PL98635B1 - Sposob wytwarzania antybiotyku a-28086 - Google Patents

Sposob wytwarzania antybiotyku a-28086 Download PDF

Info

Publication number
PL98635B1
PL98635B1 PL1975181085A PL18108575A PL98635B1 PL 98635 B1 PL98635 B1 PL 98635B1 PL 1975181085 A PL1975181085 A PL 1975181085A PL 18108575 A PL18108575 A PL 18108575A PL 98635 B1 PL98635 B1 PL 98635B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
factor
antibiotic
growth
water
medium
Prior art date
Application number
PL1975181085A
Other languages
English (en)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US05/569,740 external-priority patent/US4038384A/en
Application filed filed Critical
Publication of PL98635B1 publication Critical patent/PL98635B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/01—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing oxygen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/195—Antibiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Feed For Specific Animals (AREA)

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania antybiotyku A-28086, stanowiacego kompleks czynni¬ ków A, B i D Antybiotyki, wytworzone sposobem wedlug wynalazku, stanowia srodki przeciwbakteryjne, przeciwgrzybowe, przeciwwirusowe, przeciw organizmom wywolujacym wysiekowe zapalenie pluc, kokcydio- bójcze, owadobójcze, roztoczobójcze i wplywajace na wzrost wykorzystania karmy u przezuwaczy.Sposób wytwarzania antybiotyku A-28086, stanowiacego kompleks czynnika A, czynnika B i czyn¬ nika D, wedlug wynalazku polega na tym, ze prowadzi sie hodowle szczepu Streptomyces aureofaciens NRRL 5758 lub Streptomyces; aureofaciens NRRL 8092 w pozywce hodowlanej, zawierajacej przyswajalne zródla weglowodanów, azotu oraz soli nieorganicznych, w warunkach wglebnej fermentacji aerobowej, az do uzyskania znacznej aktywnosci antybiotycznej wyprodukowanej przez organizm w pozywce hodowlanej.Czynnik A antybiotyku A-28086 po rekrystalizacji z mieszaniny aceton-woda, stanowi zwiazek krystalicz¬ ny barwy bialej. Zwiazek ten jest rozpuszczalny w nizszych alkoholach, dwumetyloformamidzie,dwumetylosul- fotlenku, octanie etylu, chloroformie, acetonie oraz benzenie i wykazuje slaba rozpuszczalnosc w heksanie. Jest on nierozpuszczalny w wodzie, posiada temperature topnienia okolo 98-100°C, przy czym powtórnie zestala sie i topi w temperaturze 195-200°C. Ponadto ma on nastepujace wlasciwosci: a) ciezar czasteczkowy, okreslony spektrometrycznie, wynoszacy okolo 764, b) przyblizony sklad elementarny: 66,69% C, 9,85% H i 23,10% O, c) wzór empiryczny C42 H72 Oi i, okreslony spektrometria masowa, d) skrecalnosc wlasciwa o wartosci -54° (c = 0,2 okreslona w metanolu, w temperaturze 25°C), e) widmo absorpcji w podczerwieni, w chloroformie, wykazujace nastepujace maksima (w mikronach) 2,85 3,34. 5,83, 6,82, 7,22, 7,53 (slabe), 7,78, (slabe), 8,75 (silne), 8,95 (silne), 9,15,9,50 (silne), 9,55 (silne), 9,60, 9,85, 10,15, 10,45 i 10,70 (slabe). f) widmo w nadfiolecie w etanolu, wykazuje tylko koncowa absorpqe ponizej 200 m^ g) widmo magnetycznego rezonansu jadrowego, w deuterowanym chloroformie, wykazujace nastepujace wartosci S ppm: 6,01, 4,21, 4,11, 3,90, 3,89, 3.80, 3,67, 3,65, 3,57, 3,55, 2,83, 2,76, 2,74, 2,68, 2,66, 2,58,2 90 635 2,58, 2,30, 2,22, 2,17, 2,10, 205, 1,96, 1,90, 1,85, 1,70, 1,62, 1;60, 1,47, 1,39, 1,31, 1,25, 1,18, 0,95, 0,93, 0,90,0,88, 0,85, 0,77, 0,75, 0,73, 0 68 i 0,66. h) dajaca sie miareczkowac grupe przy wartosci pKa w 80% wodnym roztworze dwumetyloformemidu, wynoszacej 7,9, i) rentgenogram dyfrakcyjny, uzyskany metoda proszkowa (promieniowanie Cu** 1,5405 X. filtr niklowy (wykazujacy odleglosci miedzyplaszczyznowe w angstremach (d), przedstawione w tablicy 1.T a b I i c a 1 d 12,00 ,10 9,25 8,00 7,50 6,92 6,40 ,98 ,68 ,20 4,98 4,62 4,21 3,48 Natezenie wzgledne 100 50 90 40 90 • . ,40 05 40 .40 40 j) wartosc Rf = 0,24, uzyskana metoda chromatografii cienkowarstwowej na zelu krzemionkowym z zastosowaniem ukladu rozpuszczalników benzen-octan etylu (3 :2) oraz Bacillus subtilis ATCC 6633 jako organizmu wykrywajacego, k) wartosci Rf, otrzymane metoda chromatografii bibulowej z zastosowaniem Bacillus subtilis ATCC 6633 i podanego w tablicy 2 ukladu rozpuszczalników.T a b I i c a 2 WartoscRf Uklad rozpuszczalników 0,11 woda nasycona Ml BK 0,41 woda nasycona Ml BK plus 2% kwasu p-toluenosulfo nowego i 1% piperydyny 0,54 woda : metanol : aceton (12:3:1)- zalkalizowane do wartosci pH = 10,5 za pomoca NH40H, a nastepnie zneutralizowane do wartosci pH = 7,5 za pomoca H3P04 0,48 1% MIRK, 0,5% NH4OH w wodzie 0,15 17,4 g K2HP04, 30 ml etanolu na 1 litr wody 0,24 benzen nasycony woda 0,24 woda 0,75 woda : MIBK : octan etylu (98 1:1) MIBK oznacza keton metyIowo izobuty(owy I) funkcje kwasowa, zdolna do tworzenia soli i pochodnych estrowych m) co najmniej jedna grupe hydroksylowa, zdolna do estryftkacji.Czynnik ten tworzy pochodne estrowe, zawierajace w grupie acylowej 2—6 atomów wegla oraz ich fizjologicznie dopuszczalne sole.Czynnik B antybiotyku A—28086 po krystalizacji z mieszaniny aceton-woda, stanowi zwiazek krystaliczny98 635 3 barwy biale], który jest rozpuszczalny w nizszych alkoholach, dwumetyloformamidzie, dwumetylosulfotlenku, octanie etylu, chloroformie, acetonie i benzenie, tylko slabo rozpuszczalny w heksanie, a nie rozpuszczalny w wodzie. Zwiazek ten posiada: a) temperature topnienia okolo 150-153°C b) ciezar czasteczkowy 762, okreslony spektrometria masowa wysokiej rozdzielczosci. c) wzór empiryczny C43 H70 Ot i, okreslony spektrometria masowa wysokiej rozdzielczosci. d) widmo absorpcji w podczerwieni w chloroformie o nastepujacych maksimach w mikronach: 2,82,3,30, ,77, 5,85, 6,80, 7,20, 7,50 (slabe), 7,72 (slabe), 7,80 (slabe), 8,57 (silne), 8,68, 8,90 (silne), 9,10,9,50,9,83 (silne), 9,90, 10,10, 10,17 (silne), 10,43 (slabe), 10,80 (slabe), 11,20 (slabe), 11,35 (slabe), 11,73 (slabe) i 12,03 (slabe). e) widmo w nadfiolecie (E,]cm = 137,5, e — 10,477), wykazujace w etanolu maksimum absorpcji przy 220 rrvu f) widmo magnetycznego rezonansu jadrowego w deuterowanym chloroformie, wykazujace nastepujace wartosci 5 w ppm 7,20, 7,09, 6,26, 6,15, 4,19, 4,12, 4,05, 3,95, 3,89, 3,78, 3,62, 4,59, 3,52, 3,48, 2,81,2,73, 2,63, 2,54, 2,52, 1,90, 1,91, 1,84, 1,71, 1,67, 1,64, 1,55, 1,43, 1,33, 1,18, 1,11, 0,96, 0,94, 0,90, 0,87, 0,84, 0,77,0,74 10,68 g) wartosc Rf = 0,42, wyznaczona metoda chromatografii cienkowarstwowej na zelu krzemionkowym z zastosowaniem ukladu rozpuszczalników benzen-octan etylu (3:2) i Bacillus Subtilis ATCC 6633 jako organizmuwykrywajacego * h) wartosci Rf, oznaczone metoda chromatografii bibulowej z zastosowaniem Bacillus subtilis ATCC 6633 jako organizmu wykrywajacego i podanego w tablicy 3 ukladu rozpuszczalników.T a b I i c a 3 WartoscRf Uklad rozpuszczalników 0,16 woda nasycona Ml BK plus 2% kwasu p-taluenosulfonowego i 1% piperydyny 0,46 woda : metanol : aceton (12 : 3 :1), zalkalizowane NH4CHdo wartosci pH =10,5, a nastepnie zobojetnione H3P04 do wartosci pH = 7,5 0,36 1%MIBK,0,5%NH4OH w wodzie 0,51 benzen nasycony woda 0,11 woda 0,61 woda :MIBK : octan etylu (98 :1 :1) e) funkcje kwasowa, zdolna do tworzenia soli i pochodnych estrowych j) dwie grupy ketonowe k) co najmniej jedna grupe hydroksylowa.Czynnik ten tworzy fizjologicznie dopuszczalne sole.Czynnik D antybiotyku A—28086 stanowi po krystalizacji z mieszaniny aceton-woda zwiazek krystaliczny, który jest rozpuszczalny w metanolu, etanolu, dwumetyloformamidzie, dwumetylosulfotlenku, octanie etylu, chloroformie, acetonie i benzenie, slabo rozpuszczalny w heksanie, a nie rozpuszczalny w wodzie. Zwiazek ten ma temperature topnienia 96—98°C i nastepujace wlasciwosci: a) ciezar czasteczkowy 778, okreslony spektrometria masowa wysokiej rozdzielczosci. b) przyblizony sklad elementarny wynoszacy: 67,59% C, 9,38% H i 22,77% O c) wzór empiryczny C44H74Oi ^okreslony spektrometria masowa wysokiej rozdzielczosci d) skrecalnosc wlasciwa —56° w temperaturze 25°C (c = 0,1; metanol) e) widmo absorpcji w podczerwieni w chloroformie, wykazujace nastepujace maksima w mikronach: 2,89, 3,39, 3,43, 3,50, 5,85, 6,90, 7,27, 7,60, 7,84, 9,00, 9,26,9,62,10,31,10,58,11,10 i 11,49 f) w 95% wodnym roztworze etanolu nie obserwowano absorpcji w nadfiolecie g) widmo magnetycznego rezonansu jadrowego, wykazujace nastepujace wartosci 8 w ppm: 6,00, 4,20, 4,10, 4,00, 3,98, 3,92, 3,86, 3,83, 3,79, 3,67, 3,64, 3,57, 3,54, 2,88, 2,81, 2,71, 2,62, 2,58, 2,48, 2,43, 2,37, 2,29, 2,21, 2,15, 2,10, 2,04, 1,97, 1,89, 1,83, 1,76, 1,68, 1,61, 1,58, 1,55, 1,47, 1,39, 1,30, 1,25, 1,18,0,95, 0,90, 0,88, 0,84, 0,74 i 0,68 h) dajaca sie miareczkowac grupe przy wartosci pKa w 80% wodnym roztworze dwumetyloformamidu, wynoszacej 8,674 98 635 i) rentgenogram dyfrakcyjny, uzyskany metoda proszkowa (promieniowanie Cu**, 1,5405 X filtr niklowy) wykazujacy odleglosci miedzyplaszczyznowe w angstremach (d) przedstawione w tablicy 4, Tablica 4 12,40 ,20 8,85 7,80 6,80 6,30 ,70 ,35 ,10 4,90 4,65 4,45 4,20 3,30 3,15 2,99 2,77 2,28 Natezenie wzgledne 100 ,70 90 -30 ,100 ,20 40 05 ,05 05 j) wartosci Rf, oznaczone chromatografia cienkowarstwowa na zelu krzemionkowym z zastosowaniem Bacillus subtilis ATCC 6633 jako organizmu wykrywajacego przedstawione w tablicy 5 TabI i ca 5 Wartosc Rf Uklad rozpuszczalników 0,26 benzen-octan etylu (3 : 2) 0,66 octan etylu — dwumetyloamina (95 : 5) k) wartosci Rf, oznaczone chromatografia bibulowa z zastosowaniem 3acillus subtilis ATCC 6633, przedstawione w tablicy 6.Tablica 6 WartoscRf Uklad rozpuszczalników 0,10 woda, nasycona ketonem mety Iowoizobutylowym (MIBK) 0,26 woda, nasycona MIBK plus 2% kwasu p-toluenosulfonowego i 1% piperydyny 0,36 woda : metano? : aceton (12:3:1), zaikalizowane NH4OH do wartosci pH = 10,5, a nastepnie zobojetnione H3P04 do wartosci pH = 7,5 0,29 1% MIBK 0,5% NH4OH w wodzie 0,25 17,4 g K2HP04, 30 ml etanol na 1 litr wody 0,26 benzen nasycony woda 0,09 woda 0,64 woda : MIBK : octan etylu (98 : 1 : 1)98 635 5 !) funkcje kwasowa, zdolna do tworzenia soli i pochodnych estrowych m) co najmniej jedna grupe hydroksylowa, zdolna do estryfikacji Czynnik ten tworzy pochodne estrowe, zawierajace w grupie acylowej 2-6 atomów wegla oraz ich fizjologicznie dopuszczalne sole.Chociaz znanych jest obecnie wiele substancji przeciwbakteryjnych, ciagle jednakze, istnieje zapotrzebowa¬ nie na nowe, lepsze antybiotyki. Jednym z problemów w terapii antybiotykami jest to, ze antybiotyki wykazuja rózna skutecznosc dzialania przeciw organizmom chorobotwórczym. Inny problem stanowi rozwój mikroorga¬ nizmów, które sa uodpornione na dzialanie standardowych antybiotyków. Ponadto poszczególne antybiotyki wywoluja czesto u indywidualnych pacjentów powazne reakcje, spowodowane nadwrazliwoscia i/lub toksycz¬ nym dzialaniem. Z powyzszych wzgledów w obecnej terapii poszukuje sie coraz nowych antybiotyków.Oprócz zapotrzebowania na nowe antybiotyki, uzyteczne w leczeniu chorób u ludzi ulepszone antybiotyki sa równiez potrzebne w weterynarii. W jednym z waznych aspektów ulepszone antybiotyki sa potrzebne do wspomagania wzrostu drobiu i bydla. Wplyw na wzrost zwierzat osiaga sie np. przez zwalczanie choroby i przez zwiekszenie wykorzystania karmy.Jedna z dobrze znanych w weterynarii chorób o ekonomicznym znaczeniu, zwlaszcza w przemyslowej hodowli drobiu jest kokcydioza, wywolana pierwotniakami. Kokcydioza jest wynikiem zakazenia co najmniej jednym szczepem Eimeria lub Isospora (opisanych przez Lunda i Farr'a w „Diseases of Poultry" wydanie 5/ Biester and Schwarte, Eds, Iowa State University Press, Ames, la 1965, str, 1056—1096) poniewaz kokcydioza powoduje olbrzymie straty ekonomiczne, a znane srodki przeciw kokcydiozie sa niekorzystne, ciatjle prowadzi sie badania nad znalezieniem lepszych srodków przeciw tej chorobie. Inna choroba, powodujaca duze straty dla hodowców bydla jest dur rzekomy. Dur rzekomy u kurczat, swin, bydla rogatego i owiec wywoluja glównie bakterie beztlenowe, zwlaszcza Clostridium perfrigens i wirusy. Zatrucie jelitowe u przezuwaczy, którego przykladem jest „choroba przejedzenia" u owiec powoduje zakazenie Clostridium perfringens. » ¦ < Wspomaganie wzrostu u przezuwaczy, takich jak bydlo rogate, jest innym ekonomicznie korzystnym przedmiotem badan w weterynarii. Szczególnie interesujace jest przyspieszanie wzrostu przez zwiekszenie wykorzystania karmy. Mechanizm przyswajania wiekszosci skladników odzywczych, czyli weglowodorów z karmy przezuwaczy jest dobrze znany. Mikroorganizmy wzwaczu powoduja rozpad weglowodanów, do monosacharydów, które sa nastepnie przeksztalcane w pochodne kwasu pirogronowego. Zwiazki pirogronowe ulegaja w procesach mikrobiologicznych metabolizmowi do octanów, maslanów i propionianów, ogólnie znanych jako lotne kwasy tluszczowe (VFA). Zagadnienie to jest szczególowo opisane przez Leng'a w „Physiology af Digestion and Metabolism in the Ruminant", Phillipson'a i wspólpracowników, Eds, Oriet Press, Newcastle — - upon - Tyne, Anglia, 1970, str. 408-410.Wzgledna efektywnosc wykorzystania VFA jest omówiona przez Mc Cullough#e w Feedstuffs", 19 czerwiec 1971, str. 19, Eskelauda i wspólpracowników w J. Am.Sci. 33, 282 (1971), a takze Church's i wspólpracowni¬ ków w Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants" Vol. 2,1971, str. 622 i 625. Chociaz zarówno octany, jak i maslany sa przyswajalne, jednakze propioniany sa przyswajane znacznie skuteczniej. Ponadto, przy zbyt malej ilosci propionianów w organizmie zwierzecia rozwija sie kwasica ketonowa. Tak wiec korzystny zwiazek powoduje, ze zwierze wytwarza wiecej propionianów, dzieki czemu wzrasta stopien wykorzystania weglowoda¬ nów, a równoczesnie spada liczba przypadków kwasicy ketonowej.Czynniki A, B i D antybiotyku A-28086 sa nowymi grupami antybiotyków poliestrowych. Przykladem tego typu grup jest monensyna (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3501568); dianemycyna (R.L. Hamill, M.M. Hochn. G.H. Pittenger, J, Chamberlin i M. Gorman, J. Antibiotics 22,161 (1969); nigerycyna (L.K. Steinrauf, Hary Pinkerton i J.W. Chamberlin, Biochem, Biophys. Res. Comm.3329 (1968) i Salinomycyna (japonski opis patentowy nr 47-25392, opublikowany 20 pazdziernika 1972, zgloszony za numerem 19620/1971; Derwent nr 76960T; opis patentowy Stanów Zjednoczonych nr 3857948; H. Kinasbi, N. Otake, H. Yonchara, S. Sato i Y.Saito, Tetrahedron Lett, 49, 4955 - 4958 (1973).Okreslenie „kompleks antybiotyku", stosowany w procesie fermentacji oraz w opisie nie oznacza komplek¬ su w sensie chemicznym lecz mieszanine wspólnie otrzymanych, poszczególnych czynników antybiotyku.Stwierdzono, ze antybiotyk, wytworzony podczas fermentacji, stanowi kompleks antybiotyku, zawierajacy poszczególne czynniki antybiotyku w róznym stosunku, zaleznym od warunków fermentacji.Kompleks antybiotyku A-28086 wytwarza sie podczas hodowli nowego szczepu Streptomyces aureofa¬ ciens NRRL 5758 w warunkach wglebnej fermentacji aerobowej, prowadzonej az do otrzymania znacznej aktywnosci antybiotycznej.Kompleks antybiotyku A-28086 otrzymuje sie równiez podczas hodowli innego nowego szczepu, jakim jest Streptomyces aureofaciens NRRL 8092. Otrzymany podczas hodowania S. aureofaciens NRRL 5758 lubS. aureofaciens NRRL 8092 kompleks antybiotyku A-28086 ekstrahuje sie z brzeczki fermentacyjnej i grzybni za6 ¦ :' 9B635-.'- ¦*". ;' '.;¦;"' \ '-' \. ¦", pomoca polarnego rozpuszczalnika organicznego. Wyekstrahowana mieszanine, antybiotyku oddziela; sie, pn^z zateztnie rozpuszczalników, dodanie otrzymanego koncentratu do'nadmiaru eteru naftowego'dla oddzielenia zanieczyszczen, saczenie i odparowanie przesaczu, w wymku czego otrzymuje sfe nrtiesz mine A-28086vMiWani- na antybiotyku moze byc dodatkowo oczyszczana i rozdzielana .n$ poszczególne czy? niklza porripcg chromato- grafitkolumnowej. * - Zwiazki stanowiace antybiotyk A-28086, hamuja rozwój organizmów^ które wywoluja choroby zwierzat i zywych roslin. Jednym z aspektów dzialania hamujacego jest aktywnosc tych zwiazków przeciw kokcydiozie.Ponadto antybiotyk A-28086 jest srodkiem przeciwbakteryjnym, przecz organizmom, wywolujacym wysiekowe zapalenie pluc (PPLO), owadobójczym, rozioczobójczym oraz zwiekszajacym wyko¬ rzystanie karmy uprzezuwaczy. ? Zalaczone rysunki przedstawiaja widma absorpcji w podczerwieni wykonane w chloroformie, pr/y czym fig. 1 przedstawia widmo czynnika A-28086-A; fig. 2 przedstawia • ty Mimo czynnika'A-28086 B, fig. 3 przedstawia widmo estru octowego czynnika A-28086-A; fig, 4 przedstawia /widmo, estru propionowego czynnika A-28086-A; fig. 5 przedstawia widmo estru maslowego czynnika A-^2808£W\; fig. 6 przedstawia widmo estru walerianowego czynnika A—28086-A; fig. 7 przedstawia widnro estru kapronowego czynnika A-28086--A, a fig. 8 przedstawia widmo czynnika A-28086-D/ Czynniki A-28086 sa ze soba strukturalnie spokrewnione. Podczas fermentacji otrzymuie sie mieszanine co najmniej czterech czynników antybiotycznych. Czynniki te oddziela sie i wyodrebnia; Czynniki A, B i D wydziela sie jako poszczególne zwiazki. Mieszanina czynników antybiotyku A—28086 jest rozpuszczalna w wiekszosci rozpuszczalników organicznych, a nierozpuszczalna w wodzie.Ponizej opisano fizyczne i spektralne wlasciwosci czynników A, B i D antybiotyku A—28086.Czynnik A krystalizuje z mieszaniny aceton-woda. Czynnik ten ma temperature topnienia okolo 98—100°C i po ponownym zestaleniu mt temperature topnienia okolo 195-20Ó°C. Analiza elementarna wykazara nastepujacy sredni sklad procentowy: 66,69% C, 9,85% H, 23,10% O. Proponowany wzór empiryczny czynnika A-C^3H720i i.Czynnik A ma pozorny ciezar czasteczkowy okolo 764, co okreslono spektrometria masowa.Widmo w podczerwieni, w chloroformie, przedstawia fig 1# Obserwowano nastepujace maksima absorpcji w mikronach: 2,85, 3,34, 5,85, 6,82, 7,22, 7,53 (slabe), 7,78 (slabe), 8,75 (silne), 8,95 (silne), 9,15,9,50 (silne), 9,55 (silne), 9,60, 9,85, 10,15, 10,45 i 10,70 (slabe).Widmo w nadfiolecie w etanolu wykazuje tylko koncowa absorpcje ponizej 220 m/i Widmo ^magnetycznego rezonansu jadrowego czynnika A, w deuterowanym chloroformie wykazuje nastepujace wartosci 5 ppm: 6,01, 4,21, 4,11, 3,99, 3,89, 3,80, 3,67, 3,65, 3,57, 3,55, 2,83, 2,76, 2,74, 2,68, 2,66, 2,58, 2,56, 2,30, 2,22, 2,17, 2,10, 2,05, 1,96, 1,90, 1,85, 1,70, 1,62, 1,60, 1,47, 1,39, 1,31, 1,25, 1,18, 0,95, 0,93, 0,90, 0,88, 0,85, 0,77, 0,75, 0,68 i 0,66.Czynnik A antybiotyku A-28086 po krystalizacji z mieszaniny aceton woda daje rentgenogram dyfrakcyj¬ ny, uzyskany metoda proszkowa, przedstawiony w tablicy 7, '(promieniowanie Cu*+, 1,5405 X, filtr niklowy d = odleglosc miedzyplaszczyznowa w angstremach).T a b I i c a 7 d 12,00 ,10 9,25 8,00 7,50 6,92 6,40 ,98 ,68 ,20 4,98 4,62 4,21 3,48 Natezenie w; 100 50 ,90 40 90 40 05 40 40 40 1098635 7 Skrecalnosc wlasciwa czynnika A antybiotyku A—28086 w temperaturze 25QC wynosi .-54°(c * 0,2, metanol). Skrecalnosc wlasciwa jest srednia wartoscia, otrzymana z kilku pomiarów.Elektrometryczne miareczkowanie czynnika A w 80% wodnym dwumetyloformamidzie wykazalo obec¬ nosc zdolnych do miareczkowania grup przy wartosci pKa 7,9.Czynnik A antybiotyku A-28086 jest rozpuszczalny w róznych rozpuszczalnikach organicznych, takich jak metanol, etanol, dwumetyloformamid, dwumetylosulfotlenek, octan etylu, chloroform, aceton i benzen, slabo rozpuszczalny w niepolarnych rozpuszczalnikach, takich jak heksan i nierozpuszczalny w wodzie.Czynnik A antybiotyku A—28086 ma grupe kwasowa, zdolna do tworzenia soli i pochodnych estrowych i co najmniej jedna grupe hydroksylowa, zdolna do estryfikacji.Na podstawie wyzej podanych wlasciwosci fizycznych zaproponowano budowe czynnika A antybiotyku A-28086, przy czym jest zrozumiale, ze przedstawiona budowa jest jedynie hipoteza robocza. Przypuszczalna strukture czynnika A—28086—A okresla wzór 1.Czynnik B antybiotyku A-28086 jest po krystalizacji z mieszaniny aceton-woda zwiazkiem krystalicznym barwy bialej o temperaturze topnienia okolo 150—153°C.Jak okreslono spektrometria masowa wysokiej rozdzielczosci, czynnik B ma po orny ciezar czasteczkowy okolo 762 i proponowany wzór empiryczny C43 H70 O! i, Widmo w podczerwieni czynnika B, w chloroformie, zgodnie z fig 2, wykazuje nastepujace maksima absorpcji w mikronach: 2,82, 3,30, 5,77, 5,85, 6,80, 7,20 7,50, (slabe), 7,72 (slabe), 7,80 (slabe), 8,57 (silne), 8,68, 8,90 (silne), 9,10, 9,50 9,83 (silne), 9,90, 10,10,10,17 (silne), 10,43 (slabe), 10,80 (slabe), 11,20 (slabe), 11,35 (slabe), 11,73 (slabe) i 12,03 (slabe).Widmo w nadfiolecie czynnika B, w etanolu, wykazuje maksimum absorpcji prz\ 220 m/i, (E-,^ = 137,5, e* 10477) Widmo magnetycznego rezonansu jadrowego czynnika B antybiotyku A-28086 w deuterdwanym chlorofo¬ rmie wykazuje nastepujace wartosci 8ppm: 7,20, 7,09, 6,26, 6,15, 4,19,4,12,4,05,3,95,3,89,3,78, 3,62,3,59, 3,52, 3,48, 2,81, 2,73, 2,63, 2,54, 2,52, 1,99, 1,91, 1,84, 1,71, 1,67, 1,64, 1,55, 1,43, 1,33, 1,18, 1,11, 0,96, 0,94, 0,90, 0,87, 0,84, 0,77, 0,74, i 0,68.Czynnik B antybiotyku A—28086 jest rozpuszczalny w róznych rozpuszczalnikach organicznych, takich jak metanol, eta noi, dwumetyloformamid, dwumetylosulfotlenek, octan etylu, chloroform, aceton i benzen, lecz slabo rozpuszczalny w niepolarnych rozpuszczalnikach organicznych, takich jak heksan, a nierozpuszczalny w wodzie.Chociaz budowa chemiczna czynnika B antybiotyku A-28086 nie jest wyjasniona, jednakze dane fizyko-chemiczne wskazuja, ze czynnik B ma jedna grupe kwasu karboksylowego- dwie grupy ketonowe i jedna lub wiecej grup hydroksylowych.S. aureofaciens NRRL 5758 produkuje niewielkie ilosci czynnika D antybiotyku A—28086. Jednakze przy stosowaniu S. aureofaciens NRRL 8092 czynnik D stanowi do 10% odzyskanej aktywnosci antybiotycznej.Czynnik D antybiotyku A-28086, po krystalizacji z mieszaniny woda-aceton jest substancja krystaliczna barwy bialej o temperaturze topnienia 96-98°C. Jak okreslono spektrometria masowa wysokiej rozdzielczosci czynnik D antybiotyku A-28086 ma pozorny ciezar czasteczkowy 778.Sklad elementarny piku w widmie masowym soli sodowej czynnika D antybiotyku A-28086 daje wartosc 800, 5050 (wartosc obliczona dla C44 H73 On Na = 800,5050). W widmie masowym czynnika D w postaci wolnego kwasu obserwuje sie niewielki pik przy 778 i wiekszy pik przy 760, 5117 (wartosc obliczona dla C44 H72 Oi o = 760,S125). wartosc m/e = 760 w widmie masowym wolnego kwasu wynika z utraty wody przez jon czasteczkowy.Tak wiec sklad jonu czasteczkowego czynnika A—28086—D w postaci wolnego kwasu okresla wzór C44H74Oi1.Wzór empiryczny proponowany dla czynnika D antybiotyku A—28086, jest nastepujacy C44H74Oi 1.Analiza elementarna czynnika D wykazala nastepujacy sklad: 67,59% C, 9,38% H 22,77% O Teoretycznieobliczony sklad dla C44 H74 Oi 1 wynosi: 67,87% C 9,51% H 22,77% O.Widmo absorpcji w podczerwieni czynnika D antybiotyku A—28086 (fig. 8) wykazuje nastepujace maksima (w mikronach): 2,89, 3f39, 3,43, 3,50, 5,88, 6,90, 7,27, 7,60,7,84, 9f00,9,26, 9,62,10,31, 10,58,11,10 i 11,49.Czynnik D antybiotyku A-28086 w 95% wodnym roztworze etanolu nie wykazuje absorpcji w ultrafiole¬ cie.Widmo magnetyczne rezonansu jadrowego czynnika D antybiotyku A—28086 wdeuterowanym chlorofor¬ mie wykazuje nastepujace wartosci 5ppm: 6,00, 4,20, 4,10, 4,00, 3,98, 3,92, 3,86, 3,83, 3,79, 3,67,3,64,3,57,8 98 635 3,54, 2,88, 2,81, 2,71, 2,62, 2,58, 2,48, 2,43, 2,37, 2,29, 2,21, 2,15, 2,10, 2,04, 1,97, 1 89, 133, 1,76, 1,68. 1,61,1,58,1,55, 1,47,1,39, 1,30, 1,25, 1,18, 0,95, 0,90, 0,88r 0,84, 0,74 i 0,68 Czynnik D antybiotyku A—28086 po krystalizacji z mieszaniny aceton wode daje rentgenogram dyfrakcyj¬ ny, uzyskany metoda proszkowa (promieniowanie Cu**, 1,5405 X, filtr niklowy (cJ = odleglosc miedzyplaszczyz- nowa w angstremach), przedstawiony w tablicy 8.T a b I i c a 8 d 12,40 ,20 8,85 7,80 6,80 6,30 ,70 ,35 ,10 4,90 4,65 4,45 4,20 3,30 3,15 2,99 2,77 2,28 Natezenie wzgledne! 100 70 90 ,100 .20 40 05 ,05 05 Skrecalnosc wlasciwa czynnika D antybiotyku A—28086 w temperaturze 25°C wynosi —56° (c=0,1, metanol).Miareczkowanie elektrometryczne czynnika D antybiotyku A—28086 w 80% wodnym roztworze dwumety- loformamidu wykazalo obecnosc zdolnych do miareczkowania grup przy wartosci pKa 8,67.Czynnik D antybiotyku A—28086 jest rozpuszczalny w rozpuszczalnikach organicznych, takich jak meta¬ nol, etanol, dwumetyloformamid, dwumetylosulfotlenek, octan etylu, chloroform, aceton i benzen, malo rozpuszczalny w niepolarnych rozpuszczalnikach organicznych, takich jak heksan, a nierozpuszczalny w wodzie.Czynnik D antybiotyku A—28086 ma grupe kwasowa, zdolna do tworzenia soli i pochodnych estrowych oraz co najmniej jedna grupe hydroksylowa, zdolna do estryfikacji.Na podstawie wyzej przytoczonych danych fizycznych zaproponowano strukture czynnika D antybiotyku A—28086, przy czym nalezy rozumiec, ze przedstawiona struktura jest jedynie hipoteza robocza. Przypuszczalna budowe czynnika D okresla wzór 2, w którym Rj = CH3 i R2=C2 H5 lub R3 =C2 HSlaR2 = CH3.Wartosci Rf czynników A, B i D antybiotyku A—28086 w róznych ukladach chromatografii bibulowej z zastosowaniem Bacillus subtilis ATCC 6633 przedstawiono w tablicy 9. /98 635 ; Tablica 9 Czynnik A 0,11 0,41 0,54 0,48 0,15 0,24 0,24 0,75 Wartosc Rf Czynnik B 0t09 0,16 0,46 0,36 0,33 0,51 0,11 0,61 Czynnik D 0,10 0,26 0,36 0,29 0,25 0,26 0,09 0,64 Uklad rozpuszczalników woda nasycona ketonem metyloizobutylowym woda, nasycona MIB K plus 2% kwasu p-toluenosulfonowego i 1%piperydyny . woda : metanol : aceton (12 : 3 : D.zalkalizowane za pomoca NH4OH, a nastepnie zobojetnione do wartosci pH = 7,5 za pomoca H3 PO4 . 1% MIBK, 0,5% NH4 OH w wodzie 17,4 g K2HP04, 30 ml etanolu na Iitr wody benzen; nasycony wóda woda woda : MIBK octan etylu (98 :1 :1) W tablicy 10 przedstawiono Rf czynników A, B i D antybiotyku A-28086, oznaczone metoda chromato¬ grafii cienkowarstwowej w dwu ukladach chromatograficznych, na zelu krzemionkowym (wstepnie pokryte plytki, E. Merck, Darmstadt F-254, grubosc warstwy = 0,25 mm)..Ta b I i ca 10 Wartosc 3f Czynnik A Czynnik B Czynnik D Uklad rozpuszczalników 0,24 0,42 0,28 benzen - octan etylu 0,54 0,34 0,66 octan etylu-dwuetyloamina Inna substancje, wytworzona razem z kompleksem antybiotyku A-28086, oznaczono jako A-28086-1.Chociaz skladnik A-28086-1 nie jest mikrobiologicznie aktywny, jest on strukturalnie spokrewniony z czynni¬ kami antybiotyku A-28086.A—28086— I po krystalizacji z mieszaniny aceton-woda jest zwiazkiem krystalicznym barwy bialej o tempe¬ raturze topnienia 160—162°C. Badania porównawcze widma NMR i innych wlasciwosci A—28086—I oraz syntetycznie wytworzonego estru metylowego czynnika A antybiotyku A-28086 wykazaly, ze A-28086-I jest estrem metylowym czynnika A lub bardzo zblizonym zwiazkiem takim jak steroizomer.Chociaz skladnik A-28086-l otrzymuje sie razem z aktywnymi czynnikami antybiotyku A-28086, to moze on byc latwo oddzielony od nich za pomoca chromatografii na zelu krzemionkowym. Skladnik A—28088—I ma wartosc Rf - 0,53, oznaczona chromatografia cienkowarstwowa na zelu krzemionkowym z zastosowaniem octanu etylu jako rozpuszczalnika eluujacego i waniliny jako wywolywacza (3% roztwór waniliny w metanolu + 0,5 ml stezonego H2S04 na 100 ml roztworu). Po spryskaniu wanilina i ogrzaniu A—28086—I daje plame koloru niebieskiego, natomiast czynniki A-28086 daja plamy jasnorózowe, które szybko zmieniaja sie na ciemnobrazowo-niebieskie.Czynniki A, B i D antybiotyku A-28086 oraz wymienione pochodne estrowe czynników A i D, utworzone z grupa acylowa, sa zdolne do tworzenia soli. „Fizjologicznie dopuszczalne'' sole sa solami, które sa takze farmaceutycznie dopuszczalne: sa to sole, których toksycznosc w stosunku do zwierzat cieplokrwistych nie wzrasta w odniesieniu do postaci nie bedacej sola. Przykladem sa odpowiednie sole metali alkalicznych i metali ziem alkalicznych czynnika A i B antybiotyku A—28086, takie jak sodowe, potasowe, litowe, cezowe, rubidowe, borowe, wapniowe i magnezowe. Odpowiednie sole z aminami czynników A i B antybiotyku A-28086 stanowia sole amonowe, pierwszo, drugo i trzeciorzedowe alkiloamoniowe, zawierajace w grupie alkilowej 1—4 atomy10 98 635 wegla oraz hydroksyalkiloamoniowe o 2-4 atomach wegla w grupie alkilowej. Przykladem soli z aminami sa zwiazki, otrzymane przez reakcje czynników A i B antybiotyku A-28086 z wodorotlenkiem amonu, metyloami¬ na, llrz.-butyloamina, izopropyloamina, dwuetyloamina, dwuizopropyloamina, etanoioamina, trójetyloamina, 3-aminopropanolem-1 itp.Sole czynników A, B i D antybiotyku A—28086 z kationami metali alkalicznych i metali ziem alkalicznych oraz acylowe pochodne czynników A i D wytwarza sie sposobom, stosowanym zwykle do wytwarzania soli kationowych. Na przyklad, czynnik antyhiotyczny w postaci wolnego kwasu tub pochodna estrowa rozpuszcza sie w odpowiednim rozpuszczalniku, takim jak cieply metanol lub etanol i do tego roztworu dodaje sie roztwór, zawierajacy stechiometryczna ilosc okreslonej zasady nieorganicznej. Wytworzona w ten sposób sól wydziela sie znanymi sposobami, takimi jak saczenie lub odparowanie rozpuszczalnika.Sole z aminami organicznymi wytwarza sie w podobny sposób. Na przyklad amine w stanie cieklym lub gazowym dodaje sie do roztworu czynnika w odpowiednim rozpuszczalniku, takim jak aceton, a rozpuszczalnik i nadmiar aminy usuwa sie przez odparowanie.Wiadomo, ze podczas leczenia farmaceutykami w weterynarii postac antybiotyku nie jest wazna przy podawaniu zwierzetom. W wiekszosci przypadków warunki w organizmie zwierzecia powoduja zmiane postaci leku, w której byl on podany. Z tego wzgledu, stosowana w sposobie leczenia postac soli nie jest wazna. Postac soli moze byc wybrana ze wzgledów ekonomicznych, wygody i toksycznosci.Czynnik A antybiotyku A-28086 tworzy z grupa acylowa pochodne estrowe.Estryfikacji ulega co najmniej jedna z grup hydroksylowych czynnika A antybiotyku A-28086 po potraktowaniu bezwodnikiem kwasowym o 2—6 atomach wegla lub chlorkiem kwasowym. Estry zwykle wytwarza sie na drodze reakcji czynnika A antybiotyku A-28086, np. z odpowiednim bezwodnikiem kwaso¬ wym, w temperaturze pokojowej. Pochodne estcowe sa takze uzyteczne jako antybiotyki i srodki zwiekszajace wykorzystanie karmy.Ponizej podano wlasciwosci estrowych pochodnych czynnika A antybiotyku A—28086.Ester octowy czynnika A antybiotyku A—28086 po krystalizacji z mieszaniny aceton-woda jest zwiazkiem krystalicznym barwy bialej o temperaturze topnienia okolo 100—103°C. Ma on wzór empiryczny C45H74O12 i ciezar czasteczkowy okolo 807, okreslony na podstawie wzoru empirycznego, zaproponowanego dla czynnika A antybiotyku A—28086. Analiza elementarna estru octowego czynnika A wykazala sklad procentowy: Obliczono dla C45 H74Oi2 C H O 66,97 9,24 23,79 •znaleziono: 66,67 8,71 23,13 Widmo w podczerwieni estru octowego czynnika A antybiotyku A—28086, w chloroformie, przedstawiono na fig. 3. Zaobserwowano nastepujace maksima absorpcji w mikronach 2,85,3,36, 3,38 (silne), 5,80,6,83,7,25, 7,52 (silne), 7,60 (slabe), 7,80, (silne), 8,45 (silne), 8,80 (silne), 8,95 (silne), 9,10 (silne), 9,20,9,63,9,80 (silne), ,12 (slabe), 10,25 (slabe) i 10,50.Widmo w nadfiolecie estru octowego czynnika A, w etanolu, wykazuje tylko koncowa absorpcje. Potencjo- metryczne miareczkowanie estru octowego czynnika A^w80% Wodnym roztworze dwumetyloformamidu wykazuje zdolna do miareczkowania grupe przy wartosci pKa 8,5.Ester propionowy czynnika A antybiotyku A—28086 po krystalizacji 1 mieszaniny aceton-woda jest zwiazkiem krystalicznym barwy bialej, o temperaturze topnienia okolo 96—98°C. Pochodna ta ma wzór empiryczny C46H76012 i ciezar czasteczkowy okolo 821, obliczony na podstawie wzoru empirycznego, zaproponowanego dla czynnika A antybiotyku A—28086. Analiza elementarna estru propionowego czynnika A wykazala nastepujacy sklad procentowy: dla wzoru 64(1-17(0! 2 C H O Obliczono: 67,29 9,33 23,38 znaleziono: 66,06 9,17 23,41 Widmo w podczerwieni estru propionowego czynnika A w chloroformie przedstawia fig. 4. Zaobserwowano nastepujace maksima absorpcji w mikronach: 2,85, 3,33, 3,38 (silne), 3,45 (silne), 5,75 (silne), 5,82,6,81, 7,22, 7,30 (silne), 7,50 (slabe), 7,60 (slabe), 7,80, 8,43, 8,75 (silne), 8,90, 9,05, 9,15 (silne), 9,50 (silne), 9,63,933 (slabe), 10,05 (silne), 10,13,10,20 (silne), 10,45 i 10,68.Widmo w nadfiolecie estru propionowego czynnika A w etanolu wykazuje tylko koncowa absorpcje.Ester maslowy czynnika A antybiotyku A-28086 po krystalizacji z mieszaniny aceton-woda jest zwiazkiem krystalicznym barwy bialej o temperaturze topnienia 96-98°C. Ester ten ma wzór empiryczny C47H78012, ciezar czasteczkowy okolo 835 i przyblizony sklad wynoszacy. 67,60% C, 9,41% H, 22,99% O, wyprowadzony ze wzoru empirycznego, zaproponowanego dla czynnika A—28086—A.98 635 11 Widmo w podczerwieni tej pochodnej przedstawia fig. 5. Obserwuje sie nastepujace maksima absorpcji w mikronach: 2,89, 3,40, 3,45, 3,51, 5,85, 5,92 (silne), 5,97 (silne), 6,90,7,30,7,84 (slabe), 8,55,8,85 (slabe), 9,01 (silne), 9,26, 9,76, 9,95, 10,31 i 10,64.Ester walerianowy czynnika A antybiotyku A—28086 po krystalizacji z mieszaniny aceton-woda jest zwiazkiem krystalicznym barwy bialej o temperaturze topnienia 173—175°C.Walerianowa pochodna antybiotyku A-28086 ma wzór empiryczny C48HB0Oi2, ciezar czasteczkowy okolo 849 i nastepujacy przyblizony sklad: 67,89% C, 9,50% H, 22,61% O, wyprowadzony ze wzoru empirycznego, zaproponowanego dla czynnika A antybiotyku A—28086.Widmo w podczerwieni estru kapronowego czynnika A antybiotyku A—28086 w chloroformie przedstawia fig. 7. Zaobserwowano nastepujace maksima absorpcji w mikronach: 2,90, 3,40, 3,45, 3,51, 5,87, 5,92 (silne), ,97 (silne), 6,90, 7,30, 7,66 (slabe), 7,84 (slabe), 8,16, 8,58,8,85 (slabe), 9,05 (silne), 9,17,9,72,9,95,10,29 i 10,62.Acylowanie czynnika A antybiotyku A—28086 powoduje nastepujace zmiany w widmie magnetycznego rezonansu jadrowego !H: rezonans karbinylu wystepujacy przy okolo 4 ppm, przesuwa sie w dolny obszar do okolo 5,3 ppm (dokladne polozenie zmienia sie nieznacznie dla róznych pochodnych acylowych), a sygnaly protonów z grupy winylowej sa równiez przesuniete. Stanowi to charakterystyke przemiany przedstawionej czesciowymi wzorami na schemacie, gdzie R oznacza grupe alkilowa o 1—5 atomach wegla. Ta czesciowa struktura jest calkowicie zgodna z badaniami homonuklearnego odsprzezenia * H i magnetycznymi danymi jadra 13C dla estru octowego i propionowego. Pochodne acylowe czynnika A antybiotyku A-28086 b 2—6 atomach wegla w grupie acylowej sa rozpuszczalne w róznych rozpuszczalnikach organicznych, takich jak metanol, etanol, dwumetyloformamid, dwumetylosulfotlenek, octan etylu, chloroform, aceton i benzen, malo rozpuszczalne w niepolarnych rozpuszczalnikach organicznych, takich jak hekran i nierozpuszczalne w wodzie.Kazda acylowa pochodna antybiotyku A-28086 o 2-6 atomach wegla w grupie acylowej ma funkcje * kwasowa, zdolna do tworzenia soli pochodn/eh estrowych.Nowe antybiotyki wytwarza sie przez hodowanie produkujacego A-28086 szczepu Streptomyces aureofa- ciens we wglebnych warunkach aerobowych, w odpowiednim srodowisku, az do otrzymania znacznej aktywnosci antybiotycznej. Antybiotyki wydziela sie i oczyszcza znanymi sposobami.Jeden z nowych organizmów, stosowanych do wytwarzania antybiotyków A—28086, wyizolowano z próbki ziemi, zebranej w Mount Ararat w Turcji. Organizm ten sklasyfikowano jako szczep Streptomyces aureofaciens Duggar, co opisal E.B. Shirling i D. Gottlieb w „Cooperative Description of Type Cultures of Streptomyces. III Additional Species Descriptions from First and Second Studies, „Intern. Buli. Systematic Bacteriol. 18, 279-392 (1968). Klasyfikacja ta jest oparta na metodach, zalecanych przez International Streptomyces Project (E.B. Shirling'a i D. Gottlieb'a, „Methods tor Characterization of Streptomyces species, „Intern. Buli. Systematic Bacteriol. 16, 313-340 (1966) z pewnymi dodatkowymi testami. Nazwy barw okreslano metoda ISCC-NBS (K.L. Kelly i D. S. Judd, „The ISCC - NBS Method of Designating Color and a Dictionary of Color Names", Departament Handlu USA, Circ. 553, 1955, Washington, D.C, oznaczenia w nawiasach dotycza Serii barw Tresner'a i Backus'a (Tresner, H.D. and S.J. Backus, „System of Color Wheels for Streptomyces Toxonomy, „Appl. Microbiol. 11, 335-338 (1963); oznaczenie odrózniajace kolor jest podkreslo¬ ne. Grupy kolorów Maerz'a i PauTa (A. Maerz and M.R. Paul, „Dictionary of Color, „McGraw-Hill Book Co., Inc.New York, N.Y. (1959) sa ujete w nawiasach klamrowych. Hodowle rosna w temperaturze 30°C w ciagu 14 dni.Ponizej przedstawiono charakterystyke szczepu NRRL 5758, produkujacego antybiotyk A—28086.Morfologia. Zarodnikujace, powietrzne strzepki grzyba stanowia haczyki, petle i otwarte spirale. Obserwo¬ wano równiez morfologie typu prostych zgiec. Zarodniki sa krótkie i cylindryczne. W lancuchu znajduje sie -50 zarodników. Zarodniki maja wymiary 1,3 M X 1,75ju w zakresie 1,3judo 1,95/u. Powierzchnia zarodniko¬ wa, obserwowana pod mikroskopem elektronowym jest gladka.Charakterystyke hodowlana szczepu NRR 5758 na róznych pozywkach przedstawiono w tablicy 11.12 98 635 Tablica 11 Pozywka Charakterystyka 1 ISP02 (ekstrakt drozdzy-ekstrakt brzeczki ISP 0 3 (maka owsiana) ISP 0 4 (sole nieorganiczne — agar skrobiowy) ISP 0 5 (gliceryna - agar asparagino¬ wy) Pasta pomidorowa — agar z maki owsianej Agar glicerynowo-glicynowy Agar gl ikozowo-asparaginowy Agar odzywczy Agar Bennett'a Agar ]abraczanu Agar roztworu Czapek'a Agar Emerson'a Agar tyrozynowy Agar tryptonowo-drozdzowy Wzrost obfity; zmienny umiarkowanie zólty {11K3]; dostateczna do ciobrej grzybnia, napowietrzna i zarodnikowanie; biale (W) 13ba i ciemnoszare (Gy) 3 i h, nie rozpusz¬ czalny pigment.Wzrost dobry; zmienny szaro-zólty (11B2), dostateczna grzybnia napowietrzna (Gy) ciernno-szara 3 i h; lekko brazowy rozpuszczalny pigment.Wzrost obfity, zmienny jasno iólto-brazowy [12E5J napowietrzna grzybnia i zarodniki (W) purpurowo biale 13ba do (Gy) jasno-szaryeh (d); pigment nierozpuszczalny.Wzrost dobry; zmienno blado zólto-zielony (10B1 j, dobra grzybnia napowietrzna i za¬ rodniki (Gy) zóltawo-szare 2 do, do jasno zóltawo-czerwieniejaco brazowych 5fe; nie rozpuszczalny pigment.Wzrost obfity; zmienny jasno zólto-brazowy [13H7J dostateczne do dobrej grzania napowietrzna i zarodniki (W) biale a do (Gy) sredno szarych g; bardzo jasnobezowy rozpuszczalny pigment.Wzrost obfity; zmienny ciemnoszaro-zclty |12I6J; dobra grzybnia napowietrzna i zarod¬ niki |Y) blado zólte 2 db; pigment nie rozpuszczalny.Wzrost obfity; zmienny szarawo-zieionkawo-zólty {12E2J; obfita grzybnia napowietrzna i zarodniki (Gy) zóltawo szare 2dc; bardzo jasno-brazowy, rozpuszczalny pigment. wzrost dobry; zmienny szarawo-zólty [1282Jzarodniki, barwy nie okreslono ze wzgledu na ubogi wzrost; nie rozpuszczalny pigment.Wzrost obfity; zmienny szarawo-zólty [12K31; skapa napowietrzna grzybnia i zarodniki (Gy) zóltawo-szare 2dc; nie rozpuszczalny pigment.Wzrost dobry; zmienny szarawo brazowy [15C8J nie powietrzna grzybnia lub zarodni¬ kowanie; brazowy, rozpuszczalny pigment. Powierzchnia oczyszczona przed inokulum.Wzrost ubogi; barwy nie okreslono ze wzgledu na ubogi wzrost.Wzrost obfity; zmienny szarawo-zólty [11J5]; nie powietrzna grzybnia i zarodniki; nie rozpuszczalny pigment.Wzrost obfity; zmienny jasno oliwkowo-brazowy (14C4]; obfita napowietrzna grzybnia i zarodniki z (W) b (srodek) do (Gy) jasno brazowo-szarego 3fe (krawedz); bardzo jasno brazowy, rozpuszczalny pigment.Wzrost skapy; nie okreslano barwy.Organizm NRRL 5758 badano standardowymi sposobami dla scharakteryzowania wlasciwosci fizjologicz- .. nych. Zaobserwowane wlasciwosci i charakterystyke podano w tablicy 12.98635 13 Tabl ica 12 Zaobserwowanewlasciwosci Charakterystyka Dzialanie namleko Mleko sciete, bialy slój vzrostu; czysta powierzchnia zól¬ ta - wartosc pH reakcji 5, 7 Redukcjaazotanu Pozytywna Zelatynaodzywcza Po 14 dniach 30% przeszlo w stan ciekly Ciemnobrazowy pigment wytworzo¬ ny na: Tyrozyna — skosagarowy Bardzo slaby wynik dodatni (pigment po 4 dniach) PeptonDifco Wynik ujemny Ekstrakt drozdzy Zelazowy skos agarowy Trypton drozdze-ekstrakt brzeczki Wynik ujemny Zadana temperatura (ISP srodowisko 26-30°C - dobry wzrost; 30-37°C doskonaly wzrost i za- 0 2 ekstrakt drozdzy, skos ekstraktu rodnikowanie; brzeczki) 45°C — maly weyetatywny wzrost; czerwieniejacy rozpusz¬ czalny pigment Wyniki badan przyswajaInosci wegla przez organizm NRRL 5758 podano w tablicy 13, Zastosowane symbole oznaczaja: + dobry wzrost, dodanie przyswajania (+) wzrost ubogi do slabego; (—) niewyrazny wzrost, prawdopodobnie brak przyswajania; — brak wzrostu, brak przyswajania Ta b I ica 13 Zródlo wegla D-glikoza L-arabinoza D*ksyloza D-fruktoza sacharoza D-mannit l-inozyt Ramnoza Rafinoza —C kontrolne (brak weglowodanów) Wynik + + + + — + + + - - Drugi nowy organizm produkujacy antybiotyk A-28086, zostal otrzymany z S. aureofaciens NRRL 5758 na drodze naturalnych selekcji, a nastepnie w chemicznej mutacji. Organizm ten oznaczono jako NRRL 8092, a jest on takze sklasyfikowany jako szczep Streptomyces aureofaciens Duggar. Klasyfikacja ta jest oparta na badaniach organizmu NRRL 8092 z zastosowaniem wyzej opisanych metod klasyfikacji Streptomyces i podob¬ nych warunków wzrostu. Charakterystyke organizmu NRRL 8092, zaobserwowana w tych badaniach przedsta¬ wiono ponizej.Morfologia. W srodowisku ISP 0 1 (agar tyrozynowy) hodowla wytwarza nieliczne haczyki, ale glównie wytwarza krótkie, rozgalezione sporofory. Lancuchy zarodników zawieraja w lancuchu najwyzej 10 zarodni¬ ków, zazwyczaj 4—7 zarodników w jednym lancuchu. Krótkie rozgalezione lancuchy obserwowano w srodowis¬ ku ISP j5 3, roztwór agaru Czapek'a i ISP j3 5. Obfite owocowanie obserwowano na agarze Emerson'a .Obserwacje pod mikroskopem elektronowym przeprowadzono na agarze tyrozynowym fSP u)3 7) i agarze glikozowo-asparaginowym. Zarodniki sa gladkie i maja dlugosc 1,2 — 2,0 \i a srednice okolo 1,0/i.14 98 635 W tablicy 14 przedstawiono charakterystyke hodowlana organizmu ISiRRL 8092 na róznych pozywkach.Tablica 14 ,Pozywka Charakterystyka 1 ISP02 (ekstrakt drozdzy- ekstrakt brzeczki ISP 3 3 (maka owsiana) ISP 0 4 (sole nieorganiczno-agar skro¬ biowy ISP 0 5 (agar glicerynowo-asparagino- wy) Agar z pasty pomidorowej i owsianki Agar glicerynowo-glicynowy Agar glikozowo-asparaginowy Agar odzywczy Agar Bennett'a Agar jablczanu wapnia Agar roztworu Czapek'a Agar Emerson'a Agar tyrozynowy Agar trypton-drozdze Wzrost slaby; zmienny jasno zólto-brazowy [12H8] dostateczna grzybnia napowietrzna; ubogie zarodnikowanie; powierzchnia blado szara [11Al);nie rozpuszczalny pigment.Wzrost ubogi; zmienny szklisty; grzybnia napowietrzna; nie rozpuszczalny pigment.Wzrost umiarkowany; zmienny szarawo-zólty [11B2]; skapa, napowietrzna grzybnia i za¬ rodnikowanie; powierzchnia blado zólto-szara [10A—I] nie rozpuszczalny pigment.Wzrost umiarkowany; zmienny blado zólty |10F2]; dostateczna grzybnia napowietrzna; skape zarodnikowanie; powierzchnia biala [10A1 ], nie rozpuszczalny pigment.Wzrost umiarkowany; zmienny szarawo-zielono-zólty; dostateczna grzybnia napowietrz¬ na; zarodnikowanie umiarkowane; jasno blado szare [53A2J; pigment nierozpuszczalny Wzrost obfity; zmienny szarawo zólty [11E4]; umiarkowana grzybnia napowietrzna, biala [10AI]; zarodnikowania brak; pigment nierozpuszczalny Wzrost umiarkowany; zmienny blado zólty I10F2J; umiarkowanie napowietrzona grzybnia i zarodnikowanie, bialy [10A1 ]; nierozpuszczalny pigment • Wzrost ubogi; zmienny blado zólty [10B2J; grzybnia nie powietrzna; nierozpuszczalny pigment Wzrost dostateczny; zmienny zólto rózowy [11A7J bardzo skapia grzybnia napowietrz¬ na; brak zarodnikowania; brak rozpuszczalnego pigmentu.Wzrost bardzo skapy; zmienny szklisty; grzybnia nie napowietrzna; nierozpuszczalny pigment.Wzrost bardzo skapy; zmienny szklisty; grzybnia nie napowietrzna; nierozpuszczalny pigment. .Wzrost umiarkowany; zmienny szarawo-zólty [1115]; centkówana napowietrzna grzyb¬ nia; brak zarodnikowania; nierozpuszcza'ny pigment.Wzrost umiarkowany; zmienny jasno zólto brazowy [12H6]: umiarkowana napowietrzna grzybnia; jasno blado szara krawedz [53A2] srodek prawie bialy i umiarkowane zarodni¬ kowanie; nierozpuszczalny pigment.Wzrost bardzo skapy, szklisty; nie powietrzna grzybnia; nie rozpuszczalny pigment Organizm NRRL 8092 badano równiez w celu znalezienia wlasciwosci fizjologicznych zgodnie ze znanymi sposobami. Zaobserwowane wlasciwosci i ich charakterystyke przedstawiono w tablicy 15.Tablica 15 Obserwowane wlasciwosci Charakterystyka 1 Dzialanie namleko Scina (90%); blado zólto slój wzrostu, oczyszczona powierzchnia blado zólta, wartosc pH reakcji 4,6 Redukcjaazotanów Dodatnia Zelatynaodzywcza W ciagu 14 dni 50% shydrolizowanej Ciemno brazowy pigment wytwarza na: Brzeczce trypton-ekstrakt drozdzy Ujemny Tyrozyna-skos Czop marchwiowy Bardzo slabo dodatni Obfity wzrost, blado zólty; nie powietrzna grzybnia98 635 ciag dalszy tablicy 15 1 Czop ziemniaczany Wymagania temperaturowe (ISP srod¬ owisko 0 2 wyciag drozdzy skos ekstraktu brzeczki Obfity wzrost, szarawobialy; nie powietrzna grzybnia; brak zmian w czopie. % - obfity wzrost; dostateczna grzybnia napowietrzna, zmienny jasno brazowy; nie rozpuszczalny pigment. 3(fC — obfity wzrost; dostateczna grzybnia napowietrzna; zmienny jasno brazowy; nie rozpuszczalny pigment. 37°C — obfity wzrost; dostateczna grzybnia napowietrzna; zmienny brazowy; rozpusz¬ czalny brazowy pigment. 40°C — obfity wzrost; skapa grzybnia napowietrzna; odwracalny czerwono-brazowy; rozpuszczalny pigment ciemno czerwono brazowy. 45°C — slaby wzrost, nie powietrzna grzybnia; zmienny czerwono-brazowy; umiarkowa¬ nie czerwono-brazowy pigment. cy 16. i Wyniki badania przyswajania wegla przeprowadzone z organizmem NRRL 8092 przedstawiono wtabli- Stosowane symbole do wykazania wzrostu oznaczaja: + wzrost dobry, przyswajanie dodatnie (+) wzrost ubogi do slabego (-) wzrost niewyrazny, prawdopodobnie brak przyswajania — brak wzrostu, brak przyswajania Tablica 16 Zródlo wegla D-glikoza L-arabinoza D-ksyloza D-fruktoza Sacharoza D-mannit i-inozyt Ramnoza Raf inoza —C kontrolna (brak weglowodanów) Wynik + + + + — — + + — — Pewne wlasciwosci szczepów S. aureofaciens produkujacych antybiotyk A—28086, rózne od wlasciwosci organizmów, opisanych przez Shirling'a i Gettlieba, przedstawiono w tablicy 17.Tablica 17 Przyswajanie wegla NRRL 5758 NRRL 8092 Znane opisane organizmy Sacharoza l-inozytol Ramnoza Uplynnianie zelatyny Dzialanie na mleko + + % po 14 dniach mleko sciete biale sloje wzrostu + + 50% po 14dniach ograniczone lub brak mleko sciete bialo ograniczone iVózne zólte sloje wzrostu * (czesto brak); ograniczony wzrost i koagulacja Wlasciwosci organizmu NRRL 5758, które róznia sie od wlasciwosci organizmu NRRL 8092, przedstawio¬ no w tablicy 1816 98 635 Tablica 18 Charakterystyka NRRL5758 NRRL 8092 Kolor srodowiska Zarodnikowanie Wzrost na: jablczan wapnia Sole nieorganiczne - skrobia Agar Bennett 'a Zólty w kilku srodowiskach Kilka spiralnych zarodników na pascie pomidorowej i mace owsianej i skrobi Wzrost slaby, brazowy, klarowny Umiarkowane zarodnikowanie powierzchnia czerwono-biala do szarej Odwracalny bladozólty Kremowy do blado zóltego w kilku srodowiskach Krótkie rozgalezione zarodniki z nielicznymi haczykami Wzrost, niewielki, jasne, brak klarownosci Skape zarodnikowanie powierzchnia blado-zólto szara Odwracalny rózowy Stosowane do produkcji antybiotyków A—28086 kultury Streptomyces aureofaciens zostaly zdeponowane i stanowia czesc kolekcji kultury macierzystej the Nothern Harketing and Nutrition Research Division UjS. Dept, of Agriculture Agricultural Research Seryice, Peoria Illinois, 61704, skad sa dostepne pod numerami NRRL 5758 i NRRL 8092.Pozywka, stosowana do hodowli Streptomyces aureofaciens NRRL 5758 lub Streptomyces aureofaciens NRRL 8092, moze byc wybrana dowolnie z licznych stosowanych do tego celu pozywek, jednakze ze wzgledu na ekonomike produkcji, wydajnosc i latwosc izolowania produktu korzystne sa niektóre z nich. A wiec, na przyklad korzystnym zródlem weglowodorów do fermentami, prowadzonej na duza skale sa: glukoza, skrobia kukurydziana, fruktoza, mannoza, maltoza, laktoza itp. Innymi uzytecznymi zródlami wegla sa olej kukurydzia¬ ny, olej arachidowymi, olej sojowy i olej rybi. Korzystnym zródlem wegla jest enzymatycznie hydrolizowana kazeina, aczkolwiek peptony, takie jak maka kukurydziana, maka z nasion bawelny, aminokwasy, takie jak kwas glutaminowy itp. sa równiez uzyteczne. Sposród soli nieorganicznych, które moga byc wprowadzane do pozywki, jako skladnik odzywczy sa zwykle, rozpuszczalne sole zawierajace jony sodu, magnezu, wapnia, amonu, chloru, weglanowe, siarczanowe, azotanowe itp.W pozywce hodowlanej powinny znajdowac sie równiez podstawowe pierwiastki sladowe, potrzebne do rozwoju i wzrostu hodowanych organizmów. Pierwiastki te wystepuja zwykle jako zanieczyszczenie innych skladników pozywki w ilosciach, odpowiednich do zaspokojenia potrzeb wzrostu hodowanego organizmu.Przy prowadzeniu fermentacji na duza skale powstawanie piany moze nastreczac trudnosci i wtedy do pozywki nalezy dodawac niewielkie ilosci tj. 0,2 ml/l srodka przeciwpiennego, takiego jak glikol propylenowy..Aczkolwiek nie ma to istotnego znaczenia, zauwazono, ze hodowla szczepów Streptomyces aureofaciens prowadzona w celu otrzymania antybiotyku A-28086 przebiega lepiej, jezeli do pozywki doda sie male ilosci oleju, takiego jak olej sojowy.Przy produkcji duzych ilosci antybiotyków A-28086 korzystna jest wglebna fermentacja aerobowa prowa¬ dzona w tankach. Male ilosci antybiotyków A—2b086 mozna otrzymywac, prowadzac hodowle na trzesawkach.Poniewaz opóznienie w produkcji antybiotyku zwiazane jest zwykle z inokulacja duzych tanków forma zarodni¬ kowa organizmu, korzystne jest uzycie inokulum wegetatywnego. Inokulum wegetatywne otrzymuje sie przez inokulacje malych ilosci pozywki hodowlanej forma zarodnikowa lub fragmentami grzybni organizmu w celu otrzymania swiezej, szybko rosnacej kultury hodowanego organizmu. Inokulum wegetatywne przenosi sie nastep¬ nie do duzego tanku. Do hodowli inokulum wegetatywnego stosuje sie te sama pozywke, której uzywa sie do fermentacji w wiekszej skali, ale mozna równiez stosowac inne pozywki.Organizmy, produkujace A-28086, moga wzrastac w temperaturze 20-40°C, ale optymalne wytwarzanie A—28086 nastepuje w temperaturze 27-30?$.Jak zwykle przy prowadzeniu procesów we wglebnych warunkach aerobowych przez pozywke, zawieraja¬ ca kulture, przedmuchuje sie jalowe powietrze. W celu zapewnienia efektywnego wzrostu hodowanego organiz¬ mu stosuje sie do produkcji w tankach powietrze w ilosci 0,1 objetosci powietrza (1 objetosc pozywki/minute.W celu zapewnienia szybszego wzrostu antybiotyków A-28086 stosuje sie do produkcji w tankach 0,25 objetos¬ ci powietrza (1 objetosc pozywki/minute. Wysoka zawartosc rozpuszczonego tlenu nie obniza produkcji antybio¬ tyku.98635 17 Podczas fermentacji wytwarzanie sie antybiotyków ocenia sie, przeprowadzajac badanie próbek bulionu lub ekstraktów stalych zarodników na aktywnosc antybiotyczna przeciw organizmom, znanym jako wrazliwe na wytwarzane antybiotyki. Jednym z tych próbnych organizmów uzytecznych przy badaniu wytwarzanych anty¬ biotyków jest Bacillus subtilis ATCC 6633. Biopróbke przygotowuje sie zwykle na krazku bibulowym lub na plytce 2 agarem.Poczatkowa wartosc pH nieinokulowanej pozywki jest rózna w zaleznosci od rodzaju uzytej pozywki.Zwykle wartosc pH powinna byc utrzymana w zakresie 6,0—7,5, natomiast wartosc pH po zakonczeniu fermen¬ tacji jest zwykle wyzsza i wynosi 6,0-8,0.Zwykle aktywnosc antybiotyczna moze byc wykryta w drugim dniu fermentacji, a maksimum aktywnosci antybiotycznej przypada na szósty do dziesiatego dzien fermentacji.Antybiotyki A—28086, otrzymane w warunkach wglebnej fermentacji, prowadzonej w warunkach aerobo- wych, odzyskuje sie z pozywki fermentacyjnej w sposób zwykle stosowany do odzyskiwania produktów fermen¬ tacji. Podczas fermentacji organizmu, produkujacego A—28086, otrzymuje sie zarówno filtrowany bulion, jak i mase zarodnikowa, wykazujace aktywnosc antybiotyczna W celu odzyskania antybiotyków A—28086 z naj¬ wyzsza wydajnoscia stosuje sie filtracje, ekstrakcje i adsorpqe chromatograficzna. Korzystnym rozpuszczalni¬ kiem, stosowanym do odzyskiwania antybiotyków A—28086 z calej masy pofermentacyjnej lub filtrowanego bulionu pofermentacyjnego, jest octan etylu, ale zadowalajace sa równiez inne zwykle uzywane rozpuszczalniki.Szczególnie korzystnym zabiegiem przy rozdzielaniu czynników A, B i D-28086 jest obnizenie wartosci pH calego bulionu fermentacyjnego do okolo 3,0. Przy tej wartosci pH czynniki A, Bi D A—28086 mozna oddzielic z masa zarodnikowa przez filtracje. Innym korzystnym sposobem oddzielania czynników A—28086jest dodanie wodoroweglanu, takiego jak np. wodoroweglan sodu do calego bulionu w ilosci okolo 1 g/l. W tym przypadku czynniki A—28086 oddziela sie z masa zarodnikowa w postaci soli.Korzystnym rozpuszczalnikiem, stosowanym do oddzielania antybiotyków z masy zarodnikowej, jest meta¬ nol, ale mozna stosowac równiez inne nizsze alkohole i ketony. Do odzyskiwania antybiotyków A—28086 mozna równiez korzystnie stosowac destylacje azeptropowa. W tym przypadku do zawierajacego wode bulionu fermen¬ tacyjnego dodaje sie rozpuszczalnik organiczny, który tworzy z woda azeotrop. Otrzymana mieszanine, zawie¬ rajaca rozpuszczalnik i bulion, poddaje sie destylacji azeotropowej w celu usuniecia co najmniej polowy wody, zawartej w bulionie, pozostawiajac mieszanine wody i rozpuszczalnika, w której antybiotyki A—28086 znajduja sie w postaci roztworu w rozpuszczalniku organicznym. Nierozpuszczalne produkty uboczne usuwa sie przez filtracje lub wirowanie. Antybiotyki A—28086 odzyskuje sie z roztworu organicznego znanymi sposobami, taki¬ mi jak odparowanie rozpuszczalnika, wytracanie przez dodatek substancji nierozpuszczalnej lub ekstrakqe.Rozpuszczalnikami organicznymi, które tworza odpowiednie azeotropy z woda, potrzebne do przeprowadze¬ nia odzysku w ten sposób, sa np. alkohol butylowy, alkohol amylowy, alkohol heksylowy, alkohol benzylowy, octan butylu, octan amylu, 1,2-dwuchloroetan, pentanon-2, heksanon-2, benzen, cykloheksanon, toluen, ksyleny jtP- Odzysk na drodze destylacji azeotropowej jest specjalnie korzystny przy fermentacji, prowadzonej na duza skale. Zarówno wode, jak i rozpuszczalnik, które odbiera sie jako destylat azeotropowy mozna zawrócic po uprzednim usunieciu wody w znany sposób. Woda ta nie zawiera zanieczyszczen i nie wymaga zadnych zabiegów, zmierzajacych do usuniecia zanieczyszczen. Rozpuszczalnik po oddzieleniu wody mozna zawrócic do procesu.Dalsze oczyszczanie antybiotyków A—28086 polega na dodatkowej ekstrakcji i adsorpcji. Jako adsorbenty stosuje sie korzystnie takie substancje jak zel krzemionkowy, wegiel, florisil R (krzemian magnezu, Floridin Co., P.O. Box 989, Tallahasses Fla.) itp.Alternatywnie jako zródlo antybiotyków A-28086 mozna stosowac stale skladniki hodowli, zawierajace pozywke i zarodniki bez ekstrakcji i oddzielania, ale po uprzednim usunieciu wody. Na przyklad po wyhodowa¬ niu antybiotyku A—28086 pozywke suszy sie przez liofilizacje i miesza sie bezposrednio z mieszana karma.W innym przypadku, po otrzymaniu A—28086 o odpowiedniej aktywnosci w pozywce zarodniki oddziela sie i suszy, przy czym otrzymuje sie produkt, nadajacy sie do bezposredniego uzycia do wytwarzania mieszanej karmy. Jezeli stosuje sie te metode oddzielania zarodników, wskazane jest dodanie weglanu wapnia w ilosci okolo 10 g/l, który ulatwia filtrowanie i suszenie produktu.W opisanych warunkach szczepy Streptomyces aureofaciens, oznaczone jako NRRL 5758 i NRRL 8092, wytwarzaja jako glówny produkt czynnik A antybiotyku A—28086. Mimo, ze stosunek poszczególnych czynni¬ ków zmienia sie w zaleznosci od stosowanych warunków fermentacji, na ogól czynnik A stanowi ponad 99% calkowitej odzyskanej aktywnosci antybiotycznej przy stosowaniu NRRL 5758 i do okolo 90% calkowitej odzyskanej aktywnosci antybiotycznej przy stosowaniu NRRL 8092. Czynnik B stanowi wiekszosc pozostalej aktywnosci antybiotycznej, uzyskanej przy uzyciu NRRL 5758, a czynnik D mniejsza jej czesc. Z drugiej strony czynnik D stanowi okolo 8-10% calkowitej odzyskanej aktywnosci antybiotycznej, uzyskanej przy stosowaniu NRRL 8092, a czynnik B wystepuje w malej ilosci.18 98 635 Czynniki A, B i D antybiotyku A-280S6 rozdziela sie i wyodrebnia w postaci, oddzielnych zwiazków, stosujac dobrze znane metody, takie jak chromatografia kolumnowa, chromatografia cienkowarstwowa itp. Na przyklad czynniki A, B i D rozdziela sie w kolumnie chromatograficznej, wypelnionej zelem krzemionkowym, przez eluowanie kolumny róznymi mieszaninami rozpuszczalników, takimi jak np. benzen i octan etylu. Przy uzyciu tej mieszaniny rozpuszczalników z kolumny eluuje sie najpierw czynnik b, a potem czynniki A i D. Jak opisano powyzej, chromatografia cienkowarstowa jest wygodna metoda, pozwalajaca na ocene postepu milicji.Zwiazki A-28086 hamuja wzrost bakterii i grzybów patogennych wobec zwierzat i roslin. W tablicy 19 podano wzgledne aktywnosci mikrobiologiczne czynników A i B A-28086.Do badan stosowano zwykla metode dyfuzji krazkowej (6 mm wkladki zanurzono w roztworze, zawieraja¬ cym 1 mg zwiazku) 1 m! roztworu, umieszczono na plytkach z agarem zasilanych badanym organizmem).Organizm badany Staphylococcus aureus Bacillussubtilis ATCC 6633 Sarcina lutea ATCC 9341 Ta Mycobacterium avium ATCC 7992 Saccharomyces paslorian jm ATCC 2366 Candida tropicalis Fusarium moniliforme lica A~ 19 Strefa hamowania (mm) 28086 czynnik A 19 28 26 12 17 14 12 A--28086 ¦ czynnikB 21 31 16 12 - 14 nie badany Wazna cecha zwiazków A—28086 jest hamowanie wzrostu bakterii beztlenowych.W tablicy 20 zebrano wyniki badan minimalnego stezenia hamujacego (MIC), przy którym czynnik A A—28086 hamuje wzrost róznych bakterii beztlenowych. Oceny dokonano metoda standardowego testu rozcienczen na agarze. Wynik koncowy odczytywano po 24 godzinach inkubacji.Tablica 20 Organizm badany Actinomyces bovis Clostridium inocuum Clostridium perfringens Clostridium ramosum Clostridium septicum Clostridium septicum boVine Eubacterium aerofaciens Peptococcus anaerobius Peptostreptococcus intermedius Propionibaeterium acnes 44 Propion ibacter iu m acnes 79 Bacteroides fragilis ssp, fragilis Bacteroides fragilis ssp. thetaiotacrnicron Bacteroides fragilis ssp. vulgntis 1563 Bacteroides fragilis ssp. vulgatis 1211 Fusobacterium symbiosum Fusobacterium necrophorum Veillonella alcalescens MIC (/ig/ml) <0.5 <0,5 < 0,5 4.0 <0,5 <0,5 1,0 ¦¦< 0.5 16,0 16,0 2.0 8,0 8,0 8,0 2,0 <0,5 8,0 16.0 Aktywnosc przeeiwbakteryjna i przeciwgrzybowa, wykazuja równiez pochodne estrowe, zawierajace w gru¬ pie acylowej 2—6 atomów wegla czynnika A A—28086, Pochodne te maja nawet zwiekszona aktywnosc Gram- dodatnia. Wzgledna aktywnosc gram-dodatnia niektórych sposród tych pochodnych porównywano z aktywnos-98 635 19 cla czynnika A. Zwiazki badano w próbach turbidymetrycznych przy uzyciu pólautomatycznego urzadzenia (Autoturb ® microbiological assoy system, Elanco) opisanego przez N.R. Kuzei i F.W.Kayahaugh'a w J. Pharma- c&ut.-Sci. 60 (5), 764 i 767 (1971). Podczas badania antybiotyków A-28086 stosowano nastepujace parametry.Staphylococcus aureus (H~Heatley) NRRL B-314 w pozywce bulionowej o wartosci pH.=v7 inkubowano w okresie 4 godzin w temperaturze 37°C. Próbki standardowe i badane rozpuszczono w mieszaninie metanol-wo- da (10:90). Standard, czyli czynnik A A-28086 znajdowal sie w Karuzeli Autoturb ® w stezeniu 2, 3, 4 i 5 mcg/ml. Badany zwiazek wprowadzono do karuzeli rozcienczony do zawartosci okolo 3—4 mcg aktywnosci /1 ml. Wzgledne aktywnosci badanych zwiazków w porównaniu ze standardem podano w tablicy 21.T a b I i c a 21 Zwiazek Wzgledna aktywnosc G , A-28086 czynnik A (Standard) 1 A-28086-A Esteroctowy 2,5 A-28086-A Ester propionowy 7 A-28086-A Estern-maslowy 8 A-28086-A Ester n-walerianowy 14 A-28086-A \ Ester n-kapronowy 20 Inna korzystna cecha zwiazków A-28086 jest ich aktywnosc entymikrobowa przeciw Mycoplasma. Szcze¬ py Mycoplasma, znane równiez jako organizmy, wywolujace wysiekowe zapalenie pluc (PPI O), sa patogenne w stosunku do ludzi i róznych zwierzat. Srodki, wykazujace aktywnosc przeciw organizmom PPLO, sa szczegól¬ nie poszukiwane przez przemyslowe hodowle drobiu. Minimalne stezanie hamujace (MIC) czynnika A antybioty¬ ku A-28086 przeciw róznym szczepom Mycoplasma okreslono w badaniach, prowadzonych metoda rozcienczen in vitro. Wyniki zestawione sa w tablicy 22.T a b I i c a 22 Organizm MIC (mcg/ml) 12,5 12,5 6,25 6,25 6.25 Roztwory, zawierajace zaledwie 10 mcg antybiotyku A—28086/ml roztworu, sa odpowiednie do dezynfek¬ cji powierzchni, majacej na celu ochrone zwierzat przeciw róznym szczepom Mycoplasma.Zwiazki A-28086 sa równiez srodkami przeciwwirusowymi. Czynnik A A—28086 jest aktywny przeciw wirusowi polio typ III, wirusowi ospy (vacinia virus), virusom opryszczki (herpes virus) i Semliki Forest virus, jak wykazano wprowadzonym in vitro tescie zatrzymanej plytki, podobnym do opisanego przez Siminoffa, Appllied Microbiology 9 (1), 66-72, (1961). Czynnik A-28086-A jest takze aktywny przeciw wirusom: wiruso¬ wi udzielajacego sie duru brzusznego rzekomego Transmissible Gastro^nteritis virus, Newcastle Disease virus i Infections Bovine Rhinotracheitis virus, jak wykazano przy pomocy podobnych badan kultury tkankowej.Zwiazek A-28086 moze byc podawany ssakom w celu ochrony przed wirusami doustnie, pozajelitowo lub zewnetrznie. Skuteczna dawka, zapobiegajaca lub leczaca chorobe wirusowa, waha sie w granicach 1—5 mg/kilo¬ gram wagi ciala w zaleznosci od zwalczanego wirusa i tego, czy lek stosuje sie profilaktycznie, czy w celach leczniczych.Roztwory zawierajace A—28086, korzystnie ze srodkiem powierzchniowo czynnym, stosuje sie do odkaza¬ nia in vitro srodowiska, na którym wystepuja takie wirusy, jak polio lub herpez. Do niszczenia wirusów skuteczne sa roztwory, zawierajace 1-1500 mcg zwiazku A-28086/ml.M.gallisepticum M.hyorhinis M.synoviae M.hypopneumoniae M.hyosynoviae20 98 635 Ostra toksycznosc czynnika A antybiotyku A—28086, podawanego dootrzewnowe my&zom, wyrazona jako LD50, wynosi 7,15 mg/kg.Zwiazki A-28086 maja równiez dzialanie owadobójcze i roztoczobójcze. Zwiazki A-28086 sa aktywne przeciw takim owadom, jak fasolowy chrzaszcz meksykanski (Mexican bean beetle, owad trojesc (milkweed bug) i mucha domowa oraz przeciwko roztoczom, takim jak roztocze two spotted spider przy zastosowaniu tak niskiej dawki, jak 500 ppm. Ponadto zwiazki A—28086 sa aktywne przeciw larwom moskitów juz przy stosowaniu w ilosci 1 ppm.Wazna wlasciwoscia zwiazków A—28086 jest ich aktywnosc przeciw kokcydiozie. Na przyklad w doswiad¬ czeniach, prowadzonych z karma stwierdzono, ze jezeli karma mlodych kurczat zawiera 0,003% A-28086, to nastepuje wzrost wagi zwierzat, a zawartosc 0,005% A-28086 przeciwdziala padaniu zwierzat i zapewnia spadek liczby zachorowan wsród pisklat, zaatakowanych kokcydioza. Wyniki badan prowadzonych na piskletach, zaata¬ kowanych róznymi szczepami Eimeria, przedstawiono w tablicach 23, 24 i 25.Dawka ieku w karmie % wagowy 0,04 0,02 0,01 zakazone kontrolne normalne kontrolne 0,02 0,01 0,005 0,0025 zakazone kontrolne normalne kontrolne Aktywnosc czynnika A Numer kurczecia Tablica antybiotyku A- % smiertelnosci 0 0 0 0 0 0 0 40 0 23 -28086 przeciw Eimeria % przyrostu wagi 60 82 94 68 100 84 96 91 87 74 100 i Tenella- Srednia ilosc uszkodzen 0 0,2 0,2 3,65 - 0 0 2,8 3,85 3,85 — % spadek ilosci uszkodzen 100 J95 95 - - 100 100 27 0 <- — T a b I i c a 24 Aktywnosc czynnika A antybiotyku A—28086 przeciw szczepom Eimeria1/ Organizm zakazajacy Dawka leku w karmie % wagowy % % smier- przyrost telnosci wagi Srednia % ilosc ... uszkodzen 0,75 1,25 1,60 0,2 1.3 ¦1.2 1.7 % spadku ilosci uszkodzen 53 r - - _ Przepuszczone komórki Ogólem Ptak (1 X 10*) 6,15 4.91 36,32 1,95 3,24 2,31 .55 i jajowe % spadku 83 86 58 _ Eimeria acervulina Zakazone kontrolne Eimeria maxima Zakazone kontrolne Eimeria branetti Zakazone kontrolne 0,005 0,0025 0,005 0,005 87 82 63 85 65 88 62 / 4 powtórzenia, 5 brojlerów kogucików kazde98635 21 T a b I i c a 26 Aktywnosc czynnika A antybiotyku A-28086 przeciw mieszanym szczepom BimeriaV % przyrostu Uszkodzenia jelitowe Uszkodzenia i wagi srednio % spadku srednio % spadku Organizm zakazajacy £.necatrix i E. tenella Zakazone kontrolne E.tenella E.rKicatrix, \ E.rnaxirna E.brunet* i E.acervulina E.mivati Zakazone kontrolne Dawka leku % wagowy 0,005 0,01 — % smiertel 0 0 50 94 52 91 12 0,7 1,7 0,4 1.9 59 79 1,75 3,5 0,9 3,3 50 73 1 4 powtórzenia, 5 brojlerów kogucików kazde W celu zapobiezenia lub leczenia kokcydiozy u drobiu podaje sie ptakom, korzystnie doustnie w dawkach dziennych nietoksyczna, antykokcydiozowa ilosc zwiazku A—28086. Zwiazek moze byc podawany w rózny sposób, ale najdogodniej podawac go z akceptowanym fizjologicznie nosnikiem, korzystnie z karma, zjadana przez ptaki. Przy ustalaniu odpowiedniego stezenia zwiazku A—28086 wzieto pod uwage rozmaite czynniki i stwierdzono, ze na ogól dawki, w których nalezy podawac lek, mieszcza sie w zakresie 0,003—0,04% wagowych karmy, nie zawierajacej medykamentów, a korzystnie w zakresie 0,005-0,02%.Inna wazna wlasciwoscia zwiazków A—28086 jest zdolnosc do zwiekszania wykorzystania karmy. Na przyklad zwiazki A—28086 poprawiaja wykorzystanie karmy u przezuwaczy przez usprawnienie funkcji zwacza.Omawiana powyzej efektywnosc wykorzystania weglowodorów przez przezuwacze rosnie, jezeli stymuluje sie flore zwacza zwierzecia do wytwarzania w wiekszym stopniu propionianów, zamiast octanów lub maslanów.Efektywnosc uzytej karmy kontrolowano, obserwujac wytwarzanie i stezenie propionianów w zwaczu przy uzy¬ ciu nastepujacych metod.Plyn zwacza wolu odprowadza sie chirurgicznie wykonana przetoka, przy czym zwierze otrzymuje wyso- kowartosciowa racje. Próbke plynu zwacza filtruje sie przez poczwórna warstwe gazy i zbiera sie filtrat. Czastki stale, pozostale na gazie, przeprowadza sie w zawiesine w odpowiednim buforze fizjologicznym o objetosci, odpowiadajacej poczatkowej objetosci plynu zwacza i zawiesine taka filtruje sie ponownie. Uzywa sie buforu o nastepujacym skladzie, podanym przez Cheng'a i in. w J.Dairy Sci., 38,1225—1230 (1955).Skladnil Na2HP04 KH2P04 NaHC03 KCI NaCI MgS04 CaCI2 • 2H2 FeS04 • 7H, MnS04 • H2 ZnS04 • 7H CuS04 • 5H COCI2 • 6H2 < ' 0 *o 0 2o iO g/i 0,316 0,152 2,260 0,375 0,375 0,112 0,050 0,008 0,004 0,004 0,002 0,001 Oba przesacze laczy sie i pozostawia do czasu, az czastki splyna ku górze. Klarowna warstwe oddziela sie, rozciencza tym samym buforem w stosunku 1 :1, a nastepnie pH doprowadza sie do wartosci 63-7,0. ml rozcienczonego plynu zwacza umieszcza sie w 25 ml kolbie, zawierajacej 40 mg opisanej poprzednio karmy, dodaje sie 1 g protein sojowych i badany zwiazek. Do badania uzywa sie czterech kolb, z których dwie sa kontrolne. Stosuje sie próbe kontrolna, odpowiadajaca czasowi 0 i próbke kontrolna, inkubowana wciagu 16 godzin. Wszystkie próbki badane inkubuje sie 16 godzin, w temperaturze 38°C. Po inkubacji mierzy sie wartosc pM i do kazdej kolby dodaje sie 2 ml kwasu metafosforowego. Próbki pozostawia sie do osadzenia, a supernatant22 96 635 poddaje sie analizie metoda chromatografii gazowej w celu oznaczenia propionianów octanów i maslanów. Zwiaz¬ ki aktywne w istotny sposób zwiekszaja ilosc wytwarzanych propionianów, ponad te, która powstaje w próbach kontrolnych.Wyniki badania zwiazków porównano statystycznie z wynikami prób kontrolnych. W tablicy 26 zestawiono stosunek stezen lotnych kwasów tluszczowych w kolbach z badanym zwiazkiem do stezen w kolbach kontrol¬ nych.Zwiazek A--28086 Czynnik A A-28086 Czynnik B A-28086 Czynnik A ester octowy A-28086 Czynnik A ester propiondtoy At28086 Czynnik A ester maslowy A-28086 Czynnik A ester walerianowy A-28086 Czynnik A ester kaprylowy Tablica 26 Stosunek prób badanych do kontrolnych ppm w plynie ze zwacza 1 1 1 1 1 1 1 % molowy octan 0,94 0,97 0,79 0,90 0,91 0,92 0,86 -¦ % molowy maslan 0.87 0.96 0,76 4 0,68 0,81 0,79 0,97 % molowy propionian 1,34 1,15 2,04 1,73 1,56 1,55 1,57 Ogólem lotne kwasy tluszczowe mM/l 1,26 1,29 1,04 " 1,25 . 1,19 1,18 0,99 Efektywnosc wykorzystania weglowodorów wykazano ponadto w prowadzonych in vivo próbach na zwie¬ rzetach, któryrn zainstalowano przetoki wzwaczach, dzieki czemu mozna bylo uzyskiwac próbki zawartosci zwacza.Badanie, którego wyniki zestawiono w tablicy 27, przeprowadzono na dojrzalych wolach o wadze 453,6 kg kazdy. Dwa woly karmiono normalnie, a czterem w kazdej z badanych grup podawano te sama karme z dodatkiem czynnika A—28086—A. Do kazdego plynu zwacza o objetosci 100 ml dodawano 10% kwasu meta- fosforowego (100 ml). Próbki pozostawiono do osadzenia sie, a supernatant analizowano metoda chromatografii gazowej w celu oznaczenia stezenia kwasu propionowego.Wyniki w tablicy 27 odpowiadaja sredniemu procentowemu wzrostowi stezenia kwasu propionowego wzwaczu, obliczonemu jako srodki z pieciu analiz w 14-to dniowym okresie traktowania badanym zwiazkiem.Próby kontrolne wykazuja w przyblizeniu zawartosc 20% kwasu propionowego.Ta A-28086 Czynnik A (mg/dzien) 100 bl i ca 27 % wzrostu ponad wartosc w próbije kontrolnej 17,4 54,0 Ponadto w badaniu in vivo wykazano, ze czynnik A A—28086 powoduje wzrost efektywnosci wykorzysta¬ nia karmy u owiec. Wyniki tych badan prowadzonych w okresie 56 dni, zestawione sa w tablicy 28.Tablica 28 A-28086 Czynnik A g/tone karmy Numer zwierzecia Sredni przyrost dzienny kg/dzieri Pobór karmy kg/dzien Karma/ przyrost % wzrostu 9 18 Kontrolne 13 13 17 0,20 0,17 0,19 1,49 1,42 - 1,61 7,40 8.31 8,38 12 1 -98635 23 Zwiazki, stanowiace czynnik D A-28086, sa srodkami przeciwwirusowymi. Czynnik D A-28086 jest aktywny przeciw wirusowi Maryland B, wirusowi polio typ III, wirusowi COE, wirusowi opryszczki (herpes virus) i Semliki Forest virus, jak wykazano w prowadzonym in vitro tescie zatrzymanej plytki, podobnym do opisanego pnez Siminoffa, Applied Microbiology 9 (1), 66-72 (1961). Czynnik A A-28086 jest takze aktywny przeciw wirusom: Transmissible gastroenteritis virus, Newcastle Disease virus i Infections Bovine Rhinotracheitis virus, jak wykazano przy pomocy podobnych badan kultury tkankowej.Fakt, ze zwiazki stanowiace A—28086-D posiadaja aktywnosc zarówno przeciwko wirusom, jak i bakteriom beztlenowym, czyni te zwiazki szczególnie korzystnymi przy leczeniu i zapobieganiu zapaleniu jelit u kurczat, trzody chlewnej, bydla rogatego i owiec. Zwiazki, stanowiace czynnik D A—28086, sa równiez przydatne do leczenia zatruc jelitowych u przezuwaczy.Wazna wlasciwoscia zwiazków, stanowiacych czynnik D A—28086, jest ich aktywnosc przeciw kokcydio- zie. Doswiadczenia prowadzone in vitro wykazuja aktywnosc antykokcydiozowa czynnika A-28086-D przeciw Eimeria tenella. Stosuje sie nastepujace metody, opisane szczególowo przez L.R. McDougalda i R.B. Golloway'a w Exper. Parasitology 34,189-196 (1973).Hodowle komórki zywiciela otrzymuje sie zwyklymi sposobami przy uzyciu kadzi, plytek z plastyku, naczyn lub innych zbiorników odpowiednich do hodowli. Po nastepnych 2—3 dniach wzrostu w odpowiedniej pozywce hodowlanej (zasadnicza minimalna pozywka Eagle'a, laktoalbuminowy hydrolizat Earle'a, zrównowazo¬ na solanka Hank'a, pozywka 199 itp) powstaja odpowiednie hodowle jednowarstwowe gotowe do zakazenia i traktowania lekiem. Do tych badan stosuje sie pierwotne hodowle komórek nerki pisklecia.Zdolne do zycia komórki jajowe Eimeria tenella otrzymuje sie z fekaliów zakazonych kurczat i przed uzyciem oczyszcza sie je i wyjalawia. Komórki jajowe zarodnikuje sie przez inkubacje w temperaturze pokojowej przy przepuszczaniu pecherzyków powietrza przez zawiesine, przez delikatne wstrzasanie w wirniku zyroskopo¬ wym lub innymi odpowiednimi sposobami. W celu zabezpieczenia zarodnikowania przeciw wzrostowi bakterii lub plesnieniu mozna wprowadzic dodatek dwuchromianu potasu, kwasu siarkowego lub innych chemikaliów.Usuniecie zakazonych zarodników z komórek jajowych polega na rozerwaniu mechanicznym scianek ko¬ mórek jajowych, a nastepnie na dzialaniu na nie trypsyna i solami kwasów zólciowych w celu uwolnienia zarod¬ ników z resztek otoczki.Hodowle komórkowa zakaza sie przez wprowadzenie zdolnych do uzycia zarodników do naczynia hodow¬ lanego. Badania chemiczne mozna prowadzic w tym czasie lub pózniej. Badania te prowadzi sie, stosujac potrzeb¬ ne stezenie w 10% roztworze dwumetyloformamidu w soli fizjologicznej. Na zakonczenie badania okresla sie hamowanie bezplciowych stadiów rozwojowych przez obserwacje mikroskopowa nieruchomej zabarwionej ho¬ dowli, która prowadzi sie w 96 godzin po zakazeniu.,Wyniki rejestruje sie jako (A) aktywna, (N) nieaktywna lub (C) cytotoksyczna w zaleznosci od obecnosci lub nieobecnosci Schizotonów drugiej generacji i innej oczywistej toksycznosci wobec jednowarstwowych komórek.Aktywnosc antykokcydiozowa czynnika A—28086—D, która wykazano w tym badaniu zestawiona jest w tablicy 29.Tablica 29 Aktywnosc antykokcydiozowa czynnika D antybiotyku A-28086 Stezenie czynnika D antybiotyku A-28086 (mcg/ml) Ocena ' C 1 C 0,2 C 0,4 A,C* 0,03 A 0,02 A 0,01 ± A 0,008 N ?wyniki dwóch badan Inna wartosciowa cecha czynnika A-28086-D jest jego zdolnosc do zwiekszenia wykorzystania karmy przez zwierzeta przezuwajace, przez poprawienie funkcji zwacza. Mechanizm wykorzystania wiekszosci skladni-24 98 635 ków odzywczych, czyli weglowodanów, zawartych w karmie, jest dobrze znany. Mikroorganizmy zwacza doko¬ nuja degradacji weglowodanów do monosacharydów, które sa nastepnie przeksztalcone w pochodne kwasu pirogronowego. Pochodne pirogronowe ulegaja w wyniku procesów mikrobiologicznych metabolizmowi do octa¬ nów, maslanów i propionianów, które zwane sa ogólnie lotnymi kwasami tluszczowymi (VFA), Blizsze wiadomo¬ sci na ten temat podane sa przez Lenga w „Phisiology of Digestion and Metabolism in the Ruminant" Philllpsóna i in., Eds., Oriel Press, Newcastle upon Tyne, Wielka Brytania, 1970, str. 405-410.Wzgledna efektywnosc wykorzystania VFA omawiana jest przez McCullough'a w Feedstuffs 19 Czerwiec, 1971, str. 19, Eskeland i in. w J.An.Sci,, 33, 282 (1971) i Church'a i in. w „Dige$tive Phisiology and Nutrition of Ruminants, tom 2,1971, str. 622-625. Chociaz zarówno octany, jak i maslany sa przyswajane, to propioniany sa przyswajane ze znacznie wieksza efektywnoscia. Ponadto, jezeli dostepne sa zbyt male ilosci propionianów, u zwierzecia rozwija sie kwasica ketonowa. Tak, wiec korzystny zwiazek powoduje, ze zwierze wytwarza wiek¬ sza ilosc propionianów z weglowodanów, a dzieki temu wzrasta stopien wykorzystania weglowodanów, a równoczesnie spada liczba przypadków kwasicy ketonowej.Aktywnosc korzystnych zwiazków okreslono, obserwujac ich skutecznosc w wytwarzaniu propionianów o odpowiednim stezeniu w zwaczu, przy czym zastosowano te sama metode, co przy okreslaniu tych danych dla czynnika A.Wyniki, uzyskane dla badanego zwiazku, porównywano z próbami kontrolnymi. W tablicy 30 przedstawio¬ no stosunek stezen lotnych kwasów tluszczowych w kolbach, do których wprowadzono czynnik A -28086-D do stezen w kolbach, zawierajacych próby kontrolne.Czynnik D A-28086 mcg/ml 1,0 0,3 % molowy octanów 0,8715 0,8976 Tablica % molowy maslanów 0,7973 0,8726 % mcIowy propionianów 1,7981 1,5871 Ogólna ilosc VFA mM/l 1,1979 .1,0630 Badane zwiazki sa wyraznie skuteczne w zwiekszaniu ilosci propionianów i rosnie stopien wykorzystania karmy przy podawaniu ich doustnie przezuwaczom w dawkach 0,05—5,0 mg/kg/dzien. Najkorzystniejsze rezulta¬ ty osiaga sie, stosujac dawki 0,1—2,5 mg/kg/dzien. Korzystny sposób podawania zwiazku polega na mieszaniu go z karma zwierzat, jednakze mozna je stosowac równiez w inny sposób, np, w postaci tabletek, wlewek do gardla, duzych pigulek i kapsulek. Przygotowanie tych preparatów opiera sie na metodach, stosowanych zwykle w far¬ macji weterynaryjnej. Kazda pojedyncza dawka powinna zawierac ilosc zwiazku, odpowiadajaca bezposrednio odpowiedniej dawce dziennej traktowanego zwierzecia.Zwiazek A—28086 moze byc stosowany w karmie, odpowiedniej dla bydla opasowego, która zawiera skladnik paszowy i 1—30 g zwiazku/tone.Jak wiadomo fachowcom, karma bydleca rózni sie od innych pasz, np. od paszy drobiu. Dieta bydla zawiera niestrawne czesci, takie jak np. luski nasion bawelny lub silosowanego zboza. Ponadto karma bydleca zawiera duzy procent, czesto 15—25% niebialkowych zródel azotu. Czesto stosowanym niebialkowym zródlem azotu jest mocznik.Ponizej podano przykladowe receptury karmy dla drobiu i bydla.Racja pokarmowa pisklecia modyfikowana A—28086 pozwalajaca na opanowanie kokcydiozy.Zrównowazona wysoko energiczna, racje pokarmowa, dostosowana do karmienia pisklat która zapewnia szybki przyrost wagi wytwarza sie z nastepujacych skladników: Skladnik Mielona zólta kukurydza Maka sojowa, roztwór ekstrahowany z luskanych, dokladnie zmielonych ziaren, zawierajacy 50% protein Tluszcz zwierzecy (lój wolowy) Suszone mieso rybie ze skladnikami rozpuszczalnymi (60% protein) Rozpuszczalny slód gorzelniowy z kukurydzy Fosforan dwuwapniowy o granulacji odpowiedniej do sporzadzania karmy CaC03 % 50 31,09 6,5 ,0 4,0 1,8 0,8 kg 453 282,1 59,0 45,4 36,3 16,3 7,398 635 25 Mieszanina witamin/zawierajaca witaminy A, D, E, K i B12, choline, niacyne, kwas pantotenowy,ryboflawine, bietyne ze srodkiem zawierajacym duze ilosciglikozy 0,5 4,5 Slady domieszek mineralnych (MnS04, ZnO, KI, FeS04,CaC03 0,2 1^8 Kwas 2-amino-4-hydroksymaslowy {analog hydroksylowymetioniny) 0,1 0,97 CzynnikA-28086-A 0,01 0,097 Skladniki te miesza sie zgodnie ze standardowa technika sporzadzania mieszanej karmy. Piskleta karmione taka racja z woda ad libitum nie sa zagrozone kokcydioza, nawet jezeli zetkna sie z zakazeniem. Przyrost wagi jest porównywalny do tego, jaki maja piskleta, nie zarazone kokcydioza i karmione pasza, nie zawierajaca leku.Racja pokarmowa bydla rogatego, modyfikowana A-28086.Zrównowazona, wysoko wydajna racja karmy bydla rogatego ma nastepujacy sklad: Skladnik , % , k$ Dokladne mielonakukurydza 67,8 615,0 Mielone kaczanykukurydzy 10 90,7 < Odwodniona maka z lucerny 17%protein • 5 45,4 Maka z luskanej soi, roztwór z ekstrakcji (50% protein) Melasa z trzciny cukrowej Mocznik Czynnik A-28086-A Fosforan dwuwapniowy o granulacji odpowiedniej do sporzadzania karmy CaC03 NaCI Siady domieszek mineralnych Domieszka witamin A i D2* Domieszka witaminy E** Propionian wapnia • Zawierajaca na funt 2.000,000 I .U. witaminy A, 227.200 l.U, witaminy D2 i 385,7 g soi paszowej z dodatkiem 1% oleju.•• Ziarna slodu gorzelnianego z kukurydzy ze skladnikami rozpuszczalnymi, zawierajaca 20,000 I.U. octanu d-alfatokoferylu.Zmieszana karme prasuje sie w bloczki. Przy przecietnej dziennej dawce, zjadanej przez zwierze, wynoszacej 6,8 kg, pasza ta dostarcza zwierzeciu w ciagu dnia okolo 300 mg czynnika A A—28086.Racja pokarmowa pisklecia, zawierajaca czynnik A—28086—D, pozwalajaca na opanowanie kokcydiozy.Zrównowazona, wysokoenergetyczna racje pokarmowa, dostosowana do karmienia pisklat, która zapewnia szybki przyrost wagi wytwarza sie z nastepujacych skladników: Skladnik % kg Mielona zóltakukurydza 50 453,6 Maka sojowa, roztwór ekstrahowany z luskanych, dokladnie zmielonych ziaren, zawierajacy 50% protein Tluszcz zwierzecy (lój wolowy) Suszone mieso rybie ze skladnikami rozpuszczalnymi (60% protein) Rozpuszczalny slód gorzelniany z kukurydzy Fosforan dwuwapniowy o granulacji odpowiedniej do sporzadzenia karmy 1,8 16,3 9,9956 0,6 0,0044 0,5 0.5 0,3 0,03 0,07 0,05, 0,15 90,7 45,4 ,4 0,0399 4,5 4,5 2,7 0,27 0,63 0,45 1,36 31,09 6,5 ,0 4,0 282,0 59,0 45,4 36,326 98 635 0,5 0,2 0,1 0,01 4,5 1,8 0,97 0,097 CaC03 0,8 7,3 Mieszanina witamin (zawierajaca witaminy A, D, E, K i Bj 7,t choline, niacyne kwas pentatenowy, ryboflawine, biotyne ze srodkiem, zawierajacym duze ilosci glikozy) Slady domieszek mineralnych (MnS04, ZnO, K!, FeS04, CaC03) Kwas 2-amino-4-hydroksymalowy (analog hydroksylowy metioniny) Czynnik D A-28086 Skladniki te miesza sie zgodnie ze standardowa technika sporzadzania mieszanej karmy. Piskleta karmione taka racja z woda ad libidum nie sa zagrozone kokcydioza, nawet jezeli zetkna sie z zakazeniem. Przyrost wagi jest porównywalny do tego, jaki maja piskleta, nie zarazone kokcydioza i karmione pasza, nie zawierajaca leku.Racja pokarmowa bydla rogatego, zawierajaca czynnik A—28086-D. Zrównowazona, wysoko wydajna racja ma nastepujacy sklad: Skladnik % kg Dokladnie zmietonakukurydza 67,8 * 615,0-"- Mielone kaczanykukurydzy 10 90,7 Odwodniona maka z lucerny (17% protein) Maka z luskanej soi, roztwór z ekstrakcji (50% protein) Melasa z trzciny cukrowej Mocznik Czynnik A-28086-D Fosforan dwuwapniowy o granulacji odpowiedniej do sporzadzania karmy CaC03 NaCI Siady domieszek mineralnych Domieszka witamin A i D2 * Domieszka witaminy E** Propionianwapnia 0,15 1,36 • Zawierajaca na funt 2,000.000 I.U. witaminy A, 227,200 I.U. witaminy D2 i 385,7 g soi pasarowaj z dodatkiem 1% oleju.*• Ziarna slodu gorzelnianego z kukurydzy ze skladnikami rozpuszczalnymi, zawierajace 20.000 octanu d-alfa-toko- ferylu.Zmieszana karme prasuje sie w bloczki. Przy przecietnej dziennej dawce, zjadanej przez zwierze, wynoszacej 6,8 kg pasza ta dostarcza zwierzeciu w ciagu dnia okolo 300 mg czynnika A—28086-D.Jak wykazano powyzej, zwiazki A—28086 sa srodkami przeciwirusowymi i wykazuja aktywnosc przeciw bakteriom beztlenowym, zwlaszcza Clostridium perfringens. Stad tez zwiazki A—28086 sa skuteczne jako srodki lecznicze lub profilaktyczne przeciw zapaleniu jelit u kurczat, trzody chlewnej, bydla i owiec. Zwiazki A—28086 sa równiez uzyteczne przy leczeniu toksemii pochodzenia jelitowego u przezuwaczy.Nastepujace przyklady ilustruja sposób wedlug wynalazku.Przyklad I. A. Fermentacja na wstrzasarce A- 28086 przy uzyciu S.aureofaciens NRRL 5758.Hodowle Streptomyces aureofaciens NRRL 5758 zaklada sie na skosie agarowym o nastepujacym skladzie.Skladnik Ilosc Agar 20 o Dekstryna 10 g Hydrolizowiiny enzym kazeiny 2 g Ekstraktwolowy 2 g Ekstraktdrozdzowy 2 g Woda destylowana do objetosci 1 litra 9,9956 0,6 0,0044 0,5. 0,5 0.3 0,03 0,07 0,05 45,4 90,7 45,4 .4 0,0399 4.5 4.5 ' 2,7 0,27 0,63 0,4598 635 27 Skos inokuluje sie Strptomyces aureofaciens NRRL 5758 i inokulowany skos inkubuje sie w temperaturze ° C w okresie 6-10dni. Dojrzala hodowle na skosie pokrywa sie surowica wolowa i zdrapuje sie jalowym ocz¬ kiem w celu rozluznienia zarodników. Otrzymana zawiesine zarodników i fragmentów grzybni w surowicy wolov. , W9j liofilizuje sie w szesc tabletek.Jedna z otrzymanych w ten sposób liofilizowanych tabletek stosuje sie do inokulówania 50 ml pozywki wegetatywnej o nastepujacym skladzie: Skladnik Glikoza Luskana soja Plyn z rozmoczonej kukurydzy CaC03 Woda wodociagowa do objetosci Ilosc g 15g 10g 2g 1 litra Inokulowana pozywke wegetatywna w 250 ml kolbach Erlenmeyera inkubuje sie w temperaturze 30 C w ciagu 72 godzin na wstrzasarce obrotowej o luku 5,08 cm w srednicy przy 250 obrotach/min.B. Fermentacja w tanku A-28086 przy uzyciu S. aureofaciens NRRL 5758.W celu uzyskania wiekszej ilosci inokulum 10 ml opisanej poprzednio inkubowanej pozywki wegetatywnej uzywa sie do inokulówania 400 ml wzrostowej pozywki wegetatywnej drugiego stopnia o tym samym skladzie, co pozywka wegetatywna. Pozywke drugiego stopnia inkubuje si£ w 2 I kolbie w temperaturze 30°C w okresie 24 godzin na wstrzasarce obrotowej o luku 5,08 cm w srednicy, przy 250 obrotach/min. 1 I pozywki wegetatywnej drugiego stopnia stosuje sie do inokulówania 100 I jalowej pozywki o nastepuja¬ cym skladzie; Skladnik Ilosc Dekstryna tapioki Hydrolizowany enzym kazeiny Brzeczka melasowa MgS04 ¦ W20 CaC03 Rafinowany olej sojowy Odmineralizowana woda do objetosci 60 g/l 8,0 g/l ,0 g/l 0,5 g/l 2,9 g/l ,0 g/l 1 litra Po wyjalowieniu w autoklawie w temperaturze 120 C, w okresie 30 minut, pod cisnieniem 6,8-9,1 kg/cm2, wartosc pH pozywki wynosi 6,7. W 165 litrowym tanku fermentacyjnym fermentuje sie inokulowana pozywke w temperaturze 29°C w okresie 10 dni. Pozywke fermentacyjna napowietrza sie jalowym powietrzem, przepuszczonym z szybkoscia 0,4 objetosci powietrza (objetosc pozywki hodowlanej/minute.Pozywke miesza sie zwyklym mieszadlem o 250 obrotach/minute, Przyklad II. Antybiotyki A-28086 wytwarzano sposobem, opisanym w przykladzie I i w kolbach przy uzyciu pozywki o nastepujacym skladzie: Skladnik Ilosc Glikoza Jadalna brzeczka melasowa Pepton CaC03 Woda wodociagowa do objetosci g/l g/l g/l 2 g/l 1 litra Przyklad III. Oddzielanie kompleksu antybiotyków A—28086, otrzymanego przy uzyciu S. aureo¬ faciens NRRL 5758.Caly bulion fermentacyjny o objetosci 132 I, otrzymany w sposób, opisany w przykladzie I, filtruje sie na filtrze, takim jak Hyflo Super-cel, ziemia okrzemkowa, (Johns-Manville Products Corp.), otrzymujac 97 litrów filtrowanego bulionu, który ekstrahuje sie odpowiednia, równa objetoscia octanu etylu. Ekstrakt w octanie etylu oddziela sie od warstwy wodnej i zateza do objetosci okolo 500 ml. Zatezony ekstrakt wprowadza sie do eteru naftowego w duzym nadmiarze (Skelly Solve F okolo 10 I) w celu wytracenia, a nastepnie oddzielenia substancji28 98 635 niepozadanych. Oddzielony przesacz odparowuje sie pod obnizonym cisnieniem, otrzymujac czesc bulionu, zawierajaca 6,9 g kompleksu antybiotyków A-28086.Czesc grzybniowa kompleksu antybiotyków A—28086 otrzymuje sie przez dwukrotna ekstrakcje odfiltro¬ wanych grzybni przy uzyciu w przyblizeniu polowy objetosci metanolu, tj. 621 i 591. Dwa ekstrakty metanolowe laczy sie i zateza pod obnizonym cisnieniem w celu usuniecia metanolu. Po zatezeniu pozostaje okolo 101 tazy wodnej. Wartosc pH fazy wodnej doprowadza sit, do okolo 7,5 przy uzyciu rozcienczonego roztworu wodorotlenku sodu. Otrzymany roztwór ekstrahuje sie dwukrotnie równymi w przyblizeniu ohjetoscia- mi octanu etylu, tj.9l i 101. Ekstrakty w octanie etylu laczy sie i odparowuje do objetosci okolo 400 ml.Stezony ekstrakt w octanie etylu wprowadza sie do nadmiaru eteru naftowego w celu usuniecia niepozadanych substancji, w sposób opisany powyzej, odnoszacy sie do zatezenia ekstraktu bulionowego. Czesc grzybniowa kompleksu antybiotyków A-28086, otrzymana z przesaczu wazy 20,6 g.Przyklad IV. Rozdzielenie poszczególnych czynników A i B z A-28086.Czesc grzybniowa kompleksu antybiotyków A-28086 o wadze 235 g, otrzymana w sposób, opisany w przykladzie III, rozpuszcza sie wokolo 80 ml benzenu. Roztwór benzenowy nanosi sie na kolumne, wypelniona zelem krzemionkowym, o wymiarach 9X 130 cm o objetosci 8 I zelu Matheson o granulacji 62.Kolumne eluuje sie róznymi mieszaninami benzenu z octanem etylu. Pcstep elucji okresla sie przy pomocy chromatografii cienkowarstwowej. Stosujac system rozpuszczalników benzen-octan etylu w stosunku 90 :1 eluuje sie najpierw czynnik B, który oddziela sie jako odrebny czynnik. Czynnik B w ilosci 43 mg krystalizowany z octanu z woda ma temperature topnienia 150—153°C.Kontynuujac elucje mieszaninami benzenu i octanu etylu, lecz zwiekszajac stopniowo ilosc octanu etylu w mieszaninie eluuje sie czynnik A. Rózne frakcje, zawierajace czynnik A, laczy sie i zateza pod obnizonym cisnieniem do sucha. Pozostalosc rozpuszcza sie wokolo 150 ml acetonu i dodaje sie okolo 150 ml wody.Wartosc pH otrzymanego roztworu doprowadza sie do 3 przy uzyciu 1 n kwasu solnego. Zakwaszona mieszanine miesza sie okolo 1 godzine. W tym czasie tworzy sie osad, który odsacza sie i rekrystalizuje z okolo 150 ml acetonu po dodaniu 60 ml wody. Produkt suszy sie przez noc pod zmniejszonym cisnieniem i otrzymuje sie okolo 6,6 g czynnika A. Po odparowaniu z przesaczu czesci acetonu otrzymuje sie nastepna porcje czynnika A w ilosci okolo 1,2 g.Przyklad V. Ester octowy czynnika A-28086-A. 7,4 g czynnika A antybiotyku A—28086 rozpuszcza sie w 150 ml pirydyny i do roztworu dodaje sie 50 m bezwodnika octowego. Otrzymany roztwór miesza sie dokladnie, a nastepnie pozostawia na noc w temperaturze pokojowej.Dodaje sie 200 ml wody i starannie miesza, a nastepnie pozostawia sie mieszanine przez okres 4 godzin w temperaturze pokojowej. Wytracony bialy osad odsacza sie, przemywa woda i suszy na powietrzu. Otrzymane cialo stale rozpuszcza sie w 100 ml acetonu i roztwór acetonowy odparowuje sie do suchosci pod obnizonym cisnieniem, powtarzajac te czynnosc trzykrotnie. Otrzymana pozostalosc krystalizuje sie z mieszaniny 100 ml acetonu i 50 ml wody, otrzymujac 6,14 g estru octowego czynnika A A-28086 o temperaturze topnienia 100-103°C.Przyklady VI—IX. Ester propionowy czynnika A antybiotyku A-28086 otrzymuje sie, poddajac reakcji czynnik Az bezwodnikiem propionowym, w obecnosci pirydyny, zgodnie ze sposobem, opisanym w przykladzie V. Produkt ma temperature topnienia 96-98°C.Ester n-maslowy czynnika A antybiotyku A-28086 otrzymuje sie, poddajac reakcji czynnik A z bezwodni¬ kiem kwasu n-maslowego w obecnosci pirydyny, zgodnie ze sposobem, opisanym w przykladzie V^Produkt ma temperature topnienia 79-81°C.Ester n-kapronowy czynnika A antybiotyku A—28086 otrzymuje sie, poddajac reakcji czynnik A z bez¬ wodnikiem kwasu kapronowego, w obecnosci pirydyny, zgodnie ze sposobem, opisanym w przykladzie V, Produkt ma temperature topnienia 163—167°C.Ester n-walerianowy czynnika A antybiotyku A-28086 otrzymuje sie, poddajac reakcji czynnik Az bez¬ wodnikiem kwasu walerianowego, w obecnosci pirydyny, zgodnie ze sposobem, opisanym w przykladzie V.Produkt ma temperature topnienia 173—175°C.Przyklad X. Wytwarzanie soli sodowej czynnika A A--28036. 500 mg czynnika A antybiotyku A-28086 rozpuszcza sie w 50 ml acetonu i do roztworu dodaje sie 50 ml wody i 5 n roztwór wodorotlenku sodu w ilosci takiej, aby pH roztworu osiagnelo wartosc 10,5-11. Otrzymany roztwór miesza sie wciagu 1 godziny, a nastepnie ekstrahuje octanem etylu. Ekstrakt w octanie etylu odparowuje sie do suchosci pod obnizonym cisnieniem. Pozostalosc wytraca sie z roztworu acetonu i wody, otrzymujac 378 mg soli sodowej czynnika A A-28086 o temferaturze topnienia 120-123°C.98 635 29 Przyklady, XI-XV. Sól barowa czynnika A antybiotyku A-28086 otrzymuje sie z 500 mg czynnika A—28086—A i nasyconego roztworu wodorotlenku baru sposobem, opisanym w przykladzie X, otrzymujac 369 mg soli barowej czynnika A-28086—A o temperaturze topnienia 188-190°C.Sól potasowa czynnika A antybiotyku A—28086 otrzymuje sie z 500 mg czynnika A-28086-A i 5 n roztworu wodorotlenku potasu sposobem, opisanym w przykladzie X, otrzymujac 363 mg soli potasowej czynnika A-28086- A o temperaturze topnienia 165-167°C, Sól cezowa czynnika A antybiotyku A-28086 otrzymuje sie z 500 mg czynnika A-28086-A i 1 n roztworu wodorotlenku cezu sposobem, opisanym w przykladzie X, otrzymujac 540 mg soli cezowej czynnika A-28086-A o temperaturze topnienia 190-210°C.Sól sodowa czynnika B antybiotyku A—28086 otrzymuje sie z czynnika B i 5 n roztworu wodorotlenku sodu sposobem, opisanym w przykladzie X.Przyklad XVI. Fermentacja na wstrzasarce A-28086 przy uzyciu S.aureofaciens NRRL 8092.Hodowle Streptomyces aureofaciens NRRL 8092 zaklada sie na skosie agarowym o nastepujacym skladzie: Skladnik Ilosc K2HP04 MgS04 • 7H20 NH4NO3 CaC03 FeS04 • 7H20 MnCIj • 7H20 ZnS04 • 7H20 Glikoza Agar Odmineralizowana woda do objetosci pH (nie nastawiana) 2g , 0,25 g 2g 2.5 g 0,001 g 0,001 g 0,001 g 10g g 1 litra 7,7 Skos inokuluje sie Streptomyces aureofaciens NRRL 8092 i inokulowany skos inkubuje sie w temperaturze °C w ciagu 7 dni. Dojrzala hodowle na skosie pokrywa sie wyjalowiona surowica wolowa i zdrapuje sie jalowym oczkiem w celu otrzymania z hodowli na skosie zawiesiny zarodników i grzybni. Otrzymana zawiesine liofilizuje sie w maksimum szesciu tabletkach.Jedna z otrzymanych w ten sposób tabletek stosuje sie do inokulowania 50 ml pozywki wegetatywnej o nastepujacym skladzie.Skladnik Ilosc Glikoza 20g Makasojowa 15 g Plyn z rozmoczonejkukurydzy 10g CaC03 2g Woda wodociagowa do objetosci 1 litra pH doprowadzone rozcienczonym roztworem NaOHdo 6,5 Inokulowana pozywke wegetatywna w 250 ml kolbach Erlenmeyera inkubuje sie w temperaturze 30°C, w ciagu 72 godzin na wstrzasarce obrotowej o luku 5,08 cm, przy 250 obrotach/min.Opisana powyzej inkubowana pozywke wegetatywna w ilosci 0,5 ml (1%) stosuje sie do inokulowania 50 ml pozywki fermentacyjnej o nastepujacym skladzie:30 98 635 Skladnik Mosc Dekstrynatapioki* 60,0 9 Hydrolizowany enzym kazeiny** 6,0 £ Hydrolizat enzymatyczny kazeiny*** 2,0 g CaC03 2,0 g MgS04-7H20 0,5 g Frakcja koncowa melasy z trzciny cukrowej 15,0 g Rafinowany olejsojowy 5,0 ml Woda wodociagowa do objetosci 1 litra pH (nie nastawiane) 6,6 * Dekstryna Staley'a 11, A.E. Staley Co.Dacatur, I, 11.** Amber EHC Amber Laboratories, Juneau, Wisc.*** NZ Amine A, Sheffield Chemical Co. Norwich, N.Y.Przyklad XVII. Fermentacja w tanku A-28086 przy uzyciu S.aureofaciens NRRL 8092.Do fermentacji w tanku stosuje sie poczatkowe postepowanie, opisane w przykladzie XVI dla fermentacji na watrzasarce. W celu otrzymania wiekszej objetosci inokulum stosuje sie 10 ml inkubowanej pozywki wegetatywnej do inokulowania 400 ml pozywki wegetatywnej drugiego stopnia o tym samym skladzie, co pierwsza pozywka wegetatywna. Pozywke drugiego stopnia inkubuje sie w 2 I kolbie Erlenmeyera, w temperatu¬ rze 30°C, w okresie 24 godzin na wstrzasarcs obrotowej o luku 5,08 cm, przy 250 obrotach/min. 800 ml inkubowanej pozywki wegetatywnej stosuje sie do inokulowania 100 I jalowej pozywki o nastepuja¬ cym skladzie: Skladnik Mosc Dekstrynatapioki* 60,0 g/l Hydrolizowany enzym **kazeiny 6,0 g/l Hydrolizat enzymatyczny kazeiny*** 2,0 g/l CaC03 2,0 g/l MgS04-7H20 0,5 g/l Frakcja koncowa melasy z trzciny cukrowej 15,0 g/l Rafinowany olejsojowy 5,0 mg/l Woda wodociagowa doobjetosci 1 litra • Dekstryna Staley'a 11, A.E, Staley Co., Decatur 111 * ** Amber EHC, Amber Laboratories, Juneau, Wisc, *** NZ Amine A, Sheffield Chemical Co., Norwich, N. Y, Po wyjalowieniu w autoklawie w temperaturze 121°C, w okresie 30 minut, pod cisnieniem 6,8—9,1 kg/cm2 wartosc pH pozywki wynosi 6,8 ±0,1. W 165 litrowym tanku fermentacyjnym fermentuje sie inokulowana pozywke w temperaturze 28°C ± 1°, w okresie 10—12 dni, Pozywke fermentacyjna napowietrza sie jalowym powietrzem, przepuszczonym z szybkoscia 0,4 objetosci powietrza /objetosc pozywki hodowlanej / minute.Pozywke miesza sie zwyklym mieszadlem o 300 obrotach/minute.Przyklad XVIII. Antybiotyki A-28086 wytwarza sie sposobem, opisanym w przykladzie XVII, stosujac wstrzasarke i tank oraz pozywke o nastepujacym skladzie.98 635 31 Skladnik Ilosc Dekstryna tapioki* glikoza Hydrolizowany enzym kazeiny** Hydrolizat enzymatyczny kazeiny*** Ekstrakt drozdzowy CaC03 MgS04 • 7H20 Frakcja koncowa melasy z trzciny cukrowej Rafinowany olej sojowy Woda wodociagowa do.objetosci ,0 g/l ,0 g/l 3,0 g/l 1,0 g/l 2,5 g/l 2,0 g/l 1,0 g/l ,0 g/1 ,0 ml/l 1 litra • Dekstryna Stanley'a nr 11, A.E. Stanley Co„ Decatur 111 ** Amber EHC, Amber Laboratories, Juneau, Wisa ***NZ Amine A, Sheffield Chemical Co., Norwich, N.Y.Po wyjalowieniu w autoklawie w warunkach podanych w przykladzie XVII, wartosc pK pozywki wynosi 6,4.Przyklad XIX. Oddzielanie kompleksu antybiotyków A—28086, otrzymanego przy uzyciu S.aureofa- ciensNRRL8092.Caly bulion fermentacyjny o objetosci 60 I otrzymany w sposób, opisany w przykladzie XVII, doprowa¬ dza sie dodatkiem rozcienczonego kwasu solnego do wartosci pH = 3. Otrzymany roztwór filtruje na filtrze, takim jak Hyflo Super-cel, ziemia okrzemKowa (Johns Manville Products Corp.), Otrzymany placek grzybni ekstrahuje si oddzieleniu ekstraktu placek grzybniowy ekstrahuje sie ponownie nastepna porcja 30 litrów metanolu. Oba ekstrakty metanolowe laczy sie i odparowuje pod obnizonym cisnieniem w celu usuniecia metanolu. Pozostaly roztwór wodny o objetosci okolo 7 litrów doprowadza sie rozcienczonym kwasem solnym do wartosci pH = 7,5.Roztwór ten ekstrahuje sie dwukrotnie porcjami po 7 litrów octanu etylu. Ekstrakty w octanie etylu laczy sie i odparowuje pod obnizonym cisnieniem, otrzymujac oleista pozostalosc, która rozpuszcza sie w 1500 ml acetonu. Do roztworu acetonowego dodaje sie 1500 ml wody i wartosc pH roztworu doprowadza sie rozcienczonym kwasem solnym do 3, a nastepnie miesza sie wciagu 1 godziny. Wytworzony osad odsacza sie, rozpuszcza sie w 1500 ml acetonu i do roztworu dodaje sie 400 ml wody. Roztwór pozostawia sie na 16 godzin do krystalizacji. Wytworzone krysztaly odsacza sie pod obnizonym cisnieniem, otrzymujac 74 g surowego produktu krystalicznego, zawierajacego czynniki A i D A—28086 i inne zanieczyszczenie krysztalów. 40g surowego krystalicznego produktu rozpuszcza sie wokolo 250 ml benzenu. Roztwór benzenowy nanosi sie na kolumne, wypelniona zelem krzemionkowym, o wymiarach 9 X 120 cm zawierajaca zel Grace-Davi- dson o granulacji 62. Kolumne eluuje sie stopniowo 40 I kazdego z nastepujacych roztworów: 1/ benzen, 2/ benzen: octan etylu (9:1), 3/ benzen : octan etylu (4 : 1); 4/ benzen: octan etylu (7 :3); 5/ benzen: octan etylu (1 :1); 6/ octan etylu; II metanol.Zbiera sie frakcje o objetosci 1 litra. Kazda frakcje badano na obecnosc Bacillius subtilis i metoda chromatografii cienkowarstwowej w celu zidentyfikowania eluowanych zwiazków. A—28086 I eluuje benzen: octan etylu (4 :1), czynnik B A-28086 eluuje benzen: octan etylu (7 :3), czynnik A i D eluuje sie we frakcji otrzymywanej z mieszaniny benzen : octan etylu (7 : 3 i 1 : 1), frakcje 119-156. Frakcje te laczy sie i odparo¬ wuje do suchosci pod obnizonym cisnieniem, Otrzymana pozostalosc rozpuszcza sie w 500 ml acetonu, a nastepnie do roztworu dodaje sie 500 ml wody, po czym wartosc pH roztworu doprowadza sie do 3 rozcienczonym kwasem solnym. Roztwór miesza sie 1 godzine, a otrzymany osad saczy sie i krystalizuje z 500 m\ acetonu i 180 ml wody. Otrzymane krysztaly .odsacza sie, suszy pod obnizonym cisnieniem i uzyskuje sie ,1 g mieszaniny czynników A i D A-28086.Przyklad XX. Rozdzielanie i oczyszczanie poszczególnych czynników A i D.Krystaliczna mieszanine czynników AiD A—28086, otrzymanych wedlug przykladu XVIII, w ilosci 18,8 g rozpuszcza sie w 50 mi benzenu i roztwór benzenowy nanosi sie na kolumne, wypelniona zelem32 98 635 krzemionkowym, o wymiarach 7 X 100 cm, zawierajaca zel E. Merck o granulacji 62, drobniejszej niz 230 mesh ASTM). Kolumne eluuje sie w sposób ciagly nastepujaco: 1/ 12 litrów benzenu; 2/12 litrów benzen:octan etylu (9 :1); 3/ 12 litrów benzen: octan etylu (4 : 1); 4/ 32 litry benzen: octan etylu (7 : 3); 5/ 10 litrów metanolu.Prowadzi sie cienkowarstwowa analize chromatograficzna na celulozie, stosujac celuloze produkcji, firmy Merck Darmstadt na nosniku z tlenku glinu i bioautografie B. SubtiNs w celu siedzenia postepu elucji. Uzywa sie nastepujacych ukladów rozpuszczalników: woda : metanol : aceton (12:3:1), nastawiajac uprzednio wartosc pH roztworu na 10,5 przy uzyciu NH4OH, a nastepnie na 7,5 kwasem solnym.Zbiera sie frakcje po 1 lub 2 litry do chwili, az wykryje sie aktywnosc, a potem frakcje po 200 ml. Frakcje te, zawierajace tylko czynnik A—28086—D, laczy sie i odparowuje. Pozostalosc krystalizuje sie z mieszaniny aceton : woda (1 :1). Oddzielone krysztaly suszy sie pod obnizonym cisnieniem, otrzymujac 140 mg krystalicz¬ nego czynnika A-28086-D.Frakcje, zawierajace czynnik A—28086—D ze sladami czynnika A A-28086, przerabia sie w ten sam sposób i otrzymuje sie dodatkowo 150 mg krystalicznego czynnika A—28086—D, zawierajacego niewielkie ilosci czynnika A-28086-A.Frakcje, zawierajace czynnik A—28086-A, przerabia sie w ten sam sposób, otrzymujac 4,7 g krystalicznego czynnika A-28086-A.Przyklad XXI. Antybiotyki A-28086 otrzymuje sie w sposób, opisany w przykladzie XVI, lecz stosujac pozywke o nastepujacymskladzie: , \ » * Skladnik , Ilosc Ekstraktwolowy 2,00 g Dekstryna 20,00 g Ekstrakt drozdzow 2,00 g Hydrolizat enzymatyczny kazeiny 4,00 g CoCI2 -6H20 0,02 g Agar 20,00 g Odmineralizowana woda do objetosci 1 litra pH nastawiane roztworemKOH 7,0 Inkubacje inokulowanego skozu prowadzi sie w temperaturze 28°C w ciagu okolo 7 dni.Przy k lad XXII. Antybiotyki A-28086 otrzymuje sie w sposób, opisany w przykladzie XVII, lecz stosujac hodowle w kolbach na pozywce o nastepujacym skladzie: Skladnik Ilosc Dekstrynatapioki* 80 g/l Hydrolizowany enzym kazeiny** 15,0 g/l Frakcja koncowa melasy z trzciny cukrowej 15,0 g/l CaC03 2,0 g/l (NH4/2S04 1,0 g/l MgS04 0,5 g/l Rafinowany olejsojowy 4,6 g/l • Dekstryna Staley'a 11, A.E, Staley Co., Decatur 111 ** Amber EHC, Amber Laboratories, Juneau, Wisc, Przyklad XXIII. Antybiotyki A-28086 otrzymuje sie w sposób, opisany w przykladzie XXI, lecz stosujac pozywke wegetatywna trzeciego stopnia o nastepujacym skladzie: Skladnik Ilosc Cereloza Plyn z namoczonej kukurydzy Luskana soja CaC03 Drozdze Melasa buraczana ,0 g/! ,0 g/1 ,0 g/l 2,0 g/l 2,0 g/l ,0 g/l98 635 33 Przyklad XXIV. Ester octowy czynnika A-28086-D Czynnik D antybiotyku A-28086 rozpuszcza sie w pirydynie i do roztworu dodaje sie stechiometryczna ilosc bezwodnika kwasu octowego. Otrzymany roztwór miesza sie starannie i pozostawia na noc w temperaturze pokojowej.Do roztworu dodaje sie nadmiar wody, dokladnie go mieszajac i pozostawia sie go na kilkanascie godzin w temperaturze pokojowej. Otrzymany osad odsacza sie, przemywa woda i suszy. Cialo stale rozpuszcza sie w acetonie i odparowuje do suchosci pod obnizonym cisnieniem i otrzymuje sie ester octowy czynnika A-28086-D.Przyklady XXV—XXVIII. Ester propionowy czynnika D antybiotyku A—28086 otrzymuje sie, poddajac reakcji czynnik A—28086-D z bezwodnikiem propionowym, w obecnosci pirydyny, zgodnie ze sposobem, opisanym w przykladzie XXIV. Ester n-maslowy czynnika D antybiotyku A—28086 otrzymuje sie, poddajac reakcji czynnik A—28086—D*z bezwodnikiem kwasu n-maslowego, w obecnosci pirydyny,zgodnie ze sposobem, opisanym w przykladzie XXI V.Ester n-maslowy czynnika D antybiotyku A-28086 otrzymuje sie, ppddajac reakcji czynnik A-28086-D z bezwodnikiem kwasu n-maslowego, w obecnosci pirydyny, zgodnie ze sposobem, opisanym w przykladzie XXIV.Ester n-kapronowy czynnika D antybiotyku A—28086 otrzymuje sie poddajac reakcji czynnik A—28086-D z bezwodnikiem kwasu kapronowego w obecnosci pirydyny, zgodnie ze sposobem, opisanym w przykladzie XXIV.Ester n-walerianowy czynnika D antybiotyku A-28086 otrzymuje sie, poddajac reakcji czynnik A—28086—D z bezwodnkiem kwasu, n-walerianowego, w obecnosci pirydyny, zgodnie ze sposobem, opisanym w przykladzie XXIV.Przyklad XXIX. Wytwarzanie soli sodowej czynnika A-28086-D.Czynnik D antybiotyku A—28086 rozpuszcza sie w acetonie, do roztworu dodaje sie równa ilosc wody i5n roztwór wodorotlenku sodu w ilosci takiej, aby pH roztworu osiagnelo wartosc, okolo 11. Otrzymany roztwór miesza sie wciagu 1 godziny, a nastepnie ekstrahuje sie octanem etylu. Ekstrakt w octanie etylu odparowuje sie, otrzymujac sól sodowa czynnika A—28086—D.Przyklad XXX-XXXII. Sól potasowa czynnika D antybiotyku A-28086 otrzymuje sie z czynnika A—28086-D i 5 n roztworu wodorotlenku potasu, stosujac sposób, podany w przykladzie XXIX.Sól barowa czynnika D antybiotyku A—28086 otrzymuje sie z czynnika A-28086-D i nasyconego roztworu wodorotlenku baru, stosujac sposób, podany w przykladzie XXIX* Sól cezowa czynnika D antybiotyku A—28086 otrzymuje sie z czynnika A—28086—D i 1 n roztworu wodorotlenku cezu, stosujac sposób, podany w przykladzie XXIX. -.j^a___iijBfti?9Biiflfi y» nw mwy? «LJftL.yo. w - na.—M i«n 4 1—* * 1 ^ 1 * fe tr—i n * ma trojpsjqp*p_*tA. to»* * 4 1 * ir—¦*—-t L—*-—*—»;—*—fr—*-J FlG 4 70 8.0 W W 2 H t68X#35W "' 10 *»7 542? $000 2500 2000 1800 1600 HOP 1200 MO W SOD 400 250 tctti fen? Fig 598 635 70 80 W10 12 K16187075 35W 1X100 yinwT \80 160 V° [20 ~W00 5500 5C00 2509 2000 J800 MO 1400 1200 M 990 600 400 250 (Chi (M"l • 10 Fig, 6 J.5 50 W 50 60 70 80 9J) 10 12 141619/0253540 w- 80. 60* fO . 0 , 40 ~V^\r-" A 40]f . 00 5500 5000 2500 tctri «.,..-..¦ _., /— 80 \r^L r* ' 60 W |%Vy $0 40 40 • 40 •20 20 20 2000 1900 1600 1400 1200 (000 800 600 (MV ;=*££ \100 80 60 40 n 400250 Fig. 7. 50 100' 80 . 60- ¦ 0 ^A, V3w ioV *—~~ 50 60 W $0 W 8P $0(0 12 14 161620255540 ^i f&J vif^W^ 40 Vr 40 20 '100 80 60 0 *WQ 3500 5000 2500 2000 t$00 1600 1400 f200 1000 800 600 400 250 (C/11 (C/1'J Fig,898 635 O HO-C-CH I CH i OH i 2 CH3 J?s—CU-Cli- Mch ^H chP CH O CH li i wH-CH-CH-C-CH i CH.CH2-CH3 Wzór f HO-C-CH- i CH3 i A CH, OH CH. 9 CH M ch; ch3 I Hf"2 CH-CH-CH-C-CH CH3 CH3 Wzoc 2 RCOX $c.U CH.-CH, Prac. Poligraf. UP PRL nakiod 120*18 Cena 45 i\ PL PL PL PL PL PL PL

Claims (1)

Zastrzezenia patentowe
1. Sposób wytwarzania antybiotyku A-28086, stanowiacego kompleks czynnika A, czynnika B oraz czynnika D, z n a m i e n n y tym, ze w warunkach wglebnej fermentacji aerobowej prowadzi sie hodowle szczepu Streptomyces aureofaciens NRRL 5758 w pozywce hodowlanej, zawierajacej przyswajalne zródla weglowodanów, azotu oraz soli nieorganicznych az do wyprodukowania przez organizm znacznej aktywnosci antybiotycznej w pozywce. 2, Sposób wytwarzania antybiotyku A-28086, stanowiacego kompleks czynnika A, czynnika B oraz czynnika O, znamienny tym, ze w warunkach wglebnej fermentacji aerobowej prowadzi sie hodowle szczepu Streptomyces aureofaciens NRRL 8092 w pozywce hodowlanej, zawierajacej przyswajalne zródla weglowodanów azotu oraz soli nieorganicznych az do wyprodukowania przez organizm znacznej aktywnosci antybiotycznej w pozywce.98 635 A-28086 i 4-—*—*—*—+—*—•—*—*—*—*~ FIGI A-26066 »gp^BQj9pL«pa....^B jayg.i«»^gfet;w qwfgfi.g 4 4 i i * > * 1 * n A n ft *- FfG2 9oa9L^masa,
PL1975181085A 1974-06-10 1975-06-10 Sposob wytwarzania antybiotyku a-28086 PL98635B1 (pl)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US47795474A 1974-06-10 1974-06-10
US56971975A 1975-04-21 1975-04-21
US05/569,740 US4038384A (en) 1974-06-10 1975-04-21 Antibiotic a-28086 and process for production thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL98635B1 true PL98635B1 (pl) 1978-05-31

Family

ID=27413429

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL1975181085A PL98635B1 (pl) 1974-06-10 1975-06-10 Sposob wytwarzania antybiotyku a-28086

Country Status (23)

Country Link
JP (1) JPS5836957B2 (pl)
AR (1) AR207982A1 (pl)
AU (1) AU497101B2 (pl)
BG (2) BG28850A4 (pl)
CH (1) CH621687A5 (pl)
DD (2) DD122261A5 (pl)
DE (1) DE2525095C2 (pl)
DK (1) DK142061B (pl)
EG (1) EG12589A (pl)
ES (1) ES438422A1 (pl)
FI (1) FI53837C (pl)
FR (1) FR2273550A1 (pl)
GB (1) GB1512568A (pl)
HU (2) HU174299B (pl)
IE (1) IE41079B1 (pl)
IL (1) IL47426A (pl)
NL (1) NL184575C (pl)
NO (1) NO143030C (pl)
PL (1) PL98635B1 (pl)
RO (1) RO64706A (pl)
SE (2) SE429763B (pl)
SU (1) SU576966A3 (pl)
YU (1) YU37359B (pl)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4141907A (en) * 1977-10-20 1979-02-27 Eli Lilly And Company Deoxynarasin antibiotics
US11026966B2 (en) 2018-05-02 2021-06-08 Purina Animal Nutrition Llc Animal feed products containing percarbonate and methods of feeding same

Also Published As

Publication number Publication date
YU37359B (en) 1984-08-31
DE2525095C2 (de) 1984-11-15
FI53837B (fi) 1978-05-02
HU173603B (hu) 1979-06-28
NO143030C (no) 1980-12-03
BG28269A3 (bg) 1980-03-25
SE7506509L (sv) 1975-12-11
BG28850A4 (bg) 1980-07-15
ES438422A1 (es) 1977-05-16
FR2273550A1 (fr) 1976-01-02
AU8181475A (en) 1976-12-09
GB1512568A (en) 1978-06-01
HU174299B (hu) 1979-12-28
IE41079B1 (en) 1979-10-10
DK142061C (pl) 1981-01-12
IL47426A (en) 1978-04-30
JPS519788A (en) 1976-01-26
SU576966A3 (ru) 1977-10-15
EG12589A (en) 1979-06-30
IL47426A0 (en) 1975-08-31
FR2273550B1 (pl) 1978-11-10
DK142061B (da) 1980-08-18
DE2525095A1 (de) 1975-12-18
RO64706A (ro) 1980-03-15
DK257975A (pl) 1975-12-11
FI751705A7 (pl) 1975-12-11
NO752033L (pl) 1975-12-11
DD127431A5 (pl) 1977-09-21
JPS5836957B2 (ja) 1983-08-12
FI53837C (fi) 1978-08-10
NO143030B (no) 1980-08-25
SE7905655L (sv) 1979-06-27
NL184575C (nl) 1989-09-01
AU497101B2 (en) 1978-11-30
CH621687A5 (en) 1981-02-27
DD122261A5 (pl) 1976-09-20
NL7506920A (nl) 1975-12-12
SE429763B (sv) 1983-09-26
IE41079L (en) 1975-12-10
AR207982A1 (es) 1976-11-22
SE431153B (sv) 1984-01-23
YU145475A (en) 1983-04-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR840000750B1 (ko) 폴리에테르 화합물
US4582822A (en) Antibiotic A80190, pharmaceutical compositions containing same and method of use
US4038384A (en) Antibiotic a-28086 and process for production thereof
US4035481A (en) Antibiotic A-28086 and process for production thereof
US4075323A (en) Coccidiocidal combinations
HU194312B (en) Process for preparing novel polycyclic ether antibiotics and compositions comprising the same
US4683201A (en) Antibiotic A80190-producing Actinomadura oligospora and process
US4129578A (en) Polycyclic ether antibiotic
US4085224A (en) Method of increasing feed utilization
US4132778A (en) Antibiotic A-32887
US4133876A (en) Antibiotic A-32887 and process for production thereof
US3719753A (en) Coccidiostats
US4174404A (en) Deoxynarasin antibiotics
CA1052779A (en) Antibiotic a2041 derivatives
AU625818B2 (en) Polyether antibiotic
CA1051800A (en) Homologs of antibiotic lasalocid a from streptomyces
US4110435A (en) Antibiotic a-28086 factor d and process for production thereof
US4110436A (en) Antibiotic a-28086 factor d and process for production thereof
PL98635B1 (pl) Sposob wytwarzania antybiotyku a-28086
EP0184291B1 (en) Polyether antibiotic a80190
EP0071970A1 (en) Novel antibiotic 76-11, process for the production thereof, anticoccidiosis agent and domestic animals growth accelerator comprising the same as an effective ingredient
US3932619A (en) Metabolite A-27106 and processes for its preparation and use
US4204039A (en) Process for producing deoxynarasin antibiotics
US5098834A (en) Process for producing antibiotic A8210 which comprises cultivating Actinomadura Fibrosa sp nov. NRRL 18348, or an A82810-producing mutant thereof
CS209848B2 (cs) Způsob přípravy polyetberických antibiotik A-28086