DK158746B - Fremgangsmaade til fremstilling af et poly(cyclisk-ether)-antibioticum kaldet cp-53607 - Google Patents

Fremgangsmaade til fremstilling af et poly(cyclisk-ether)-antibioticum kaldet cp-53607 Download PDF

Info

Publication number
DK158746B
DK158746B DK323482A DK323482A DK158746B DK 158746 B DK158746 B DK 158746B DK 323482 A DK323482 A DK 323482A DK 323482 A DK323482 A DK 323482A DK 158746 B DK158746 B DK 158746B
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
antibiotic
agar
growth
fermentation
ethyl acetate
Prior art date
Application number
DK323482A
Other languages
English (en)
Other versions
DK323482A (da
DK158746C (da
Inventor
Walter Daniel Celmer
Walter Patrick Cullen
Riichiro Shibakawa
Junsuke Tone
Original Assignee
Pfizer
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pfizer filed Critical Pfizer
Publication of DK323482A publication Critical patent/DK323482A/da
Publication of DK158746B publication Critical patent/DK158746B/da
Application granted granted Critical
Publication of DK158746C publication Critical patent/DK158746C/da

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/16Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing two or more hetero rings
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07HSUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/01Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing oxygen
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04Antibacterial agents
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205Bacterial isolates
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/181Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system, e.g. Salinomycin, Septamycin
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12RINDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465Streptomyces
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215Microorganisms
    • Y10S435/822Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/886Streptomyces

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Feed For Specific Animals (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

! DK 158746 B
Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et hidtil ukendt poly(cyclisk-ether)-antibioticum, kaldet CP-53607 med den i krav l's indledning angivne formel, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte.
5 Det omhandlede antibioticum kaldet CP-53607 er et hidtil ukendt medlem af den gruppe antibiotica, der betegnes sure, poly(cyclisk-ether)-antibiotica, en klasse af forbindelser, der biologisk er karakteriseret ved deres virkning på kation-transporten i mitochondria. Denne 10 familie af antibiotica inkluderer: monensin [J. Amer. Chem. Soc., 89:5737 (1967)]; nigericin [Biochem. Biophys. Res. Comm., 33: 29, (1968)]; 15 grisorixin [J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1421 (1970)]; dianemycin [J. Antibiotics, 22: 161 (1969)]; salinomycin [J. Antibiotics, 27: 814 (1974)]; X-537A [J. Chem. Soc., Chem. Commun., 967 (1972)]; 20 X-206 [J. Chem. Soc., Chem. Commun., 927 (1971)]; A204A [J. Amer. Chem. Soc., £5: 3399 (1973)]; mutalomycin [J. Antibiotics, 30: 903 (1977)]; ionomycin [J. Amer. Chem. Soc., 101: 3344 (1979)]; K-41B [J. Antibiotics, 32: 169 (1979)]; 25 A-130B og A-130C [J. Antibiotics, 33: 94 (1980)]; leuseramycin [J. Antibiotics, 33: 137 (1980)]; og A-28695B [J. Antibiotics, 33: 252 (1980)].
30 Emnet er ligeledes genstand for en oversigtsartikel af Westley, "Polyether Antibiotics", Adv. Appl. Microbiol., 22: 177 (1977).
De ovenfor omtalte poly(cyclisk-ether)-antibiotica er 35 aktive over for Gram-positive bakterier, fungi og
DK 158746 B
2 protozoer. Disse antibiotics udviser kraftig anticoccidial aktivitet.
Den velkendte protozo-sygdom, coccidiose, er fortsat et 5 alvorligt problem, og bekæmpelsen af sygdommen er af økonomisk betydning for veterinærvidenskaben, især i forhold til fjerkræavl. Coccidiose er et resultat af infektion med en eller flere arter af Eimeria eller Isospora (en oversigt er anført af Lund og Farr i 10 "Diseases of Poultry", 5th ed., Biester og Schwarte,
Eds., Iowa State University Press, Ames, la., 1965, side 1056-1096). Der findes seks arter af coccidier, som let fremkalder påviselig sygdomstilstand hos modtagelige kyllinger. Eimeria tenella, E. necatrix, E. brunetti, E.
15 acervulina, E. maxima og E. mivati forvolder beskadigelse enten direkte gennem ødelæggelse af fordøjelseskanalens epithelceller eller indirekte gennem produktion af toxiner. Tre andre arter af protozoer, som tilhører den samme slægt, anses for at være forholdsvis uskadelige; E.
20 mitis, E. hagani og E. praecox er imidlertid i stand til at reducere vægtforøgelsen, at formindske fodereffektiviteten og på ugunstig måde at influere på ægproduktionen.
25 På grund af de store økonomiske tab, der skyldes coccidiose, og .på grund af ulemperne knyttet til visse kendte anti-coccidiale midler, fortsætter man forskningen efter bedre anti-coccidiale midler.
30 En anden sygdom, som kan forårsage alvorlige økonomiske tab for husdyrproducenter, er enteritis. Enteritis forekommer hos kyllinger, svin, kvæg og får og tilskrives i hovedsagen anaerobe bakterier, især Clostridium perfringens, samt virus. Enterotoxæmi hos drøvtyggere, på 35 hvilket et eksempel er "pulpy kidney disease" hos får, er en tilstand, som forårsages af infektion med C. perfringens.
DK 158746B
3
Svinedysenteri er en af de hyppigst diagnosticerede svinesygdomme i USA. Sygdommen er i øvrigt udbredt i mange andre lande og forårsager hvert år tab på mange tusinde dollars i bestanden hos svineopdrættere verden 5 over. Man har for nylig fundet, at en stor spirochæt er den forårsagende organisme ved denne sygdom. Denne organisme, Treponema hyodysenteriae, er nu blevet isoleret og påvist at være i stand til at fremkalde sygdommen [Harris, D.L. et al.: "Swine Dysenteri-1 10 Inoculation of Pigs with Treponema hyodysenteriae (New Species) and Reproduction of the Disease", Vet. Med/SAC, 67: 61-64: 1972)]. De i det følgende anførte afprøv ningsdata angår afprøvninger gennemført med denne organisme. Det skal her bemærkes, at man ikke ved, hvorvidt 15 T. hyodysenteriae er den eneste forårsagende organisme ved svinedysenteri. Det kan imidlertid sluttes fra tilgængelige data, at den er en primær kilde til infektionen.
20 Et andet økonomisk ønskværdigt formål med veterinær videnskaben er præstations-forbedringer (forøget væksthastighed og/eller forøget foderudnyttelses-effektivitet) hos drøvtyggere, såsom kvæg. Af særlig interesse er vækstfremme, som opnås igennem forøgelse af foder-25 udnyttelses-effektiviteten. Mekanismen til udnyttelsen af den betydeligste ernæringsandel (kulhydraterne) i drøv-tyggerfodere er velkendt. Mikroorganismer i dyrets vom nedbryder kulhydrater til dannelse af monosaccharider og omdanner derpå disse monosaccharider til pyrodruesyre-30 forbindelser. Pyrodruesyreforbindelserne metaboliseres ved mikrobiologiske processer til dannelse af acetater, butyrater eller propionater, der som et samlet begreb er kendt under betegnelsen flygtige fedtsyrer (VFA). For en mere detaljeret diskussion henvises til Leng i 35 "Physiology of Digestion and Metabolism in the Ruminant", Phillipson et ål., Eds., Oriel Press, Newcastle-upon-Tyne, England, 1970, side 408-410.
v
DK 158746 B
4
Den relative effektivitet af VFA-udnyttelse er omtalt af McCullough i "Feedstuffs", 19. juni 1971, side 19; Eskeland et al. i J. An. Sci. 33, 282 (1971); og Church et al. i "Digestive Physiology and Nutrition of 5 Ruminants", Vol. 2, 1971, side 622 og 625. Skønt acetater og butyrater udnyttes, udnyttes propionaterne med større effektivitet.
Dyrene kan derudover, når der er for lidt propionat til 10 rådighed, udvikle ketose. En gavnlig forbindelse vil derfor stimulere dyrene til at producere en højere andel af propionater ud fra kulhydrater, hvorved man forbedrer effektiviteten af kulhydratudnyttelsen og ligeledes reducerer forekomsten af ketose.
15
Endnu en sygdom, som forårsager økonomiske tab for husdyropdrættere, forårsages af en protozo-parasit af slægten Theileria. Denne sygdom, theileriosis, kendes ligeledes under betegnelsen "East Coast Fever", "Coastal 20 fever", eller "Rhodesian tick fever". Theileria- parasitten invaderer, men ødelægger ikke de røde blodceller, hvilket fører til akutte eller kroniske febrile infektioner. Hos kvæg er sygdommen karakteriseret ved høj feber, opsvulmning af lymfeknuderne, afmagring og høj 25 dødelighed. Sygdommen udgør et meget alvorligt problem i Østafrika og Centralafrika. Med hensyn til en mere detaljeret beskrivelse af theileriosis henvises til "The Merck Veterinary Manual", Siegmund et al., Eds., Merck &
Co., N.J., 5. udgave, side 431-433 (1979).
30
Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstilles som nævnt et hidtil ukendt surt poly(cyclisk-ether)-antibio-ticum ved neddykket, aerob formering i vandige nærings-substrater af organismen Streptomyces halstedii ATCC 35 31812, som er blevet isoleret fra en jordprøve fra Japan.
Antibioticummet og dets kation-salte er aktive over for en række forskellige mikroorganismer og er effektive til
DK 158746B
5 bekæmpelse af coccidiose, enteritis, svinedysenteri og theileriosis, ligegsom de er effektive til fremme af væksten hos fjerkræ og drøvtyggere.
5 På vedlagte tegninger er vist infrarøde absorptionsspektre i kaliumbromid, idet;
Fig. 1 viser antibioticum 53 607 i form af natriumsaltet .
10
Fig. 2 viser antibioticum 53 607 i form af den frie syre.
Den antibioticum-producerende mikroorganisme til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen blev isoleret 15 fra en jordprøve indsamlet i Hiroshima, Japan. Man fandt ved undersøgelser, at mikroorganismen havde morphologiske træk svarende til en Streptomyces. Man fandt, at den havde smalle hyfer svarende til Actinomycetales og luftmycelium med kæder af sporer, karakterisk for slægten 20 Streptomyces. Den generiske identitet blev yderligere understøttet af cellevæg-analyse.
En kultur af denne mikroorganisme blev podet fra en skråkultur ind i flydende substrat ATCC nr. 172 og dyrket 25 i 4 dage ved 28 °C på rysteapparat. Den blev derpå fjernet fra rysteapparatet, centrifugeret, vasket tre gange med sterilt, destilleret vand og udsået på substrater, som almindeligvis anvendes til identificering af medlemmer af Actinomycetalerne.
30
Inkuberingen foregik ved 28 °C, undtagen hvor andet er anført, og resultaterne blev aflæst på passende tidspunkter; de nedenfor anførte resultater er efter to ugers inkubation, medmindre andet er anført.
De identificerings-medier, som blev brugt til at karakterisere kulturen, samt henvisninger til deres sammen- 35
DK 158746 B
6 sætning, er som følger: 1. Trypton-gærekstrakt-væske - (ISP nr. 1 substrat,
Difco).
5 2. Gærekstrakt-maltekstrakt-agar - (ISP nr. 2 substrat,
Difco).
3. Havregryn-agar - (ISP nr. 3 substrat, Difco).
4. Uorganiske salte-stivel se-agar - (ISP nr. 4 substrat,
Difco).
10 5. Glycerol-asparagin-agar - (ISP nr. 5 substrat, Difco).
6. Pepton-gærekstrakt-jern-agar - (ISP nr. 6 substrat,
Difco).
7. Czapek-sucrose-agar - S.A. Waksman, "The Actinomycetes", Vol. 2, substrat nr. 1, side 328, 15 1961.
8. Glucose-asparagin-agar - Ibid, substrat nr. 2, side 328.
9. Bennett’s agar - Ibid, substrat nr. 30, side 311.
10. Emerson’s agar - Ibid, substrat nr. 28, side 331.
20 11· Næringsagar - Ibid, substrat nr. 14, side 330.
12. Gordon og Smith's tyrosin-agar - R.E. Gordon og M.M.
Smith, Jr. Bact. 69: 147-150, 1955.
13. Casein-agar - Ibid.
14. Calciummalat-agar - S.S. Waksman, Bact. Rev. 21: 1- 25 29,.1957.
15. Gelatine - R.E. Gordon og J.M. Mihm, Jr. Bact. 73: 15-27, 1957.
16. Stivelse - Ibid.
17. Organisk-nitrat-væske - Ibid.
30 18. Dextrose-nitrat-væske - S.A. Waksman, "The
Actinomycetes", Vol. 2, substrat nr. 1, side 328, 1961, med 3 g dextrose i stedet for 30 g sucrose og agar udeladt.
19. Kartoffel-gulerod-agar - M.P. Lechevalier, Jr. Lab.
35 og Clin. Med. 71: 934-944, 1968, men der anvendes kun 30 g kartofler, 2,5 g gulerødder og 20 g agar.
20. 2% vandværksvandsagar.
DK 158746 B
7 21. Skummetmælk - Difco.
22. Celluloseudnyttelse - (a) H.L. Jensen, Proc. Linn. Soc. N.S.W. 55: 231-248, 5 1930.
(b) M. Levine og H.W. Schoenlein, "A Compilation of Culture Media", substrat nr. 2511, 1930.
23. Carbonhydrater - ISP nr. 9 substrat, Difco; Nonomura 10 og Ohara's C-2 substrat i Nonomura, H. og Y. Ohara, J. Ferment. Technol. 49: 887-894, 1971.
24. Temperaturområde - ATCC substrat nr. 172 "ATCC Culture Collection Catalogue", 14. udgave, side 518, 1980.
15
Den nye kultur (Pfizer N393-39) blev beskrevet på følgende måde på de forskellige substrater med farver beskrevet i almindelig sprogbrug, men de nøjagtige farver blev bestemt ved sammenligning med farvemærkater fra 20 Color Harmony Manual, 4. udgave: Gærekstrakt-maltekstrakt-agar - God vækst, flødefarvet til lysegul (nær 2 ca) moderat hævet, glat, ujævn til rynket, intet luftmycelium; bagsiden det samme som over-25 fladen; intet opløseligt pigment.
Havregryn-agar - Væksten moderat, grå til brunliggrå (2 ge, 2 lg til 2 ni), tynd til let hævet, glat med små hvide prikker; luftmycelium sparsomt, hvidt til lysegråt; 30 bagsiden det samme som overfladen; opløseligt pigment svagt lysegult.
Uorganiske salte-stivelse-agar - Væksten moderat, gulligbrun til brun (2 ic, 3 ne til 3 le), tynd, glat, intet 35 luftmycelium; bagsiden det samme som overfladen; intet opløseligt pigmént.
DK 158746B
8
Glycerol-asparagin-agar - Væksten dårlig til moderat, snavset hvid, tynd, glat med nogle små hvide pletter; luftmyceliet sparsomt, hvidt; bagsiden det samme som overfladen; intet opløseligt pigment.
5
Gordon og Smith's tyrosin-agar - Væksten dårlig til moderat, farveløs til flødefarvet (2 ca), tynd, glat, intet luftmycelium; bagsiden det samme som overfladen; intet opløseligt pigment.
Czapek-sucrose-agar - Væksten dårlig, farveløs til snavset hvid, tynd, glat, med nogle få små hvide pletter af luftmycelium; bagsiden det samme som forsiden; intet opløseligt pigment.
15
Glucose-asparagin-agar - Væksten moderat, gulliggrå til lavendelgrå (2 ig, 3 ge til 3 ig), tynd, glat men let rynket nær kanten; luftmycelium svag gråligt (2 ge); bagsiden det samme som overfladen; opløseligt pigment, svagt 20 lysegult.
Calciummalat-agar - Væksten dårlig, farveløs med en snavset hvid rand, neddykket, glat, med små pletter af gråligt luftmycelium (omtrent grå serie 2 dc til 2 fe); 25 bagsiden det samme som overfladen; intet opløseligt pigment.
Casein-agar - Væksten moderat, blegt brunlig (2 ne til 3 ne), tynd, glat til let ujævn, intet luftmycelium; bag-30 siden det samme som overfladen; intet opløseligt pigment.
Bennett1 s agar - Væksten god, brun (3 ng til 3 ni), ophøjet, rynket, intet luftmycelium; bagsiden det samme som overfladen; opløseligt pigment blegt gulligt (2 ca).
Emerson’s agar - Væksten moderat god, blegt gulligbrun (2 ca til 3 ca) til grøngrå (23 ge til 23 ig), tynd til 35
DK 158746 B
9 ophøjet, glat til let ujævn eller forekommende som hin-deagtige fordybninger, der var uregelmæssigt rynkede, intet luftmycelium; bagsiden det samme som overfladen; intet opløseligt pigment.
5 Næringsagar - Væksten dårlig til moderat, blegt gullig (2 ca), tynd, glat, intet luftmycelium; bagsiden det samme som overfladen; intet opløseligt pigment.
10 Gelatine-agar - Væksten moderat, blegt gullig (2 ca), tynd, glat, intet luftmycelium; bagsiden det samme som overfladen, intet opløseligt pigment.
Stivelse-agar - Væksten god, flødefarvet, blegt gullig 15 til blegt gulligbrun (2 ca til nær 3 gc), tynd til let ophøjet, glat, men rynket hen mod kanten, intet luftmycelium; bagsiden det samme som overfladen; intet opløseligt pigment.
20 Kartoffel-gulerod-agar - Væksten moderat, flødefarvet (2 ca) med grålige til mørkegrålige randområder (nær grå-serien 2 fe, 2 ih til 2 ml), tyndt, glat luftmycelium, gråt til mørkegråt; bagsiden det samme som overfladen; intet opløseligt pigment.
25
Vandværksvand-agar - Væksten dårlig, farveløs til snavset hvid, tynd, glat, med nogle små hvide pletter af luftmycelium; bagsiden det samme som overfladen; intet opløseligt pigment.
30
De iagttagne biokemiske egenskaber kan opsummeres på følgende måde: 1
Melanin ikke produceret.
35 2. Hydrogensulfid ikke produceret.
3. Gelatine smeltes.
4. Stivelse hydrolyseres.
DK 158746 B
10 5. Nitrat reduceres til nitrit.
6. Sparsom vækst på Jensen's cellulose.
7. Ingen vækst på Levine og Schoenlein's cellulose.
8. Ingen nedbrydning på begge cellulose-substrater.
5 9. Ingen koagulering af mælk.
10. Ingen peptonisering af mælk.
11. Ingen fordøjelse af casein, calciummalat og tyrosin.
12. carbonhydratudnyttelse: I. På Nonomura's substrat udnyttedes glucose, 10 arabinose og xylose; raffinose blev kun tvivlsomt udnyttet; sucrose, inositol, mannitol, fructose og rhamnose blev ikke udnyttet.
II. På ISP nr. 9 substrat blev udnyttet glucose, 15 arabinose, xylose og saccharose; fructose, inositol, mannitol, raffinose og rhamnose blev ikke udnyttet.
Man foretog følgende morphologiske iagttagelser på kar-20 toffel -gulerod-agar efter 15 dages inkubering:
Sporemasse i den grå farverække; sporekæder lige, krumme, uregelmæssigt bøjede eller bølgeformede, sjældent sammenhægtede, 10-30 sporer pr. sporekæde, sjældent mindre 25 end 10 sporer pr. sporekæde; sporerne ovale, elliptiske til stavformede, 1-1,8 x 0,8-0,9 μη», glatte, således som det blev afsløret ved skanderende elektronmikroskopi.
Forholdet mellem temperaturen og væksthastigheden blev 30 iagttaget med følgende resultat: 35
DK 158746B
11
Temperatur Vækst 21 °C God til fremragende 28 °C God 5 37 0C Moderat 45 °C Dårlig
Som det tidligere er nævnt, understøttede cellevæganalyse kulturens generiske identitet som en art af Streptomyces.
10 Analyse af hele cellen afslørede tilstedeværelsen af LL-diaminopimelinsyre og glycin, men fravær af diagnostiske sukkerarter. De metoder, der anvendtes til analyse på hele cellens aminosyre og sukker, er beskrevet hos Becker et al., Appl. Microbiol., 12: 421-423, 1964; og i 15 Lechevalier, M.P., J. Lab. Clin. Med., 71: 934-944, 1968.
Kulturen N393-39 er karakteriseret ved lysegrå til grå farve af sporerne i masse, lige til bøjede sporekæder, glatte sporer og manglende evne til at producere melanin.
20 Tilstedeværelsen af LL-diaminopimelinsyre og fraværet af diagnostiske sukkerarter i hydrolysater af de hele celler fastslår, at kulturen skal tilskrives slægten
Streptomyces. Kulturen minder nært om Streptomyces halstedii, som er beskrevet af Shirling/ E.B. og 25 Gottlieb, D., 1968, Int. J. Syst. Bacteriol., 18: 69-189, og derfor anvendes typestammen S. halstedii ATCC 10897 til sammenligning. Begge kulturerne stemmer overens med hinanden med hensyn til følgende egenskaber: Spore kædernes morfologi, sporeoverfladens morfologi, negativ 30 melaninproduktion og de fleste af de biokemiske egenskaber. Kulturen N393-39 afviger fra S. halstedii ATCC 10897 ved fraværet af luftmycelium på mange substrater; ved brune snarere end grå til sorte kolonier på bagsiden af ISP nr. 2, ISP nr. 3 og ISP nr. 4 substraterne; nega-35 tiv H2S produktion og manglende evne til at udnytte fructose. Eftersom disse forskelle blot er mindre variationer, der kan forekomme blandt stammer af en
DK 158746B
12
Streptomyces-art, betragter man N393-39 som en ny stamme af Streptomyces halstedii (Waksman og Curtis) Waksman og Henrici.
5 Den nye kultur (Pfizer N393-39) blev deponeret d. 23. februar 1981 i American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, og tildelt betegnelsen Streptomyces halstedii ATCC 31812. Den permanente opretholdelse af deponeringen af denne kultur ved The American Type 10 Culture Collection i Rockville, Maryland, og den lette tilgængelighed dertil for offentligheden er tilbudt gennem dette patents effektive levetid.
Dyrkningen af kulturen Streptomyces halstedii ATCC 31812 15 kan gennemføres under betingelser, der svarer til dem, der er anvendt ved tidligere kendte gæringsfremgangsmåder førende til polyether-antibiotica. Se f. eks. US patentskrift nr. 4 195 079. Dyrkningen finder fortrinsvis sted i vandigt næringssubstrat under neddykkede aerobe be-20 tingelser ved omrøring og ved en temperatur på 24-36 °C. Næringsmedier, som er nyttige ved dyrkningen, inkluderer en kilde til assimilerbart carbon, såsom sukkerarter, stivelser og glycerol; en kilde til organisk nitrogen, såsom casein, enzymatisk fordøjelsesprodukt af casein, 25 sojabønnemel, bomuldsfrømel, jordnøddemel, hvedegluten, sojamel, kødmel og fiskemel. En kilde til vækstsubstanser, såsom "grain solubles" og gærekstrakt, såvel som salte, såsom natriumchlorid og calciumcarbonat, og sporelementer, såsom jern, magnesium, zink, cobalt og 30 mangan, kan ligeledes anvendes med fordelagtige resultater. Dersom man under gæringen støder på for kraftig skumning, kan man tilsætte gæringsmediet et anti-skummemiddel, såsom vegetabilske olier eller siliconer. Beluftningen af mediet i tankene til neddykket vækst hol-35 des fortrinsvis ved en hastighed på ca. h til 2 rumfang fri luft pr. rumfang gæringsvæske pr. minut, som presses ind i væsken gennem et fordelingshoved. Omrøringen kan
DK 158746 B
13 opretholdes ved hjælp af omrørere, som vil være kendte for fagmanden. Omrøringshastigheden afhænger af den type omrører, der anvendes. En rysteflaske arbejder sædvanligvis ved 150-200 cykler pr. minut, medens en fermentor 5 sædvanligvis arbejder med 300-600 omdr./minut. Man må selvfølgelig opretholde aseptiske betingelser under overførelsen af organismen og gennem hele dennes vækst.
Podemateriale til fremstillingen af det omhandlede anti-10 bioticum kan opnås ved anvendelse af vækst fra en skråkultur. Dette materiale kan bruges til at pode enten rysteflasker eller podningstanke, eller podningstankene kan forsynes fra rysteflaskerne. Væksten i rysteflaskerne vil normalt have nået sit maksimum på 2-4 dage, medens 15 podemateriale i neddykkede podningstanke sædvanligvis vil være i sin mest gunstige periode fra 1½ til 3 dage. Fremgangen med hensyn til antibioticumproduktion under gæringen og gæringsvæskens biologiske aktivitet kan overvåges ved biologisk afprøvning af væsken under anvendelse 20 af en følsom stamme af Staphyloccus aureus eller Bacillus subtilis. S. aureus ATCC 6538 og B. subtilis ATCC 6633 er egnede stammer til dette formål. Man anvender en standardteknik til pladeafprøvning, hvorved inhiberingszonen omkring en skive af filtrerpapir mættet med gæringsvæsken 25 anvendes som et mål på den antibiotiske styrke. Tyndt-
lagskromatografi under anvendelse af silicagel er ligeledes et nyttigt instrument til analysering af de antibiotics, som dannes i gæringsmedierne og sammensætningen af rå og rensede materialer, som ekstraheres fra 30 gæringsvæsken. Kromatogrammer på Analtech silicagel GF
udvikles med ethylacetat/methanol (9:1) eller chlo- roform/methanol (9:1). Den antibiotiske forbindelse gøres synlig ved sprøjtning med vanilin i ethanolisk svovlsyre (3 g vanilin i 97 ml methanol og 3 ml koncentreret svovl-35 syre) og opvarmning af TLC-pladen til 80 °C. Antibio- ticummet fremkommer som en lyserød plet. Pladen kan ligeledes overlejres med agar, som er podet med enten S.
aureus eller B. subtilis og inkuberes ved 37 °C i 16 timer til synliggørelse af antibioticummet.
DK 158746B
14
Antibioticummet fremstillet ved gæring af S. halstedii 5 ATCC 31812, kan frasepareres og udvindes ved ekstraktion af den samlede, ufiltrerede gæringsvæske med et organisk opløsningsmiddel, såsom chloroform, ethylacetat, methyl-isobutylketon eller butanol ved det naturligt forekommende pH. Ekstrakten i opløsningsmidlet kan derpå kon-10 centreres under vakuum til en tynd sirup.
En typisk fremgangsmåde til fraseparering og udvinding af det omhandlede antibioticum (som i det følgende betegnes "Antibiotisk Forbindelse 53607") er som følger: 15
Den samlede væske fra gæringen af S. halstedii ATCC 31812 blev ekstraheret med methylisobutylketon. Ekstrakten gav en mørk olie efter afdampning af opløsningsmidlet under vakuum. Olien blev opløst i chloroform og hældt ud på et 20 leje af silicagel. Silicagellejet blev derpå vasket successivt med chloroform, ethylacetat og acetone. Vaskefraktionerne blev undersøgt ved tyndtlagskromatografi, og man fandt, at antibiotisk forbindelse 53607 næsten udelukkende blev fundet i ethylacetatfraktionen. Ethyl-25 acetatfraktionen blev inddampet til tørhed, og de øvrige fraktioner blev kasseret. Den tørre ethylacetatfraktion blev yderligere renset ved søjlekromatografi, idet den blev opløst til ethylacetat, og sat til en søjle pakket med silicagel opslæmmet i ethylacetat og elueret med 30 ethylacetat. Udskæringer af søjlen indeholdende den antibiotiske forbindelse 53607 (som bestemt ved tyndtlagskromatografi) blev forenet, og rumfanget blev reduceret ved afdampning. Dette materiale blev derpå kroma-tograferet under en søjle pakket med "Sephadex® LH-20" i 35 methanol, og de fraktioner, som indeholdt den antibiotiske forbindelse 53607, blev forenet, inddampet til et reduceret rumfang og derpå opløst i chloroform.
DK 158746B
15
Chloroformopløsningen blev vasket med 5% monona-triumphosphatbuffer reguleret til pH 4,5 med phos-phorsyre. Opløsningsmiddelfasen vaskedes derpå med 5% vægt/rumfang i natriumphosphatbuffer, hvis pH blev 5 reguleret til 9,0 med natriumhydroxidopløsning. Opløsningsmiddelfasen blev derpå tørret over vandfrit natriumsulfat og inddampet. Inddampningsresten blev opløst i acetone og anbragt i et køleskab, hvorpå den antibiotiske forbindelse 53607 udkrystalliserede som na-10 triumsaltet. Den frie syre kan opnås ved vaskning af en ethylacetatopløsning af natriumsaltet med vand, der er indreguleret til pH 4,5. Afdampning af opløsningsmidlet førte til krystaller af den frie syre af den antibiotiske forbindelse 53607.
15
Analyse af den antibiotiske forbindelse 53607 viser følgende strukturformel: OH H CH-
20 C02VVCH3 CH3, X X|>3 CA
0Η3 H aW
L Ih ch *h h
3 OH CH20H
25
Den antibiotiske forbindelse 53607 udviser inhiberende virkning over for væksten af et antal Gram-positive mikroorganismer. I efterfølgende tabel I er vist 30 resultaterne af in vitro afprøvning for MIC. Ved denne test podes hver af organismerne i en serie af reagensglas indeholdende næringssubstrat og varierende koncentrationer af forbindelsen 53607 til bestemmelse af den minimale koncentration af antibioticummet udtrykt i 35 ng/ml, som inhiberer væksten af organismen over en periode på 24 timer (MIC).
DK 158746B
TABEL I
16 MIC, jig/ml 5 CP-53607 Salinomycin
Organisme (natriumsalt)
Staphylococcus aureus 01A005 0,78 3,12-12,5 01A052 0,78 3,12-12,5 10 01A110 1,56 01A400 1,56
Streptococcus faecalis 02A006 1,56
Streptococcus pyogenes 020203 <0,01
Corynebacterium pyogenes 11D001 25 15 Bacillus subtilis 06A001 0,39 1,56- 3,12
Bacteroides fragilis 78C004 12,5 12,5 78C009 6,25 12,5 78C010 6,25 6,25
Bacteroides vulgatis 78E032 3,12 6,25-12,5 20 Haemophilus influenzae 54A036 6,25 54A037 3,12 54A059 12,5
Pasteurella multocida 59A001 >200 50
Clostridium perfringens 10A002 0,98 0,09- 1,56 25 10A003 0,98
Neisseria sicca 66C000 25
Staphylococcus epider- midis 01B087R 0,78 3,12-12,5 01B111RR 0,78 3,12-12,5 30 01B126 1,56
Fusobacterium necropho- rum 84C004 3,12 6,25-12,5
Treponema hyodysenteriae 94A001 0,39 94A002 0,098 35 -
DK 158746B
17 MIC-værdierne var >50 i hvert enkelt tilfælde over for Gram-negative bakterier, såsom Escherichia coli. Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens og Aerobacter aerogenes.
5
Den antibiotiske forbindelse 53607 og dens kationsalte udviser fremragende aktivitet over for coccodial-infektioner hos fjerkræ. Når de inkorporeres i kyllingers foder i niveauer på 50-200 ppm, er disse forbindelser 10 effektive til modvirkning af infektioner, som skyldes Elmeria tenella, E. acervulina, E. maxima, E. brunetto og E. necatrix.
Man opnåede data på effektiviteten for den antibiotiske 15 forbindelse 53607 og dennes salte over for coccidial-infektioner hos kyllinger på følgende måde: Grupper på 3-5 ti dage gamle SPF hvide italienske hanekyllinger blev fodret med et fodermiddel indeholdende antibiotisk forbindelse 53607 eller dennes natrium- og/eller kaliumsalt, 20 som var jævnt fordelt i dette foder. Efter at have været på denne foderration i 24 timer blev hver kylling indpodet per os med oocyster af den særlige art af Eimeria, der blev afprøvet. Andre grupper på 3-5 ti dage gamle kyllinger blev fodret med en tilsvarende foderblanding 25 uden antibiotisk forbindelse 53607 eller salte deraf.
Disse blev ligeledes inficeret efter 24 timers forløb og tjente som inficerede kontrolgrupper. Endnu en gruppe på 3-5 ti dage gamle kyllinger blev fodret med foderblandingen uden antibiotisk forbindelse 53607, og de blev 30 ikke inficeret med coccidier. Disse tjente som normale kontrolgrupper. Resultatet af behandlingen blev bedømt efter 5 dage for E. acervulina's vedkommende og 6 dage for alle andre påvirkningers vedkommende. I tabel II er opsummeret de opnåede resultater og til sammenligning 35 resultaterne af tilsvarende forsøg med monensin. Dataene i parentes er resultater af gentagelsesforsøg.
TABEL II
DK 158746 B
18
Arten af Dosis Gennemsnitlig Vægtfor- 5 infektion (ppm) infektionsgrad1 Forhold1 øgelse (%)
Anticoccidiale data for CP-53607 10 Eimeria tenella 200 1,3 0,41 37 100 1,0 (1,3) 0,32 (0,37) 57 (60) 50 2,7 (0,3) 0,86 (0,09) 22 (97) 25 3,0 (1,7) 0,95 (0,49) 47 (102)
Eimeria acer- 15 vulina 200 1,5 0,75 2 100 1,2 0,60 22 50 2,0 1,00 18 25 2,0 1,00 7
Eimeria necatrix 200 --- ---- 20 100 0,0 0,00 69 50 0,2 0,11 99 25 0,6 0,33 111
Eimeria maxima 200 1,5 0,94 10 100 0,8 0,50 37 25 50 1,0 0,63 70 25 1,4 0,88 51
Eimeria brunetti 200 --- ---- 100 0,4 0,22 47 50 1,0 0,55 49 30 25 2,6 1,44 47 35 TABEL II (fortsat)
DK 158746 B
19
Arten af Dosis Gennemsnitlig Vægtfor- 5 infektion (ppm) infektionsgrad1 Forhold1 øgelse (%)
Anticoccidiale data for monensin 10 Eimeria tenella 100 0,7 0,22 70 50 1,3 0,47 48
Eimeria necatrix 100 0,6 0,33 97 50 1,4 0,77 87 15
Eimeria brunetti 100 0,4 0,22 36 50 0,6 0,33 57 20 1) De kriterier, som blev anvendt til at måle den anticoccidiale aktivitet, bestod af læsionsbedømmelser fra 0 til 4 for E. tenella ifølge J.E, Lynch, "A New Method for the Primary Evaluation of Anticoccidial Activity", Am. J. Vet. Res. 22: 324-326 (1961)? og fra 25 0 til 3 for de andre arter baseret på modifikation af det bedømmelsessystem, der er udformet af J. Johnson og W.H. Reid, "Anticoccidial Drugs. Lesion Scoring Techniques in Battery and Floor Pen Experiments in Chicks", Exp. Parasit. 28: 30-36 (1970). Man opnåede 30 en konstant forholdsværdi ved at dividere bedømmelsen for beskadigelserne for hver behandlet gruppe med læsionsbedømmelsen for den inficerede kontrolgruppe.
Man har sædvanligvis fastlagt værdien af dyrefoder gennem 35 fodringsforsøg med dyrene. I britisk patentskrift nr.
1 197 826 omtales detaljeret en in vitro vom-teknik, hvorved omdannelserne, som foregår i fodermidlerne, og
DK 158746 B
20 som er frembragt af mikroorganismer, lettere og med større nøjagtighed måles til bedømmelse af fodermidlerne.
Denne teknik involverer anvendelsen af et apparat, i hvilket dyrenes fordøjelsesprocesser gennemføres og 5 undersøges in vitro. Dyrefodermidlerne, et podningsmiddel fra vommen og forskellige midler til fremme af væksten indføres i og udtrækkes fra en laboratorieenhed under omhyggeligt kontrollerede betingelser, og man studerer kritisk og fortløbende de forandringer, der har fundet 10 sted under forbruget af fodermidlet af mikroorganismerne.
En forøgelse af propionsyreindholdet i vomsaften indikerer, at man har opnået et ønskværdigt respons i den samlede drøvtygger-funktion ved hjælp af det vækstfremmende middel i foderblandingen. Ændringen i propion-15 syreindholdet er udtrykt som en procent af det pro-pionsyreindhold, som findes i en kontrolvomsaft. Lang-tidsfodringsundersøgelser in vivo anvendes til at påvise en pålidelig korrelation mellem propionsyreforøgelsen i vomsaften og forbedret ydeevne for dyret.
20
Vomsaften opsamles fra en fistuleret ko, som fodres med en kommerciel opfedningsfoderblanding plus hø. Vomsaften filtreres straks gennem ostklæde, og man tilsæter 10 ml til en 50 ml konisk kolbe indeholdende 400 mg af et 25 standardsubstrat (68% majsstivelse + 17% cellulose + 15% affedtet sojaskrå), 10 ml pH 6,8 buffer samt forbindelsen, der skal afprøves. Kolberne gennemblæses med oxygenfrit nitrogen i ca. 2 minutter og inkuberes i et ryste-vandbad ved 39 °C i ca. 16 timer. Alle prøver blev 30 gennemført i triplikat.
Efter inkuber ingen blandes 5 ml af prøven med 1 ml 25% metaphosphorsyre. Efter 10 minutters forløb tilsættes 0,25 ml myresyre, og blandingen centrifugeres ved 1500 35 omdr./min i 10 minutter. Prøverne analyseres derpå ved gasfasekromatografi ifølge den metode, der er angivet af D.W. Kellog, J. Dairy Science, 52, 1690 (1969). Man
DK 158746 B
21 bestemmer højden på toppene for eddikesyre, propionsyre og smørsyre for prøver fra såvel ubehandlede som behandlede inkuberingskolber.
5 Når den blev prøvet ved denne in vitro procedure, gav den antibiotiske forbindelse 53607 i et niveau på 20 ug pr. ml anledning til ca. 57% forøgelse i produktionen af propionsyre i forhold til dette produkt i kontrolopløsningen uden tilsat antibiotisk forbindelse 53607. Til 10 sammenligning førte det kommercielt tilgængelige monensin (et andet poly(cyclisk-ether)-antibioticum) i doseringen 10 ug/ml til en cirka 20%'s forøgelse af propionsyren i forhold til kontrolforsøget [J. Amer. Chem. Soc., 89, 5757 (1967)].
15
Den antibiotiske forbindelse 53607 fremkaldte, når den blev sammenlignet med salinomycin [J. Antibiotics, 27: 814 (1974)], ca. 43% forøgelse i propionsyre ved et niveau på 20 ug/ml, og ca. 40%'s forøgelse ved 5 ug/ml, 20 sammenlignet med en forøgelse på ca. 52% for salinomycin ved 5 ug/ml.
Man kan baseret på disse data slutte, at den antibiotiske forbindelse 53607 vil forbedre foderudnyttelsen hos 25 drøvtyggere, såsom kvæg og får, og hos enmavede dyr, såsom svin og kaniner. Den antibiotiske forbindelse 53607 kan inkorporeres i foderblandinger i form af den frie syre, natriumsaltet, kaliumsaltet eller blandinger deraf. Urensede former af den antibiotiske forbindelse 53607 30 eller tørret gæringsvæske indeholdende antibioticummet kan inkorporeres i foderblandingerne i de ønskede styrkekoncentrationer .
Fremstillingen af den antibiotiske forbindelse 53607 ved 35 fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere i de efterfølgende eksempler.
DK 158746 B
22 EKSEMPEL 1 Podemateriale 5 Man fremstillede et sterilt, vandigt medium med følgende sammensætning:
Bestanddel Gram/liter 10 Cerelose (kommercielt glucoseprodukt) 10
Stivelse 20 Gærekstrakt 5 "NZ Amine ytt"* 5
Dikaliumhydrogenphosphat 0,5 15 Kødmel 5
Cobaltchlorid 0,002
Calciumcarbonat 4 pH 7,1-7,2 20
Celler fra en skråkultur af Streptomyces halstedii ATCC 31812 blev overført til en række 300 ml kolber, som hver indeholdt 40 ml af dette sterile medium, og kolberne blev rystet på et roterende rysteapparat ved 28-36 °C i 3-4 25 dage.
*
Varemærke for enzymatiske nedbrydningsprodukter af casein, Humko Sheffield Chemical Co., Inc.
30 35
DK 158746B
23 Gæring
En aliquot af den dyrkede kultur, tilstrækkelig til at give et 2 vol.-% podemateriale blev overført til 5 fermentorer på 4 liter, som hver indeholdt 2 liter af følgende sterile medium:
Bestanddele Gram/liter 10 Cerelose (kommercielt glucoseprodukt) 10 "NZ Amine A"* 5
Stivelse 20 Gærekstrakt 5,0
Calciumcarbonat 1,0 15 Cobaltchlorid 0,002
Vand til at bringe op på 1000 ml.
*
Varemærke for enzymatiske nedbrydningsprodukter af casein, Humko Sheffield Chemical Co., Inc.
20 Gæring blev gennemført ved 30 °C under omrøring med 1700 omdr./min og beluftning med 1 rumfang luft pr. rumfang væske pr. minut, indtil man iagttog en betydelig aktivitet (baseret på afprøvning med antibiotisk skive i 25 forhold til B. subtilis ATCC 6633), sædvanligvis 3-5 dage.
Gæringsvæskens biologiske aktivitet og de påfølgende indvindingsbehandlingsstrømme blev fulgt under anvendelse 30 af en følsom stamme af Baccilus subtilis ATCC 6633 eller Staphylococcus aureus ATCC 6538. Komponenterne i gæringsvæsken og i indvindings-behandlingstrømmene blev gjort synlige under anvendelse af silicagelplader i følgende system: ethylacetat/methanol 9:1 eller chlo- 35 roform/methanol 9:1, hvorpå pladen blev sprøjtet med vanilin (3 g vanilin i 97,0 ml ethanol og 3,0 ml koncentreret svovlsyre) og påfølgende opvarmning til 80 °C.
DK 158746 B
24
Forbindelsen 53607 fremkommer som en lyserød plet. Alternativt blev pladen overlejret med agar, podet med enten S. aureus eller B. subtilis, hvortil var sat 1,0 ml 1% tetrazoliumopløsning, og inkuberet ved 37 °C i 16 5 timer til synliggørelse af antibioticummet (klare områder mod en lyserød baggrund).
Hele gæringsvæsken blev filtreret ved neutralt pH under anvendelse af filterhjælpemiidel ("Super-Cel" eller 10 "Celite”), filtratet blev ekstraheret med enten me- thylisobutylketon eller n-butanol. Den organiske fase blev skilt fra den vandige fase ved frasugning og filtreret til fjernelse af suspenderet materiale. Filterkagen blev opslæmmet med methanol, filtreret, metha-15 nolet blev af dampet, og inddampningsresten blev ekstraheret med det samme opløsningsmiddel, som blev anvendt til ekstraktion af den filtrerede gæringsvæske. Ekstrakterne blev forenet og inddampet under vakuum til dannelse af en viskøs olie. Olien blev bragt i suspension i 20 heptan, omrørt med silicagel og filtreret. Filterkagen blev vasket gentagne gange med heptan, og reaktions- produktet blev elueret trin for trin med chloroform alene, med blandinger af chloroform og ethylacetat og til sidst med ethylacetat alene. Efter tyndtlagskromatografi 25 (TLC) og biologisk afprøvning af fraktionerne blev de aktive fraktioner kombineret, inddampet under vakuum, og inddampningsresten igen kromatograferet til opnåelse af den antibiotiske forbindelse 53607 i form af et fast stof. Infrarødt spektrum (KBr skive) μπι: 2,95, 3,42, 30 6,00, 6,37, 6,85, 7,14, 7,30, 7,65, 7,90, 8,10, 9,05, 9,15, 9,67, 10,00, 10,18, 10,53, 11,15, 11,40, 11,75, 13,25. Man fandt, at det var opløseligt i chloroform, ethylacetat, methanol og methylisobutylketon, og det var uopløseligt i vand.
35 25
DK 158 746 B
EKSEMPEL 2
Man fremstillede et podemateriale som beskrevet i det forudgående eksempel, med undtagelse af at man anvendte 5 700 ml medium pr. kolbe, og podematerialet fra ryste kolberne blev gæret i 3-4 dage ved 28 °C sammenhældt i to flasker med sidearme.
En fermentor på 6435 liter indeholdende 4542 liter af 10 det nedenfor anførte sterile medium blev podet med 6 liter (0,1%) af det ovennævnte podemateriale: Gæringsmedium 15 Bestanddel Gram/liter
Cerelose (kommercielt glucoseprodukt) 1,0
Casein 5,0
Stivelse 5,0 20 Majsstøbevand 5,0 ml
Calciumcarbonat 3,0
Cobaltchlorid 0,002
Vand op til 1 liter 25 pH 6,9-7,0
Fermentoren blev holdt ved 28 °C under omrøring ved 1700 omdr./min og beluftning. Efter 120 timers forløb blev fermentoren høstet. Den samlede gæringsvæske (4542 liter) 30 blev ekstraheret med 946 liter methylisobutylketon, lagene blev adskilt i en ekstraktor (af Podbielniak-typen), og den organiske fase blev koncentreret i vakuum, hvorved der blev opnået 30 liter olie. Olien blev yderligere koncentreret i vakuum i en roterende inddamper. Den re-35 sterende sirup blev bragt i suspension i heptan, omrørt med silicagel og filtreret, hvorpå der blev vasket adskillige gange med heptan. Den vaskede filterkage blev
DK 158746B
26 oparbejdet som beskrevet i eksempel 1 til opnåelse af 300 g af en olie. Olien blev opløst i en lille mængde chloroform, opløsningen blev hældt på et filter (Lapp) indeholdende 3,5 kg silicagel (Merck, grad 60), og 5 silicagellaget blev vasket successivt med 19 liter hver af chloroform, ethylacetat og acetone. Fraktionerne blev undersøgt ved tyndtlagskromatografi. Man fandt, at reaktionsproduktet næsten udelukkende forelå i ethyl-acetatfrektionen. De øvrige fraktioner blev kasseret, og 10 ethylacetatfraktionerne blev inddampet til tørhed under vakuum til opnåelse af 150 g koncentrat. Koncentratet blev yderligere renset ved kromatografi på en søjle, 8,0 x 1000 cm, pakket med silicagel (Merck, grade 60), ved opslæmning med ethylacetat. Søjlen blev elueret med 15 ethylacetat, idet man udtog fraktioner på 1 liter ved 60 ml/minut. Fraktioner indeholdende reaktionsproduktet blev forenet og inddampet under vakuum til dannelse af 85 g produkt.
20 Produktet blev sendt igennem en søjle indeholdende 1 kg "Sephadex® LH-20", idet man eluerede med ethanol med en strømningshastighed på 25 ml/minut. Man udtog fraktioner på hver 300 ml. Kombinering af de produktholdige fraktioner og afdampning af opløsningsmidlet gav 30 g fast 25 stof. Dette blev opløst i 500 ml chloroform, opløsningen blev vasket med et lige så stort rumfang 5% Nal^PO^-buffer, som var blevet indstillet på pH 4,5 med 85% phosphorsyre. Den organiske fase blev skilt fra og vasket med 500 ml 5% NaHPO^-buffer, som var blevet indstillet på 30 pH 9,0 med IN natriumhydroxid. Ekstrakten blev derpå tørret over vandfrit natriumsulfat og inddampet til tørhed under vakuum. Inddampningsresten blev opløst i acetone og fik lov til at udkrystallisere i et køleskab. Man opsamlede krystaller ved filtrering og tørrede dem under 35 høj-vakuum ved stuetemperatur til dannelse af 14,0 g af natriumsaltet af den antibiotiske forbindelse 53607, smeltepunkt 199-204 °C.
DK 158746 B
27
Optisk drejning: [«]D +44° (c = 1, chloroform) [e]D +37° (c = 1, methanol).
UV-spektrum : λ , 233 nm (methanol).
max 1% 5 E cm = 212
Infrarødt spektrum (KBr skive) um: 2,95, 3,42, 6,00, 6,37, 6,85, 7,14, 7,30, 7,65, 8,10, 9,05, 9,15, 9,67, 10 10,00, 10,18, 10,53, 11,15, 11,40, 11,75, 13,25.
Det infrarøde spektrum er vist i fig. 1.
Grundstofanalyse: C 57,54 - H 7,74 - N 0,0.
15 Når man anvendte K^PO^-fpH 4,5) og F^HPO-buffer, der var indstillet til 9,0 med IN kaliumhydroxid, ved ovennævnte fremgangsmåde, opnåede man på tilsvarende måde kaliumsaltet af den antibiotiske forbindelse 53607.
20 På tilsvarende måde opnår man ammoniumsaltet under anvendelse af (NH^JI^PO^ og (NH^^HPO^ ved ovennævnte fremgangsmåde.
25 EKSEMPEL 3
En portion af det ovenfor beskrevne natriumsalt af den antibiotiske forbindelse 53607 blev opløst i ethylacetat, der blev tilsat vand, og den vandige fase blev ind-30 reguleret til pH 4,5 med 85% phosphorsyre. Det organiske lag blev skilt fra, tørret (Na2S04) og inddampet under vakuum til opnåelse af den frie syre af forbindelsen 53607, smeltepunkt 84-94 °C. Man gennemførte grundstofanalyse på en prøve, som var tørret natten over ved 35 stuetemperatur under høj-vakuum:
DK 158746 B
28 C 64,69 - H 8,91 - N 0,0.
Man fandt, at syren var uopløselig i vand; opløselig i chloroform, ethylacetat, methanol og methylisobutylketon.
5 [a]D +74,5° (c = 1, chloroform).
[β]β +49,7° (c = 1, methanol).
UV-spektrum: *max 233 nm (methanol).
10 1% E = 198.
1 cm
Infrarødt spektrum (KBr skive) um: 2,95, 3,45, 6,00, 15 6,85, 7,28, 8,13, 9,05, 9,67, 10,20, 10,55, 11,15 og 11,48.
Dette spektrum er vist i fig. 2.
20 Man fremstiller bariumsaltet ved at ryste 2,9 g af den frie syre opløst i 80 ml ethylacetat med et lige så stort rumfang vand indeholdende 2,4 g bariumhydroxid, octahydrat. Lagene adskilles, og den organiske fase vaskes med frisk opløsning af Ba(OH), 81^0, tørres (Na2S04) 25 og inddampes i vakuum, hvilket giver det ønskede salt af den antibiotiske forbindelse 53607.
Calciumsaltet fremstilles ved den ovenstående procedure, idet man anvender calciumhydroxid i stedet for barium-30 hydroxid, octahydrat.
EKSEMPEL 4
Man gennemfører fremgangsmåden fra eksempel 1, men an-35 vender 4 vol.-% podemateriale i fermentorer på 4 liter, som hver indeholder 2 liter af følgende sterile medium:
DK 158746 B
29
Bestanddel_ Gram/liter
Cerelose (kommercielt glucoseprodukt) 10
Majsstivelse 10 5 Sojabønneskrå 10
Calciumcarbonat 1
Forgærbart tørstof fra majs 5
Natriumchlorid 5 10 pH 7,0.
Gæring blev udført i 2 dage ved 36 °C og under omrøring ved 1700 omdr./min samt med lufttilførsel og fordeling med en hastighed på 2 rumfang/rumfang gæringsvæske pr.
15 minut. Hele gæringsvasken blev ekstraheret med chloroform og oparbejdet, således som det er beskrevet i eksempel 1, hvilket gav den antibiotiske forbindelse 53607 som en blanding af dens natrium-, kalium- og calciumsalte.
20 Når man gentager ovennævnte fremgangsmåde, men anvender
et gæringsmedium indeholdende glycerol i stedet for cerelose, fiskemel eller bomuldsfrømel i stedet for forgærbart tørstof fra majs, og gennemfører gæringen ved pH
8,0 og 28 °C i 6 dage, er de opnåede resultater stort set 25 uændrede.
30 35

Claims (3)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et poly(cyclisk-5 ether)-antibioticum, kaldet CP-53607, med formlen: OH H CH- C02Hys.CH3 C\I ^Jtl ^CH3 ^Η3 10 ch3 “ ^ > 5^—N A/ CH3 CH3 OH 'CH20H 15 kendetegnet ved, at mikroorganismen Streptomyces halstedii ATCC 31812 dyrkes i et vandigt dyrkningsmedium indeholdende assimilerbare kilder til carbon, nitrogen og uorganiske salte under neddykkede, aerobe gæringsbetingelser, indtil der er dannet en 20 væsentlig mængde af det nævnte antibioticum.
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at antibioticummet separeres fra gæringsmediet. 25
3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at gæringsmediet inddampes til tørhed. 30 35
DK323482A 1981-07-20 1982-07-19 Fremgangsmaade til fremstilling af et poly(cyclisk-ether)-antibioticum kaldet cp-53607 DK158746C (da)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US28526481 1981-07-20
US06/285,264 US4361649A (en) 1981-07-20 1981-07-20 Polycyclic ether antibiotic

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DK323482A DK323482A (da) 1983-01-21
DK158746B true DK158746B (da) 1990-07-09
DK158746C DK158746C (da) 1990-12-03

Family

ID=23093491

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK323482A DK158746C (da) 1981-07-20 1982-07-19 Fremgangsmaade til fremstilling af et poly(cyclisk-ether)-antibioticum kaldet cp-53607

Country Status (28)

Country Link
US (1) US4361649A (da)
EP (1) EP0070669B1 (da)
JP (1) JPS5859987A (da)
KR (1) KR860000217B1 (da)
AR (1) AR227730A1 (da)
AT (1) ATE16107T1 (da)
AU (1) AU533091B2 (da)
CA (1) CA1182414A (da)
CS (1) CS229936B2 (da)
DD (1) DD208990A5 (da)
DE (1) DE3266931D1 (da)
DK (1) DK158746C (da)
ES (1) ES514141A0 (da)
FI (1) FI71950C (da)
GR (1) GR77226B (da)
HU (1) HU189600B (da)
IE (1) IE53265B1 (da)
IN (1) IN158870B (da)
MX (1) MX7192E (da)
NO (1) NO156653C (da)
NZ (1) NZ201314A (da)
PH (1) PH17606A (da)
PL (1) PL130945B1 (da)
PT (1) PT75268B (da)
SU (1) SU1151219A3 (da)
YU (1) YU42781B (da)
ZA (1) ZA825129B (da)
ZW (1) ZW12582A1 (da)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4510317A (en) * 1983-07-28 1985-04-09 Hoffmann-La Roche Inc. Antibiotic X-14934A
US4552843A (en) * 1984-02-17 1985-11-12 Pfizer Inc. Process for producing an acidic polycyclic ether antibiotic by cultivation of a novel strain of Streptomyces endus subspecies aureus
US4625041A (en) * 1984-02-17 1986-11-25 Pfizer Inc. Acidic polycyclic ether antibiotic
US5275938A (en) * 1984-03-09 1994-01-04 Nisshin Flour Milling Co., Ltd. Process for producing leucanicidin
FR2570378B1 (fr) * 1984-09-19 1987-05-22 Sanofi Sa Nouvel ionophore polyether, procede d'obtention et compositions veterinaires alimentaires ou therapeutiques le contenant
IN166452B (da) * 1985-04-09 1990-05-12 Pfizer
US5665542A (en) * 1989-11-03 1997-09-09 Research Institute Of Palo Alto Medical Foundation Toxoplasma gondii P28 gene and methods for its use
EP3402586B1 (en) 2016-03-23 2021-06-30 New York Air Brake LLC Adsorption drying unit and method of operating the same

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2771392A (en) * 1953-04-06 1956-11-20 Pfizer & Co C Carbomycin complexes
US2991230A (en) * 1959-06-24 1961-07-04 Pfizer & Co C Oxygenation of steroids with streptomyces halstedii
US4022885A (en) * 1975-02-10 1977-05-10 Pfizer Inc. Polycyclic ether antibiotic
FR2408619A1 (fr) * 1977-10-07 1979-06-08 Rhone Poulenc Ind Nouvelle substance anticoccidienne et sa preparation par culture d'un streptomyces
US4283493A (en) * 1978-09-22 1981-08-11 Hoffmann-La Roche Inc. Process of producing antibiotic X-14766A by a streptomyces
JPS5592387A (en) * 1978-12-29 1980-07-12 Taisho Pharmaceut Co Ltd Antibiotic substance tm-531
JPS5758687A (en) * 1980-09-27 1982-04-08 Taisho Pharmaceut Co Ltd Antibiotic

Also Published As

Publication number Publication date
NO156653C (no) 1987-10-28
FI822544L (fi) 1983-01-21
FI822544A0 (fi) 1982-07-19
SU1151219A3 (ru) 1985-04-15
ZA825129B (en) 1983-05-25
NZ201314A (en) 1984-10-19
IE821720L (en) 1983-01-20
DK323482A (da) 1983-01-21
ES8308360A1 (es) 1983-08-16
FI71950B (fi) 1986-11-28
EP0070669A1 (en) 1983-01-26
PH17606A (en) 1984-10-05
US4361649A (en) 1982-11-30
NO822480L (no) 1983-01-21
DD208990A5 (de) 1984-04-18
PL130945B1 (en) 1984-09-29
JPS6248671B2 (da) 1987-10-15
NO156653B (no) 1987-07-20
HU189600B (en) 1986-07-28
AU533091B2 (en) 1983-10-27
CS229936B2 (en) 1984-07-16
EP0070669B1 (en) 1985-10-16
JPS5859987A (ja) 1983-04-09
DK158746C (da) 1990-12-03
ZW12582A1 (en) 1982-09-18
MX7192E (es) 1987-12-23
AR227730A1 (es) 1982-11-30
ATE16107T1 (de) 1985-11-15
IE53265B1 (en) 1988-09-28
YU155982A (en) 1984-12-31
PT75268B (en) 1985-12-13
KR840000642A (ko) 1984-02-25
CA1182414A (en) 1985-02-12
ES514141A0 (es) 1983-08-16
KR860000217B1 (ko) 1986-03-15
PT75268A (en) 1982-08-01
GR77226B (da) 1984-09-11
PL237567A1 (en) 1983-03-14
YU42781B (en) 1988-12-31
FI71950C (fi) 1987-03-09
DE3266931D1 (en) 1985-11-21
IN158870B (da) 1987-02-07
AU8615582A (en) 1983-02-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4195079A (en) New polycyclic ether antibiotic
US4992423A (en) Polycyclic ether antibiotics
US4431801A (en) Polycyclic ether antibiotic
US4361649A (en) Polycyclic ether antibiotic
US4533553A (en) Polycyclic ether antibiotic
EP0117107B1 (en) Dianemycin derivative and process therefor
US4625041A (en) Acidic polycyclic ether antibiotic
US4552843A (en) Process for producing an acidic polycyclic ether antibiotic by cultivation of a novel strain of Streptomyces endus subspecies aureus
AU622557B2 (en) Novel acidic polycyclic ether antibiotics and microorganisms useful in the production thereof
US4707493A (en) 19-epi-dianemycin as an anticoccidial and antibacterial agent
GB1566019A (en) Polycyclic ether antibiotic produced by species of dactylosporangium

Legal Events

Date Code Title Description
PBP Patent lapsed