SU1409132A3 - Способ получени антибиотика 6270 - Google Patents

Description

(21)3892105/28-13

(22)12,04.85

(31)72912/1984

(32)13.04.84

(33)JP

(46) 07.07.88. Бюл. № 25

(71)Какен Фармасьютикал Ко. Лтд (JP)

(72)Йоко Касукабе, Нобуко Такахаси, Акио Сейно и Ясуо Ивагайа (JP)

(53)615.779.9(088.8)

(56) Патент СССР № 673184, кл. С 12 Р 1/02, 1979.

За вка Франции № 2164792, кл. А 61 К 21/00, 1973.

(54)СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА 6270

(57) Изобретение относитс  к новому антибиотику 6270, к способу его получени  и применени  в качестве анти- кокщадиозного средства или в качестве пищевой добавки дл  ускорени  роста домашних животных и птицы. 11елью изобретени   вл етс  выделение микроорганизмов , обладающих антибиотическими свойствами. Способ заключаетс  в культивировании штамма Nocatdiopsis sp.FERM ВР-717 на питательной среде, содержащей источники углерода, азота И минеральные соли при температуре 30°С в течение 96 ч с последующим выделением и очисткой целевого продукта . 4 табл.

S

о

со

4

о со

со

C/J

Изобретение относитс  к новому а тибнотику 6270, к способу его получени  и применени  в качестве анти кокцидиозного средства или в качестве пищевой добавки дл  ускорени  рос та домаиших животных и птицы.

Целью изобретени   вл етс  выделение микроорганизмов, обладающих антибиотическими свойствами.

Штамм Nocardiopsis sp. 6270 депонирован в Исследовательском ферментационном институте Японии под номером FERM ВР-717..

Морфологические характеристики.

Субстратный мицелий хорошо развит и разветвлен, поэтому ширина каждого мицели  составл ет примерно 0,4 мкм. Воздуш ый мицелий хорошо растет в некоторых культуральных средах, таки как сахарозо-нитратна  агарова  куль туральна  среда (Дифко. Агаровый раствор Чапека), крахмальна  агарова  культуральна  среда (Т S Р-4, Дифко-Неорганический солевой крах- мальный агар), культуральна  среда овс на  мука - агар (I S Р-8) или глюкозо-аспарагинова  агарова  культуральна  среда. Воздушный мицелий  вл етс  пр мым или искривленным и внешний вид колонии паутинистый (в целом они образуют паутину). При созревании воздушный мицелий имеет ширину от 0,4 до 0,6 мкм. У стареющей колонии через 10 дней после начала культивировани  воздушный мицелий повергаетс  фрагментации и образует длинные споровые цепи, кажда  из которых содержит по крайней мере ГО спор. Споровые цепи не  вл ютс  спиральными. Поверхность спор гладка , споры имеют цилиндрическую форму . Их размер составл ет примерно 0,4-1,2 мкм. Нет споранги , наблюдаютс  склероции или синнемы.

Культуральные характеристики.

Тесты провод т в соответствии с общеприн тым методом испытаний.

Цвет определ ют под стандартным источником освещени  ксеноновой лампой .

Приведенные ниже данные относ т к услови м роста при культивировании в течение трех недель при 28 С на

агаровой пластинчатой культуральнои среде. Показатель а указывает рост, показатель Ь указьшает состо ние воздушного мицели , показатель с указывает растворимый пигмент и показа0

о 5 Q

0

5

0

5

тель d - наличие других характеристик .

Сахарозо-нитратна  культуральна  среда (Агаровый раствор Дифко-Чапека):

а) хороший, сероватый,(2 ва);

h) белый, порошкообразный;

с) нет.

Глюкозо-аспарагинова  культуральна  среда:

a)хороший, светло-желтый (3ic) до бежевого (3ge);

b)сероватый (Зва);

c)нет.

Глицерино-аспарагинова  культуральна  среда:

a)слабый, (2ва);

b)слабое образование;

c)нет. Крахмало-агарова  культуральна 

среда:

a)отличный, 3 ic до Shale (Зса);

b)белый порошкообразный;

c)нет;

d)гидролиз крахмала: отрицательно .

Тирозно-агарова  культуральна  среда.

a)слабый (3ge)

b)нет;

c)нет.

Питательна  агарова  среда (Дифко, Бакто-питательный агар):

a)слабый, светла  пшеница (2еа)

b)нет;

c)нет.

Дрожже-солодовый экстракт агарова  культуральна  среда:

a)отличный, трещины (cracks) топаз (Зпе);

b)белый;

c)нет. I

Культуральна  среда с овс ной мукой:

a)хороший, оболочка (shell) (2са);

b)2 Ьа;

c)нет.

Физиологи 1еские характеристики.

Интервал температуры роста. Не наблюдают рост ниже 5 или вьш1е 39,5°С. Оптимальна  температура 27-38 с.

Разжижение столбика глюкозо-пепто- но-желатиновой культуры: положительно .

Гидролиз крахмала: отрицательно.

Коагул ци  и пептонизаци  сн того молока: нет коагул ции и существенной пептонизации (37 с).

3

Образование меланина: ISP - тиро- эинова  агарова  культуральна  среда отрицательно; ISP - тирозинова  культуральна  среда с бульоном дрожжевог экстракта: отрицательно; TSP - пеп- тоно-дрожже-железиста  агарова  культуральна  среда: отрицательно.

Толерантность NaCl: нет роста при А% и вьпие.

Растворимость ксантина, гипоксан- тина, аденина: отрицательно.

Использование источника углерода (баэальна  среда Прайдхэма и Готтли- ба).

Положительно: D-глюкоза, L-араби- ноза, D-ксилоза, салицин.

Слабо положительно: D-фруктоза, сахароза.

Отрицательно: инозит, L-рамноза, раффино 3 а, D-ман нит.

Штамм 6270 идентифицируют как штамм, принадлежащий к Nocardiopsis Мейер 1976 среди октиномицетов, так как нар ду с упом нутыми различными характеристиками он образует длинные цепи спор в воздушном мицелии, а гид ролизат целых клеток содержит мезо- диаминопимеровую кислоту и галактозу но не содержит арабинозы и мадурозы, кроме того не определ етс  миколева  кислота.

При осуществлении способа микроорганизм , продуцирующий антибиотик 6270, культивируют в соответствии с традиционными методиками культивиро- вани  известных актиномицетов. Однако с промьшшенной точки зрени  выгодно примен ть метод культивировани  с аэрацией - перемешиванием. В качестве культуральной среды дл  продуцировани  могут быть применены материалы , обычно используемые дл  культивировани  актиномицетов. А именно могут быть использованы в подход щих сочетани х различные источники углерода, источники азота и органические и неорганические соли, а также противовспенивающий агент при необходимости . Температура культивиро

вани  обычно лежит в интервале от 25 до 35 С, предпочтительно около 30 С. Врем  культивировани  может мен тьс  в зависимости от различных условий. Однако обычно накопление продуцированного антибиотика 6270 достигает максимума через 72-148 ч.

Антибиотик 6270 может быть выделен из культуральной среды и очищен

0

5

0

09

5

5

0

5

0

5

1324

при использовании его физико-химических свойств с помощью традиционных методик, таких как метод использовани  различи  в растворимости примесей , метод использовани  различий в адсорбции ионообменными смолами или различными адсорбирующими агентами , метод экстракции органическим растворителем, не смещивающимс  с водой, или же сочетание различных средств, таких как осаждение, удаление примесей, диализ, сушка и перекристаллизаци  .

Например, антибиотик 6270, полученный в культуральной среде, извлекают следующим образом. После добавлени  фильтрующей добавки, такой как диатомитова  земл  или Радиолит 700, культуральный бульон фильтруют и фильтрат и микробные клетки соответственно экстрагируют подход щими растворител ми, такими как этилаце- тат и ацетон. Затем объедин ют клеточный экстракт и экстракт из фильтрата . Отгон ют растворитель из этого экстракта, в результате получают антибиотик 6270 в виде сырых кристаллов , сырые кристаллы подвергают, например , хроматографии. Элюат концентрируют при пониженном давлении, а остаток раствор ют в подход щем растворителе, таком как этилацетат, а затем обрабатывают разбавленной сол ной кислотой. Слой растворител  концентрируют, в результате антибиотик 6270 кристаллизуетс  в виде свободной кислоты.

Дл  получени  натриевой соли упом нутый слой растворител  обрабатывают разбавленным раствором сол ной кислоты, а затем разбавленньп раствором -карбоната натри , слой растворител  концентрируют, в результате получают антибиотик 6270 в виде натриевой соли. Полученный таким образом антибиотик 6270 в- виде свободной кислоты или натриевой соли может быть перекристаллизован из подход щего растворител , такого как н-гексан- этилацетат, чтобы получить чистые кристаллы. Антибиотик 6270 в виде свободной кислоты обладает следуюци-- ми свойствами.

Бесцветные иглоподобные кристаллы, кислотное вещество.

Точка плавлени : II5-118°С.

Элементньй анализ найдено,%: С 62.72; Н 9,А9; О 27,78.

f

Удельное вращение: (с) . П,5 (С 1,0, метанол).

УФ-спектр поглоп1е11и  .

Не наблюдаетс  максимумов полос поглощени  при 210 нм или более при измерении метанольного раствора.

Характеристические полосы поглощени  () в ИК-спектре (таблетка с бромистым калием): 3470, 2980, 2945, 2890, 1735, 1460, 1380, 1315, 1165, 1102, 1075, 987, 980.

Растворимость: растворим в метаноле , этаноле, этилацетате, хлороформе эфире, ацетоне и бензоле; нерастворим и воде.

Цветные реакции, положительно в реакции с ванилином - серной кислотой и в реакции Драгендорфа; отрицательно в реакции с нингидрином; окраска с Ij газообразным.

Тонкослойна  хроматографи : (на

2 г4

кизельгуре GF , производимом фирмой Мерк Ко):

Система растворителей Величина R Хлороформ:метанол(20:1) 0,49. н-Гексан-этилацетат(1:1) 0,08 Бензол-этилацетат (1:1) 0,04 Хлороформ-ацетон (2:1) 0,36 н-Гексан-зтилацетат (1:3) 0,13 Этилацетат0,22

Н-5ГМР-спектр: наличие трех ме- токсигрупп наблюдаетс  при сГ ппм 3,39 (ЗН), 3,49 (6Н), спектр сн т при 100 МГц в т желом хлороформе с испо/тьзованием ТМС в качестве внутреннего стандарта.

С-ЯМР-спектр: результаты измерений при 25 МГц в т желом хлороформе с использованием ТМС в качестве внутреннего стандарта. Согласно этим результатам общее число атомов углерода равно 44.

Антибактериальный спектр приведен в табл.1. Антибиотик 6270 обладает особенно сильными антибактериальными свойствами против грамположи- тельных бактерий и  вл етс  полезным как антибактериальный агент.

В низких концентраци х он обладает антикокцидиозной, акарицидной и противовирусной активност ми и  вл етс  полезным как антикокцидиозное средство дл  домашней птицы, такой как куры, перепела, утки, гуси и индейки , и дл  домашних животных, таких как коровы, , кролики, буйволы , козы и овцы, в качестве агента дл  лечени  диарреи домашних живот

,

ш ,1Х или в качестве агента дл  увели-, чени  эффективности питани  или дл  ускорени  роста домашних животных и птицы.

I

Пример 1. Засевают 1 л куль- туральной среды (рН 6,0), содержащей 6,0% глюкозы, 2,0% соевой муки, 1,0%

10 torula дрожжей и 0,5% карбоната кальци , штаммом Nocardiopsis sp. 6270 (FERM ВР-717) и культивируют при З0 с 48 ч. Этим культуральным бульоном засевают 100 л культуральной среды,

15 имеющей указанный состав, и культивируют при 30°С в течение 96 ч при перемешивании в аэрации в сосуде,имеющем емкость 200 л. Скорость аэрачии составл ет 100 л/мин, а скорость вра20 щени  мещалки равна 250 об/мин. После добавлени  фильтрующей добавки (Радиолит 700) этот культуральный бульон фильтруют дл  разведени  фильтрата и клеток. Затем фильтрат экс 25 трагируют 40 л этилацетата, а клетки экстрагируют 30 л ацетона. Ацето- .новый клеточный экстракт концентрируют при пониженном давлении дл  удалени  ацетона и экстрагируют 20 л этил30 ацетата. Этот экстракт объедин ют с экстрактом из фильтрата и объединенный раствор концентрируют при пониженном давлении. Остаток адсорбируют на колонке, заполненной 750 г сили-jg кагел  (Вако-гель С-200) с хлороформом , и через колонку пропускают смесь хлороформа и метанола (100:1). Активную фракцию концентрируют при пониженном давлении досуха, в результа40 те получают масл нистый остаток. Затем остаток раствор ют в небольшом количестве ацетона и адсорбируют раст вор на колонке с Сефадексом LH-20, заполненной ацетоном, и элюируют аце45 тоном. Полученную таким образом активную фракцию концентрируют дл  получени  сырых кристаллов антибиотика 6270. Кристаллы раствор ют в этилацетате и встр хивают с разбавленной

5Q сол ной кислотой. Этилацетатный слой концентрируют при пониженном давлении . Образовавшиес  кристаллы пере- кристаллизовывают из смеси н-гексана и этилацетата, в результате получают

ее 23,4 г свободной кислоты антибиотика 6270 в виде бесцветных иглоподоб- ных кристаллов. Полученна  таким образом свободна  кислота антибиотика 6270 обладает упом нутыми физико-химическими и биологическими характеристиками ,

П р и м е р 2. Антикокцидиозна  активность.

Антибиотик 6270 однородно смешивают со сложным кормом дл  кур, чтобы получить заранее определенную концентрацию . Полученный таким образом корм свободно поедаетс  курами в те- чение двух дней до инокул ции ооцита ми и до конца испытани  (восемь дней после заражени ).

Дл  сравнени  используют Моненсин который  вл етс  известиным антикок- цидиозным препаратом.

Используют цыпл т в возрасте 7 дней которых содержат в услови х полного предохранени  от кокцидиозной инфекции по 5 в группе.

Ооциты, использованные дл  заражени , представл ют собой чувствительный штамм Eimeria tenella. Каждому цыпленку инокулируют полностью выросшие ООЦИТЫ (3 Ю) орально с использованием металлического зонда. Результаты представлены в табл.2.

Эффект от применени  средства определ ют по Аитикокцидиальному Индексу (ACI), который рассчитьтают по следующей формуле:

ACI (Относительное увеличение веса + доза выживани )-(ооцитна  величина + показатель заболеваемости);

120 или менее: как антикокцидиоз- ный агент неэффективен;

160 или менее: слабо эффективен;

160-180: умеренно эффективен;

180 или вьпие: очень эффективен.

(i) Относительное увеличение веса

В конце испытани  определ ют увеличение веса (а именно вес в конце испытани  - вес во врем  заражени ) каждой испытуемой группы и вычисл ют относительное увеличение веса на основе веса контрольной группы(100), котора  не получает антикокцидиозное средство.

(ii) Ооцитовый индекс.

Число ооцитов в слепой кишке под- считывают через 8 дней после заражени  путем гомогенизации кишечного канала . Ооцитовый индекс определ ют следуюпщм образом.

Число ооцитов, май- Ооцитовый ий-

денных в кишечном деке

канале 0,0-0,110 0,1-1,0-10

О 1

1,0-5,0-10 5,0-11,0-10 11,0-10

10 20 40

(iii) Показатель заболеваемости кишечного канала.

Испытуемых цьтл т анатомизируют в конце опыта (8 дней после заражени ) и исследуют кишечный канал невооруженным глазом, чтобы определить пЬказатель заболеваемости. Показател заболеваемости определ ют, как приведено ниже, а величина заболеваемости была определена в дес ть раз, так же как и величина показател  заболеваемости .

О,(-) Кишечник совершенно нормальный . Если найдено п тно крови, (-) мен етс  на (),

Claims (1)

1. I,(+) Кишечник нормальный по форме . Его содержимое слегка жидкое и желтоватое. Обнаруживаетс  слабое набухание частично на слизистой мембране кишечника, который становитс  беловатым.

   2,() Кишечник обычно нормальный по форме. Набухание наблюдают на всей поверхности слизистой мембраны. В содержимом крови не найдено. Слизь слегка желтовата  и поблекша . На слизистой мембране обнаружено немного белых некротических п тен или кров ных п тен.

   3,() Кишечник заметно усох и изменен по форме, он немного длиннее, чем пр ма  кишка. Содержимое с овер- шенно аномально и часто кишечник заполнен свернувшейс  кровью или бело- серым, творогоподобным перерожденным веществом. Стенка кишечника заметно набухша  и легко рветс , а иногда еще остаютс  п тна крови. Болезнь затрагивает основание кишечника, но

   не пр мую кишку.

   4,() Усыхание и деформаци  кишечника  вл ютс  значительньпчи. Кишечник выгл дит подобным колбасе по форме и не длиннее пр мой кишки. Болезнь поражает треть или четверть пр мой кишки.

   Группы 1-3 получают.корм, содержащий заранее определенную концентрацию антибиотика 6270, начина  за два дн  до инокул ции ооцитов. Группа 4 дл  сравнени  получает корм, содержащий антибиотик Моненсин. Группа 5 представл ет собой зараженную, не получавп1ую лекарства контрольную

   9

   группу, инокулированную ооцитами. Группа 6 представл ет собой незара- жеиную контрольную группу, не получавшую лекарства.

   Из этих результатов испытаний видно, что антибиотик 6270 обладает антикокцидиоэной активностью.

   П р и м е р 3. Тест на эффективность корма на свинь х.

   Используют свиней пород Land.

   Основной корм;

   а)с начала испытани  до четырех недель: 60% зерна (кукуруза, пшеница  чмень), 15% соевого ткмыха, 15% кор- ма жи вотного происхождени  (порошок сн того молока рыбна  мука, и 10% другого (ферменты, карбонат кальци , фосфат кали , хлористый натрий и др.

   б)от 4 до 12 недель: 78% зерна (кукуруза, ногоплодник ржавый, пшеница ), 13% соевого жмыха, 5% рыбной муки и 4% других (карбонат кальци , фосфат кальци , хлористый натрий и

   т.п.) .

   Методика.

   Раздел ют на три группы 15, порос т 35-дневного возраста, в каждой группе по п ть свиней, таким образом чтобы средний вес был одинаковым. Антибиотик 6270 добавл ют к основному корму в количестве 0,12.5 и 25 млн долей (ппм) соответственно. Три группы свиней корм т кормами соответственно 12 недель. Затем измер ют вес телаи потребление корма.

   Далее подсчитывают общее число дней, во врем  которых свиньи страдали от диарреи в течение четыре недель от начала испытани . Резуль- таты приведены в табл.3.

   Показатель потребности в пище улучшаетс  на 5-8% при кормлении кормом , содержащим антибиотик 6270. Повышение веса улучшилось на 5-11%. Кроме того, наблюдаетс , что диарре  у свиней с тцественно снизилась.

   0

   0 5

   0

   5

   5

   132iO

   Пример 4 .. Эффек гивнос гь корма у жвачных.

   Используют бычков породы Голь- штейн.

   Концентрированный корм: 71,5% зерна (кукуруза, ногоплодник ржавый) miro ( чмень) 11,5% м кины и отрубей (кормова  клейковина кукурузы, пшеничные отруби, масл ный жмых рисовых отрубей), 5,5% жмыха растительных масел (соевый жмых, жмых от льн ного масла) и 11,5% другого (арахисова  мука, меласса, фосфат кальци , хлористый натрий).

   Методика.

   15 кастрированных бычков в возрасте 8 мес цев раздел ют на три группы по п ть бычков в каждой таким образом, чтобы средний вес был одинаковым . Добавл ют антибиотик 6270 к основному концентрированному корму в количестве 0,7,5 и 15 ппм соответственно . Три группы бычков корм т этими кормами соответственно. Кроме того, высушенную рисовую солому скармливают в качестве сырого корма в количестве 1 кг на бычка. Результаты показаны в табл.4.

   1

   Показатель потребности в концентрированном корме улучшаетс  на 7-10% при кормле1ши кормом, содержаи1;им антибиотик 6270. Прибавка веса увеличиваетс  на 9-11%.

   Формула изобретени 

   Способ получени  антибиотика 6270, обладающего противококцидиозным действием , зг.кл oчaюш йc  в культивировании штамма Nocardiopsis sp.FERM ВР-717 на питательной среде, содержащей источник углерода, азота и минеральные соли при 30°С в течение 96 ч с последующим выделением и очисткой целевого продукта.

   Bacillus cereus IAM-1729

   Bacillus cerculans IFO 3329

   Bacillus subtilis PCI 219

   Micrococcus flavus IFO 3242

   Sarcina lutea NIHJ

   Staphylococcus aureus

   FDA 209PJC-1

   Staphylococcus aureus

   (устойчив к пенициллину, стрептомицину , хлорамфениколу, , тетрациклину и канамицину)

   Esherichia coli NIHJ JC-2

   Escherichia coli ( устойчив к стрептомицину, каиамицину, хлорамфениколу и тетрациклину)

   Klebsiella pneumoniae PCI 602

   Proteus vulgaris OX-19

   Pseudomonas aeruginosa IFO-3756

   Mycobacterium smegmatis ATCC 60

   Mycobacterium aviura IFO 3153

   Mycobacteriura phlei NIHJ

   Penicillium chrysogenum 0-176

   Aspergillus flavus ATCC 96A3

   Cochliobolus miyabeames

   Alfernaria mari

   Candida albicans YU 1200

   Saccharomyces cerevisiae

   Strain 77

   1409132 Т а

   1 2

   блица I

   a a

   a a a b

   b b

   с с

   показатель потребности пи

   Улртвение показател  потребности пище, X

   Средне количество корма, съеленного i во врем  периода нспыта мй Среднее увеличение вес  во врен  nepi;ona испытаний

   Показатель потребности в пине, когда бьст до8авле1 6267 Показатель потребности в пнце,когда не был добавлен а тибиотш

   Показатель потреб остн в концентрированном корме

   Sl SS 2i in I22 E2Et;5x bSS KS2 2 52 5EeSS 2 ni I 5 f9 Средн   прибавка веса за врем  испытаний

   Улучшение показател  потребности в кон- цеитрированном корне

   . Показа тел b noT2e6HOCTH B K02Mej Korga n HeaB{ieH 6267 Показатель потребности в корне, когда ие добавл ли антибиотик

   Т блиц  3

   Таблиц