NO136981B - Fremgangsm}te for fremstilling av antibiotikum a28695 a og b. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte

til fremstilling av nye antibiotika.

De angitte antibiotika er vilkårlig betegnet som

A28695A og A28695B. De fremstilles sammen med andre ikke identifiserte antibiotiske substanser ved å dyrke mikro-organismen Streptomyces albus NRRL 3883 i et vandig næringsmedium under

submerse, aerobe fermenteringsbetingelser inntil man får en vesentlig mengde antibiotisk aktivitet. Antibiotisk faktor A28695A fremstilles i større mengder enn antibiotikum A28695B.

De andre antibiotiske substanser som fremstilles ved fermenter-

ingen, finnes i mindre mengder slik at de ikke er lønnsomme å gjenvinne.

Antibiotika A28695A som er isolert fra A28695-blanding av antibiotika oppnås som et hvitt, krystallinsk blandet natrium-kaliumsalt med et smeltepunkt på 161 - 165°C.

Det blandete natrium-kaliumsalt av antibiotikum A28695A er uløselig i vann, lite løselig i metanol, løselig i eter og løselig i estere slik som metylacetat, etylacetat og liknende; ketoner slik som aceton og metyletylketon ; halogenerte hydrokarboner slik som kloroform; og aromatiske hydrokarboner slik som benzen og toluen. Antibiotikum A28695A er stabilt i løs-ning ved pH-verdier.som er høyere enn pH 4,0 ved temperaturer på opptil 2 7°c. Den spesifikke dreiningsevne, [^1^ » av det blandete natrium-kaliumsalt av antibiotikum A28695 er +14,07° (C=l, metanol).

Det infrarøde absorpsjonsspektrum av antibiotikum A28695A som det blandete natrium-kaliumsalt i kloroformløsning er vist i fig. 1. De følgende atskillbare absorpsjonsmaksima i spektret finner man i området 2,0 - 15,0 mikron: 3,1-3,3, 3,4, 3,47, 6,24, 6,84, 7,00, 7,25, 7,37, 7,49, 7,68, 7,78, 8,1, 8,47, 8,61, 8,95, 9,11, 9,20, 9,42, 9,5, 9,80, 9,98, 10,24, 10,54, 10,87, 11,09, 11,5 og 11,66 mikron. Antibiotikumet har intet karakteristisk ultraviolett absorpsjonsmønster.

Et røntgendiffraksjonspulverdiagram av krystallinsk blandet natrium-kaliumsalt av antibiotikum A28695A ved å anvende vanadiumfiltrert kromstråling og en bølgelengde på 2,2896Å for å beregne avstandene mellom planene, gir de følgende verdier:

Den frie syren av A28695A er et hvitt, krystallinsk

fast stoff som smelter ved ca. 97 - 99°C. Elementær-analyse av den frie syreformen av antibiotikum A28695A gir: 63,31% karbon,

8,83% hydrogen og 28,03% oksygen. Massespektraldata av anti-

biotikum A28695A indikerer en omtrentelig molekylvekt på 834.

Elektrometrisk titrering av natriumsaltet av antibiotikum

A28695A i 66% vandig etanol viser tilstedeværelsen av én titrer-

bar gruppe som har en pKa-verdi på 5,51. Molekylvekten av det løselige salt, bestemt fra titreringsdata, er ca. 874. Molekyl-

vekten av den frie syre vil derfor være ca. 852. Denne verdien er høyere enn verdien fra massespektraldata. Verdien beregnet fra massespektraldata er sannsynligvis den mest nøyaktige på

grunn av unøyaktighetene i titreringsmetoden. Kjernemagnetisk resonans spektraldata indikerer tilstedeværelsen av 4 metoksy-

grupper i antibiotikum A28695A.

Det blandete natrium-kaliumsalt av antibiotikum

A28695B er en hvit, krystallinsk forbindelse som smelter ved

170 - 172°C. Løselighet og stabilitetsmønsteret av antibiotikum-

et likner på mønsteret til det blandete natrium-kaliumsalt av antibiotikum A28695A.

Det infrarøde absorpsjonsspektrum av A28695B som

blandet natrium-kaliumsalt i kloroformløsning er vist i fig. 2.

De atskillbare bånd i det infrarøde spektrum i området 2,0 - 15,0 mikron er som følger: 3,0, 3,4, 3,47, 6,24, 6,85, 7,01,

7,26, 7,3, 7,68, 7,78, 8,1, 8,58, 8,82, 8,95, 9,11, 9,19, 9,45,

9,59, 9,82, 10,04, 10,28, 10,55, 11,10, 11,24 og 11,65 mikron.

Antibiotikumet har intet karakteristisk ultrafiolett absorpsjonsmønster.

25

Den optiske dreining, [ a] ^ , av det blandete natrium-kaliumsalt av antibiotikum A28695B er +10,1° (C=l, metanol).

Syreformen av antibiotikum A28695B er et hvitt,

krystallinsk fast stoff med et smeltepunkt på 122-124°C. Mikro-analyse gir den følgende elementæranalyse av syreformen A28695B: 60,49% karbon, 9,15% hydrogen og 31,32% oksygen. Kjernemagnetisk

resonansspektra indikerer at antibiotikum A28695B inneholder tre metoksygrupper. Massespektraldata av antibiotikum A28695B indikerer en omtrentelig molekylvekt på 846. Elektrometrisk titrering av antibiotikum A28695B som natriumsalt i 66% vandig etanol viser tilstedeværelsen av en titrerbar gruppe med en pKa-verdi på 5,9. Molekylvekten av natriumsaltet av antibiotikum A28695B, beregnet fra titreringsdata, er ca. 877. Molekylvekten av den frie syren av antibiotikum A28695B vil derfor være ca. 855.

Et røntgenpulverdiffraksjonsdiagram av den krystal-linske antibiotikum A28695B-syren ved å anvende vanadiumfiltrert kromstråling og en bølgelengde på 2,2895 Å for å beregne avstand-en mellom planene, gir de følgende verdier:

Papirkromatografiske data av blandete natrium- og kaliumsalter av A28695A og B er vist ved hjelp av Rf-verdier i tabell I nedenfor. Verdiene ble oppnådd i det angitte løsnings-middelsystem, ved å anvende i hvert tilfelle "Whatman No. 1 paper". Beliggenheten av antibiotika på kromatogrammet ble bestemt ved hjelp av bioautograf ved å anvende Bacillus subtilis som spororganisme.

Tynnsjiktskromatografi på silikagelplater med en vanil-lindusj som spormiddel anvendes også for å identifisere og at-skille antibiotikum A28695A og B. Kromatografisk oppførsel på silikagel er vist nedenfor.

De nye antibiotika ifølge foreliggende oppfinnelse har en hemmende virkning på veksten av mikrobiologiske organismer, både bakterier og fungi, som er patogene overfor dyr og plante-vekst og er derfor nyttige for å undertrykke veksten av slike organismer. Minimumhemmende konsentrasjon av de blandete natrium-

og kaliumsalter av både antibiotika A28695A og A28695B bestemt ved hjelp av agarfortynningsprøven, fremgår av tabell III.

Når både antibiotika A28695A og A28695B analyseres ved hjelp av

en skive-plateprøve, viser begge atskillbare soner av hemming av mikroorganismene Bacillus subtilis, Mycobacterium avium og Sarcina lutea.

Antibiotikumet A28695B, når det undersøkes i en virusvev-kultursystem, viser aktivitet mot de følgende virus: kukoppevirus, poliovirus III, Semliki "Forest"-virus, herpesvirus og influensa-

virus Japan 305.

Antibiotika fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse, når de prøves på planter, vil hindre utviklingen av visse plantesykdom-

mer. Når et preparat av en blanding av antibiotika A28695A og B anvendes som en dusj, er den aktiv mot melduggsykdom i bønne-planter og krongallesykdom i tomatplanter. En blanding av anti-

biotika A28695A og B er også aktiv mot plantevirussykdommer, sydstats-bønnemosaikkvirus og mais-dvergvirus, når de påføres inspiserte planter som en dusj eller ved gjennombløting.

I tillegg til de tidligere virkninger har A28695-

antibiotika også insektisid virkning. F.eks. dødeligheten av husfluer i kontakt med løsninger av antibiotikum A28695A eller antibiotikum A28695B ved en konsentrasjon på 100 ppm er 88%.

Ved en konsentrasjon på 250 ppm er dødeligheten 99%.

Enda en annen viktig egenskap av A28695-antibiotika er

deres evne til å hindre utviklingen av kokkidiose i fjærkre. De

observerte resultater når hvert antibiotikum er tilsatt til foret til kyllinger som er infisert med en kombinert infeksjon av Eimeria tenella, Eimeria necatrix, Eimeria maxima, Eimeria acervulina er vist i den følgende tabell.

De observerte resultater med kyllinger som er infisert med E. tenella er vist i tabell V.

Den akutte giftighet av antibiotikum A28695A i mus, uttrykt som LD5Q/ er ca. 41,1 mg/kg legemsvekt når antibiotikumet administreres oralt. LD5Q av antibiotikum A28695B når det administreres oralt til mus, er ca. 43,5 mg/kg legemsvekt.

Som det vil fremgå mer detaljert i det følgende, øker de individuelle A28695-antibiotika og blandinger derav karbo-hydratutnyttelsen når det gjelder drøvtyggere og gir derved for-bedret forutnyttelse for slike dyr. Som vist ved in vitro forsøk utført med mavesaft, påvirker disse antibiotika den flyktige, frie fettsyreblandingen i maven. Disse antibiotika øker spesielt mengden av propionat som er tilgjengelig for metabolisme for drøvtyggere. Propionat utnyttes mer effektivt enn acetat som er tilstede i større mengder i ubehandlete dyr.

En annen karakteristisk egenskap av A28695-antibiotika er deres evne til å danne komplekser med en-verdige kationer. Ved eksperimenter for å bestemme hvor spesifikke disse var overfor ioner, viste antibiotikum A28695A seg å være spesifikk overfor kaliumioner og rubidiumioner, mens antibiotikum A28695B viste seg å være spesifikk overfor natrium- og kalium-ioner. Anvendelsen av ione-spesifikke elektroder er viktig ved mange kjemiske analyser. På grunn av deres særegne egenskaper er antibiotika A28695A og B egnet som komponenter for ione-spesifikke elektroder.

Kompleksene som fremstilles av A28695-antibiotika med en-verdige kationer, er lipoidløselige og vil derfor lette transporten av ioner gjennom membraner. Antibiotika som har disse egenskaper betegnes vanligvis som ionoforer.

Virkningen av A28695-antibiotika på ione-transport kan måles i et system som anvender rottelever-mitokondria og den antibiotiske valinomycin. Begge antibiotika A28695A og A28695B kaster om den stimulerende virkning av valinomycin på hydrolysen av adenosintrifosfat i rottelever-mitokondria.

De nye antibiotika ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilles ved å dyrke en hittil ikke beskrevet stamme av en aktinomycetorganisme under submerse, aerobe betingelser i et kulturmedium inntil kulturmediet inneholder vesentlig antibiotisk aktivitet. Disse antibiotika kan gjenvinnes fra kulturmediet ved å anvende forskjellige isolerings- og rense-metoder som er kjent på området.

Aktinomyceten.som anvendes ved fremstillingen av antibiotika ifølge foreliggende oppfinnelse er blitt identifisert som en stamme av Streptomyces albus (Rossi-Doria) Waksman og Henrici. Organismen er deponert i den permanente kultursamling hos Northern Utilization Research and Development Division, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, og er tilgjengelig for publikum under kodetallet NRRL 3883. Stammen ble isolert fra en jord-prøve fra Curacao (Hollandsk antiller). Deler av jordprøven ble suspendert i sterilt, deionisert vann og suspensjonen ble strøk-et på næringsagarplater. Platene ble inkubert ved 25-35°C inntil man fikk vekst og koloniene av antibiotikum A28695-produserende organismer ble overført til skråagarplater ved hjelp av en steril platinaøse. Skråagarplatene ble deretter inkubert for å gi et passende podestoff for (fremstillingen av A28695.

Metodene som ble anvendt ved de taksonomiske undersøk-elser av A28695-fremstillende kultur, NRRL 3883, er de som er anbefalt av International Streptomyces Project [Shirling and Gottlieb, Intern. Bull. Systemactic Bacteriol., 16:313-340

(1966)], sammen med visse ytterligere prøver. Resultaténe av de taksonomiske undersøkelser fremgår av det følgende avsnitt. Fargenavn er gitt etter Inter-Society Color Council - National Bureau of Standards (ISCC-NBS) method (Kelly og Judd, ISCC-NBS Method of Designating Colors and a Dictionary of Color Names, U.S. Dept. of Commerce Circ. 553, Washington, D.C., 1955). Bok-stavene i parentes refererer seg til fargeblokker og understrek-ne tall og bokstaver til fargeprøver i Tresner og Backus farge-serier [Appl. Microbiol. 11:335-338 (1963)]. Fargeblokkbetegn-elsene til Maerz og Paul, [Dictionary of Color, McGraw-Hill Book Co., Inc., New York (1950)], er angitt i klammer. ISP-tall refererer seg til International Streptomyces Project media, Shirling og Gottlieb, (tilgjengelig fra Difco Laboratories, Detroit, Michigan). Observasjonene ble gjort ved å følge inkub-eringen ved 30°C i 14 dager dersom intet annet er angitt.

Mikroskopisk morfologi, kulturkarakteristika

og fysiologi

Tabell VI oppsummerer resultatene av karbonutnyttelse-forsøkene utført på A28695-fremstillende kulturer, NRRL 3883.

i

De symboler som anvendes i tabellen er:

+ = positiv utnyttelse

( + ) = sannsynlig utnyttelse

(-) = tvilsom utnyttelse

= ingen utnyttelse

A28695-produserende kultur (NRRL 3883) synes å være meget lik stammen Streptomyces albus ATTC 3004 beskrevet av Lyons og Pridham, J. Bacteriol-, 83:370-380 (1962). Det finnes forskjeller når det gjelder utnyttelsen av fire karbonkilder og ved veksten over 3 7°C. Kulturen NRRL 3883 som anvendes ifølge foreliggende oppfinnelse likner også på NRRL 3384, som fremstiller antibiotikum A204 [belgisk patentnr. 728,382 (8-13-69) ]; de observerte forskjeller indikerer at NRRL 3384 fremstiller noe lengre sporer, gjør ikke gelatin flytende og vokser ved noe høy-ere temperatur.

Kulturmediet som anvendes ved fremstilling av antibiotika A28695A og B ved dyrking av den ovenfor beskrevne organisme, kan være hvilken som helst av en rekke media, siden det fremgår av de ovenfor nevnte utnyttelseprøver at organismen er

i stand til å utnytte forskjellige energikilder. For å oppnå god økonomi, maksimalt utbytte av antibiotikum og lettvint isolering av antibiotikumet, foretrekkes imidlertid visse kulturmedier som inneholder forholdsvis enkle næringskilder. De medier som er

egnet ved fremstillingen av antibiotika A28695A og B omfatter f.eks. en assimilerbar kilde for karbon, slik som glukose, man-nitol, fruktose, oppløselig stivelse, dekstrin, molasse, brunt sukker og liknende. Foretrukne kilder for karbon er glukose og dekstrin. Brukbare medier omfatter dessuten en kilde for assimilerbar nitrogen slik som havremel, oksekjøttekstrakt, hydro-

lysert kasein, maisstøpevæske, gjærekstrakt, soyabønnemel,

peptoner (kjøtt eller soya) og liknende. De nitrogenkilder som foretrekkes er soyabønnemel og syrehydrolysert kasein.

Mineralsalter, f.eks. de som tilveiebringer kalsium-, magnesium-, natrium-, kalium-, kobolt-, klorid-, sulfat- og karbonat-ioner og en kilde for vekstfaktorer, slik som gjær eller gjærekstrakt, kan innføres i mediet med gunstige resul-

tater .

Som tilfelle er med mange mikro-organismer antas det

å være ønskelig å innføre de såkalte "sporeelementer" i kultur-

mediet for dyrking av aktinomyceten NRRL-3883. Slike sporele-

menter tilføres vanligvis som forurensninger som forekommer til-

feldig i de andre bestanddeler som tilsettes mediet.

Fremstillingen av forbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse kan utføres ved en hvilken som helst temperatur som bidrar til tilfredsstillende vekst av mikro-organismen, f.eks.,

mellom ca. 26 og 40°C og fortrinnsvis mellom ca. 26-30°C. Van-

ligvis får man optimal produksjon av antibiotika i løpet av ca.

2-5 dager.

Den opprinnelige pH av kulturmediet kan variere meget. Imidlertid har det vist seg ønskelig at den opprinnelige pH av mediet er mellom 6,5 og 7,2. Som det er iakttatt for andre aktinomyceter øker pH-verdien i mediet gradvis under vekstperiod-

en for organismen og kan nå en verdi fra ca. 7,0 - ca. 8,0 eller høyere, idet den resulterende pH-verdi i det minste delvis er avhengig av den opprinnelige pH-verdien av mediet, puffrene som er tilstede i mediet og den tiden som organismen får lov til å

vokse. Små mengder av antibiotikumet oppnås passende ved hjelp av rysteflasker og overflatekulturer i flasker. For fremstilling av større mengder av antibiotika A28695 er det imidlertid fore-

trukket å anvende submerse, aerobe kulturer i store tanker.

For å unngå en utpreget vekstforsinkelse av antibio-

tikumet og den tilsvarende dårlige utnyttelse av utstyret, er det foretrukket å anvende vegetativ istedenfor sporeformen av organismen for poding av mediet i fremstillingstankene. I over-ensstemmelse med dette fremstilles først et vegetativt podestoff av organismen ved å pode en relativt liten mengde av kultur-

mediet med sporeformen av organismen, og når et ungt, aktivt, vegetativt podemateriale er oppnådd, overføres det til store produksjonstanker. Det medium hvori det vegetative podemateriale

fremstilles, kan enten være det samme eller forskjellig fra det medium som anvendes for fremstillingen av antibiotikumet.

Som det er vanlig ved prosesser som omfatter submers, aerob kultur, blåses steril luft gjennom kulturmediet. For effektiv vekst av organismen og antibiotikaproduksjonen er volumet av luften som anvendes ved tankfremstilling av antibiotika A28695A og A28695B, fortrinnsvis fra o,l volumdel luft og opp-over pr. minutt pr. volumdel kulturmedium. Effektiv vekst og optimale utbytter av antibiotika A28695A og A28695B oppnås når det anvendte luftvolum er minst 3/10 volumdel luft pr. minutt pr. volumdel kulturmedium.

Konsentrasjonen av antibiotisk aktivitet i kulturmediet kan lett følges under fermenteringsperioden ved å undersøke prøver fra kulturmediet på deres hemmende virkning mot veksten av en organisme som man vet hemmes i nærvær av antibiotika A28695A og A28695B. Anvendelsen av organismen Bacillus subtilis er fun-net å være egnet for dette formål. Undersøkelsen kan utføres ved velkjente turbidometriske eller skive/plate-metoder.

En rekke forskjellige fremgangsmåter kan anvendes ved isoleringen og rensingen av antibiotika A28695A og A28695B, f.eks. løsningsmiddelekstraksjon, anvendelsen av adsorberings-midler og kromatografiske kolonner. Løsningsmiddelekstraksjons-metoder foretrekkes ved kommersiell fremstilling idet disse krev-er mindre tid og er billigere, og man får høyere utbytte ved gjenvinningen.

Den antibiotiske aktivitet er lokalisert i myceliet så vel som i fermentasjonsvæsken. Myceliet kan atskilles fra fermenteringsvæsken ved filtrering under anvendelse av filtrer-ingshjelpemidler og både myceliekaken og det fermenterte mediet som er filtrert, kan ekstraheres med et egnet organisk løsnings-middel for å gjenvinne A28695-aktivitet. Alternativt kan den ufiltrerte fermenteringsvæsken ekstraheres med et organisk løs-ningsmiddel for å gjenvinne den antibiotiske aktivitet. Egnete ekstraksjonsløsningsmidler omfatter f.eks. etylacetat, amyl-acetat, butanol, pentanol, etanol, metanol eller kloroform. Antibiotika-ekstraktene fordampes under redusert trykk for å oppnå en uren blanding av A28695-antibiotika som en oljeaktig rest. De gjenvunnende antibiotika er tilstede i form av deres blandete natrium-kaliumsalter. Ytterligere rensing av antibiotikabland-ingen kan utføres ved hjelp av kromatografi av den oljeaktige

i

resten over et egnet adsorberingsraiddel, slik som aktivert karbon eller silikagel. Et aktivert karbon-adsorberingsmiddel slik som "Pittsburgh Carbon" er et foretrukket adsorberingsmiddel for rensing av A28695-antibiotikablandingen.

De forskjellige antibiotika kan atskilles fra blandingen ved ytterligere kromatografi. Blandingen av natrium/kaliumsalter av A28695A og B kan således oppløses i et løsningsmiddel-system som består av benzen:etylacetat (9:1) og den oppnådde løsningen kan kromatograferes på en kolonne som er pakket med silikagel. Kolonnen elueres deretter med den samme løsningsmiddel-blanding og man samler opp en rekke fraksjoner. Forløpet av fraksjoneringen styres ved å undersøke de individuelle fraksjoner på tynnsjiktskromatogrammer eller papirkromatogrammer. Fraksjon-ene som inneholder hvert individuelt antibiotikum kombineres og løsningsmidlet fjernes ved fordamping, slik at man får en hovedsakelig ren form av de atskilte antibiotika i form av deres blandete natrium-kaliumsalter.

Foreliggende oppfinnelse har en spesiell anvendelse i forbindelse med drøvtyggere som har en utviklet vom-funksjon. Unge drøvtyggere, hovedsakelig de som ikke er avvendt, fungerer som en-mavete dyr. De utnytter sitt enkle, flytende for slik som en-mavete dyr gjør. Når de unge drøvtyggere begynner å spise fast føde som inneholder cellulose, stivelse og andre karbohyd-rater, begynner vom-funksjonen å utvikles, og den mikrobiologiske populasjon i vommen begynner å øke. Etter at dyret har spist fast føde en tid, når vom-funksjonen sin fulle utvikling og fort-setter å funksjonere gjennom dyrets hele levetid.

Foreliggende oppfinnelse er anvendbar for alle drøv-tyggere, dvs. dyr som har flere maver hvorav én er vommen. Øko-nomisk viktige drøvtyggere er kveg, sau og geiter.

Det vil forstås at anvendbarheten av metoden ikke er begrenset til dyr som skal fetes eller til unge dyr som vokser. Når metoden anvendes på voksne dyr, slik som melkekyr eller avlsdyr, får man fordelene i form av redusert for-forbruk.

Dyrene må gis en mengde antibiotikum som er virksom

for vommen for å få fordelene som metoden gir. Minste mengde som er virksom, varierer avhengig av dyrenes diett, tilstand og ald-er. Et tilfredsstillende område for tilsetting er fra 0,02 mg/ kg/dag til ca. 2,0 mg/kg/dag. Det foretrukne området er fra ca. 0,05 mg/kg/dag til ca. 1 mg/kg/dag.

De følgende eksempler illustrerer fremstillingen av A28695.

Eksempel 1

Fremstilling av A28695 i rysteflaske

Den A28695-fremstillende kultur fremstilles og holdes ved like på et skråagarsubstrat som har den følgende sammensetning :

Skråsubstratet podes med A28695-fremstillende kultur, NRRL 3883, og inkuberes ved 30°C i 4-6 dager. Kulturveksten på platen dekkes med et lite volum av sterilt, deionisert vann og platen skrapes forsiktig for å gi en vandig sporesuspensjon.

1 ml av den resulterende sporesuspensjon anvendes for å pode 100 ml sterilt, vegetativt medium som har den følgende sammensetning:

Det podete, vegetative medium inkuberes ved 30°C i 24-48 timer ved hjelp av en frem og tilbakegående rystemaskin som har en slaglengde på 5 cm og som gir 108 slag pr. minutt. 5 ml av den resulterende kulturen anvendes til å pode 100 ml av sterilisert produksjonsmedium som befinner seg i en 500 ml Erlenmeyer-kolbe, idet mediet har følgende sammensetning:

Det podete medium inkuberes ved 25-3o°C i 42-72 timer på en roterende rystemaskin som kjøres ved 250 o.p.m. Ved slut-ten av inkuberingsperioden var pH ca. 7,0.

Eksempel 2

Tank- fermentering av A28695

Den A28695-fremstillende kultur fremstilles og holdes ved like på en skråagar som har den følgende sammensetning:

Mediets pH justeres til 7,0 med natriumhydroksydløs-ning. Etter dampsterilisering i autoklav ved 1-1,3 kg/cm 2 trykk i 30 minutter var pH av mediet 6,9.

Skråagaren podes med den A28695-fremstillende kultur, NRRL 3883, og inkuberes ved 30°C i 10 dager. Kulturveksten på skråagaren dekkes med en liten mengde sterilisert, deionisert vann og skrapes forsiktig for å gi en vandig sporesuspensjon.

Hver skråagar anvendes for å pode seks 250 ml flasker som inneholder 50 ml hver av sterilt, vegetativt kulturmedium som har den følgende sammensetning:

pH-verdien av mediet justeres til 6,5 med natriumhydroksydløs-ning og er uforandret etter sterilisering i autoklav ved 1-

1,3 kg/cm 2 trykk i 30 minutter.

Det podete medium inkuberes ved 30°C i 72 timer på en roterende rystemaskin som kjøres med 250 opm. 10 ml av den resulterende kultur anvendes for å pode 200 ml sterilisert, annet-trinns vekstmedium i en 1 liters kolbe og som har den samme sammensetning som beskrevet ovenfor.

Det podete medium fermenteres ved' 3o°C i 30 timer på en frem- og tilbakegående rystemaskin som kjøres med 250 opm.

200 ml av den resulterende kultur anvendes for å pode 25 liter av det følgende medium i en 40 liters fermentator:

pH av mediet er 7,2 etter sterilisering i autoklav ved 1-1,3 kg/

2

cm trykk i 30 minutter.

Det podete medium tilsettes luft i en mengde på 3/10 volumdeler luft pr. volumdel kultur pr. minutt og omrøres i en konvensjonell agitator ved 350 opm.

Fermenteringen utføres ved 30°C i 5 dager.

Eksempel 3

Isolering av antibiotikablanding

92 liter av hele fermenteringsbuljongen som er oppnådd fra en A28695-fermentering, filtreres ved hjelp av et kommersielt filterhjelpemiddel. Myceliekaken suspenderes i 25 liter metanol, og blandingen omrøres kraftig i 30T60 minutter. Blandingen filtreres og filtratet konsentreres for å fjerne metanol. Den vandige fasen som er oppnådd på denne måte, kombineres med filtratet fra den opprinnelige fermenteringsbuljongen.

Den ekstraherte myceliekaken suspenderes deretter i

2 5 liter etylacetat og suspensjonen omrøres i 30-60 minutter. Blandingen filtreres og myceliekaken kastes.

Den filtrerte buljong ekstraheres deretter to ganger med halve volumer av etylacetat. Den benyttede buljongen kastes. Etylacetat-ekstraktene kombineres med etylacetat-ekstraktet fra myceliekaken.

A28695-aktiviteten kan alternativt ekstraheres fra ikke filtrert fermenteringsmedium ved å anvende følgende fremgangsmåte: 92 liter av hele fermenteringsmediet ble omrørt med et like stort volum av etylacetat. Blandingen ble filtrert og det resulterende filtrat ble atskilt i en etylacetat-fase og en vandig fase. Den vandige fasen ble kastet og etylacetat-fasen ble beholdt og deretter kombinert med et annet ekstrakt.

Den ekstraherte myceliemassen ble deretter ekstrahert en annen gang med etylacetat. Myceliemassen ble kastet. Etyl-

i

acetatekstrakten ble kombinert med den opprinnelige ekstrakt.

De kombinerte ekstrakter ble konsentrert til en oljeaktig rest. Den resulterende oljen ble oppløst i 1 liter kloroform. Kloroformløsningen ble kjørt gjennom en 5,5 cm x 100 cm kolonne av "Pittsburgh carbon" (12 x 40 mesh) pakket i kloro-

form. Denne kolonnen ble vasket med 20 liter kloroform. Kloro-formeffluatet og vasken ble slått sammen og konsentrert til en tørr rest. 70,4 g A28695-aktivitet ble gjenvunnet.

Eksempel 4

Atskillelse av antibiotika A28695A og A28695B

30 g av rå antibiotikablanding A28695 som ble oppnådd ifølge fremgangsmåten i det foregående avsnitt, oppløses i en 9:1 blanding av benzen og etylacetat.'Løsningen kjøres gjennom en 5,5 cm x 115 cm kolonne av silikagel (Grace grade number 62, Davison Chemical, Baltimore, Maryland 21226). Adsorberingsmidlet

var på forhånd blitt vasket med benzen:etylacetat (9:1). Kolon-

nen vaskes med 6 liter benzen:etylacetat (9:1) og avløpet og vasken ble kastet. Kolonnen elueres deretter med en benzen:etyl-acetatløsning (4:1). Eluatet samles opp i en rekke fraksjoner,

idet antib iotika A28695A faller i de første fraksjoner, mens antibiotika A28695B samles opp i de påfølgende fraksjoner. Identi-teten av antibiotika i de respektive kolonnefraksjoner bestemmes ved hjelp av papirkromatografi eller tynnsjiktkromatografi. Kolonnefraksjoner som inneholder det samme antibiotikum, slås

sammen og fordampes i vakuum for å gi de respektive, individuel-

le antibiotika i hovedsakelig ren form.

Antibiotika A28695A krystalliseres ved å oppløse det amorfe antibiotikum i varm eter. Antibiotikumet krystalliseres som blandet natrium-kaliumsalt med et smeltepunkt på ca. 163-

165°C. Utbytte: 11,8 g.

Antibiotikum A28695B krystalliseres også fra eter i

form av det blandete natrium-kaliumsalt med et smeltepunkt på ca. 170-172°C. Utbytte: 5,3 g.

Eksempel 5

Fremstilling av syreform av antibiotikum A28695A

5 g av det blandete natrium-kaliumsalt av antibiotikum A28695A oppløses i 105 ml dioksan. 40 ml vann tilsettes til løs-ningen. pH-verdien av løsningen justeres til 4 med saltsyre. Løs-ningen fordampes for å fjerne dioksan. Den resulterende, vandige løsning ekstraheres to ganger med et tilsvarende volum av etylacetat, og den forbrukte vandige fasen kastes. Etylacetat-eks-traktene kombineres og konsentreres til tørrhet. Den tørre resten oppløses i varm etyleter. Eterløsningen kjøles over natten, slik at antibiotikum A28695A krystalliserer. Krystallene gjenvinnes ved filtrering og tørkes. Utbytte: 4,5 g, sm.p. ca. 97-99°C.

Eksempel 6

Fremstilling av syreform av antibiotikum A28695B

100 mg A28695B som blandet natrium-kaliumsalt oppløses i 25 ml dioksan. 20 ml vann tilsettes til den resulterende løs-ning og pH-verdien justeres til 4,0 med saltsyre. Løsningen konsentreres i vakuum for å fjerne dioksan. Den resulterende, vandige løsning ekstraheres med et tilsvarende volum av etylacetat og forbrukt vandig fase kastes. Etylacetatekstrakten konsentreres til tørrhet. Den tørre rest oppløses i en minst mulig mengde varm etyleter. Eterløsningen holdes kjølig for å krystallisere A28695B. Krystallene gjenvinnes ved filtrering og tørkes. Utbytte: 87 mg, sm.p. ca. 122-124°C.

A28695A og A28695B har det til felles med organiske syrer at de danner salter. Uorganiske baser som danner fysiologisk aksepterbare salter med disse antibiotika, er f.eks. alkali-metallhydroksyder, slik som litiumhydroksyd, natriumhydroksyd og kaliumhydroksyd; alkalimetallkarbonater og bikarbonater, slik som litiumkarbonat og natriumbikarbonat ; jordalkalimetallhyd-roksyder og karbonater slik som kalsiumhydroksyd og magnesium-karbonat og liknende, uorganiske baser.

Eksempler på organiske baser som danner fysiologisk akseptable salter med disse antibiotika er primære, sekundære og tertiære C^-C^-lavere alkyl og lavere hydroksyalkylaminer, slik som etylamin, isopropylamin, dietylamin, metyl-n-butylamin, etanolamin og dietanolamin.

Ammoniumsalter av A28695A og A28695B fremstilles ved hjelp av ammoniakk eller ammoniumhydroksyd.

Salter av antibiotika fremstilles ifølge de vanlige metoder som anvendes for fremstilling av kationiske salter. Den frie syreform av antibiotikumet oppløses f.eks. i et egnet løs-ningsmiddel og en vandig eller organisk løsning av den ønskede base tilsettes til antibiotikumløsningen. De antibiotiske, kationiske salter kan deretter isoleres ved filtrering og rekrystal-liseres eller ved fordamping av løsningsmidlene og rensing ved rekrystallisering.

I

De følgende eksempler illustrerer fremstillingen av salter av A28695A og A28695B.

Eksempel 7

Fremstilling av natriumsaltet av A28695A

200 mg A28695A-syre, fremstilt som angitt i eksempel 5, oppløses i 10 ml aceton. Til løsningen tilsettes under omrør-ing 5 ml vann og pH-verdien av løsningen justeres til 9,0 med IN natriumhydroksyd. Aceton fordampes langsomt ved å plassere løsningen i en strøm av kvelstoff. Det dannes en utfelling som gjenvinnes og oppløses i en minst mulig mengde dietyleter. Løs-ningen fordampes til et lite volum og avkjøles ved 5°C natten over. De resulterende krystaller filtreres og tørkes for å gi 33mg A28695A-natriumsalt som smelter ved ca. 159-160°C.

Eksempel 8

Fremstillingen av A28695A- ammoniumsalt.

200 mg A28695A-syre, fremstill/som angitt i eksempel 5, oppløses i 10 ml aceton og 5 ml vann tilsettes til løsningen. pH-verdien av løsningen justeres til 9,0 med konsentrert ammoniumhydroksyd. Aceton fordampes langsomt ved å plassere løsningen i en strøm av nitrogen. Etter at acetonet er fordampet fra løs-ningen, danner det seg en ikke-krystallinsk utfelling. Suspen-sjonen ekstraheres med et tilsvarende volum dietyleter, og den resulterende eterløsning konsentreres til et lite volum ved å plassere løsningen i en strøm av nitrogen. Den konsentrerte løs-ningen får stå ved 5°C natten over. Det danner seg en krystallinsk utfelling som filtreres og tørkes for å gi 120 mg som smelter ved ca. 124-125°C.

Eksempel 9

Fremstilling av natriumsaltet av A28695B

200 mg av syreformen av A28695B, fremstilt som angitt i eksempel 6, oppløses i 10 ml aceton og 5 ml vann tilsettes langsomt under røring til den resulterende løsning. pH-verdien av løsningen justeres til 9,0 med IN NaOH. Acetonet fordampes langsomt ved å plassere løsningen i en strøm av nitrogen. Etter at acetonet er fordampet fra løsningen, begynner det å danne seg en krystallin utfelling. Suspensjonen får stå ved 5°C natten over for at krystallisasjonen skal være fullstendig. Krystallene filtreres og tørkes for å gi 150 ml A28695B-natriumsalt som smelter ved ca. 161-162°C.

Eksempel 10

Fremstilling av ammoniumsaltet av A28695B

200 mg av A28695B fri syre, fremstilt som angitt i eksempel 6, oppløses i 10 ml aceton og 5 ml vann tilsettes langsomt til den resulterende løsning under omrøring. pH-verdien av løsningen justeres til 9,0 med konsentrert ammoniumhydroksyd-løsning. Acetonet fordampes fra løsningen ved å plassere løs-ningen i en strøm av nitrogen. En krystallin utfelling begynner å dannes etter at acetonet har fordampet fra løsningen. Suspensjonen får stå ved 5°C for å avslutte krystallisasjonen. Krystallene av ammoniumsaltet av A28695B gjenvinnes ved filtrering og tørkes for å gi 138 mg som smelter ved ca. 124-125°C.

Det er velkjent på det veterinærfarmasøytiske område at saltformen av et antibiotikum er uten betydning ved behand-lingen av et dyr med antibiotikum. Miljøet i dyret forandrer ofte kjemiske forbindelser til kjemiske former som er forskjellig fra det det ble tilsatt i. Derfor er formen som forbindelsen ble tilsatt i, syre eller salt, uten betydning for behandlings-måten og kan velges på bakgrunn av økonomi, lettvinthet og giftighet.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av antibiotikumet A28695A og antibiotikumet A28695B og salter derav, karakterisert ved at man dyrker Streptomyces albus NRRL 3883 i et næringsmedium som inneholder assimilerbare kilder for karbon, nitrogen og uorganiske salter under submerse, aerobe betingelser, utvinner en blanding av nevnte antibiotika fra kulturmediet og eventuelt adskiller og isolerer de individuelle antibiotika A28695A og A28695B, eventuelt i form av salter.