NO132241B - - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av et nytt antibiotikum A16884, og dets salter. Antibiotikum A16884 har formelen:

Antibiotikum A16884 er et nytt antibiotikum fremstilt ved fermentering av en hittil ubeskrevet, antibiotikum A16884-produserende stamme av Streptomyces lipmanii. Saltene av A16884 oppnås lett ved å omsette A16884 med en egnet syre eller base. Antibiotikum A16884 og dets salter oppviser antibakteriell og anthelmintisk aktivitet. Den antibakterielle aktivitet oppvises både overfor gram-positive og gram-negative organismer, såvel som overfor•plantepato-gene organismer.

Monoammoniumsaltet av antibiotikum A16884 er et hvitt, amorft stoff, som spaltes ved ca. 180°C, er lett løselig i vann, løselig i dimetylsulfoksyd, ubetydelig løselig i lavere alkanoler og uløselig i acetonitril, er amfotert, har fire titrerbare grupper av pK^ = 3,9; pK'a2 =5,3,<*> pK'a3 =9,2 og pK'a4 = 10,5 når tit- ;rert i 66% dimetylformanid ved en begynnelses-pH på 5,8, har en til-synelatende molekylvekt på ca. 435 bestmt fra titreringsdata, har ;25 o o ;en spesifikk optisk dreining [ a] — på +140,9 (C = 1 vekt/vol.-% i vann), har i mineraloljesalve følgende klart adskillbare bånd i dets infrarøde absorpsjonsspektrum ved følgende bølgelengder i ^a: 3,18 (bredt bånd), 5,66, 6,26, 6,57, 6,89, 7,15, 7,28, 7,40, 7,73, 8,00, 8,14, 8,79, 9,24, 9,65, 9,79 og 10,40, og gir positive forsøk med ninhydrin-, Pan Deutscher-, Benedict-, Molisch-, jod- og dansylklorid-reagenser, og negative forsøk med Fehling-, ferriklorid, biuret- og Sakaguchi-reagenser. Fremgangsmåten karakteriseres ved dyrking av Streptomyces lipmanii NRRL 3584 i et kulturmedium inneholdende assi-limilerbare forråd av karbon, nitrogen og uorganiske salter under neddykkede, aerobe betingelser inntil en vesentlig mengde A16884 ;er fremstilt av nevnte organisme i nevnte kulturmedium. ;Antibiotikum A16884 kan brukes.som sådant eller som ;et salt, for eksempel et syreaddisjonssalt eller et salt med et kation. I tilfellet av et salt med et kation kan saltet enten være et mono- ellér di-salt. Det er ofte foretrukket å fremstille saltene direkte i renseprosessen slik at antibiotikumet når det er separert, er i saltform. Antibiotikum A16884 har vært separert på denne måte og av den grunn karakteriseres det heretter som monoammoniumsaltet. ;Monoammoniumsaltet av antibiotikum A16884 ér et ;hvitt, amorft, fast stoff som spaltes ved ca. 180°C, er lett løse- ;lig i vann, løselig i dimetylsulfoksyd (DMSO), svakt løselig i ;lavere alkanoler og tilnærmet uløselig i acetonitril og andre organiske løsningsmidler. Ovennevnte verdi av den spesifikke op- ;tiske dreining av monoammoniumsaltet av antibiotikum A16884 er basert på saltet tørket ved romtemperatur i vakuum over vannfritt kalsiumklorid i ca. 15 timer. ;Elektrometrisk titrering av monoammoniumsaltet av antibiotikum A16884 i 66% dimetylformanid-vannløsning ved en begynnelses-pH på 6,6 viser nærvær av firetitrerbare grupper: pK^ = 3,5, pK'a2 = 5,2, pK'a3 =9,2 og pK'a4 = 10,3. Ved lik titrering av en senere prøve, med unntagelse av en begynnelses-pH på 5,8, var, som angitt ovenfor, de respektive verdier: pK'a^ = 3,9, pK'a2 = 5,3, pK'a3 = 9,2 og pK'a^ = 10,5. Når monoammoniumsaltet av antibiotikum A16884 omdannes til syreformen, forsvinner pK'a ved 9,2 . ;Elementæranalyse av monoammoniumsaltet av A16884 tørket i vakuum ved 80°C over fosforpentoksyd ga følgende verdier : ;Analyser viste et metoksylinnhold på 6,64% og et acetylinnhold på 9,23% og en Van Slyke-undersøkelse på aminonitrogen viste 5,09%. ;Det infrarøde absorpsjonsspektrum for monoammoniumsaltet av antibiotikum A16884 i en mineraloljesalve er vist i figur 1 på den medfølgende tegning. De klart adskillbare bånd i det infrarøde spektrum over området 2,0 til 15,0 ^a er som ovenfor angitt. ;Det ultrafiolette absorpsjonsspektrum for monoammoniumsaltet av antibiotikum A16884 i vandig løsning viser absorp-1 °/ 1 % sjonsmaksima ved 242 mia (Et- = 126) og ved 625 mu (Er- = 158) . ;J /i cm . / 1 cm Sirkulær dikroisme ble også målt i vandig løsning og viste en positiv Cotton-effekt ved 263 ima og en negativ Cotton-effekt ved 236 ima • ;Papirkromatografi av monoammoniumsaltet av antibiotikum Al688*1- på Whatman nr. 1-papir ga en R^-verdi på 0,79 i et losningsmiddelsystem av propanol, acetonitril og vann i et vo-lumforhold 1:1:1. Bioautografier ble oppnådd ved å plassere pa-pirkromatografen på agarplater Inokulert med folsomme organismer, slik som Salmonella gallinarum, som prbveorganismer.

NMR-spektret til A16884 i DgO viste fblgende karakteristika: 5,16 ppm. (1H, enkel), 4,86, 4,68 ppm. (2H, AB firedoblet, J = 12,5 Hz), 3,9 - 3,7 ppm. (1H, mangedoblet), 3.67» 3,29 ppm. (2H, AB firedoblet, J = 18 Hz), 3»53PPm. (3H, enkel), 2,6 - 2,3 ppm. (2H, mangedoblet), 2,10 ppm. (3H, enkel), 2,1 - 1,6 ppm. (4H, mangedoblet).

Papirkromatografi av monoammoniumsaltet ble også utfort 1 andre losningsmiddelsysterner med fblgende resultater:

Når monoammoniumsaltet av A16884 ble underkastet tynnskikts-kromatografi på silikagelplater i 70 % vandig acetonitril, under anvendelse av en ninhydrin-dusj som en detektor, hadde det en Rf-verdi på ca. 0,4?, på celluloseplater i 70 % vandig acetonitril, under anvendelse av den samme fremgangsmåte for påvisning, hadde det en Rf-verdi på 0,45.

Aminosyreanalyser av et surt hydrolysat av antibiotikum A16884, utfort ved Spackman-Moore-Steln-teknikk, viste to ninhydrin-reaksjonstopper, hvorav én ble eluert identisk med glycin (0,758 yumol/mg) og den annen ble eluert akkurat like for glycin og ble identifisert som alfa-aminoadipinsyre (2,39yumol/ mg). Ved lik analyse av en senere prove var de observerte verdi-

er henholdsvis 0,49 jmol/ mg og 1,2 ^imol/mg.

En rekke kvalitative kjemiske undersbkelser har vært utfort med antibiotikum A16884. Antibiotikum A16884 gir en positiv prove med ninhydrin-, Pan Deutscher-, Benedict-, Molsoh-, jod- og dansylklorid-reagenser, men ikke med Fehling-,- ferriklorid, biuret- og Sakaguchi-reagenser.

Monoammoniumsaltet av antibiotikum A16884 er stabilt ved. pH 3-9 ved 5°C i 8 dogn, relativt stabilt ved pH 3-9 ved 25°C i 4 dogn og ustabilt ved varierende pH-verdier ved 100° innen 5 minutter. Biologisk aktivitet tapes langsomt ved pH 3-9 ved en temperatur på 37°C, idet halvparten tapes etter 4 dogn.

Antibiotikum A16884 har en hemmende virkning på vekst av både gram-positive og gram-negative bakterier. Nivåene

ved hvilke delvis renset monoammoniumsalt av antibiotikum A16884 viser hemmende virkning mot vekst av illustrerende organismer er angitt i tabell I. De hemmende nivåer ble bestemt ved agarfortynningsprbven eller ved kulturvæskefortynningsprbven (angitt i

tabellen ved bokstavene henholdsvis "a.d." og "b.d.".

I agarfortynningsprbven utstrykes prbveorganismen på en serie agarplater inneholdende forskjellige konsentrasjoner av monoammoniumsaltet av antibiotikum A16884 for å bestemme de minste konsentrasjoner i mcg/ml (mikrogram pr. milliliter) i agar-substratet som hemmer veksten av organismen over et tidsrom på 48 timer (72 timer i tilfellet med de plantepatogene organismer) .

I kulturvæskefortynningsprbven ble en rekke ror inneholdende næringskultur med varierende konsentrasjoner av monoammoniumsaltet av antibiotikum A16884 innokulert med prbveorga-nismene for å bestemme den minste konsentrasjon av monoammoniumsaltet av A16884 i mcg/ml i substratet som hindrer organisme-veksten i et tidsrom av tyve timer.

Ingen binding av hesteserum ble iakttatt i noen av de ovennevnte prøver.

Som det vil sees av foregående tabell, oppviser antibiotikum A16884 som monoammoniumsalt aktivitet mot gram-posi-

tive og gram-negative bakterier.

Mer høyverdig renset monoammoniumsalt av antibioti-

kum A16884 ble videre undersøkt for antibakteriell aktivitet i et forsøk hvori ble anvendt kulturvæskefortynningsteknikken beskrevet ovenfor. Resultatene uttrykt i det minste antall mikrogram pr. milliliter som kreves for oppnåelse av hemming, er angitt i tabell II nedenfor.

Antibiotikum A16884 og dets salter oppviser også

in vivo aktivitet mot et antall av ovennevnte organismer og er følgelig brukbare for å kontrollere infeksjoner foranlediget av slike organismer i vertdyr. Delvis renset antibiotikum A16884 som monoammoniumsaltet oppviser en ED^0 på 23 mg/kg i mus infisert med Proteus PR6 og en ed^q på 33,8 mg/kg i mus infisert med Shigella SH3 . Mer høyrenset A16884 som ammoniumsaltet oppviser en ED,-Q på 3,64 mg/kg i mus infisert med Escherichia coli EC14 og E°50 på 23 mg/kg mus i infisert med Salmonella typhosa SA12 og

en ED^0 93,4 mg/kg i mus infisert med Klebsiella Kl. Administrering ble foretatt under huden.

Som ovenfor nevnt, oppviser antibiotikum A16884 og dets salter anthelmintisk aktivitet i tillegg til bakteriell aktivitet. Følgelig kan antibiotikum A16884 eller saltet derav ad-ministreres til varmblodige dyr for å kontrollere forskjellige innvortes parasitter, spesielt mage- og innvollsormer som Ascaris lumbricoides var. suum, Nematospiroides dubius, Aspiculuris tetraptera, Syphacia obvelata og lignende. Administreringen foretas fortrinnsvis oralt, for eksempel ved innlemmelse av antibiotikum A16884 eller et salt i dyreføde, ved administrering av tabletter, medisin etc. inneholdende A16884 eller et salt, eller på andre måter. Generelt er doser fra 1 til 500 milligram pr. kg eller mer legemsvekt effektive i enkeltdose administrering. Hvis antibiotikum A16884 eller et-salt derav tilføres som

en bestanddel av regulær føde, gir konsentrasjoner på fra 0,001

til 0,05% eller mer gode resultater. Et foretrukket konsentrasjons-område for antibiotikum A16884 eller et salt derav i føde er fra 0,01 til 0,05%.

Den anthelmintiske aktivitet av antibiotikum A16884

er illustrert ved følgende forsøk.

I et første forsøk ble antibiotikum A16884-monoammoniumsalt administrert i en enkel dose til hver av to mus infisert med Aspiculuris tetraptern og Syphacia obvelata (nålormer). Dosen var 500 milligram antibiotikum A16884-monoammoniumsalt pr. individuelt dyrs kroppsvekt administrert som en suspensjon av fysiologisk salt-lake inneholdende 0,125% metylcellulose som suspenderingsmidde1.

En kontrollgruppe mus infisert med Aspiculuris tetraptera og Syphacia obvelata ble anvendt ved forsøket. Begge grupper ble holdt under normale laboratoriebetingelser i 48 timer etter dosering av den be-handlede gruppe. Alle mus ble så slaktet og undersøkt for bestemmelse av nærvær av og antall av nålormer, hvilket er angitt i den følgende tabell:

I et annet forsøk ble antibiotikum A16884-monoammoniumsalt blandet med standard museføde for oppnåelse av et flertall be-handlede føder inneholdende antibiotikum A16884-monoammoniumsalt i - konsentrasjoner på 0,005, 0,01 og 0,05 vektprosent. Føden ble brukt som dietter for separate grupper av mus, fem mus pr. gruppe.

Ca. 24 timer etter inntak av føden ble musene infisert med Ascaris lumbrigoides var. suum. Alle grupper ble matet med deres respektive føde og holdt under normale laboratoriebetingelser for et tidsrom av ti døgn, hvoretter alle mus ble tatt av fra mating. Den ellevte dag ble alle mus slaktet og lungene undersøkt for bestemmelse av nærvær av og i tilfelle nærvær antall lesjoner av Ascaris lumbricoides var. suum.

Nivået av antibiotikum Al6884-monoammoniumsalt i dietten og det gjennomsnittlige antall lungelesjoner pr. dyr i hver gruppe er angitt i den følgende tabell:

Antibiotikum A16884, som monoammoniumsaltet, ble undersøkt for kontrollen av plantepatogene bakterieorganismer. Ved dette forsøk ble antibiotikum A16884-monoammoniumsaltet anvendt i en vandig dusj ved en konsentrasjon på 400 deler pr. million ferdig sammensetning. 30 døgn gamle tomatplanter ble brukt ved vurderingen, 2 planter i hver potte. Plantene i en potte ble behandlet med den ovenfor beskrevne løsning, fikk tørke i luft og ble så inokulert med et medium inneholdende en aktiv kultur av Pseudomonas solanacearum. Plantene i den annen potte ble dusjet med en vandig dusj løsning identisk med den ovenfor beskrevne behandlings-løsning, men uten antibiotikum, som blindprøve. Plantene som tjente som blindprøve, ble deretter likeledes inokulert. Alle plantene ble holdt i 24 timer i et fuktig rom, deretter fjernet fra rommet og holdt i syv døgn under gode dyrkningsforhold. Ved slutten av denne periode ble alle plantene undersøkt for bestemmelse av nærvær, og i tilfelle, graden av infeksjon. Plantene behandlet med antibiotikum A16884-monoammoniumsalt var fullstendig fri for sykdoms-symptomer foranlediget av Pseudomonas solanacearum, mens blind-prøveplantene derimot oppviste utstrakte symptomer som kunne til-skrives Pseudomonas solanacearum.

Sammenligninqsforsøk

Cephalosporin C og A16884 ble samtidig undersøkt in vitro mot en rekke arter og in vivo mot Escherichia coli. Begge undersøkelsesmetoder var av vanlig type. De oppnådde data ved in vivo-forsøkene er som følger:

Det samme aktivitetsmønster ble oppnådd ved in vitro-undersøkelsen:

Antibiotikum A16884 ble videre funnet å være bedre enn Cephalosporin C mot to andre organismer:

Fremstilling og isolering av Cephalosporin C er beskrevet i US-patenter 3.093.638, 3.184.454 og 3.467.654. Videre er det også en omfattende beskrivelse av dette i kapittel 1 av "Cephalosporins and Penicillins" av Edwin H. Flynn (Academic Press, N.Y., 1972) .

Antibiotikum A16884 fremstilles ved å dyrke en

nylig funnet og hittil ubeskrevet organismestamme isolert fra jordprøver fra Syd-Amerika.

Organismen ble isolert fra ovennevnte jordprøver ved

å suspendere p®6sjoner av jordprøvene i sterilt, destillert vann og ved å stryke ut suspensjonene på næringsagar. De sådde nærings-agarplater ble inkubert ved 25-35°C i flere døgn. Ved slutten av inkubasjonstiden ble kolonier av den antibiotikum A16884-produser-ende organisme ved hjelp av en steril platinaøse overført til agar-skråkulturer. Agar-skråkulturene ble så inkubert for tilveiebring-else av passende mengder inokulat for fremstilling av antibiotikum A16884.

Actinomyceten brukt i henhold til oppfinnelsen for fremstilling av antibiotikum A16884 har blitt betegnet som en stamme av Streptomyces lipmanii Waksman og Curtis.

Den nye organisme som er istand til å produsere antibiotikum A16884 har blitt plassert som permanent depositum uten re-striksjoner med hensyn til tilgjengelighet i kultursamlingen i Northern Utilization Research and Development Division, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture (tidligere Northern Regional Research Laboratories), Peoria, Illinois 61604, og er til-gjengelig for almenheten under kulturnummeret NRRL 3584.

Streptomyces lipmanii NRRL 3584's karakteristika er

gitt i de følgende tabeller. Fremgangsmåten anbefalt av internatio-nal Streptomyces Project (Shirling m.fl.: "Methods for Characteri-zation of Streptomyces Species", Intern. Bull. Systematic Bacteriol. 16: 313-340 (1966)) for karakteriseringen av Streptomyces-arter har vært brukt sammen med supplerende forsøk. Fargebéteghelser ble fastsatt i henhold til ISCC-NBS-metoden beskrevet av Kelly m.fl. i "The ISCC-NBS Method of Designating Colors and a Dictionary of Color Names" (U.S. Department of Commerce Circ. 553, Washington, D.C., 1955) . Tallene i parenteser refererer seg til Tresner og Backus fargeserier (Tresner m.fl. "System of Color Wheels for Streptomyces Taxonomy", Appl. Microbiol. 11: 335-338 (1963)) og fargetabellbetegnelser er understreket. Maerz og Pauls fargebeteg-nelser (Maerz m.fl.: "Dictionary of Color (McGraw-Hill Book Co., Inc., New York, 1950) er angitt i parenteser. Kulturer ble dyrket ved 30°C i 14 døgn hvis ikke annet er angitt.

Karakteristika for den anvendte kultur er meget like de som nylig er publisert (Shirling E.B. og D. Gottlieb, 1968. Co-operative description of type cultures of Streptomyces. II. Species description from first study. Intern. Bull. Systematic Bacteriol. 18: 69-189) for S. lipmanii. Den adskiller seg fra S. lipmanii ved utnyttelsen av visse karbonkilder og også ved farven på glycerol-asparagin agar. Arter som ligner på S. lipmanii omfatter S. fellus, S. flavovireus, S. griseolus og S. halstedii.

Som ovenfor nevnt fremstilles antibiotikum A16884 ved dyrkning av NRRL 3584. Kulturmediet anvendt ved fremstilling av antibiotikum A16884 ved dyrkning av den ovenfor identifiserte organisme kan være hvilket som helst av flere media, idet, som det vil fremgå av de ovenfor beskrevne utnyttelsesforsøk, organismen er istand til å utnytte forskjellige energikilder. Av produksjonsøko-nomiske grunner, maksimalt utbytte av antibiotikum og lettheten ved å isolere antibiotikumet foretrekkes imidlertid visse relativt enkle næringskilder. Media som er brukbare ved fremstilling av antibiotikumet omfatter for eksempel.en assimilerbar karbonkilde som glukose stivelse glycerin, melasse, dekstrin og lignende.

Den foretrukne karbonkilde er glukose. Ytterligere anvendbare media omfatter en assimilerbar nitrogenkilde som soyabønnemel, faststoffer som maisstøp, gjær, bomullsfrømel, kjøttekstrakt, peptoner (kjøtt eller soyabønner), kasein, aminosyreblandinger og lignende. Foretrukne nitrogenkilder er peptoner, soyabønnemel, aminosyreblandinger og lignende. Blant uorganiske næringssalter som er istand til å gi natrium-, kalium-, ammonium-, kalsium-, fosfat-, sulfat-, klorid-, karbonat- og lignende ioner.

Små mengder elementer nødvendige for optimal vekst

og utvikling av organismen brukt for fremstilling av antibioti-

kum A16884 kan også innlemmes i kulturmediet. Slike sporelemen-

ter opptrer vanligvis som forurensninger i de andre bestanddel-

ene i mediet i mengder tilstrekkelig til å oppfylle vekstkrave-

ne til actinomyceten anvendt i foreliggende oppfinnelse.

Den opprinnelige pH i kulturmediet kan variere. Det er imidlertid funnet ønskelig at mediets opprinnelige pH ligger mellom 6,5 og 7,2. Som iakttatt ved andre actinomyceter, øker pH i mediet gradvis under organismens vekstperiode for fremstillingen av antibiotikumet og kan oppnå et nivå på fra 6,7 til 7,5 og derover, idet den endelige pH i det minste er avhengig av mediets opprinnelige pH, tilstedeværende puffere i mediet og tidsrommet for organismens vekst.

Neddykket, aerobe dyrkningsbetingelser i sterile be-holdere velges for fremstilling av antibiotikum A16884. Mediet i den sterile beholder kan inokuleres med en sporesuspensjon, men på grunn av vekstforsinkelsen ved anvendelse av en sporesuspensjon som inokulat, foretrekkes en vegetativ form for dyrkingen. Ved på denne måte å unngå vekstforsinkelsen, oppnåes en mer effektiv utnyttelse av dyrkningsutstyret. Det er følgelig ønskelig først å fremstille et vegetativt inokulat av organismen ved å inokulere en relativt liten mengde av kulturmediet med organismens sporeform og når et ungt, aktivt, vegetativt inokulat er oppnådd, overføres det vegetative inokulat aseptisk til den store beholder. Mediet hvori det vegetative inokulat er fremstilt, kan enten være det samme eller forskjellig fra det som anvendes for fremstilling av antibiotikum A16884 i stor målestokk.

Organismen som produserer antibiotikum A16884, kan vokse over et bredt temperaturområde, mellom 25 - 37°C. Optimal produksjon av A16884 synes å opptre ved temperaturer på 26 - 30°C. Generelt opptrer maksimal produksjon av antibiotikumet innen ca. 36-72 timer etterinokulering av kulturmediet.

Som vanlig ved aerobe, neddykkete dyrkningsprosesser, blåses steril luft gjennom kulturmediet. For effektiv vekst av . organismen og antibiotikum Al6884-produksjon er volumet av anvendt • luft i beholderen for fremstilling av A16884 fra 0,2 til 0,4 volumdel luft pr. minutt pr. volumdel kultur. Det foretrukne volum er 0,40 volumdel luft pr. minutt pr. volumdel kulturmedium.

Konsentrasjonen av antibiotikumaktivitet i kulturmediet kan lett følges under dyrkningsperioden ved å undersøke prøver av kulturmediet med henblikk på dets hemmende aktivitet

overfor veksten av organismer som man vet vil bli hemmet ved nær-

vær av antibiotikum A16884. Organismene Sarcina lutea og Salmonella gallinarium er funnet å kunne brukes for dette formål. Undersøkelsen av prøvene kan utføres ved hjelp av den kjente turbidometriske eller kopp-platemetoden.

Generelt opptrer maksimal produksjon av A16884 innen ett til tre døgn etter inokulering av kulturmediet i neddykket, aerob dyrkning eller rystekolbedyrkningsmetoder.

Antibiotika-aktiviteten frembragt under fermenteringen av A16884 opptrer i antibiotikakulturvæsken. Følgelig er isolerings-teknikken anvendt ved fremstillingen av A16884 utformet for å oppnå maksimal utvinning av antibiotikumet fra kulturvæsken. Således fjer-nes for eksempel myceliet og uløste faststoffer fra fermenterings-kulturvæsken på vanlig måte, som for eksempel filtrering eller sentrifugering, og antibiotikumet A16884 kan utvinnes fra den filtrerte eller sentrifugerte kulturvæske ved anvendelse av ekstraksjons- eller adsorpsjonsteknikk.

For utvinning av A16884 ved adsorpsjon kan anvendes forskjellige adsorpsjonsmidler og ionevekslerharpikser, for eksempel kull, silikagel, aluminiumoksyd og ionevekslerharpikser. " Antibiotikum A16884 oppnådd fra fermentering kan enten være i amfoter form eller saltform avhengig av fermenteringsbetingelsene. Uavhengig av hvilken form kan det adsorberes på ett av ovennevnte eller lignende adsorpsjonsmidler fra løsning i et passende løsningsmiddel. Det adsorberte antibiotikum A16884 eller salt kan så elueres fra adsorpsjonsmidlet ved passende elueringsteknikk, slik som ved vasking av adsorpsjonsmidlet hvorpå A16884 eller dets salt er adsorbert, med et løsningsmiddel. Hvor eluering utføres ved vasking med et løs-ningsmiddel, f.eks. ammoniumformiat eller natriumacetat, resulterer prosessen i eluering av antibiotikum A16884 som henholdsvis ammonium-eller natriumsalt. Slike salter kan lett tilbakedannes til antibiotikum A16884 på vanlig måte. I den foregåendeutvinningsprosess kan også mikrokrystallinsk cellulose brukes som adsorpsjonsmiddel.

Andre salter av antibiotikum A16884 enn ammonium- og alkalimetallsaltene fremstilles fortrinnsvis ved vanlig omsetning av antibiotikum A16884 i ikke-modifisert, amfoter form med den respektive syre eller base. Ved fremstilling av syreaddisjonssalter om-settes således antibiotikum A1S884 med en uorganisk eller organisk syre. Representative syrer omfatter korhydrogensyre, bromhydrogen-syre, jodhydrogensyre, sovelsyre, fosforsyre, eddiksyre, benzosyre, sulfaminsyre, vinsyre, citronsyre, maleinsyre, ravsyre, askorbinsyre og glykolsyre.

Antibiotikum A16884 danner også salter med kationer ved omsetning av A16884 i ikke-modifisert, amfoter form med uorganiske baser eller salter. Eksempler på slike salter er ammonium- og sub-stituerte ammoniumsalter, alkalimetallsalter som natrium, kalium, litium, cesium, rubidium, jordalkalimetallsalter som kalsium, stron-tium og barium, og salter med andre metaller som aluminium, kobber, sink, magnesium og sølv. Med hensyn til organiske baser er identi-teten av basen ikke kritisk, skjønt en base som i vann har en numer-isk pH på 3,0 eller derover foretrekkes. Representative organiske baser omfatter benzylamin, metylamin, dietylamin, trietylamin, pro-kain, diisopropylamin, etanolamin, cykloheksylamin, dicykloheksyl-amin, difenylamin, di-n-butylamin, kinolin og pyridylamin.

Saltene av antibiotikum A16884 som er farmasøytisk akseptable, er generelt foretrukket. Imidlertid er alle salter brukbare som mellomprodukter ved fremstillingen, separasjonen og rens-ingen av antibiotikum A16884. For terapeutiske formål er enten ka-tioniske eller anioniske, farmasøytisk akseptable salter generelt ekvivalente med antibiotikum A16884, skjønt spesielle salter under tiden foretrekkes på grunn av en gunstig egenskap, slik som løselig-het, jevnført med den saltdannende halvdel.

For mer fullstendig å illustrere utøvelsen av oppfinnelsen, gjengis i det følgende en del illustrerende eksempler.

Eksempel 1

RYSTEKOLBEFREMSTILLING AV ANTIBIOTIKUM A16884

En sporekultur av Streptomyces lipmanii NRRL 3584 ble fremstilt ved dyrkning av organismen på en næringsagar-skråkultur som hadde følgende sammensetning:

pH i mediet ble regulert til 7,0 ved tilsetning av nåtriumhydroksyd

Agarskråkulturen ble inokulert med sporer av Streptomyces lipmanii NRRL 3584 og inkubert i 6 døgn ved 30°C. Agarskråkulturen ble så dekket med sterilt, destillert vann og forsiktig skrapet for å fjerne sporene og cellene som en vandig suspensjon. En milliliter av den resulterende suspensjon ble brukt til inokulering av hver av 100 ml porsjoner av et vegetativt medium med følgende sammensetning:

pH i det vegetative medium ble regulert til 6,7 ved tilsetning av natriumhydroksyd.

Det vegetative inokulat ble rystet i 36 timer ved 30°C på en frem- og tilbakegående rysteinnretning med et ca. 5 cm slag ved 108 slag/min. Det således fremstilte inokulat ble brukt til fremstilling av A16884 som følger.

Et produksjonsmedium med følgende sammensetning ble fremstilt:

100 milliliters porsjoner av produksjonsmediet ble anbragt i 500 milliliters Erlenmeyer-kolber som var sterilisert ved 120°C i 30 minutter. Etter avkjøling ble hver kolbe inokulert med et 5% vegetativt inokulat. Kolben ble rystet i 72 timer ved 30°C på en roterende rysteinnretning ved 250 rpm. Under fermenteringen ble mediet luftet med steril luft ved en hastighet av 0,4 vol./vol./min. Iso-leringen ble utført i det vesentlige som gjengitt nedenfor i eks. 8.

Eksempel 2

Antibiotikum A16884 ble fremstilt i henhold til fremgangsmåten i eksempel 1, men under anvendelse av et produksjons-

medium med følgende sammensetning:

og under anvendlese av, istedenfor en roterende rysteinnretning, en frem- og tilbakegående rysteinnretning som arbeidet ved 108 slag pr. minutt.

Eksempel 3

Antibiotikum A16884 ble fremstilt som i fremgangsmåten ifblge eksempel 1 med unntagelse av., at det ble brukt et produksjonsmedium med fblgende sammensetning:

Eksempel 4

Antibiotikum A16884 ble fremstilt som i fremgangsmåten ifblge eksempel 1 med unntagelse av at det ble brukt et produksjonsmedium med fblgende sammensetning:

Eksempel 5

Antibiotikum A16884 ble fremstilt som i fremgangsmåten ifblge eksempel 1 med unntagelse av at det ble brukt et produksjonsmedium med fblgende sammensetning:

Eksempel 6

En annen sporekultur av Streptomyces lipmanii NRRL 3584 ble fremstilt ved å dyrke organismen på en nærlngsagar-skråkultur. Skråkulturen hadde i dette tilfelle fblgende sammensetning:

pH i mediet ble regulert ved tilsetning av natriumhydroksyd til 7,0.

Agar-skråkulturen ble inokulert med sporer av Streptomyces lipmanii NRRL 3584 og inkubert i 7 dogn ved 30°C, Agar-skråkulturen ble så skrapet for å fjerne sporer som ble tilsatt 2,0 ml sterilt kjbttserum. Til et sterilt lyofilt ror ble så overfort 0,1 ml av den resulterende serumsporesuspensjon. Den ble frysetbrket i form av pellets.

De såldes oppnådde pellets ble brukt til å inokulere et vegetativt medium med fblgende sammensetning:

pH i mediet var 6,7 og forble uforandret..

Eksempel 7

FREMSTILLING AV ANTIBIOTIKUM A16884 I FORSOKSANLEGG

Til et 40 liters fermenteringskar av rustfritt stål ble tilsatt 24 liter av et medium med fblgende sammensetning:

Kaldt springvann til fortynning til 25 liter

Den opprinnelige pH var 6,5 og ble ikke regulert. Mediet ble sterilisert i 30 minutter ved 120°C, avkjblt og så inokulert med et 5 % inokulat fremstilt som i eksempel 6. Fermenteringen ble utfort ved 30°C i 66 timer, luftet med steril luft med en hastighet av 0,35 vol./vol./min. og omrbrt av en mekanisk rbre-innretning som gjorde 420 omdreininger pr. minutt. Den endelige pH var 7,5»

A16884 ble utvunnet fra kulturvæsken og isolert som

angitt i eksempel 8.

Eksempel 8

ISOLERING AV UBEARBEIDET ANTIBIOTIKUM A16884 SOM M0N0AMM0NIUM-SALTET

Ca. 6o liter kulturvæske oppnådd som angitt i ek-

sempel 7, ble filtrert ved hjelp av "Hyflo Super-cel" (en di-atomé jord). Filtratet ble så fort over i en kolonne på 9,6 x 150

cm pakket med aktivkull ("Pittsburgh Cal. 12 x 40"). Kolonnen ble vasket med vann inntil effluenten var fargelbs og den aktive del adsorbert på kullet ble fjernet ved å fore 50 fa vandig ace-

ton gjennom kolonnen. Fraksjonene inneholdende den aktive del ble slått sammen, konsentrert i vakuum for å fjerne aceton, og tilfort en 5,9 x 104 cm kolonne pakket med "IRA-68"-harpiks (kom-mersiell anionvekslerharpiks som var blitt vasket med maursyre for omdannelse av harpiksen til formiatcyklusen). Kolonnen ble vasket med vann inntil effluenten var klar og fargelbs, og den aktive del ble fjernet ved vasking med 0,1 M ammoniumformiatlbs-

ning. De aktive fraksjoner ble slått sammen og fort over i en i en 4,3 x 72 cm kolonne inneholdende aktivkull ("Pittsburgh 12 x 40"). Kolonnen ble vasket med en mengde vann lik seks ganger ko-lonnens volum og den aktive del ble eluert med 30 % vandig acetonitril. De aktive fraksjoner ble slått sammen, konsentrert i

vakuum for å fjerne acetonitril, og frysetbrket. Utbyttet var 25

til 30 gram fast stoff.

Det frysetbrkete preparat ble lost 1 et minimum av

vann og tilfort en 7,2 x 60 cm kolonne pakket med mikrokrystallinsk celluloseprodukt ("Avicel") suspendert i 70 % vandig acetonitril, og som var vasket med acetonitril for tilsetningen av den aktive prove. Etter tilsetning av prbven ble kolonnen vas-

ket med ett kolonnevolum acetonitril og den aktive del eluert

med metanol. De aktive fraksjoner ble slått sammen og konsen-

trert til ca. 200 ml og den aktive del felt ved tilsetning av 10 volumdeler aceton og tbrket i vakuum. Utbyttet var 9-12 gram.

20 gram material oppnådd som ovenfor beskrevet, ble

lost i et minimum av vann og tilfort en silikagelkolonne (7,2 x

60 cm). Silikagelen (Davison Chemical type "950") var på forhånd vasket med vann og deretter med metanol og suspendert i 70 % acetonitril for pakking av kolonnen. Etter tilforing av proven ble kolonnen vasket med ett kolonnevolum acetonitril og den aktive del eluert med 70 % acetonitril. De mest aktive fraksjoner ble slått sammen, konsentrert i vakuum til torrhet og lbst i metanol og deretter felt med 10 volumdeler aceton. Bunnfallet ble filtrert, vasket med aceton og tbrket 1 vakuum. Utbyttet var 8 gram. Mindre aktive fraksjoner ga ytterligere 6 gram.

Eksempel 9

RENSING AV A16884- MONOAMMONIUMSALT

Ett gram av det frysetbrkete produkt fremstilt som beskrevet i eksempel 8, ble lost i 4 ml vann og tilfort en 2 x éo cm kolonne pakket med 175 ml silikagel type <W>950<M> i 80 % vandig acetonitril. Kolonnen ble eluert med acetonitril/vann (4:1). Elueringen ble etterfulgt av provetaking og papirkromatografi. Som resultat av elueringen ble oppnådd et flertall fraksjoner. Fraksjonene inneholdende antibiotikum A16884 som monoammoniumsalt ble slått sammen, konsentrert til torrhet, lost i et lite volum dimetylsulfoksyd, deretter i atskillige milliliter etanol og den aktive del ble felt ved tilsetning av overskudd av eter. Bunnfallet ble sentrifugert og tbrket i vakuum. Utbyttet av antibiotikum Al6884-monoammoniumsalt var 91 mg.

Eksempel 10

FREMSTILLING AV ANTIBIOTIKUM Al6884 I SYREFORM

200 mg monoammoniumsalt av A16884 ble lost i 30 ml vann og 6 ml "Dowex 50 x 12" (H+)-harpiks ble tilsatt. Blandin-gen ble omrbrt 1 40 minutter, filtrert, harpiksen vasket med vann på filtret og filtratene slått sammen. Det samlete filtrat hadde en pH på 2,7. Filtratet ble konsentrert i vakuum til ca.

1 ml, 4 ml metanol ble tilsatt og syren ble felt ved tilsetning av 40 ml aceton. Bunnfallet ble fjernet ved sentrifugering og tbrket 1 vakuum. Utbyttet var 35 mg antibiotikum A16884 i syreform. Den oppviste fblgende pKa: 3»5» 5»2 og 10,3 ved titrering i 66 % dimetylformamid. ved en begynnelses-pH på 4,5»

Eksempel 11

FREMSTILLING AV DINATRIUMSALT AV Al6884

180 mg Al6884-monoammoniumsalt ble lost i ca. 2 ml vann og pH regulert til 10 med IN NaOH. Lbsningen ble konsentrert i vakuum til lite volum, 4 ml metanol ble tilsatt og di-na tr iumsal tet felt ved tilsetning av 40 ml aceton'. Saltet ble fjernet ved sentrifugering og tbrket i vakuum. Det oppviste fol-

gende verdier av pKa: 3,9» 5»2 og 10,5 ved titrering i 66 % dimetylformamid ved. en begynnelses-pH på 10,4. Atomabsorpsjons-

analyse viste 6 % natrium.

Eksempel 12

FREMSTILLING AV ANTIBIOTIKUM A16884- HYDROKLORID

200 mg monoammoniumsalt av A16884 ble lbst i 2 ml

vann og pH regulert til 2,0 med IN HC1. Reaksjonsblandingen ble fortynnet med 5 ml metanol og 50 ml aceton ble tilsatt for å

felle ut det forbnskete antibiotikum Al6884-hyd.roklorid. Det ble separert ved sentrifugering, vasket med aceton og tbrket i va-

kuum. Analyse viste 5>74 % klor og elektrometrisk titrering i 66

% dimetylformamid ved en begynnelses-pH på 5»0 viste titrerbare grupper ved 3,9» 5»2 og 10,4.

Eksempel 13

ISOLERING AV RÅTT ANTIBIOTIKUM A16884 SOM MONONATRIUMSALT

Ca. 6o liter kulturvæske oppnådd som angitt i ek-

sempel 7, ble filtrert ved hjelp av "Hyflo-Super-cel"-filtre-ringshjelpemiddel. Filtratet ble fort over i en 9»6 x 150 cm ko-

lonne pakket med aktivkull ("Pittsburgh Ca. 12 x 40"). Kolonnen ble vasket med vann og den absorberte aktive del ble fjernet ved å fore 50 % vandig aceton gjennom kolonnen. Fraksjonene inneholdende den aktive del ble slått sammen, konsentrert i vakuum for å fjerne aceton og tilfort en 5>9 x 104 cm kolonne pakket med "IRA-68" (acetat-cyklus). Kolonnen ble vasket med vann inn-

til effluenten var klar og fargelbs, og den aktive del ble fjer-

net ved vasking med 0,1 M natriumacetat. De aktive fraksjoner ble slått sammen og fort over i en 4,3 x 72 cm kolonne pakket med "Pittsburgh 12 x 4o"-kull. Kolonnen ble vasket med seks gan-

ger kolonnevolumet av vann og den aktive del eluert med 30 % vandig aceton. De aktive fraksjoner ble slått sammen, konsentrert

i vakuum for å fjerne aceton og frysetbrket. Utbyttet var 20 -

30 g. Analyse viste 2,5 % natrium.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av antibiotikum A16884

   med formelen

   eller et salt derav, karakterisert ved at Streptomyces lipmanii NRRL 3584 dyrkes i et kulturmedium inneholdende assimilerbare kilder for karbon, nitrogen og uorganiske salter under neddykkede, aerobe betingelser, og at det dannede antibiotikum A16884 isoleres, eventuelt i form av et salt.