CS229936B2 - Production method of polycyclic ehter type new acid antibiotic - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu výroby nových kyselých antibiotik typu polycyklických etherů.

Antibiotika kyselé povahy typu polycyklických etherů jsou sloučeniny, které se účastní biologicky transportu kationtů v mitochondriích. Jde zejména o antibiotika monensin [J. Amer. Chem. Soc., 89-5737 (1967)], nigericin (Bicchem. Biophys. Res. Comm., 33, 29 (1968)] grisorixin [J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1421 (1970)], dianemycln [J. Antibiotics, 22, 161 (1969)], salinomycin [J. Antibiotics, 27, 814 (1974)], X-537A [J. Cihem. Soc., Chem. Comimun., 967 (1972)], X-206 [J. Chem. Soc., Chem. Commun., 927, (1971)], A204A [J. Amer. Chem. Soc., 95, 3399 (1973)], mutalomycin [J. Antibiotics, 30, 903, (1977)], ionomycin [J. Amer. Chem. Soc., 101, 334.4 (1979)], K-41B [J. Antibiotics, 32, 169 (1979)], A-130B а A-130C [J. Antibiotics, 33, 94 (1980)], leuseramycin [J. Antibiotics, 33, 137 (1980)] а A-28695B [J. Antibiotics, 33, 252 (1980)]. Souhrnně byla tato antibiotika popsána v publikaci Westley, „Polyether Antibiotics“, Ady. Appl. Microbiol., 22, 177 (1977).

Svrcíhu uvedená antibiotika typu polycyklickýGli etherů jsou účinná proti grampozitivním bakteriím, houbám a prvokům.

Tato antibiotika jsou také účinnými antikokcidiálními látkami.

Dobře známá choroba kokcidióza, způsobená prvoky je stále vážným problémem a její zábrana má velký hospodářský význam zejména při pěstování drůbeže. Kokcidióza vzniká při infekci jedním nebo větším počtem čeledí Eimeria nebo Isospora, problém byl souhrnně popsán v publikaci Lund a Farr „Diseases of Poultry“ 5. vydání, Biester a Schwarte, Eds., Iowa Statě University Press, Ames, Ia., 1965, str. 1056 až 1096).

Šest čeledí kokcidií může způsobit u kuřat snadno rozeznatelné onemocnění. Eimeria tenella, E. necatrix, E. brunetti, E. acervulina, E. maxima a E. mivati poškozují přímo výstelkové buňky zažívací soustavy a mimoto působí také nepřímo produkcí toxinů. Tři další čeledi, které náleží do téhož rodu se pokládají za poměrně neškodné. Jde o E. mitis, E. hagani a E. praecox, které však přece snižují přírůstky a využití krmivá a mimoto také nepříznivě ovlivňují produkci vajec.

Vzhledem k velkým hospodářským ztrátám v důsledku kokcidiózy a k nevýhodám některých známých antikokcidiálních látek pokračuje výzkum za účelem získání lepších prostředků proti kokcidióze.

Dalším onemocněním, které může způsobit vážné ekonomické ztráty v živočišné produkci, je enteritis. Enterltis se vyskytuje u kuřat, vepřů, skotu a ovcí a je způsobena převážně anaerobními bakteriemi, zejména Clostridium perfingens a viru. Enterotoxemie u přežvýkavců, jejímž projevem může být například „nemoc z přejedení“ u ovcí je způsobena infekcí C. perfrlengens.

Dysenterie vepřů je jednou z nejčastějších chorob vepřů ve Spojených státech. Proto převažuje mimoto i v řadě dalších zemí a ročně způsobuje mnohatisícové ztráty pěstitelů vepřů na celém světě. V poslední době bylo prokázáno, že příčinou tohoto onemocnění . je velká spirorocheta. Tento organismus Treponema hyodysenteriae byl nyní izolován a byla také prokázána jeho (chopnost vyvolat uvedené onemocnění, jak bylo popsáno v publikaci Harris, D. L. a další.: „Sw.ine Dysentery-1 Inoculation of Pigs with Treponema hyodysenteriae (New Spacies) and Reproduction of the Disease,“ Vet. Med/SAC, 67, 61 až 64, 1972. V této publikaci jsou uvedeny výsledky, které budou dále uváděny v souvislosti s uvedeným mikroorganismem. Je však možno zdůraznit, že není známo, zda T. hyodysenteriae je jediným organismem, způsobujících dysenterii vepřů, Z údajů, které jsou k dispozici, může být usuzováno pouze na to, že běží o primární zdroj infekce.

Jedním z .mnoha ukazatelů, sledovaných v poslední době u skotu je zvýšená rychlost růstu a/nebo zvýšené využití krmivá. Zvláště důležité je zrychlení růstu, které se dosahuje zvýšeným využitím krmivá. Mechanismus pro využití hlavní složky krmivá u skotu, kterými jsou uhlohydráty je dobře znám. Mikroorganismy bachoru zvířete rozkládají uhlohydráty za vzniku monosacharidů a pak převádějí tyto monosacharidy na deriváty pyrohroznanu. Pyrohro.znany se metabolizují mikrobiologicky za vzniku ace tátů, butyrátů nebo propionátů, které . se souhrnně nazývají těkavé alifatické kyseliny (VFA). Podrobněji je tento program rozpracován například v publikaci Leng „Physiology of Digestion and Metabolism in the Ruminant.“ Phillipson a další, Eds., Ortel Press, Newcastle-upon-Tyne, Anglie, 1970, str. 408 až 410.

Relativní účinnost využití těkavých . alifatických kyselin je diskutována v publikacích McCullough „Feedstuffs“, 19. června 1971, .str. 19, . Eskeland a další; v J. ' An. Sci. 33, 282 (1971) a Church a další „Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants,“ sv. 2, 19'71, str. 622 a 625. Přestože acetáty a butyráty využívány jsou, propionáty se využívají účinněji. Mimoto v případě, že je v bachoru přítomno příliš malé množství propionátů, může se u zvířat vivinout ketóza. Sloučenina, která tento pochod příznivě ovlivňuje, tedy podrobuje vznik vyššího podílu propionátů z uhlohydrátů, čímž se zvyšuje i účinnost využití uhlohydrátů a také se snižuje výskyt ketózy.

Dalším onemocněním, které způsobuje ekonomické ztráty v živočišné výrobě je onemocnění, způsobené parazitním prvokem rodu Theileria. Onemocnění theilerióza je rovněž známo jako „East Ciast . Fever“, „Coastal fever“ nebo. . „Rhodesian tick fever“. Parazit Theileria se dostává do. červených krvinek, avšak neničí je, čímž vzniká akutní nebo chronické horečnaté infekční onemocnění. U skotu je toto onemocnění doprovázeno horečkou, zvětšením -lymfatických uzlin a vysokou smrtností. Onemocnění je velmi závažné ve východní a střední Africe. Podrobnější popis theileriózy je podán v publikaci „Merek Veterinary Manual“, Seigmund a další, Eds., Merck a Co., Rahway, N. J. 5. vydání, str. 431 až 433 (1979).

Předmětem vynálezu je způsob výroby nových kyselých antibiotik typu polycyklických etherů vzorce

nebo kationtových solí tohoto antibiotika, vyznačující se tím, že se pěstuje mikroorganismus 'Streptomyces helstedii ATCC 31812 při teplotě 21 až 37 °C a pH 6,9 až 8,0 ve vodném živném prostředí .s obsahem využitelného zdroje uhlíku, dusíku a anorganických solí v submerzní kultuře za aerobních podmínek a připravené antibiotikum se z fermentačního. prostředí izoluje.

V přiložených výkresech je znázorněno absorpční spektrum v infračerveném světle v bromidu draselném:

—· obr. 1 znázorňuje spektrum antibiotika 53 607 ve formě sodné soli, — obr. 2 znázorňuje spektrum antibiotika 53 607 ve formě volné kyseliny.

Mikroorganismus, produkující antibiotikum podle vynálezu, byl izolován, ze vzorku půdy, odebraného v Hirošimě v Japonsku. Bylo prokázáno, že mikroorganismus má morfologické znaky Streptomyces. Má však také úzké hyfy rádu Actionomycetal-es a vzdušné mycelium s řetězci spor charakteristické pro· rod Streptomyces. Příslušnost k rodu byla prokázána také analýzou buněčné stěny.

Kultura mikroorganismu byla přeočkována ze šikmého· agaru do kapalného prostředí ATCC · 172 a byla pěstována 4 dny při teplotě 28 °C za stálého míchání. Pak byla kultura vyjmuta z třepačky, odstředěna, třikrát promyta sterilní destilovanou vodou a pěstována na prostředí, které se běžně užívá k identifikaci rodu Actinomycetales.

Kultura byla pěstována při teplotě 28 °C, není-li uvedeno jinak a výsledky byly zaznamenány v běžných časových intervalech.

Prostředí, použitá k identifikaci vlastností kultury byla následující živná prostředí:

1. Bujón s tryptonem a extraktem z kvasnic (ISP prostředí 1, Difco).

2. Agar s extraktem z kvasnic a se sladovým extraktem (ISP prostředí 2, Difco).

3. Agar s ovesnou moukou (ISP prostředí 3, Difco).

4. Agar s anorganickými solemi a škrobem (ISP prostředí 4, D^fco).

5. Agar s glycerolem a sparaginem (ISP prostředí 5, Difco).

6. Agar s peptonem, extraktem z kvasnic a železem (ISP prostředí 6, Difco).

7. Czapkův agar se sacharózou popsaný v publikaci S. A. Waksman, „The Actinomycetes,“ sv. 2, prostředí č. 1, strana 328, 1961.

8. Agar s glukózou a asparaginem, popsaný tamtéž jako prostředí č. 2, str. 323.

9. Bennettův agar popsaný tamtéž jako prostředí č. 30, str. 331.

10. Emersonův agar popsaný tamtéž jako prostředí č. 28, str. 331.

11. Živný agar · popsaný tamtéž jako prostředí č. 14, str. 330.

12. Gordonův a Smithův agar s tyrosinem popsaný v publikaci R. E. Gordon a Μ. M. Smith, Jr. Bact. 69, 147 až 150, 1955.

13. Agar s kaseinem, popsaný tamtéž,

14. Agar s malátem vápenatým popsaný v publikaci S. A. Waksman, Bact. Rev. 21, až 29, 1957.

15. Želatina, prostředí popsané v publikaci R. E. Gordo.n a J. M. Mihrn, Jr. Bact. 73, 15 až 27, 1957.

16. Škrob, prostředí popsáno tamtéž.

17. Bujón s organickými dusičnany, prostředí popsáno tamtéž.

18. Bujón s dexatrózou a dusičnanem, popsaný v publikaci S. A. Waksman, „The Actinomycetes,“ sv. 2, prostředí č. 1, str. 328, 1961, 3 g dextrózy byly nahrazeny 30 g sacharózy a agar byl vynechán.

19. Agar s bramborem a mrkví popsaný v publikaci Μ. P. Lechevalier, Jr. Lab. a Clin. Med. 71, 934 až 944, 1968, avšak bylo užito pouze 30 g brambor, 2,4 g mrkve a 20 g agaru.

20. Agar o koncentraci 2 % ve vodě z vodovodu.

21. Odstředěné mléko Difco· .

22. Využití celulózy:

a) H. L. Jensen, Proč. Linn. Soc. M. S. W. 55, ·231 až 248, 1930.

b) M. Levine a H. W. Schoenlein, „A Compilation of Culture Media,“ prostředí č. 2511, 1930.

23. Uhlohydráty, ISP prostředí 9, Difco, Nonomurovo a Oharaové prostředí C-2, popsané v publikaci Nonomura J. a Y. Ohara, J. Ferment. Technol. 49, ·88 až 894.

24. Teplotní rozmezí — ATCC · prostředí 172, popsané v · „ATCC Culture Collection Catalogue,“ 14. vydání, str. 518, ·1980.

Nová kultura (Pfizer N393-39) byla popsána na různých prostředích, jak bude dále uvedeno, přičemž barvy jsou popsány v běžné terminologii, přesné barvy byly stanoveny srovnáním s barevnými standardy v Color Harmony Manual, 4. vydání:

Agar s extraktem z kvasnic a se sladovým extraktem: růst dobrý, barva krémová až bledě žlutavá (v blízkosti 2 ca), · kolonie mírně zvýšené, hladké, drsné až zvrásněné, vzdušné mycelium se netvoří, zadní strana je stejná jako povrch, rozpustný pigment se nevytváří.

Agar s ovesnou moukou: růst střední, barva šedá až hnědošedá (2 ge, 2 lg až ·2 ni), kolonie ploché až mírně zvýšené, hladké s malými bílými skvrnami, vzdušné mycelium málo vytvořeno, bílé až bledě šedé, zadní strana stejná jako povrch, bledě žlutavý rozpustný pigment.

Agar s anorganickými solemi a škrobem:

růst mírný, barva žlutavě hnědá až hnědá (2 ic, 3 ne až 3 le), kolonie ploché, hladké, vzdušné mycelium se netvoří, zadní strana stejná jako povrch, rozpustný pigment se netvoří.

Agar s glycerolem a asparaginem: růst špatný až střední, barva špinavě bílá, kolonie ploché, hladké .s několika malými bílými skvrnami, vzdušné mycelium špatně vyvinuté, bílé, zadní strana stejná jako povrch, rozpustý pigment se netvoří.

Gordonův a Smithův agar s tyrosinem.: růst špatný až střední, koloni bezbarvé až krémové [2 ca), ploché, hladké, mycelium na vzduchu se netvoří, zadní strana stejná jako. povrch, rozpustný pigment se netvoří.

Czapkův agar se sacharózou: růst špatný, kolonie bezbarvé až špinavě bílé, ploché, hladké s několika bílými skvrnami vzdušného· mycelia, zadní strana stejná jako povrch, rozpustný pigment .se netvoří.

Agar s glukózou a asparaginem: .růst střední, kolonie žlutavě šedé až levandulové šedé (12 ig, 3 ge až 3 ig), ploché, hladké, avšak mírně zvrásněné u okraje, vzdušné mycelium bledě šedavé (2 ge), zadní strana stejná jako povrch, bledě žlutavý rozpustný pigment.

Agar .s malátem vápenatým: růst špatný, kolonie bezbarvé se špinavě bílým okrajem, noří .se do agaru, povrch je hladký s malými skvrnami šedavého vzdušného mycelia (šedé zbarvení 2 dc až 2 fe) zadní strana stejná jako povrch, rozpustný pigment se netvoří.

Agar s kaseinem: růst střední, kolonie bledě hnědavé (2 ne až 3 ne), ploché, hladké až .mírně zdrsněné, vzdušné mycelium se netvoří, .zadní strana .stejná jako povrch, rozpustný pigment se netvoří.

Bennetův agar: růst dobrý, kolonie hnědé (3 ng až 3 ni), mírně zvýšené, zvrásněné, vzdušné mycelium se netvoří, zadní strana stejná jako povrch, bleděžlutavý rozpustný pigment (2 ca).

Emersonův agar: růst střední až dobrý, kolonie bleděžlutavě hnědé (2 ca až 3 ca) až zelenavě šedé (23 ge až 23 ig), ploché až zvýšené, povrch hladký, mírně zdrsněný nebo vyskytující se jako membranózní zvýšeniny velmi nepravidelně zvrásněné, vzdušné mycelium se netvoří, zadní strana stejná jako povrch, rozpustný pigment se netvoří.

Živný agar: růst špatný až střední, kolonie bledě žlutavé (2 ca), ploché, hladké, vzdušné mycelium se netvoří, zadní strana stejná jako povrch, rozpustný pigment se netvoří.

Agar s želatinou: růst střední, kolonie bledě žlutavé (2 ca), ploché, hladké, vzdušné mycelium se netvoří, zadní strana stejná jako povrch, rozpustný pigment se netvoří.

Agar se škrobem: růst dobrý, kolonie krémově zbarvené, bledě žlutavé až bledě žlutavě hnědé (2 ca až . téměř 3 gc), ploché až mírně vyvýšené, hladké, avšak zvrásněné při kraji, vzdušné mycelium ,se netvoří, zadní strana stejná jako povrch, rozpustný pigment se netvoří.

Agar s bramborem a mrkví: růst střední, kolonie krémové (2 ca) s šedavým až tmavošedavým okrajem (šedé zbarvení 2 fe, 2 ih až 2 ml), ploché, hladké, vzdušné mycelium šedé až tmavě šedé, zadní strana stejná jako povrch, rozpustný pigment se netvoří.

Agar ve vodě z vodovodu: růst špatný, kolonie bezbarvé až špinavě bílé, ploché, hladké .s několika malými bílými skvrnami vzdušného¹ mycelia, zadní strana stejná jako povrch, rozpustný pigment se netvoří.

Biochemické vlastnosti kultury je možno shrnout následujícím způsobem:

1. Melanin není produkován.

2. Hydrogensulfid není produkován.

Želatina se zkapalňuje.

4. Škrob je hydrolyzován.

5. Dochází k redukci dusičnanů na dusitany.

6. Kultura špatně roste na Jensenově prostředí s celulózou.

7. Kultura neroste na Leviňově a Schoenleinově prostředí s celulózou.

8. Na žádném z prostředí s obsahem celulózy nedochází k rozkladu.

9. Nedochází ke koagulaci mléka.

10·. Nedochází k peptonizaci mléka.

11. Nedochází k trávení kaseinu, malátu vápenatého a tyrosinu.

12. Využití glukózy:

I. Na no.nomurově prostředí dochází k využití glukózy, arabinózy a xylózy, využití rafinózy je pochybné, nevyužívá se sacharóza, inositol, .manitol, fruktóza a rhamnóza.

II. Na ISP prostředí 9 se využívá glukóza, araginóza, xylóza a. sacharóza, nevyužívá se .fruktóza, inositol, mannitol, rafinóza a fhamnóza.

Po 15 dnech inkubace na agru s bramborem a mrkví bylo možno pozorovat následující morfologické znaky:

Hmota . spor měla šedavé zbarvení, řetězce spor byly přímé, zakřivené, nepravidelně zahnuté nebo vymyté, zřídka s háčky, až 30 spor v řetězci, zřídka méně než 10 spor v řetězci, spory jsou oválné, elipsovité až tyčinkovité, rozměry 1 až 1,8 X 0,8 až

0,9 μιη, hladké, jak je možno prokázat elektronovou mikroskopií.

Byl prokázán následující vztah mezi teplotními hodnotami a růstem:

Teplota	Růst
21 °C	dobrý až výborný
28 °C	dobrý
37 °C	střední
45 °C	spatný
Jak yž by	lo -svrchu uvedeno, -analýza bu-
něčné stěny	potvrdila, že kultura náleží - k
čeledi Streptomyces.. Analýza celých buněk

prokázala přítomnost kyseliny LL-d’am mu'pimelové a glycinu, avšak nepřítomnost běžných cukrů. Způsoby analýzy aminokyselin a cukrů v celých buňkách jsou popsány v publikacích Becker B. a další, Appl. Microbiol., 12, 421 až 423, 1964, a v Lechevalier Μ. P., J. Lab. Clin. Med., 71, 934 až Γ4144, 1968.

Kultura N393-39 je charakteristická bledě šedou a šedou barvou spor, přímými až zakřivenými řetězci spor, hladkými sporami a neschopností produkovat melamin. Přítomnost kyseliny LL-diaminopimelové a nepřítomnost některých cukrů v hydrolyzátu celých buněk potvrzují příslušnost k rodu Streptomyces. Kultura je blízce příbuzná Streptomyces hals-cdm který byl popsán v publikaci Shirling 1S. B. a Gottlieb, D., .1933, Int. J. Syst. Bact-eriol., 18, 69 až 189 a z tohoto důvodu byl kmen S. halstedii ATCC 10897 užit pro srovnání. Obě kultury jsou shodné s následující vlastností: morfologie řetězců spor a povrchu spor, negativní produkce melaninu a většina bichemických vlastností. Kultura N393-39 se liší od S. halstedii tím, že se nevytváří vzdušné mycelium na celé řadě prostředí, hnědavou spíše šedou až černou barvou zadní strany kolonie na ISP prostředí 2, 3 a 4, negativní produkcí sirovodíků a neschopností využívat fruktózy. Protože tyto rozdíly jsou jenom malými variacemi v případě kmenů čeledi Streptomyces, je možno pokládat kultury N393-39 za - nový kmen Streptomyces halstedii (Waksman a Henrici.

Nová kultura (Pfizer N393-39) byla 23. února 1981 uložena do veřejné sbírky Američan Type C^utlture Collection, Rockville, Maryland pod číslem Streptomyces. halstedii ATCC 31812. K^l^ltura je uložena v The Američan Type Culture Collection at Rockville, Maryland a bude přístupná a udržována po celou dobu platnosti patentu v případě, že patent bude udělen, v průběhu řízení je přístup pres 37 CFR 1.14 a 35 USC 112. Všechna omezení přístupnosti kultury budou odvolána, jakmile dojde k udělení patentu.

Streptomyces halstedii ATCC 31812 je možno pěstovat za podmínek, které jsou obdobné podmínkám při fermentaci k získání jiných antibiotik typu polyetheru, jak je popsáno například v US patentu č. 4 195 079. Kultura se pěstuje obvykle ve vodném prostředí v submerzní kultuře za aerobních podmínek za stálého míchání při teplotě 24 až 35 °C. Živné prostředí má obsahovat využitelný zdroj uhlíku jako cukr, škrob a glycerol, zdroj organického dusíku jako kasein, enzymaticky natrávený kasein, sójovou mouku, mouku z bavlníkových semen, arašídovou mouku, pšeničný gluten, - sójovou mouku, masovou moučku nebo rybí moučku. Je výhodné zařadit do živného prostředí také růstové látky, například rozpustný podíl obilovin, extrakt z kvasnic a mimoto soli, například chlorid sodný .a chlorid vápenatý a stopové prvky, například železo, hořčík, zinek, kobalt a mangan. V případě, že v průběhu fermentace dochází k přebytečnému pěnění, je možno přidat k fermentačnímu prostředí protipěnivá činidla, například rostlinné oleje nebo silikony. Živné prostředí v submerzní kultuře v tancích se s výhodou provzdušňuje rychlostí //z až 2 objemy sterilního vzduchu na 1 objem fermentačního prostředí za 1 minutu pomocí trysky pod tlakem. Živné prostředí je možno míchat běžnými míchadly. Rychlost míchání závisí na typu použitého míchacího zařízení. V případě třepací lahve -jde obvykle o 150 až 200 výkyvů za minutu, v případě fermentorů o 300· až 600 otáček za minutu. Při přeočkování organismu a v průběhu jeho · růstu je . nutno zachovat aseptické podmínky.

Očkovací materiál pro výrobu antibiotika podle vynálezu ie možno získat z kultury, pěstované na šikmém agaru. Tímto materiálem je možno naočkovat třepací lahve nebo tanky, očkovací materiál pro tyto tanky je možno získat také z třepacích lahví. Maximálního růstu v třepacích lahvích se obvykle dosáhne v průběhu 2 až 4 dnů, kdežto nejpříznivější růstové -období v submerzní kultuře v tanku je 1,5 až 3 dny.

Produkce antibiotika v průběhu fermentace a biologická účinnost fermentačního prostředí .se obvykle -sledují biologicky při použití citlivého kmene Staphylococcus aureus Bacillus subtilis. S. aureus ATCC 6538 a B. -subtillis ATCC 6633 jsou nejvhodnějšími kmeny pro toto použití. Užívá se standardního způsobu na plotnách, při níž je mírou účinnosti antibiotika velikost inhibiční zóny, oblopující kotouč - filtračního papíru, nasycený živným prostředím. Antibiotikum, získané z fermentačního prostředí a surové i čištěné materiály, extrahované z fermentačního prostředí je možno analyzovat chromatografií na tenké vrstvě při použití silikagelu. Chromatogramy na silikagelu Analtech silikagel GF se vyvíjejí směsí ethylacetátu a methanolu v poměru 9 : 1 nebo směsí chloroformu a methanolu v poměru 9 : 1. Antibiotikum je možno učinit viditelným působením vanilinu v ethanolovém roztoku kyseliny sírové, (3 g vanilinu v 97 ml ethanolu a 3 ml koncentrované kyše229936 liny sírové) s následným zahřátím plotny na teplotu 80 °C. Antibiotikum se objeví jako růžová skvrna. Plotnu je také možno překrýt agarem, naočkovaným S. aureus nebo B. subtilis a pak inkubovat při teplotě 37 °C po dobu 16 hodin.

Antibiotikum, získané fermentací S. halstedli ATCC 318)12 je možno izolovat ·a oddělit extrakcí nefiltrovaného živného prostředí organickým rozpouštědlem jako chloroformem, ethylacetátem, methylisobutylketonem a butanolem při pH, které má prostředí na konci fermentace. Extrakt je pak možno zahustit ve vakuu na řídký sirup.

Způsobem podle vynálezu se obvykle odděluje i izoluje antibiotikum podle vynálezu [dále nazývané „Antibiotikum 53 607“) takto:

Živné prostředí po fermentací S. halstedii ATCC 31812 se extrahuje methylisobutylketonem. Extrakt je tmavá, olejovitá kapalina, která vznikne po odpaření · ve vakuu. Tato olejovitá kapalina se rozpustí v chloroformu a nanese na · vrstvu silikagelu. Vrstva silikagelu se pak postupně promývá chloroformem, ethylacetátem a acetonem. Frakce se analyzují chromatografií na tenké vrstvě, antibiotikum 53607 se nachází téměř výlučně v ethylacetátové frakci. Ethylacetá tová frakce se odpaří dosucha, ostatní frakce se odloží. Eezvodá ethylacetátová frakce se dále čistí chromatografií na sloupci silikagelu, na vrchol sloupce se nanese jako roztok ethylacetátu, sloupec se vymývá ethylacetátem. Frakce s obsahem antibiotika 53 607 podle stanovení chromatografií na tenké vrstvě se slijí a zahustí odpařením. Tento· materiál se dále chrom-atografuje na sloupci Sephadex LI1-20 v methanolu, frakce s obsahem antibiotika 53 607 se slijí, zahustí a smísí s chloroformem. Chloroformový roztok se promyje 5% pufrem dlhydrogenfosforečnanu sodného· o pil 4,5, které se upraví kyselinou fosforečnou. Směs se pak promyje pufrem hydrogenfosforečnanu sodného · o· koncentraci 5 % [hmotnostní nebo objemová % ] o pH, které se upraví na 9,0 roztokem hydroxidu sodného. Rozpouštědlo se pak vysuší bezvodým síranem sodným a odpaří. Odparek se smísí s acetonem a uloží do lednice, antibiotikum 53 607 · krystalizuje jako sodná sůl. Volná kyselina se získá promytím ethylacetátového roztoku sodné soli vodou, upravenou na pH 4,5. Odpařením rozpouštědla se získají krystalky antibiotika 53 607 ve formě volné kyseliny.

Analýzou antibiotika 53 607 je možno prokázat následující vzorec

Antibiotikum 53 607 má inhibiční účinek proti celé řadě grampozitivních mikroorganismů. V následující tabulce I jsou shrnuty výsledky, dosažené in vitro jako minimální inhibiční koncentrace (MIC). Při provádění tohoto pokusu byl každý mikroorganismus naočkován do zkumavek, které obsahovaly živné prostředí a různou koncentraci antibiotika 53 607, tak aby bylo možno stanovit minimální inhibiční koncentraci antibiotika v ^g/ml, která způsobí inhibici růstu mikroorganismu v průběhu 24 hodin.

Tabulka 1

MIC ^g/ml antibiotika 53 607 Mikroorganismus [sodná sůl)

Staphylococcus	01A005	0,78
aureus	01A052	0,78
	01A110	1,56
	01A400	1,56
Streptococcus
faecalis	02A006	1,56
Streptococcus
pyogenes	020203	<0,01
Corynebacterium
pyogenes	11D001	25
Ba-cillus subtilis	06A001	0,39
Bacteroides fragilis	78C004	12,5
	78C009	6,25
	78C010	6,25

22SS3S

MIC qg/ml antibiotika 53 607 ; (sodná sůl)

Mikroorganismus

Bacteroides vulgaris 78E032

Haemophilius influenzae 54A036

54A037

54A059

Pasteurella multocida 59A001

Clostridium 10A002 perfrinces 10A003

Neisseria sicca 660000

Staphylococcus- 01B087R epidermidis 01B111RR

01B126 Fusobacterium neerophorum 84C004

Treponema 94A001 hyodysenteriae 94A002

3,12

6,25

3,12

12,5 >200

0,98

0,98

0,78

0,78

1,56

3,12

0,39

0,098

Proti gramnegativním bakteriím jako Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens a Enterobacterium aerogenes jsou hodnoty MIC ve všech případech vyšší než 50.

Antibiotikum 53 607 a jeho kationtové soli mají velmi dobrý účinek proti kokcidiální infekci u drůbeže. V případě, že jsou tyto látky včleněny do krmivá kuřat v koncentraci 50 až 200 ppm, zabrání infekci, způsobené Eimeria tenella, Ξ. acervulina, E. maxima, E. brunetti a E. necatrix.

Údaje o účinnosti antibiotika 53 607 a jeho solí proti kokcidiální infekci u kuřat byly získány následujícím způsobem. Skupiny po 3 až 5 bílých kohoutcích leghornů (SPF) o stáří 10 dnů byly krmeny běžným krmivém s obsahem antibiotika 53 607 nebo s obsahem jeho sodné a/nebo draselné soli. Toto krmivo bylo podáváno 24 hodin, pak bylo· každé kure perorálně naočkováno oecystami zkoumaného druhu Eimeria. Jiná kuřata o· stáří 10 dnů ve skupinách o 3 až 5 kuřatech byla krmena stejným krmivém, avšak bez antibiotika 53 607 nebo bez jeho solí. Tato· kuřata byla rovněž po 24 hodinách infikována, šlo tedy o kontrolní skupiny. Další skupina kuřat o stáří 10 dnů po 3 až 5 ve skupině byla krmena tímtéž krmivém bez antibiotika 53 607, tato skupina nebyla infikována. Šlo o normální kontrolní skupiny. Výsledky byly vyhodnoceny po 5 dnech v případě E. acervulina a po 6 dnech při použití ostatních kmenů. Výsledky Jsou shrnuty v následující tabulce lí.

Tabulka II

Druh infekce	Dávka (ppm)	Průměrný stupeň infekce	Poměr1	Hmotnostní přírůstek v %
Eimeria tenella	200	1,3	0,41	37
	100	1,0 (1,3)	0,32 (0,37)	57 (60)
	50	2,7 (0,3)	0,86 (0,03)	22 (97)
	25	3,0 (1,7)	0,35 (0,49)	47 (102)
Eimeria acervulina	200	1,5	0,75	2
	100	1,2	0,60	22
	50	2,0	1.0')	18
	25	2,0	1,00	7
Eimeria necatrix	' 200	—	—	_
	100	0,0	0,00	69
	50	0,2	0,11	99
	25	0,6	0,33	111
Eimeria maxima	200	1,5	0,94	10
	1.00	0,8	0,50	37
	50	1,0	0,63	70
	25	1,4	0,88	51
Eimeria brunetti	200	_	_	—
	100	0,4	0,22	47
	50	1,0	0,55	49
	ř? 25	2,6	1,44	47

Vysvětlivka k tabulce II:

¹ K vyhodnocení antikokcidiální účinnosti bylo užito stupnice poškození 0 až 4 v případě E. tenella podle publikace J. E. Lynch, „A New Method for the Primary Evaluation of Anticoccidlal Activity“, Am.

J. Vet. Res. 22: 324 až 326 (1961) a stupnice 0 až 3 pro -ostatní čeledi, v závislosti na modifikacích celého systému, tak jak je uvedeno- v publikaci J. Johnson a W. H. Reid, „Anticoccidial Drugs. Lesion Scoring Technigues in Battery -and Floor Pen Experiments in Chicks“, Exp. Parasit. 28: 30 až 36 (1970). Mimoto byl vypočítán příslušný stálý poměr talk, že byla vydělena hodnota poškozených kuřat hodnotou poškození - u infikovaných kontrolních kuřat.

Hodnoty krmiv byly -stanoveny obvykle přímo krmným pokusem na zvířeti. V britském patentovém -spisu č. 1 197 826 se podrobně popisuje pokus in vitro, přičemž se stanoví - změny, k nímž dochází v krmivu při použití - - různých -mikroorganismů s velkou přesností a velmi rychle, pokus napodobuje - poměry bachoru. Při provádění tohoto pokusu se užívá zařízení, které umožňuje - provádět in - vitro pokusy, které napodobují přirozené trávení u zvířat. Užívá se směsi krmivá, očkovacího materiálu z bachoru a různých látek, podporujících -růst. Tato směs -se - inkubuje za přísně stanovených podmínek a výsledné změny se zaznamenávají. V případě, že . -dojde ke vzestupu množství kyseliny propionové, znamená to, že jde o žádoucí vliv na bachorové pochody. Změny v obsahu kyseliny propionové se vyjadřují v procentech kyseliny propionové, která se nachází v kapalině bachoru. Mimoto -se používá dlouhodobých pokusů in vivo k průkazu korelace mezi vzestupem obsahu kyseliny propionové v bachoru a prospíváním zvířete.

Bachorová tekutina se odebírá od krav z - bachoru pištěli, těmto- krávám se podává běžné krmivo a seno. Tato kapalina se okamžitě zfiltruje a 10 ml zfiltrované -kapaliny se- vloží do baňky o obsahu 50 ml s - obsahem 400 mg standardního, substrátu, (68 procent kukuřičného škrobu + 17 % celulózy + - 15 - % extraktu ze sójové -mouky), pak -se přidá 10 ml pufru o pH 6,8 a -zkoumaná látka. Baňky se promívají dusíkem, prostým kyslíku přibližně 2 minuty a pak se inkubuje ve vodní lázni za -stálého míchání při teplotě 39 °C přibližně 16 hodin. Všechny testy -se provádějí třikrát.

Po- inkubaci se 5 m.l vzorku smísí s 1 ml kyseliny methafosforečné o koncentraci 25 procent. Po 10 minutách se přidá 0,25 ml kyseliny mravenčí a směs se odstřeďuje 10 minut při 1500 otáčkách za minutu. Vzorky -se pak analyzují plynově kapalinovou chromatografii způsobem, popsaným v publikaci D. W. Kellog, J. Dairy Science, 52, 1690 (1969). Nejvyšší hodnoty pro kyselinu octovou, propionovou a máselnou -se -stanoví pro vzorky z inkubačních baněk s přidáním i bez přidání zkoumané látky.

Při zkoumání in vitro způsobu je antibiotikum 53 607 v koncentraci 20- mikrogramů/ /ml přibližně 57% vzestup produkce kyseliny propionové ve srovnání s množstvím, které vzniká v kontrolním roztoku bez přidání antibiotika -53 607. Při -srovnání -s běžně dodávaným antibiotikem Monensln, které rovněž -náleží do skupiny po-lycyklických etherů v množství 10 mikrogramů/ml jde o 20'% vzestup množství kyseliny propionové ve srovnání s kontrolami [J. Amer. Chem. Soc., 89, 5737 (1967)1.

Ve srovnávacích pokusech se -salinomycinem popsaným v J. Antibiotics, 27: 814 (1974) je možno - prokázat, že antibiotikum 53 607 způsobuje vzestup kyseliny propionové o· 43 -% v koncentraci 20 ^g/ml a o 40 % v koncentraci 5 ^g/ml, salinomycin způsobuje -vzestup o- 52 % v koncentraci 5 (g/ml.

Na základě těchto údajů je možno usuzovat, že antibiotikum 53 607 zlepší využití krmiv u zvířat s bachorem, například u skotu a ovcí a také u monogastrickýeh živočichů, například u vepřů a králíků. Antibiotikum 53 607 je možno včlenit do krmivá ve formě volné kyseliny, ve formě sodné nebo draselné soli nebo ve formě směsí těchto látek. Je možno užít také surových forem antibiotika 53 607 nebo sušeného fermentačního prostředí, které toto antibiotikum obsahuje, pokud -se dosáhne žádané výsledné koncentrace.

Vynález bude osvětlen následujícími příklady.

Příklad 1

Očkovací materiál

Připraví se -sterilní vodný roztok následujícího -složení:

Složka g/litr

cerelóza škrob extrakt z kvasnic NZ amin YTT+ hydrogenfosforečnan draselný masová moučka chlorid kobaltnatý uhličitan vápenatý pH 7,1 až 7,2 + Značka, pod kterou se dodává enzymaticky natrávený kasem (Humko Scheffield - Chemical Co., Inc.J.

Buňky kmene Streptomyces halstedii

ATCC 31^812, pěstovaného na šikmém agaru se přenese -do řady baněk o objemu 300 mililitrů, z nichž každá obsahuje 40 ml sterilního prostředí a baňky -se inkubují za

2S 9 3 Ο

П 18 stálého míchání na rotační třepačce při teplotě 28 až 36 °C po dobu 3 až 4 · dnů.

Fermentace

Podíl kultury, dostatečný k získání 2% očkovacího· materiálu (objemová %) se přenese do fermentoru o obsahu 4 litry, z nichž každý obsahuje 2 litry následujícího sterilního prostředí. '

Složka	g/litr
cerelóza	10
NZ amin A +	5
škrob	20
extrakt z kvasnic	5,0
uhličitan vápenatý	1,0
chlorid kobaltnatý	0,002
voda do	1000 ml

+ Značka, pod kterou se dodává enzymaticky natrávený kasein (Humko Scheffield Chemical Co., Inc.j.

Fermentace se provádí pili teplotě 30 °C za stálého míchání 1700 otáček za minutu a při provzdušňováním 1 objemem vzduchu na 1 objem živného prostředí za minutu do nahromadění antibiotika, což trvá obvykle 3 až 5 dnů. Nahromadění antibiotika se zkouší běžným pokusem s papírovými kotouči při použití B. subtilis ATCC 6633. Živné prostředí se zfiltruje při neutrálním pH při použití pomocného prostředku pro filtraci (Supercel nebo Celit], filtrát se extrahuje metylisobutylketonem nebo n-butanolem. Organická fáze se oddělí od vodné a pevný podíl se oddělí filtrací. Filtrační koláč se uvede v suspenzi v methanolu, směs se zfiltruje, methanol se odpaří a odparek se extrahuje stejným rozpouštědlem, které bylo užito k extrakci zfiltrovaného živného prostředí. Extrakty se slijí a odpaří ve vakuu, čímž se získá viskózní olejovitá kapalina. Tato olejovitá kapalina se uvede v suspenzi v heptanu, pak se za stálého míchání přidá silikagel a suspenze se zfiltruje. Filtrační koláč se několikrát promyje heptanem a výsledný produkt se pak vymývá postupně chloroformem.

Biologická účinnost živného prostředí a účinnost materiálu při následující izolaci se sleduje použitím citlivého kmene Bacillus subtilis ATCC 6633 nebo Staphylococcus aureus ATCC 6538. Složky živného prostředí a izolovaný materiál je možno znázornit na silikagelových plotnách při použití následujícího systému: směs ethylacetátu a methanolu v poměru 5 : 1 nebo směs chloroformu a methanolu v poměru 9 : 1, plotna se postřikuje vapHinem, (3 g vanilinu v 97,0 ml ethanolu s 3,0 ml koncentrované kyseliny sírové] s následným zahřátim na teplotu 80 °C. Sloučenina 53 607 vytváří růžovou skvrnu. Je také možno· postupovat tak, že se plotna převrství agarem, naočkova ným E. aureus nebo B. subtilis s 1,0 ml tetrazoliové soli o koncentraci 1 % s následnou inkubací při teplotě 37 °C po dobu 16 hodin ke znázornění oblastí s obsahem antibiotika. Jde o čiré oblasti na růžovém podkladě.

Po vymytí chloroformem se svrchu uvedený filtrační koláč vymývá směsí chloroformu a ethylacetátu a nakonec samotným ethylacetátem. Po· chromatografií na tenké vrstvě a biologických zkouškách, na jednotlivých frakcích se aktivní frakce slijí, odpaří ve vakuu a odparek se chromatografuje, čímž se získá antibiotikum 53 607 v pevné formě.

Spektrum v infračerveném světle při použití pelet bromidu draselného má následující maxima: 2,95, 3.42, 6,00, 6,37, 6,85, 7,14, 7,30, 7,65, 7,90, 8,10, 9.05, 9,15, 9,67, 10,00, 10,18, 10,53, 11,15, 11,40, 11,75, 13,25 дш.

Antibiotikum je rozpustné v chloroformu, ethylacetátu, methanolu a ηethyllsobutylketonu. je však nerozpustné ve vodě.

Příklad 2

Očkovací materiál se připraví stejně jako v předchozím příkladu s tím rozdílem, že se užije 700 ml živného prostředí v baňce a fermentace se provádí 3 až 4 dny při teplotě 23 °C, přičemž baňky jsou opatřeny dvěma hrdly.

Fermentory s obsahem 400 litrů o obsahu 300 litrů sterilního prostředí, tak jak bylo svrchu uvedeno se naočkují 6 litry (0,1 procenta) svrchu uvedeného očkovacího materiálu:

Fermentační prostředí

Složka	g/litr
cerelóza	1,0
kasein	5,0
škrob	5,0
kukuřičný výluh	5.0 ml
uhličitan vápenatý	3,0
chlorid kobaltnatý	0,002
voda do	1 litru

pH 6,9 až 7,0

Fermentor se udržuje na teplotě 28 °C za stálého provzdušňování a míchání při 1709 otáčkách za minutu. Po· 120 hodinách se fermentace zastaví a celé živné prostředí se extrahuje 60 litry mathylisobutylketonu, vrstvy se oddali v extrakčním zařízení (Podbíelniak) a organická fáze se zahustí ve vakuu, čímž se získají 4 litry olejovité kapaliny. Tato kapalina se znovu zahustí ve vakuu na rotační odparce. Získaný sirup se uvede v suspenzi v heptanu, míchá se se silikagelem, pak se zfiltruje a několikrát promyje heptanem. Promytý filtrační koláč se zpracuje stejně jako v příkladu 1, čímž se získá 300 g olejovité kapaliny. Tato ole2 2 S 9.3 G jovitá kapalina se rozpustí v malém množství chloroformu, roztok se vlije na filtr (Lapp) s obsahem 3,5 kg silikagelu (Merck, 60} a silikagel se postupně promývá 4,2 litry chloroformu a pak stejným množstvím ethylacetátu a acetonu. Frakce se sledují chromatografií na tenké vrstvě. Produkt se nachází téměř výlučně v ethylacetátové frakci. Ostatní . frakce se odloží, ethylacetátová frakce se vysuší do sucha ve vakuu, čímž se získá 150 g koncentrátu. Koncentrát se dále čistí chromatografií na sloupci o rozměrech 8,0 X 1000 cm s náplní silikagelu (Merek 60) v ethylacetátu. Sloupec se vymývá ethylacetátem a odebírají se frakce o objemu 1 litr průtoku 60 mil za minutu. Frakce s obsahem produktu se slijí a odpaří ve vakuu, čímž se získá 85 g výsledného produktu.

Tento produkt se nechá projít sloupcem s obsahem 1 kg Sephadex LH-20, -sloupec se vymývá methanolem při rychlosti průtoku 25 ml/mínuta. Odebírají se frakce po 300 ml. Frakce -s obsahem produktu se slijí a rozpouštědlo se odpaří, čímž se získá 300 g pevné látky. Tato pevná látka se rozpustí v 500 ml chloroformu, roztok se promyje stejným objemem puf.ru .s dihydrogenfosforečnanem sodným o koncentraci 5 % po úpravě na pH 4,5 přidáním 85'% kyseliny fosforečné. Organická fáze se oddělí, .promyje se 500 ml hydrogenfosforečnanu sodného o koncentraci 5 % po úpravě na pH 9,0 přidáním 1 N hydroxidu sodného. Extrakt se pak vysuší bezvodým síranem sodným a odpaří . do sucha ve vakuu. Odparek se -smísí s acetonem a nechá se krystalizovat v lednici. Krystaly se odfiltrují a -usuší ve vysokém vakuu při teplotě místnosti, čímž se získá 14 g sodné soli antibiotika 53 607 o teplotě tání 199 až 204 °C.

Optická otáčivost:

[a]n + 37° (c — 1, methanol).

[a)b + 44° [c == 1, chloroform),

Spektrum v -ultrafialovém světle:

A_ina, 233 nm (methanol) El_Cm ¹% - - 212.

Spektrum v infračerveném světle při použití pelet s bromidem draselným.:

2,95, 3,42, 6,00, 6,37, 6,85, 7,14, 7,30, 7,65, 7,90, 8,10, 9,05, 9,15, 9,67 10,00, 10,18, 10,53, 11,15, 11,40, 11,75, 13,25 ^m.

Spektrum v infračerveném světle je znázorněno na obr. 1.

Elementární -analýza:

C: 57,54, H: 7,74, N: 0,0.

Při použití dihydrogenfosforečnanu draselného o pH 4,5 a hydrogenfosforečnanu draselného, upraveného na pH 9,0 přidáním

N hydroxidu draselného jako pufru při provádění svrchu uvedeného- postupu se získá draselná sůl antibiotika 53 607.

Obdobným způsobem je možno při použití dihydrogenfosforečnanu amonného a hydrogenfosforečnanu amonného získat při provádění svrchu uvedeného postupu amonnou sůl.

Příklad 3

Podíl svrchu uvedené -soli antibiotika 53 607 se rozpustí v ethylacetátu, přidá se voda a vodná fáze se upraví na pH 4,5 přidáním 85% kyseliny fosforečné. Organická vrstva se oddělí, vysuší -se -síranem sodným a odpaří se ve vakuu, čímž se získá antibiotikum 53 607 ve formě volné kyseliny o teplotě tání 84 až 94 °C. Elementární -analýza -se provádí na vzorku, který se suší přes noc ve vysokém vakuu při teplotě místnosti.

Analýza:

C: 64,69, H: 8,91, N: 0,0.

Kyselina je nerozpustná ve vodě, rozpustná v chloroformu, ethylacetátu, methanolu a methylisobutylketonu.

O^^tická otáčivost:

[a]o + 74,5° (c = 1, chloroform), [apo + 41,7° (c — 1, methanol).

Spektrum v ultrafialovém světle:

max 233 nm (methanol), - E₁cm1% = 198.

Spektrum v infračerveném světle při použití pelet -s bromidem draselným:

2,95, 3,45, 6,00, 6,85, 7,28, 8,13, 9,05, 9,67, 10,20, 10,55, 11,15, 11,48 ,mn.

Spektrum v infračerveném světle - je znázorněno na obr. 2.

Barnatá sůl se získává tak, že -se protřepává 2,0 g volné kyseliny v roztoku v 80- ml ethylacetátu se stejným množstvím vody -s obsahem 2,4 g oktahydrátu hydroxidu barnatého. Vrstvy se oddělí, organická fáze se promyje čerstvým -roztokem oktahydrátu hydroxidu barnatého, vysuší se síranem sodným a odpaří se ve vakuu, čímž se získá požadovaná sůl antibiotika 53 607.

Vápenatá -sůl se připraví -rovněž svrchu uvedeným způsobem s tím rozdílem, že -se místo oktahydrátu oxidu barnatého použije hydroxid vápenatý.

Příklad 4

Postupuje se obdobným způsobem jako v příkladu 1 s tím rozdílem, že se užije 4 objemových °/o očkovacího materiálu a fermentorů o obsahu 4 litry, z nichž každý obsahuje 2 litry následujícího sterilního živného prostředí:

Složka . g/lltr cerelóza10 kukuřičný škrob10 sójová mouka10 uhličitan vápenatý1 pevný podíl z matrlálu po fermentaci kukuřice5 chlorid sodný 5 pH 7,0

Fermentace se provádí 2 dny při teplotě 33 °C za stálého míchání 1700 otáček za minutu a provzdušňovéní rychlostí 2 objemy vzduchu/objem živného prostředí za minutu. Živné prostředí se pak extrahuje chloroformem a zpracovává stejným způsobem jako v příkladu 1, čímž se získá antibiotikum 53 607 ve formě směsi sodné, draselné a vápenaté soli.

V případě, že se svrchu uvedený postup opakuje, avšak užije se fermentační prostředí s obsahem glycerolu místo cerelózy, rybí moučky nebo mouky z bavlníkových semen místo pevného podílu po fermentaci kukuřice a postup se provádí při р'лЧ 8,0, teplotě 28 °C po dobu 6 dnů, dosáhne se přibližně stejných výsledků.

Claims (2)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   1. Způsob výroby nového· kyselého antibiotika typu polycyklických etherů vzorce nebo kationtových .solí tohoto antibiotika, vyznačující se tím, že se pěstuje mikroorganismus Streptomyces helstedii ATCC 31812 při teplotě 21 až 37 °C a pH 6,9 až 8,0 ve vodném živném prostředí s obsahem využitelného zdroje uhlíku, dusíku a anorganických. solí v submerzní kultuře za ae robních podmínek a antibiotikum se z fermentačního prostředí izoluje.
2. 2. Způsob podle bodu 1 nebo· 2, vyznačující se tím, že se fermentační prostředí extrahuje rozpouštědlem, nemísitelným s vodou a pak se odpaří dosucha.