HU189600B

HU189600B - Process for producing new polycylic ester derivatives and pharmaceutical compositions containing them

Info

Publication number: HU189600B
Application number: HU822286A
Authority: HU
Inventors: Walter D Celmer; Walter P Cullen; Riichiro Shibakawa; Junsuke Tone
Original assignee: Pfizer Inc,Us
Priority date: 1981-07-20
Filing date: 1982-07-14
Publication date: 1986-07-28
Also published as: US4361649A; JPS5859987A; MX7192E; ES8308360A1; PT75268A; NZ201314A; DE3266931D1; NO156653C; CA1182414A; NO156653B; PL130945B1; SU1151219A3; FI71950C; YU42781B; ZW12582A1; IE53265B1; FI71950B; PH17606A; AR227730A1; IN158870B

Description

A találmány tárgya eljárás új savas policiklusos éter-típusú antibiotikumok előállítására.

A savas policiklusos éter antibiotikumokat biológiailag a mitochondriumokban történő kation szállítására gyakorolt hatásukkal jellemezzük. Ez az antibiotikum család a következőket foglalja magába: monensin [7. Amer. Chem. Soc., 89-5Ί3Ί (1967)]; nigericin [Biochem. Biophys. Rés. Comm., 33; 29, (1968)]; grisorixin [7. Chem. Soc., Chem. Commun., 1421 (1970)]; dianemycin [7. Antibiotics, 22; 161 (1969)]; salinomycin [7. Antibiotics, 27: 814 (1974)]; X-537A [J. Chem. Soc., Chem. Commun., 967 (1972)]; X-206 [7. Chem. Soc., Chem. Commun., 927 (1971)]; A204A [7. Amer. Chem. Soc., 95: 3399 (1973)]; mutalomycin [7. Antibiotics, 30: 903, (1977)]; ionomycin [7. Amer. Chem. Soc., 101: 3344 (1979)]; K-41B [7. Antibiotics, 32: 169 (1979)]; A130B és A-130C [7. Antibiotics, 33: 94 (1980)]; leuseramycin [7. Antibiotics. 33: 137, (1980)]; és A-28695B [7. Antibiotics, 33: 252 (1980)]. A témát ismerteti az alábbi irodalom is: Westley, „Polyether Antibiotics”, Adv. Appl. Microbiol., 22: 177. (1977)].

A fent felsorolt policiklusos éter antibiotikumok hatásosak Gram-pozitív baktériumokkal, gombákkal és protozoákkal szemben. Ezek az antibiotikumok jelentős antikokcidiális aktivitást is mutatnak.

A jól ismert protozoa-okozta betegség, a kokcidiózis, továbbra is komoly problémát jelent, befolyásolása nagy gazdasági jelentőségű az állatgyógyászat, különösen a baromfitenyésztés szempontjából. A kokcidiózist egy vagy több Eimeria vagy Isospora fajta fertőzése okozza (Lund és Farr, „Diseases ofPoultry”, 5. kiadás, Biesterand Schwarte, Eds., Iowa State University Press, Ames, la., 1965, 1056-1096).

Hat kokcidium fajta okoz könnyen felismerhető betegséget az érzékeny csirkéken. Áz Eimeria tenella, E. necatrix, E. brunetti, E. acervulina, E. maxima és az E. mivati vagy közvetlenül az emésztőrendszer hámsejtjeinek pusztulását okozza vagy közvetetten toxinok termelésével okoz betegséget. Másik három, ugyanahhoz a fajhoz tartozó protozoa fajta viszonylag ártalmatlannak tekinthető, ennek ellenére az E. mitis, E. hagani és az E. praecox is okozhat súlycsökkenést, rosszabb táplálékhasznosítást, és hátrányosan befolyásolhatja a tojástermelést.

Mivel a kokcidiózis nagy gazdaságossági veszteségeket okoz, és bizonyos ismert kokcidiózis elleni szerek nem hatékonyak, a kutatás tovább folyik jobb kokcidiózis elleni szerek kutatása érdekében.

Az enteritisz a másik olyan betegség, amely igen nagy károkat okozhat az állattenyésztőknek. Az enteritisz előfordul csirkénél, sertésnél, szarvasmarhánál, és birkánál, és főként anaerob baktériumok, különösen a Clostridium perfringens, és vírusok okozzák. A kérődzők enterotoxémiáját, például a birkák „zabálási betegségé”-t C. perfringens fertőzés okozza.

A sertés dizentéria egyike a legmindennaposabb sertésbetegségeknek az Egyesült Államokban. A betegség más országokban is elterjedt és évente sok ezer dollár veszteséget okoz a sertéstenyésztőknek szerte a világon. Napjainkban fedezték fel, hogy egy nagy spirochéta a betegség okozója. Ezt a kórokozót, a Treponema hyodysenteriae-t most izolálták, és bebizonyosodott, hogy képes kiváltani a betegségeket. [Harris, D. L. és társai: „Swine Dysentery-1 Inoculation of Pigs with Treponema hyodysenteriae (New Species) and Reproduction of the Disease”, Vet. MedjSAC, 67: 61-64: 1972], Az alább közök vizsgálati adatok az ezzel a kórokozóval kapcsolatos vizsgálatokra vonatkoznak. Meg kell említeni, hogy nem ismeretes, vajon a T. hyodysanteriae okozza-e egyedül a sertés dizentériát. A rendelkezésre álló adatokból arra lehet következtetni, hogy elsődleges okozója a fertőzésnek.

A teljesítmény növekedés (nagyobb növekedési sebesség és/vagy jobb táplálékhasznosítás) a kérődzők, így a szarvasmarhák esetében a másik kívánatos gazdaságossági célkitűzése az állatgyógyászatnak. A kérődzőeleség fő tápláló részének, a szénhidrátoknak a hasznosítási mechanizmusa jól ismert. Az állat bendőjében mikroorganizmusok lebontják a szénhidrátokat monoszaharidokká, majd a monoszaharidokat piroszőlősavas észterekké alakítják. A piroszőlősavas észterek mikrobiológiai folyamatok által metabolizálódnak és acetátok, butirátok vagy propionátok keletkeznek, ezek együttesen illékony zsírsavakként (VFA) ismeretesek.

A témát részletesebben az alábbi irodalmak tárgyalják: Leng, „Physiology of Digestion and Metabolism in the Ruminant”, Phillipson és társai, Eds., Oriel Press, Newcastle-upon-Tyne, England, 1970, 408^410.

A VFA hasznosítás relatív hatékonyságát tárgyalják a következő irodalmak is: McCullough, „Freedstuffs”, June 19, 1971, 19; Eskeland és társai, 7. An. Sci. 33, 282, (1971); Church és társai, „Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants”, Vol. 2, 1971, 622-625. Bár az acetátokat és a butirátokat is hasznosítják az állatok, a propionátokat nagyobb hatékonysággal hasznosítják. Sőt, ha túl kevés propionát áll rendelkezésre, az állatokban ketózis léphet fel. Egy megfelelő hatású vegyület elősegítheti azt, hogy az állatok nagyobb százalékban alakítsanak át a szénhidrátokból propionátokat, így megnövelve a szénhidrát hasznosítás hatékonyságát és egyidejűleg csökkentve a ketózis előfordulását.

Egy másik betegséget, amely veszteséget okoz az állattenyésztőknek, a Theileria fajhoz tartozó protozoa parazita okozza. Ez a betegség, a teileriózis, vagyis Theileria okozta fertőzés, mint „keleti parti láz”, „tengerpati láz”, vagy „Rodéziai kullancsláz” néven ismeretes. A Theileria parazita megfertőzi az állatot, de nem pusztítja el a vörös vértesteket, ami akut vagy krónikus lázas fertőzéseket idéz elő. A szarvasmarhában a betegség magas lázzal, nyirokcsomó-duzzanatokkal, lesoványodással jár, és nagy a halálozási arány. A betegség igen komoly problémát jelent Kelet- és Közép-Afrikában. A teileriózissal bővebben foglalkoznak az alábbi irodalmak: „The Merck Veterinary Manual”, Siegmund és társai, Eds., Merck & Co., Rahway, N. J., 5. kiadás, 431-433 (1979).

A találmány tárgya eljárás új savas policiklusos éter típusú antibiotikum előállítására, amelyet Ja-21

189 600 pánból származó talajmintából izolált Streptomyces halstedii ATCC 31812 vizes táptalajon, süllyesztett aerob tenyésztésével állítunk elő. Az antibiotikum és kationos sói sokféle mikroorganizmussal szemben hatásosak, és hatékonyan befolyásolják a kokcidiózist, enteritiszt, sertés dizentériát és a teileriózist, valamint hatásosan elősegítik a baromfiak és a kérődzők növekedését.

A mellékelt rajzokon a következő infravörös abszoprciós spektrumok (KBr) láthatók: 1. ábra:

53,607 antibiotikum (a találmány szerinti eljárással előállított vegyület) nátrium-só formában; 2. ábra:

53,607 antibiotikum, szabad sav formában.

A találmány szerinti eljárással előállított antibiotikumot termelő mikroorganizmus törzset egy Japánban, Hirosimában vett talajmintából izoláltuk. A mikroorganizmus, morfológiai jellemvonásait tekintve Streptomyces. Kevés Actinomycetales gombafonalat találtunk, és légmicéliumot, a Streptomyces nemzetség spóraláncaival. A nemzetségi azonosítást sejtfal analízissel végeztük.

A mikroorganizmus tenyészetet egy ferde agaros tenyészetről ATCC* 172 folyadékközegbe oltottuk és 4 napig 28 ’C-on egy rázógépben tartottuk. Ezután kivettük a tenyészetet a rázógépből, centrifugáltuk, steril desztillált vízzel háromszor átmostuk és az Actinomycetales tagok azonosítására közönségesen használt közegekre telepítettük.

Az inkubálás, ha csak külön meg nem említjük, 28 ’C-on történt, és az eredményeket megfelelő időnként feljegyeztük; az itt megadott eredményeket két hetes inkubálás után kaptuk, az ettől eltérőeket külön említjük.

A tenyészet jellemzésére használt azonosító közegeket, és az összetételükre vonatkozó referenciákat az alábbiakban soroljuk fel:

1. Tripton élesztőkivonat táptalaj - (ISP * tápközeg, Difco).

2. Élesztőkivonat-malátakivonat agar - (ISP * tápközeg, Difco).

3. Durva zabliszt agar - (ISP * 3 tápközeg, Difco).

4. Szervetlen sók - keményítő agar - (ISP * tápközeg, Difco).

5. Glicerin - aszparagin agar - (ISP # 5 tápközeg, Difco).

6. Pepton - élesztőkivonat agar - (ISP # 6 tápközeg, Difco).

7. Czapek - szaharóz agar - S. A. Waksman, „The Actinomycetes”, Vol. 2. 1. számú tápközeg, 328. o„ 1961.

8. Glükóz aszparagin agar - Ibid, 2. számú tápközeg, 328. o.

9. Bennet-féle agar - Ibid, 30. számú tápközeg, 331. oldal.

10. Emerson-féle agar - Ibid, 28. számú tápközeg, 331. o.

11. Húsleves (Nutrient) agar - Ibid, 14. számú tápközeg, 330. o.

12. Gordon és Smith-féle tirozin Agar - R. E. Gordon és Μ. M. Smith, Jr. Bact. 69: 147-150, 1955.

13. Kazein agar - Ibid.

14. Kalcium malát agar - S. A. Waksman, Bact. Rév. 21: 1-29, 1957.

15. Zselatin - R. E. Gordon és J. M. Mihm, Jr. Bact. 73: 15-29, 1957.

16. Keményítő - Ibid.

17. Szerves nitrátos táptalaj - Ibid.

18. Dextróz nitrátos táptalaj - S. A. Waksman, „The Actinomycetes” Vol. 2. 1. számú tápközeg, 328. o. 1961, 30 g szaharózzal helyettesített 3 g dextrózzal, az agar elhagyva.

Burgonya - sárgarépa agar - Μ. P. Lechevalier, Jr. Láb. and Clin. Med. 71; 934-944, 1968, de csak 30 g burgonyát, 2,5 g sárgarépát és 20 g agart használtunk.

2% Csapvizes agar.

Lefölözött tej - Difco.

Cellulóz hasznosítás a) H. L. Jensen, Proc. Linn. Soc. N. S. W. 55: 231-248, 1930.

b) M. Levine and H. W. Schoenlein, „A Compilation of Culture Media”, 2511 számú tápközeg, 1930.

23. Szénhidrátok - ISP 9 tápközeg, Difco; Nonomvra and Ohara féle C-2 közeg, lásd: Nonomura, E. and Y. Ohara, J. Ferment. Technoi. 49: 887-894, 1971.

24. Hőmérséklet-tartomány - ATCC 172 tápközeg, „ATCC Culture Collection Catalogue”, 14. kiadás, 518. o. 1980.

Az új tenyészetet (Pfizer N393-39) az alábbiakban jellemezzük a különböző közegeken: a színeket az általános terminológiának megfelelően írjuk le, de a pontos színárnyalatokat a Color Harmony Manual negyedik kiadásában levő színmintákkal történt összehasonlítás alapján határoztuk meg.

Elesztőkivonat - malátakivonat agar - A növekedés jó, a krémszínűtől a világossárgáig (2 ca-hoz közeli, mérsékelten kidomborodó, sima, a durvától a barázdásig, légmicélium nincs, a hátoldal ugyanolyan mint a felület; nincs oldható pigment.

Durva zabliszt agar - A növekedés mérsékelt, a szürkétől a barnásszürkéig (2 ge, 2 Ig-től a 2 ni-ig), a vékonytól az enyhén kidomborodóig, sima kis fehér pontokkal; szórványos légmicélium, fehértől a halvány szürkésig; a hátoldal ugyanolyan mint a felület; világossárgás színű oldható pigment.

Szerves sók - keményítő agar - A növekedés mérsékelt, sárgásbarnától a barnáig (2 ic, 3 ne-tól 3 le-ig), vékony, sima, légmicélium nincs; a hátoldal ugyanolyan mint a felület; nincs oldható pigment.

Glic erin - aszparagin agar - A növekedés a gyengétől ε mérsékeltig, matt fehér; vékony, sima, kevés kis fehér· pontocskával; szórványos légmicélium, fehér; a hátoldal ugyanolyan mint a felület; nincs oldható pigment.

Gordon és Smith féle tirozin agar - A növekedés a gyengétől a mérsékeltig, a színtelentől a krémszínűig (2 ca), vékony, sima, nincs légmicélium; a hátoldal ugyanolyan mint a felület, nincs oldható pigment.

Czapek-szaharóz agar - A növekedés gyenge, színtelentől a mattfehérig, vékony, sima, kevés kis fehér pontszerű légmicéliummal; a hátoldal ugyanolyan nint a felület; nincs oldható pigment.

Glüi óz-aszparagin agar - A növekedés mérsékelt, sárgásszürkétől a levendulaszürkéig (2 ig.

189.600 ge-től 3 ig-ig), vékony, sima, de a széle mellett enyhén redőzött; a légmicélium halványszürke (2 ge); a hátoldal ugyanolyan mint a felület; sárgás színű oldható pigment.

Kálcium malát agar - A növekedés gyenge, színtelen, mattfehér széllel, besüllyedt, sima, légmicéliumok kis szürkés pontocskáival (közel a 2 de 2 fe szürke sorozathoz); a hátoldal ugyanolyan mint a felület; nincs oldható pigment.

Kazein agar - A növekedés mérsékelt, halványbarnás (2 ne - 3 ne), vékony, simától az enyhén durváig, nincs légmicélium, a hátoldal ugyanolyan mint a felület; nincs oldható pigment.

Bennet-féle agar - A növekedés jó, barna (3 ng3 ni), kidomborodó, redőzött, nincs légmicélium, a hátoldal ugyanolyan mint a felület; halványsárgás (2 ca) oldható pigment.

Emerson-féle agar - A növekedés a mérsékelttől a jóig, halvány sárgásbarnától (2 ca - 3 ca) a zöldesszürkéig (23 ge - 23 ig), vékonytól a kidomborodóig, simától az enyhén durváig, vagy előfordulnak membránszerű behúzódások, amelyek szabálytalanul redőzöttek, nincs légmicélium, a hátoldal ugyanolyan, mint a felület, nincs oldható pigment.

Húsleves (Nutrient) agar - A növekedés a gyengétől a mérsékeltig, halvány sárgás (2 ca) színű, vékony, sima, nincs légmicélium; a hátoldal ugyanolyan mint a felület; nincs oldható pigment.

Zselatin agar - A növekedés mérsékelt, halvány sárgás (2 ca), véklony, sima, nincs légmicélium; a hátoldal ugyanolyan mint a felület, nincs oldható pigment.

Keményítő agar - A növekedés jó, krémszínű, halvány sárgástól a halvány sárgásbarnáig (2 ca-tól a 3 gc-hez közel), vékonytól az enyhén kidomborodóig, sima, de a szélek felé redőzött, nincs légmicélium; a hátoldal ugyanolyan mint a felület; nincs oldható pigment.

Burgonya sárgarépa agar - A növekedés mérsékelt, krémszínű (2 ca) szürkéstől a sötétszürkés széllel (közel a 2 fe, 2 ih - 2 ml szürke sorozathoz), vékony, szürkétől a sötétszürkéig terjedő színű sima légmicélium, a hátoldal ugyanolyan mint a felület, nincs oldható pigment.

Csapvíz agar - A növekedés gyenge, színtelentől a mattfehérig, vékony, sima, kevés fehér légmicéliumpontocskával; a hátoldal ugyanolyan mint a felület; nincs oldható pigment.

A biokémiai tulajdonságokat az alábbiakban foglaljuk össze:

1. Melanin nem termelődik

2. Kénhidrogén nem termelődik

3. A zselatin elfolyósodik

4. A keményítő hidrolizál

5. A nitrát nitritté redukálódik

6. Gyér növekedés Jensen féle cellulózon

7. Nincs növekedés Levine és Schoenlein féle cellulózon

8. Egyik cellulóz közegen sincs lebomlás

9. Nincs koaguláció tejen

10. Nincs peptonizáció tejen

11. Nincs kazein, kalcium malát és tirozin emésztés

12. Szénhidrát hasznosítás:

I. Nomomura közegen glüklóz, arabinóz és xilóz hasznosítás; a raffinóz hasznosítás kétséges; szaharóz, inozit, mannit, fruktóz és ramnóz hasznosítás nincs.

II. ISP # 9 közegen glükóz, arabinóz, xilóz és szaharóz hasznosítás; fruktóz, inozit, mannit, raffinóz és ramnóz hasznosítás nincs.

Burgonya sárgarépa agaron, 15 napos inkubáció után a következő morfológiai megfigyeléseket végeztük :

Spóra tömeg szürke színű csoportokban; a spóraláncok egyenesek, görbültek, szabálytalanul hajladozók vagy hullámosak, ritkán összekapcsolódottak, spóralánconként 10-30 spóra van, ritkán előfordul spóralánconként 10-nél kevesebb spóra; a spórák oválisak, ellipszis alakúak vagy pálcaalakúak, 1-1,8 x 0,8-0,9 pm méretűek, simák, pásztázó elektronmikroszkópos megfigyelések alapján.

A .hőmérsékletnek a növekedési sebességre gyakorolt hatása a következőkben látható:

Hőmérséklet Növekedés °C jótól a kiválóig °C jó °C mérsékelt °C gyenge

Amint fentebb említettük, sejtfal analízissel a tenyészetet Streptomyces nemzetséghez tartozónak találtuk. Egész-sejtes analízis LL-diamino-pimelinsav és glicin jelenlétét és a jellemző cukrok hiányát fedte fel. Az egész-sejtes aminosav és cukor analízisekhez használt módszereket a következő irodalmakban írják le: Becker, B. és társai, Appl. Microbiol., 12: 421-423, 1964; Lechevalier, Μ. P. J. Láb. Clin. Med. 71: 934-944, 1968.

Az N393-39 tenyészet halványszürke-szürke színű spóratömeggel, egyenes-hajlékony spóraláncokkal, sima spórákkal és melaminképzésre való képtelenséggel jellemezhető. Az LL-diamino-pimelinsav jelenléte és a jellemző cukrok hiánya az egészsejtes hidrolizátumokban kétségtelenné teszi, hogy a tenyészet a Streptomyces nemzetséghez tartozik. A tenyészet legjobban a Shirling, Ε. B. és Gottlieb, D., (1968, Int. J. Syst. Bacteriol., 18: 69-189) által leírt Streptomyces halstedii-hez hasonlít, és így az

5. halstedii ATCC 10897 standard törzset használtuk összehasonlításul. Mindkét tenyészet megegyezett a következő tulajdonságokban: spóraláncok morfológiája, spórafelület morfológiája, negatív melamin képződés, valamint megegyeztek a legtöbb biokémiai tulajdonságban is. Az N393-39 tenyészet a következőkben különbözött az 5. halstedii tenyészettől: a legtöbb közeg esetében hiányoztak a légmicéliumok; inkább barnás, mint szürkésfekete telepes hátoldal ISP * 2, ISP #3 és ISP * 4 közegen; negatív H₂S termelés és fruktóz-hasznosítási képtelenség. Mivel ezek a különbségek csupán csekély változatokat jelentenek egy Streptomyces fajta törzsei között az N393-39-et új Streptomyces halstedii törzsnek tekintjük.

Az új tenyészetet (Pfizer N393-39) 1981. február 23-án helyeztük letétbe, a letétbehelyezés helye: American Type Culture Collection, Rockwille, Maryland. Az új tenyészet a Streptomyces halstedii ATCC 31812 deponálási számot kapta. A tenyé-41 .189 600 szetnek a köz számára való hozzáférhetősége a szabadalom megadása után a szabadalom egész oltalmi idejére kiterjed. Amíg a szabadalmi bejelentés függőben van, a tenyészethez 37CFR 1.14 és 35 USC 112 hivatkozási számmal lehet hozzáférni. A hozzáférhetőség minden korlátozása megszűnik a szabadalom megadásával.

A Streptomyces halstedii ATCC 31812 tenyésztését olyan körülmények között végeztük, amelyek hasonlóak a poliéter antibiotikumokat termelő mikroorganizmusok fermentációs körülményeihez. Ilyen fermentációról ir a 4 195 079 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás. A tenyésztést előnyösen vizes tápközegben, süllyesztett aerob körülmények között, keverés mellett, 24 °C-36 °C hőmérsékleten hajtjuk végre. A tenyésztéshez használt tápközeg emészthető szénforrás, így cukrok, keményítők és glicerin; szerves nitrogénforrás, így kazein, kazein enzimatikus kivonata, durva szójaliszt, durva gyapotmagliszt, durva mogyoróliszt, búzaglutén, finom szójaliszt, húsliszt és halliszt lehet. Növekedést elősegítő anyagokként előnyösen gabonaoldatokat és élesztőkivonatot, valamint sókat, így nátrium-kloridot és kálcium-karbonátot, nyomelemeket, így vasat, magnéziumot, cinket, kobaltot és mangánt alkalmazhatunk. A fermentáció alatt intenzív habzás következik be, ezért a fermentációs közeghez habzásgátló anyagokat, így növényi olajokat vagy szilikonokat adhatunk. A fermentorokban a közeg levegőztetését előnyösen úgy oldhatjuk meg, hogy a fermentációs táptalaj térfogatára nézve körülbelül 1/2-2 térfogat steril levegőt áramoltatunk át percenként a táptalajon, egy levegőeloszlató segítségével. A keverést a fermentációs iparban ismert keverők felhasználásával biztosíthatjuk. A keverés sebessége az alkalmazott keverő típusától függ. Egy rázó-lombik általában 150-200 percenkénti fordulatszámmal forog, míg egy fermentor keverője általában 300-600 percenkénti fordulatszámmal. Természetesen fontos az aszeptikus körülmények fenntartása az egész tenyésztés alatt.

A találmány szerinti eljárással előállított antibiotikum előállításához szükséges oltóanyagot egy ferde tenyészetből származó anyagból nyerhetjük. Az oltáshoz használt anyag tenyésztése lehet rázólombikban vagy inokulum fermentorban, vagy az inokulum fermentort beolthatjuk a rázó-lombikból. Rázó-lombikokban a növekedés maximális értéke 2-4 nap alatt érhető el, míg az oltóanyag süllyesztett inokulum fermentorokban általában 1 1/2-3 nap alatt éri el legelőnyösebb periódusát.

A fermentáció alatt az antibiotikum termelés előrehaladását és a fermentációs táptalaj bioaktivitását a táptalaj biológiai vizsgálatával ellenőrizhetjük, egy érzékeny Staphylococcus aureus vagy Bacillus subtilis törzs felhasználásával. Erre a célra a

5. aureus ATCC 6538 és B. subtilis ACCC 6633 törzsek megfelelőek. Lemezes vizsgáló módszert alkalmazunk, amelyben a táptalajjal átitatott szűrőpapír gyűrű által körülvett gátló zónát használjuk az antibiotikus hatóképesség mértékéül. Szilikagéles vékonyréteg kromatográfia is használható a fermentációs közegben termelődött antibiotikum és a fermentációs táptalajból extrahált nyers és tisztított anyagok összetételének analizálására. Az. Analtech szilikagél GF kromatogramokat etilacetát/metanollal (9:1) vagy kloroform/metanollal (9:1) futtatjuk. Az antibiotikumot előhívhatjuk oly módon, hogy a lemezt vanillin etanolos kénsavas oldatával (3 g vanillin 97 ml etanolban és 3 ml koncentrált kénsavban oldva) befújjuk és 80 °C-ra melegítjük. Az antibiotikum mint pirosas folt jelentkezik. Az antibiotikum előhívását úgy is elvégezhetjük, hogy a lemezt 5. 6>vz<?w.v-szal vagy B. subtilis-sz-a] beoltott agarral vonjuk be és 37 °C-on 16 óra hosszat inkubáljuk.

Az S halstedii ATCC 31812 fermentációjával termelt antibiotikumot a szüretien fermentációs táptalajból valamilyen szerves oldószerrel, így kloroformmal, etil-acetáttal, metil-izobutil-ketonnal vagy butanollal, a természetes pH értéken történő extra'iálással választhatjuk el és nyerhetjük ki. Az oldószeres extraktumot ezután vákuumban híg sziruppá koncentrálhatjuk.

A találmány szerinti eljárással előállított antibiotikum - a továbbiakban „53,607 antibiotikum” elválasztására és kinyerésére tipikus módszer az alábbi: Az halstedii ATCC 31812 fermentációjából származó teljes táptalajt metil-izobutil-ketonnal ectraháljuk. Az oldószeres extraktumból vákuumdí-sztillációval eltávolítjuk az oldószert, így egy sötét olajat kapunk. Ezt az olajat kloroformban oldjuk és szilikagél ágyra öntjük. Ezután a szilikagél ágyat egymás után kloroformmal, etil-acetáttal és acetonnal mossuk. A mosófrakciókat vékonyréteg-kromatográfiával vizsgálva, az etil-acetátos frakcióban csaknem kizárólag 53,607 antibiotikumot találunk. Az etil-acetátos frakciót szárazra pároljuk, a többi frakciót kiönjük. A száraz etil-acetátos frakciót oszlopkromatográfiásan tisztítjuk oly módon, hogy etil-acetáttal felhígítjuk és etil-acetáttal e'iszaposított szilikagéllel töltött oszlopra öntjük, és etil-acetáttal eluáljuk. A vékonyréteg kromatográfiás vizsgálattal meghatározott, 53,607 antibiotikumot tartalmazó frakciókat egyesítjük, majd bepárlással csökkentjük a térfogatot. Ezt az. anyc got ezután Sephadex LH-20 metanolos töltettel megtöltött oszlopon kromatografáljuk, az

53,607 antibiotikumot tartalmazó frakciókat egyesítjük, csökkentett térfogatúra bepároljuk, majd kloroformmal felhígítjuk. A kloroformos oldatot fosz'örsavval pH = 4,5 értékűre beállított 5%-os mononátrium-foszfát pufferrel mossuk. Az oldószeres fázist ezután 5 s/v %-os dinátrium-foszfát puferrel mossuk, amelynek pH-ját nátrium-hidroxid oldattal pH = 9,0 értékre állítjuk be. Az oldószeres fázist ezután vízmentes nátrium-szulfát felett szárítjuk, és bepároljuk. A maradékot acetonban feloldjuk és hűtőszekrénybe helyezzük, ahol is az

53,607 antibiotikum nátriumsó formájában kikristályosodik. A szabad savat megkapjuk, ha a nátrium só etil-acetátos oldatát pH = 4,5 értékűre beállított vízzel mossuk. Az oldószer elpárologtatósa után megkapjuk az 53,607 antibiotikum kristályos szabad savas formáját.

Az 53,607 antibiotikum analízise az (I) képletű szerkezetet bizonyította.

Az 53,607 antibiotikum gátló hatást mutat számtala í Gram-pozitív mikroorganizmussal szemben.

189 600

Az alább következő I. táblázatban az in vitro MIC (minimális gátlókoncentráció) vizsgálatok eredményeit foglaltuk össze. A vizsgálatban a mikroorganizmusokat olyan kémcsősorozatokba oltottuk, amelyek a tápközeget és különböző koncentrációkban az 53,607 vegyületet tartalmazták. Ez a vizsgálat az antibiotikumnak azt a minimális gátlókoncetnrációját (MIC) határozza meg mcg/ml-ben, amely az organizmusok szaporodását 24 órás pe⁵ rióduson túl meggátolja.

I. táblázat

Mikroorganizmus

MIC, mcg/ml, 53,607 antibiotikum (nátrium só)

Staphylococcus aureus	01A005 O1AO52 01A110 01A400	0,78 0,78 1,56 1,56
Streptococcus faecaiis		02A006	1,56
Streptococcus pyogenes		' 020203	<0,01
Corynebacterium pyogenes		1ID001	25
Bacillus subtilis		06A001	0,39
Bacteroides fragilis		78C004	12,5
		78C009	6,25
		78C0I0	6,25
Bacteroides vulgatis		78E032	3,12
Haemophilus influenza		54A036	6,25
	54A037	3,12
		54A059	12,5
Pasteurelia múltoddá		59A001	>200
Clostridium perfringens		10A002	0,98
		10A003	0,98
Neisseria sicca		66C000	25
Staphylococcus epidermidis		01B087R	0,78
		01B1I1RR	0,78
		01B126	1,56
Fusobacterium necrophorum		84C004	3,12
Treponema hyodysenteriae		94A001	0,39
		94A002	0,098

A Gram-negativ baktériumokkal, mint az Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens és Enterobacteriacese aerogenes, a MIC értékek minden esetben 50nél nagyobbak.

Az 53,607 antibiotikum és kationos sói kiváló aktivitást mutatnak baromfik kokcidiumos fertőzéseivel szemben. 50-200 ppm mennyiségben csirkeeledelbe keverve, ezek a vegyületek igen hatékonyak Eimeria tenella, E. acervulina, E. maxima, E. brunetti és E. necatrix okozta fertőzésekkel szemben.

Az 53,607 antibiotikumnak és sóinak csirkék kokcidiumos fertőzéseivel szemben mutatott hatékonysági adatait a következő módon kaptuk meg. 3-5 darab tíz napos SPF fehér leghorn kakast olyan élelemmel etettünk, amely az élelemben egyenletesen elkeverve tartalmazta az 53,607 antibiotikumot vagy annak nátrium és/vagy kálium sóját. 24 óra után minden csirkét per os beoltottunk a vizsgálni kívánt megfelelő Eimeria fajta oocytáival. Egy má⁵ sik csoport, 3-5 darab tíz napos csirkét olyan táplálékkal etettünk, amely nem tartalmazta az 53,607 antibiotikumot, sem sóit. A csirkéket 24 óra után szintén megfertőztük, és fertőzött kontrollként használtuk fel őket. Egy harmadik, 3-5 tagú tíz ⁴⁰ napos csirkecsoportot olyan táplálékkal etettünk, amely szintén nem tartalmazta az 53,607 antibiotikumot, és ezeket a csirkéket nem is fertőztük meg. Ez volt a normál kontrollcsoport. E. acervulina esetében öt nap után, minden más mikroorganiz⁴⁵mus esetében pedig 10 nap után értékeltük ki az eredményeket. A II. táblázatban foglaljuk össze a kapott eredményeket. A súlynövekedést a csirkéknek a kísérlet kezdetén mért súlyához viszonyítottuk.

. 189 600

II. táblázat

A fertőzéshez használt fajta	Dózis (ppm)	A fertőzés átlagos mértéke	Arány’	Súlynövekedés (%)
Eimeria tenella	200	1,3	0,41	37
	100	1.0 (1,3)	0,32 (0,37)	57 (60)
	50	2,7 (0,3)	0,86 (0,09)	22 (97)
	25	3,0 (1,7)	0,95 (0,49)	47 (102)
Eimeria acervulina	200	1,5	0,75	2
	100	1,2	0,60	22
	50	2,0	1,00	18
	25	2,0	1,00	7
Eimeria necatrix	200	-	-	-
	100	0,0	0,00	69
	50	0,2	0,11	99
	25	0,6	0,33	111
Eimeria maxima	200	1,5	0,94	10
	100	0,8	0,50	37
	50	1,0	0,63	70
	25	1,4	0,88	51
Eimeria brunetti	200	-	-	-
	100	0,4	0,22	47
	50	1,0	0,55	49
	25	2,6	1,44	47

¹ Az antikokcidiális aktivitás (fertőzés átlagos mértéke) mérésére használt ismérvek: E. tenella esetében ezt O-tól 4-ig terjedő sérülési pontszámokkal fejezzük ki, az alábbi irodalomban leírtak alapján: J. E. Lynch, „A New Method fór the Primary Evaluation of Anticoccidial Activity” Am. J. Vet. Rés. 22: 324-326 (1961), más fajták esetében pedig O-tól 3-ig terjedő pontszámokkal, a pontozási rendszer módosított változata alapján, amelyet J. Johnson és W. H. Reid írt le, az alábbi munkájában: „Anticoccidial Drugs. Lesion Scoring Techniques in Battery and Floor Pen Experiments in Chicks”, Exp. Parasit. 28: 30-36 (1970). A táblázatban szereplő arányszámot úgy kapjuk meg, hogy minden vizsgált csoport esetében a sérülési pontszámot elosztjuk a fertőzött kontroll sérülési pontszámával.

Az állati takarmányok értékét általában közvetlenül az állat etetésével határoztuk meg. Az 1 197 826 számú brit szabadalmi leírás részletez egy olyan bendő-módszert, amellyel a táplálékokban a mikroorganizmusok által létrehozott változások könnyen és nagy pontossággal mérhetők, az állati takarmányok értékelése céljából. Ez a módszer egy berendezést alkalmaz, amivel az állatok emésztési folyamatai in vitro figyelhetők és tanulmányozhatók. Az állati eleségeket, a bendő-inokulumot és különféle növekedést serkentő anyagokat egy laboratóriumi egységbe tesszük bele, majd visszanyerjük, gondosan ellenőrzött és szabályozott körülmények között: miközben a mikroorganizmusok emésztik a táplálékot, a bekövetkezett változásokat folyamatosan figyeljük és értékeljük. A bendőfolyadékban a propionsav tartalom növekedése azt jelzi, hogy a növekedést serkentő anyagok megfelelően befolyásolták a kérődzők táplálékhasznosítását. A propionsav tartalom változása a kontroll kérődző folyadékban talált propionsav tartalom százalékában van kifejezve. A bendő-folyadék propionsavtartalmának növekedése és a megnövekedett tápanyag hasznosítás közti kölcsönhatás megbízható kimutatására hosszú időtartamú in vivő etetési vizsgálatokat használunk.

Bendő folyadékot gyűjtünk egy olyan sipolyozott tehénből, amelyet normálisan hizlaló táplálékkal és szénával etetünk. A bendő folyadékot rögtön ²⁵ átszűrjük egy szűrő-szövetén és egy 50 ml-es Erlenmeyer lombikba, amely 400 mg standard táptalajt (68% kukorica keményítő + 17% cellulóz +15% extrahált szójaliszt) 10 ml pH = 6,8 értékű puffért és a vizsgálandó vegyületet tartalmazza, 10 ml-t ³θ teszünk belőle. A lombikot oxigénmentes nitrogénnel telítjük körülbelül két percig, majd körülbelül 16 ó-a hosszat inkubáljuk 39 °C-on, rázott vízfürdőn. Minden vizsgálatot háromszor ismételtünk ^meg' ^Ja Az inkubálás után a minta 5 ml-ét 1 ml 25%-os méta foszforsavval keverjük. 10 perc után 0,25 ml hangyasavat adunk hozzá, ezután a keveréket 10 percig, 1500 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk. A mintákat ezután gáz-folyadék kromatográ⁴⁰fiával vizsgáltuk, az alábbi módszer szerint: D. W. Keling, J. Dairy Science, 52,1690 (1969). A csúcsok magasságát ecetsav, propionsav és vajsav esetében kezeletlen és kezelt inkubációs lombikból származó minták alapján határoztuk meg.

Ezzel az in vitro módszerrel vizsgálva, az 53,607 antibiotikum 20 pg/ml szintnél körülbelül 57%-os emelkedést okozott a propionsav termelődésben, szemben az 53,607 antibiotikumot nem tartalmazó kontroll oldatok propionsav termelésével. A keres50 kedelemben kapható Monensin-nel (amely szintén policiklusos éter antibiotikum) összehasonlítva, ez utóbbi 10 pg/ml szintnél körülbelül 20%-os propionsav emelkedést eredményezett, a kontrolihoz képest. [/. Amer. Chem. Soc., 89, 5737 (1967)].

5E Salinomycinnel [/. Antibiotics, 27: 814 (1974)] összehasonlítva, az 53,607 antibiotikum körülbelül 43%-os propionsav emelkedést eredményezett 20 gg/rrl szintnél, 5 pg/ml szintnél pedig körülbelül 40%-os emelkedést, összehasonlítva a Salinomycin gC által 5 pg/ml-es szintnél okozott körülbelül 52%-os emelkedéssel.

Ezeknek az adatoknak az alapján azt mondhatjuk, hogy az 53,607 antibiotikum javítja a táplálékhasznosítást kérődzők, így szarvasmarha és birka, .189 600 valamint egy-gyomrú állatok, így sertések, nyulak esetében egyaránt. Az 53,607 antibiotikum belekeverhető az állati takarmánykeverékbe szabad sav, nátrium só, kálium só, vagy ezek keveréke formájában. Az 53,607 antibiotikum nyers formája, vagy az antibiotikumot tartalmazó szárított fermentációs táptalaj szintén belekeverhető az állati eleségbe, a kívánt koncentrációban.

Az alább következő példák a találmány szerinti eljárást illusztrálják anélkül, hogy az oltalmi kört ezekre a példákra korlátoznánk.

1. példa Oltóanyag

A következő összetételű steril vizes tápközeget készítjük el:

Adalékanyag grammjliter

Keményítöcukor 10

Keményítő 20

Élesztő extraktum 5

NZ Amin YTT* 5

Dinátrium-hidrogén-foszfát 0,5

Húsliszt 5

Kobalt-klorid 0,002

Kalcium-karbonát 4 pH = 7,1-7,2

Streptomyces halstedii ATCC 31812 ferde tenyészetéből származó sejteket egy sorozat 300 ml-es lombikba helyezünk, amelyek mindegyike 40 ml-t tartalmaz a fenti steril táptalajból, és egy forgó rázógépen 28-36 °C hőmérsékleten 3-4 napig rázzuk őket.

Fermentáció

A kifejlődött tenyészet megfelelő mennyiségét, ami 2 térf% oltóanyag biztosításához elegendő, négy literes fermentorokba helyezzük, amelyek mindegyike két liter, az alábbi összetételű steril tápközeget tartalmazza:

A dalékanyag grammjliter

Keményítőcukor 10

NZ Amin A* 5

Keményítő 20

Élesztő extraktum 5,0

Kálcium-karbonát 1,0

Kobalt-klorid 0,002

Víz, 1000 ml-es össztérfogathoz * = Enzimatikusan lebontott kazein bejegyzett márkaneve, Humko Sheffield Chemical Co., Inc.

A fermentációt 30 °C-on, 1700 fordulat/perc (RPM) keverési sebességgel, a táptalaj térfogategységére vonatkoztatva percenként egy térfogategység levegővel történő levegőztetéssel, addig folytatjuk, amíg elegendő aktivitás figyelhető meg (a vizsgálati módszer: antibiotikus korong vizsgálat, B. subtilis ATCC 6633**-vel szemben), ez a jelen esetben 3 nap volt. Az egész táptalajt semleges pHértéken leszűrjük, szűrő - Supercel vagy Celite segítségével, a szürletet metil-izobutil-ketonnal vagy n-butanollal extraháljuk. A szerves fázist elszívással elválasztjuk a vizes fázistól, és leszűrjük, a szuszpendált .anyag eltávolítása céljából. A szűrőpogácsát metanollal feliszaposítjuk, szűrjük, a metanolt elpárologtatjuk és a maradékot ugyanaz8 zal az oldószerrel extraháljuk, amit a leszűrt táptalaj extrakciójához használtunk. Az extraktumokat egyesítjük, és vákuumban bepároljuk, míg egy viszkózus olajat kapunk. Az olajat heptánban szuszpendáljuk, szilíkagéllel összekeverjük és szűrjük. A szűrőpogácsát ismételten heptánnal mossuk és a terméket lépésről-lépésre kloforommal, kloroform és etilacetá,t keverékével, majd végül etilacetáttal eluáljuk. A frakciók vékonyréteg kromatográfiája. (TLC) és biológiai vizsgálata után, az aktív frakciókat egyesítjük, vákuumban bepároljuk, és a maradékot újra kromatografáljuk, ily módon szilárd anyagként megkapjuk az 53,607 antibiotikumot.

Infravörös spektrum (KBr) mikron: 2.95, 3.42, 6.00, 6.37, 6.85, 7.14, 7.30, 7.65, 7.90, 8.10, 9.05, 9.15, 9.67, 10.00, 10.18, 10.53, 11.15, 11.40, 11.75, 13.25. Az anyag kloroformban, etil-acetátban, metanolban és metil-izobutil-ketonban oldódik; vízben oldhatatlan.

*.* A táptalaj és az átfolyás után kinyert folyadék bioaktivitását egy érzékeny Bacillus subtilis ATCC 6633 vagy Staphylococcus aureus ATCC 6538 törzs felhasználásával ellenőrizzük. A táptalaj és az átfolyás után kinyert folyadék komponenseit szilikagél lemezeken hívjuk elő a futtatáshoz 9:1 arányú etilacetát/metanol vagy 9:1 arányú kloroform/metanol elegyet használunk és a lemezt vanillinnel befújjuk (3 g vanillin 97,0 ml etanolban és 3,0 ml koncentrált kénsavban feloldva), majd 80 °C-ra melegítjük. A 53,607 antibiotikum pirosas foltként jelentkezik. Vagy, a lemezt agarral beborítjuk, beoltjuk olyan S. aureus-sza\ vagy B. subtilis-sza\, amelyhez 1,0 ml 1 %-os tetrazolium oldatot adtunk, és 37 °C-on 16 óra hosszat inkubáljuk, az antibiotikum előhívása céljából (világos területek piros háttér mellett).

2. példa

Az oltóanyagot az előző példában leírtak szerint készítjük el, azzal a különbséggel, hogy lombikonként 700 ml tápközeget használunk, a rázott Iombikos oltóanyagot - amelyet két oldalcsonkos edényben készítünk össze - 3-4 napig, 28 ’C-on fermentáljuk.

Egy 6420 literes fermentort, amely 4530 liter, az alábbi összetételű steril tápközeget tartalmazott, 10 liter (0,1%), fent leírt oltóanyaggal beoltunk.

Fermentációs tápközeg

Alkotórész grammjliter

Keményítőcukor 1,0

Kazein 5J)

Keményítő 5,0

Kukorica áztató folyadék 5,0 ml

Kálcium-karbonát 3,0

Kobalt-klorid 0,002

Víz, 1 literhez pH = 6,9-7,0

A fermentort 28 ’C hőmérsékleten tartjuk, levegőztetéssel és 1700 fordulat/perc sebességű keveréssel. 120 óra után a fermentor tartalmát feldolgozzuk. Az egész táptalajt (4530 liter) 945 liter metilizobutil-ketonnal extraháljuk, a rétegeket egy extra ktorban (Podbielniak) elválasztjuk, és a szerves . 189 600 fázist vákuumban bepároljuk úgy, hogy 30,3 liter olajat kapjunk. Az olajat vákuumban, egy forgó bepárlóban tovább koncentráljuk. A maradék szirupot heptánban szuszpendáljuk, szilikagéllel összekeverjük és szűrjük, néhányszor heptánnal átmosva. A mosott szűrőpogácsát az 1. példában leírtak szerint dolgozzuk fel, így 300 g olajat kapunk. Az olajat kevés kloroformban feloldjuk, az oldatot egy Lapp szűrőre öntjük, amely 3,5 kg szilikagélt (Merck, 60-as finomság) tartalmaz. Ezután a szilikagél ágyat egymás után 18,4-18,4 liter kloroformmal, etil-acetáttal és acetonnal mossuk. A frakciókat vékonyréteg kromatográfiával vizsgáljuk. A terméket, csaknem kizárólag, az etilacetátos frakcióban találjuk. A többi frakciót kiöntjük, az etil-acetátos frakciót vákuumban szárazra pároljuk, így 150 g koncentrátumot kapunk. Ezt tovább tisztítjuk kromatográfiásan, egy 8,0 x 1000 cm-es oszlopon, amely etil-acetátos szilikagél (Merck, 60-as finomság) töltetet tartalmaz. Az oszlopot etil-acetáttal eluáljuk, 1 liter frakciót 60 ml/ perc sebességgel nyerünk. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, és vákuumban bepároljuk, ily módon 85 g terméket kapunk.

A terméket ezután átengedjük egy olyan oszlopon, amely egy kg Sephadex LH-20-at tartalmaz: majd metanollal eluáljuk 25 ml/perc átfolyási sebességgel. 300 ml-es frakciókat veszünk le. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, és az oldószert elpárologtatva 30 g szilárd anyagot nyerünk. Ezt 500 ml kloroformban oldjuk, az oldatot megfelelő térfogatú 5%-os NaH₂PO₄ pufferrel mossuk, melynek pH-ját 4,5 értékre állítottuk be 85%-os foszforsavval. A szerves fázist elválasztjuk, 500 ml 5%-os Na₂HPO₄ pufferrel mossuk, melynek pH-ját

9-re állítjuk be IN nátrium-hidroxiddal. Ezután az extraktumot vízmentes nátrium-szulfát felett szárítjuk, és vákuumban szárazra pároljuk. A maradékot acetonban oldjuk, és egy hűtőszekrényben hagyjuk kikristályosodni. A kristályokat szűréssel elkülönítjük és nagy vákuumban, szobahőmérsékleten szárítjuk, ekkor 14 g 53,607 antibiotikum nátrium sót kapunk. Olvadáspont: 199-204 ’C. Optikai forgatóképesség:

[a]_D+44° (c = 1, kloroform), [a]_D + 37 ⁰ (c = 1, metanol).

Ultraibolya spektrum: Lmax 233 nm (metanol) Eí*_cm = 212

Infravörös spektrum (KBr) mikron: 2.95, 3.42, 6.00, 6.37, 6.85, 7.14, 7.30, 7.65, 7.90, 8.10, 9.05, 9.67, 10.00, 10.18, 10.53, 11.15, 11.40, 11.75, 13.25.

Az infravörös spektrum az 1. ábrán látható, x tengely: hullámhossz, mikronban; y tengely: %os transzmittancia (fényáteresztés).

Elemanalízis: C: 57,54; H: 7,74; N: 0,0 KH₂PO₄ (pH = 4,5) és K₂HPO₄ puffért (pH érték pH = 9-re beállítva IN nátrium-hidroxiddal) alkalmazva a fenti eljárásban, hasonló módon az

53,607 vegyület kálium sóját kapjuk meg. Hasonló módon eljárva, ha (NH₄)H₂P0₄ és (NH₄)₂PO₄ puffereket használunk, az ammóniumsót kapjuk meg.

3. példa

Az előzőek szerint kapott 53,607 antibiotikum nátiium só egy részét etil-acetátban oldjuk, vizet adunk hozzá és a vizes fázis pH-ját 85%-os foszforsavval pH = 4,5 értékre állítjuk be. A szerves fázist elválasztjuk, nátrium-szulfáton szárítjuk és vákuumban bepároljuk, ily módon megkapjuk az 53,607 antibiotikum szabad savas'alakját. Olvadáspont: 84-94 ’C.

Elemanalízis olyan minta alapján, amit nagy vákuumban, szobahőmérsékleten egy éjszakán át szárító tünk: C 64,69; H 8,91; N: 0,0.

A sav vízben oldhatatlan, kloroformban, etilacetátban, metanolban és metil-izobutil-ketonban oldódik.

[ct]_D + 74,5° (c = 1, kloroform), [a]_u + 49,7° (c = 1, metanol).

Ultraibolya spektrum: L_inas 233 nm (metanol) Ei\, = 198

Infravörös spektrum (KBr) mikron: 2.95, 3.45, 6.00,6.85,7.28,8.13,9.05,9.67, 10.20, 10.55. 11.15, 11.48.

A spektrum a 2. ábrán látható. (Az x és y tengely értelmezése ugyanaz, mint az 1. ábrán.)

A báriumsót úgy állítjuk elő, hogy 80 ml etilacetátban feloldott 2,0 g szabad savat 2,4 g báriumhidroxid-oktahidrátot tartalmazó azonos mennyiségű vízzel összerázunk. A rétegeket szétválasztjuk, a szerves fázist Ba(OH)₂.8H₂O frissen készített oldatéval mossuk, nátrium-szulfát felett szárítjuk és vákuumban bepároljuk, ily módon megkapjuk a kívánt 53,607 antibiotikumsót.

A kálcium sót is a fenti eljárással állítjuk elő, azzal a különbséggel, hogy bárium-hidroxid-oktahidrát helyett kalcium-hidroxidot alkalmazunk.

4. példa

Az 1. példában leírt eljárást alkalmazzuk, de 4 térf% oltóanyagot használunk négy literes fermentorok esetében, ezek mindegyike az alábbi összetételű steril tápközegből 2 litert tartalmaz:

A da lékanyag gramm/liter

Keményítőcukor 10

Kukoricakeményítő 10

Szójaliszt 10

Kalcium-karbonát 1

Kukorica fermentálható szilárd részei 5

Nátrium-klorid 5 pH = 7,0

A fermentációt két napon keresztül, 36 °C-on hajtjuk végre, 1700 fordulat/perc sebességű keveréssel, a levegőztetés sebessége: 2 térfogategység levegő percenként a táptalaj térfogategységére vonatkoztatva. A teljes táptalajt extraháljuk. Kloroformmal és az 1. példában leírtak szerint dolgozzuk fel, ekkor megkapjuk az 53,607 antibiotikum nátrium, kálium és kálcium sóinak keverékét.

Ha a fenti eljárást megismételjük, de a fermentációs közeg keményítőcukor helyett glicerint tartalmaz a kukorica fermentálható szilárd részei helyett pedig hallisztet vagy gyapotmag-lisztet, és a fer-91

189 600 mentációt pH = 8,0 értéken, 28 °C hőmérsékleten, 6 napig hajtjuk végre, az eredmények lényegében változatlanul ugyanazok.

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Eljárás az (I) képletű savas policiklusos éter antibiotikumnak vagy kationos sójának előállítására, azzal jellemezve, hogy Streptomyces halstedii ATCC 31812 letéti számú mikroorganizmust emészthető szén- és nitrogénforrást, valamint szervetlen sókat tartalmazó vizes táptalajon tenyésztünk, süllyesztett aerob fermentációs körülmények között, és kívánt esetben a keletkezett antibiotiku- ¹⁵ mot a tápközegből elválasztjuk, és kívánt esetben kationos sóvá alakítjuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az antibiotikumot elválasztjuk a fermentációs közegtől.
3. Az 1-2. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fermentációs közeget szárazra pároljuk.
4. Eljárás hatóanyagként az (I) képletű vegyületet tartalmazó antibiotikus hatású gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, az 1. igénypont szerint előállított hatóanyagot a gyógyszeriparban szokásosan használt hordozó és/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverve, gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.