykdommer som er forårsaket av slike patogene bakterier i mennesker eller dyr. Nedenfor er angitt de biologiske egenskaper av noen representative forbindelser med formel I". 1. Mdnoammoniumsaltet av 3-(N-formyl-N-hydroksyamino)propyl-fosf onsyre: Minste hemmende konsentrasjon (MIC): MIC-forsøket utførés ved den vanlige serie-agar-fortynningsmetode (podestoff: 10^ celler/ml) ved anvendelse av en næringsagar som inkuberes ved 37°C i 20 timer. MIC-verdien er den minste konsentrasjon av monoammoniumsaltet av 3-(N-formyl-N-hydroksyamino) propylfosf onsyre (|jg/ml) som hemmer vekst av mikroorganismer.

Resultatene er som følger.

Beskyttende virkning mot eksperimentelle infeksjoner i mus

a) Forsøksforbindelse: monoammoniumsaltet av 3-(N-formyl-N-hydroksyamino) propylfosfonsyre. b) Forsøksdyr: hannmus av stammen ICR, 4 uker gamle og med en vekt på 24 1 1 g. Hver forsøksgruppe består av 8 dyr. c) Forsøksmetode: en fastsatt mengde patogene bakterier, suspendert i 0,5 ml 5%ig vandig mucin-oppløsning, injiseres

intraperitonealt i forsøksdyrene.

Til hvert forsøksdyr administreres derefter 0,25 ml av den ovennevnte forsøksforbindelse i vanti subkutant tre ganger, 0, 1 og 3 timer eller oralt én gang 1 time efter infeksjonen med de patogene bakterier.

Alle forsøksdyrene observeres i 1 uke for registrering av antall overlevende og døde, og ED^-verdiene beregnes. Resultatene er angitt i nedenstående tabell:

A kutt toksisitet:

a) Forsøksforbindelse: mononatriumsaltet av 3-(N-formyl-N-hydroksyamino) propylfosfonsyre. b) Forsøksdyr: hann- og hunnmus av stammen ICR, 6 uker gamle.

c) Observasjonstid: 1 uke.

d) Beregningsmetode: Litchfield-Wilcoxon-metoden. 2. Monokaliumsaltet av 3-(N-formyl-N-hydroksyamino)-trans-1-propenylfos fonsyre:

Minste hemmende konsentrasjon ( MIC):

MIC-forsøk utføres ved en vanlig serie-agar-fortynnings-metode (podestoff: 10^ celler/ml) under anvendelse av en næringsagar som inkuberes ved 37°C i 18 timer. MIC-verdien uttrykkes som den minste konsentrasjon av monokaliumsaltet av 3-(N-formyl-N-hydroksyamino)-trans-l-propenylfosfonsyre (yg/ml) som hemmer vekst av mikroorganismer. Resultatene er som følger:

Farmasøytiske preparater inneholdende hydroksyaminohydrokarbon-fosfonsyrederivater

Forbindelsene med formel I", hydroksyaminohydrokarbon-fosfonsyrederivater og estere ved fosfonogruppen derav og farmasøytisk godtagbare salter derav, kan tilberedes for administrering på en hvilken som helst egnet måte analogt med kjente antibiotika, med en ikke-toksisk, farmasøytisk gbdtagbar bærer.

Et farmasøytisk godtagbart salt av forbindelsen med formel T kan omfatte et salt med en uorganisk eller organisk base, f.eks. natriumsaltet, kaliumsaltet, kalsiumsaltet, ammonium-saltet, etanolaminsaltet, trietylaminsaltet og dicykloheksylamin-saltet, og et salt med en uorganisk eller organisk syre, f.eks. hydrokloridet, sulfatet, citratet, maleatet, fumaratet, tartratet og p-toluensulfonatet, samt salter med en aminosyre så som argininsaltet, asparaginsyresaltet eller glutaminsyresaltet.

Den antimikrobielle sammensetning kan anvendes i

form av et farmasøytisk preparat, f.eks. i fast, halvfast eller flytende form, som inneholder en aktiv forbindelse fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen sammen med en farmasøytisk organisk eller uorganisk bærer eller eksipiens som er egnet til utvortes, enteral eller parenteral administrering. Den aktive bestanddel kan f.eks. tilberedes med vanlige ikke-toksiske, farmasøytisk godtagbare bærere til tabletter, piller, kapsler, suppositorier, oppløsninger, emulsjoner, suspensjoner eller en hvilken som helst annen form som er egnet til bruk. Bærere som kan anvendes er vann, glukose, laktose, akasiegummi, gelatin, mannitol, stivelsespasta, magnesiumtrisilikat, talk, maisstivelse, kerasin, kolloidalt silisiumdioksyd, potetstivelse, urinstoff og andre bærere som er egnet til fremstilling av preparater i fast, halvfast eller flytende form; hvilke preparater kan inneholde ytterligere hjelpestoffer, stabiliseringsmidler, fortyknings-midler og farve- og aromastoffer. De antimikrobielle preparater kan også inneholde konserveringsmidler eller bakteriostatiske midler for å holde aktiviteten av den aktive bestanddel i det ønskede preparat stabil. Den aktive forbindelse som er fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, tilsettes det antimikrobielle preparat i en mengde som er tilstrekkelig til å fremkalle den ønskede terapeutiske virkning på den bakterielt infiserte prosess eller tilstand.

Det foretrekkes å tilføre preparatene til mennesker

ved intravenøs, intramuskulær eller oral administrering. Mens dosering eller den terapeutisk virksomme mengde av den nye forbindelse varierer med og også avhenger av den individuelle pasients alder og tilstand, gis vanligvis en daglig dose på

ca. 2 til 100 mg av den aktive bestanddel pr. kg legemsvekt for mennesket eller dyret for behandling av sykdom, og vanligvis en gjennomsnittlig enkeltdose på ca. 50, 100, 250 eller 500 mg.

Eksempler på fermentering.

Eksempel 1

Et vandig medium inneholdende 2% potetstivelse, 1% glutenmel, 1% tørret gjær og 1% maisstøpevæske innstilles på pH 7,0

med 6N vandig natriumhydroksydoppløsning. I hver av seks 500 ml Erlenmeyer-kolber helles 100 ml av mediet, og det steriliseres ved 120°C i 20 minutter. I hvert medium podes et øyefull av en skråkultur av Streptomyces lavendulae ATCC 31279, og organismen dyrkes i et roterende rysteapparat ved 30°C i 3 dager.

På den annen side helles 20 liter av et vandig medium inneholdende 3% metyloleat, 1% bomullsfrømel, 1% hvetekim,

0,5% tørret gjær, 0,5% maisstøpevann, 1% kaliumdihydrogenfosfat og 1% sekundært natriumfosfat i en 30 liters ryste-fermenterings-beholder og steriliseres ved 120°C i 30 minutter. Til mediet helles hele volumet av den dyrkede væske erholdt som beskrevet ovenfor, hvorefter organismen dyrkes ved 30°C i 3 dager.

I dyrkningsperioden styres fermenteringen ved omrøring av

væsken med et røreutstyr med en hastighet på 250 omdr. pr. minutt, ved å lede steril luft gjennom dyrkningsvæsken i en mengde på 20 liter/dyrkningsvæske/minutt og ved å holde det indre atmosfære-trykk i fermenteringsbeholderen på 0,5 kg/cm 2.

Efter avsluttet dyrkning filtreres dyrkningsvæsken ved hjelp av 2 kg"diatoméjord. Filtratet (15 liter) innstilles på

pH 2,0 med IN saltsyre og ledes gjennom en kolonne med 5 liter aktivt kull. Efter vask av kolonnen med vann utføres elueringen med 4 liter 70%ig vandig aceton.

Eluatet inndampes til et volum på 1 liter, innstilles på pH 2 med 6N saltsyreoppløsning og ledes derefter gjennom en kolonne med 500 ml anionebytterharpiks "Duolite" A-6 (OH -type)

(Diamond Shamrock Chemical Co.). Efter vask av kolonnen med vann utføres elueringen med 1,5 liter 0,1N vandig natriumhydroksyd-oppløsning. Eluatet ledes gjennom en kolonne med kationebytter-harpiks "Duolite" C-20 (H+<->type) (Diamond Shamrock Chemical Co.). Efter vask av kolonnen med vann utføres elueringen med 500 ml 60%ig vandig aceton. Eluatet inndampes under redusert trykk, hvorved fås et oljeaktig residuum som underkastes kolonnekromatografi -på 300 ml cellulose med 80%ig vandig acetonitril som fremkallingsmiddel. Fraksjonene inneholdende den ønskede.forbindelse isoleres og inndampes under redusert trykk, hvorved fås et oljeaktig residuum som innstilles på pH 7,0 med IN vandig

kaliumhydroksydoppløsning og underkastes kolonnekromatografi på

300 ml cellulose med 60%ig vandig propanol som fremkallingsmiddel. Fraksjoner inneholdende den ønskede forbindelse isoleres og

inndampes under redusert trykk, hvorved fås et oljeaktig residuum

som oppløses i 2 ml etanol. Til oppløsningen settes 20. ml aceton og 200 ml dietyleter for å danne et bunnfall som isoleres ved filtrering og tørres, hvorved fås 150 mg rått pulver. Pulveret oppløses i 150 ml vann, og oppløsningen innstilles på pH 7 og

ledes gjennom en kolonne med 100 ml aktivt kull. Efter

passeringen inndampes oppløsningen under redusert trykk, hvorved fås et oljeaktig residuum som underkastes kolonnekromatografi på 200 ml cellulose med 65%ig vandig propanol som fremkallings-

middel. Fraksjonene inneholdende den ønskede forbindelse isoleres og inndampes under redusert trykk, hvorved fås et oljeaktig residuum som oppløses i 1 ml metanol. Oppløsningen oppvarmes til 50°C, og tilsettes 10 ml aceton. Blandingen får stå natten over ved 4°C, hvorved fås krystaller som isoleres ved filtrering og tørres for å danne 5 mg monokaliumsalt av FR-31705 i form av nåler.

Eksempel 2

■I hver av ti 500 ml Erlenmeyer-kolber helles 100 ml av

et vandig medium inneholdende 1% potetstivelse, 1% glycerol,

1% bomullsfrømel og 1% tørret gjær, og kolbene steriliseres ved 120°C i 20 minutter. I hver kolbe podes mediet ved tilsetning av et øyefull av en skråkultur av Streptomyces lavendulae ATCC 31279,

og organismen dyrkes i et roterende rysteapparat ved 30°C i 3 dager.

På den annen side helles 80 liter av et vandig medium inneholdende 3% metyloleat, 1% bomullsfrømel, 1% hvetekim,

0,5% maisstøpevann, 0,5% tørret gjær, 1% kaliumdihydrogenfosfat og 1% sekundært natriumfosfat i en 100 liters ryste-fermenterings-beholder og steriliseres ved 120°C i 30 minutter. Hele det på.ovenfor beskrevne måte erholdte volum av dyrket væske podes i mediet, og organismen dyrkes ved 30°C i 72 timer. I dyrknings-

tiden styres fermenteringen ved å omrøre dyrkningsvæsken med et røreapparat med en hastighet på 130 omdr. pr. minutt, ved å

lede steril luft gjennom dyrkningsvæsken med en hastighet på

80 liter/dyrkningsvæske/minutt og ved å holde det indre atmosfære-

trykk i fermenteringsbeholderen på 1 kg/cm 2.

Efter avsluttet dyrkning filtreres dyrkningsvæsken ved hjelp av 5 kg diatoméjord. Filtratet (70 liter) innstilles på

pH 2 med 6N saltsyreoppløsning og behandles derefter med 20 liter aktivt kull. Elueringen utføres med 20%ig vandig aceton.

Acetonet fjernes fra eluatet under redusert trykk. Den resul-terende vandige oppløsning innstilles på pH 2 med en kationebytter-harpiks, "Duolite" C-20 (H+<->type) og leder derefter gjennom en kolonne med anionebytterharpiks, "Duolite" A-6 (OH -type). Elueringen utføres med 0,2N vandig ammoniakk. Eluatet innstilles på pH 6 og lyofiliseres, hvorved fås 100 g rått pulver som opp-løses i 3 liter vann. Oppløsningen innstilles på pH 2 ved tilsetning av 6N saltsyreoppløsning og behandles med 6 liter aktivt kull. Eluering utføres med 0,03N vandig ammoniakk. Eluatet inneholdende den ønskede forbindelse inndampes under redusert trykk til et volum på 1 liter. Konsentratet innstilles på pH 2

og inndampes ytterligere under redusert trykk og underkastes derefter kolonnekromatografi på 1 liter cellulose. Kolonnen vaskes med 1 liter aceton. Derefter utføres eluering med 97%ig vandig aceton, hvorved fås et eluat som inneholder FR-31705,

og det samme utføres med 95%ig vandig aceton, hvorved fås et eluat som inneholder FR-900136. Eluatet som inneholder FR-900136 nøytraliseres med IN vandig natriumhydroksydoppløsning og inndampes under redusert trykk, hvorved fås et residuum som pulveri-seres med en blanding av aceton og dietyleter for å gi 50 mg morionatriumsalt av FR-900136 i form av pulver.

Claims (2)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et fosfonsyrederivat med den generelle formel I" hvor A<1> betegner trimetylen eller trans-l-propenylen, eller farmasøytisk godtagbare salter derav, karakterisert ved at Streptomyces lavendulae dyrkes i et vandig næringsmedium inneholdende assimilerbare kilder for karbon og nitrogen under aerobe betingelser, og det dannede fosfonsyrederivat med formel I" isoleres fra dyrkningsvæsken, eventuelt i form av et farmasøytisk godtagbart salt derav.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som Streptomyces lavendulae anvendes Streptomyces lavendulae ATCC 31279.