SE431153B - Fodermedel och anvendning av detsamma for okande av foderutnyttjningsgraden hos idisslare - Google Patents

Description

'7905655-2 g) ett NMB-spektrum 1 deuterokloroform med följande egenskaper: 66.01. 11.21.1011. 3.99. 3.89. 380. 3.67. 3.65. 3.57. 3.55. 2,83, 2,76, 2,7fl, 2,68, 2,66, 2,58, 2,56, 2,}O, 2,22, 2,17. 2,10, 2,05, 1,96, 1,90, 1,85, 1,70, 1,62, 1,60, 1,47, 1,}9. 1,31, 1,25, 1,18, 0.95. 0,95, 0,90, o,88,°o,85, 0,77, 0,75. 0,73, 0,68 och 0,66 ppm, h) en titrerbar grupp med ett pKa-värde av 7,9 1 80%-ig vatten- haltig dímetylformamid, 1) i pulverform ett karakteristiskt röntgendiffraktionsmönster (cu++-surå1n1ng, 151105 A, nickelfilner) med följande gate: konstanter 1 Å (d): d Relativ intensitet 12,00 5 100 10,10 50 9.25 90 8,00 40 7,50 15 6,92 90 6,40 ' 40 _5198 05 5,68 15 ' 5,20 40 U,98 M0 ü,62 40 #,21 20 3.118 n* ' 10 j) ett Rf-tal av 0,24 vid tunnskiktskromatografi på silikagel i ett lösningsmedelssystem av bensen-etylacetat (3:2), under användning av Bacillus subtilis ATCC 6633 såsom bestämnings- organism, ' k) följande Rf-tal i nedan angivna papperskromatografisystem under användning av Bacillus subtilis ATCC 6633 som bestäm- ningsorganísm: Rf-tal Lösningsmedelssystem 0,11 vatten mättat med metylisobutylketon (MIBK) _ 0,41 vatten mättat med MIBK plus 2% p-to- luensulfonsyra och 1% piperidin -31 g 7905655-2 Rf-tal Lösningsmedelssystem 0,54 vatten:metanol:aceton (12:3:1), inregle- rat till pH 10,5 med NH40H och därpå- sänkt till pH 7,5 med H3PO4 0,48 1% MIBK, 0,5% NH40H i Vatten 0,15 17,4 g KZHPO4, 30 ml etanol per liter vatten 0,24 bensen mättat med vatten 0,24 vatten 0,75 vatten:MIBK:etylacetat(98 :1:1) 1) en syrafunktion, som är istånd att bilda salter och ester- derivat, och m) minst en hydroxylgrupp, som kan förestras.

Antibiotikum A-28086, faktor D, är en vit kristalliserad förening, då den kristallisæææ ur aceton-vatten, som är löslig i metanol, etanol, dimetylformamid, dimetylsulfoxid, etylacetat, kloroform, aceton och bensen, men som är endast svagt löslig i hexan, och som är olöslig i vatten, smälter vid ca 96-98°C och som har: a) en molvikt av 778, bestämd genom masspektrometri med hög upplösning, b) en approximativ elementaranalys av 67,59% kol, 9,38% väte och 22,77% syre, _ c) en empirisk formel av C44H74011, bestämd genom masspektro- metri med hög upplösning, d) en specifik vridningsförmåga av -560 (c = 0,1, metanol), bestämd via 2s°c, e) ett infrarödabsorptionsspektrum 1 kloroform med följande ob- serverbara absorptionsmaxima: 2,89, },59, 3,33, 3,50, 5,88, 6,90, 7,27, 7,60, 7,8u, 9,00, 9,26, 9,62, 10,51, 10,58, 11,10 och 11,89 mikrometer, _f) ingen observerbar ultraviolettabsorption 1 95%-ig vattenhal- ' tig etanol, 5), ett NMR-spektrum 1 kloroform med följande egenskaper: ¿6,00, 4,20, 4,10» 4-00: 5:93» 51921 3,861 3185» 5,79- 3167, 3164, 5,57, 5,5ü, 2,88, 2,81, 2,71, 2,62, 2,58, 2,ü8, 2,43, 2,37, 2,29, 2,21, 2,15, 2,10, 2,on, 1,97, 1,89, 1,85, 1,76, 1,68, 1,61, 1,58, 1,55, 1,u7, 1,59, 1,50, 1,25, 1,18, 0,95, 0,90, 0,88, 0,84, 0,74 och 0,68 ppm, h) en titrerbar grupp med ett pKa-värde av 8,67 i 80ÅÄig vatten- haltig dimetylformamid, 7905655-2 i) j) K) i pulverform ett karakteriskt röntgendiffraktionsmönster (cu**-strålning, 1,s4os.x,nicke1fi1ter) maa föijanae git- terkonstanter i Å (d): d Relativ intensitet 12,4o 1oo ' 10,20 " 7o 8,85 90 7,80 30 6,80 10 6,30 100 5,70 _ 20 5,35 _ 20 5,10 20 4,90 10 4,65 20 4,45 - 40 4,20 50 ' 3,30 10 -3,15 10 2,99 , 05 ' 2.77 e 05 2,28 05 __ii,. följande Rf-tal vid användning av nedan angivna kiseldioxid- gel-tunnskiktskromatografisystem och med Bacillus subtilis ATCC 6633 såsom bestämningsorganism: Rf_tal Lösningsmedelsszstem 0,26 bensen-etylacetat (}:2) 0,66 etylacetat-díetylamin (95:5) följande R -tal vid nedan angivna papperskromatografisystem f under användning av Bacillus subtilis ATCC öójåsåsom bestäm- ningsorganismz Rf-tal Lösningsmedelssystem 0,10 _vatten, mättat med metylisobutylketon (MIBK) 0,26 vatten, mättat med MIBK plus 2% p-toluen- snlfonsyra och 1% piperidin 0,36 vatten:metanol:aceton (12:3:1) - inreg» lerat till pH 10,5 med_NH4OH~och därpå sänkt till pH 7,5 med H5PO¿ 790565 5 - 2 5 0,29 1% MIBK, 0,5% NH4OH i vatten 0,25 17,4 g K HPO , 30 ml etanol per liter va ten 0,26 bensen, mättad med vatten 0,09 vatten 0,64 vatten:MIBK:etylacetat (98:1:1) 1) en syrafunktion, som är istånd att bilda salter och ester- derivat och m) minst en förestringsbar hydroxylgrupp. ökad tillväxt hos idisslare, såsom nötkreatur, är önskvärfi av ekonomiska skäl. Av särskilt intresse är befrämjad tillväxt, som upp- nås genom ökning av utbytet vid födans utnyttjande. Mekanismen för ut- nyttjande av den närande huvudbeståndsdelen (kolhydraterna) i idiss- lares föda är välkänd. Mikroorganismer i våmmen hos djuret nedbryter kolhydrater under bildning av monosackarider och omvandlar sedan des- sa monosackarider till pyruvatföreningar. Pyruvaterna undergår ämnes- omsättning genom mikrobiologiska förfaranden till bildning av acetater, butyrater eller propionater, vilka sammanfattningsvis brukar beteck- nas flyktiga fettsyror (FFS). För en mera detaljerad diskussion se Leng i "Physiology of Digestion and Metabolism in the Ruminant", Phil- lipson et al, Oriel Press, Newcafifle-upon-Tyne, England, 1970, p. 408- 410.

Den relativa verkningsgraden för utnyttjande av FFS diskuteras av McCullough i Feedstuffs, 19 juni 1971, p. 19; Eskeland et al i g¿ An. Sci. 33, p.282 (1971); och Church et al i “Digestive Physiology and Nmxitfix1of Ruminants", volym 2, 1971, p. 622 och 625. Ehuru acetater och butyrater utnyttjas, så utnyttjas propionater med större verkningsgrad. Om vidare alltför liten mängd propionat finnes till- gänglig kan djuren utveckla ketos. En välgörande förening stimulerar därför djuren till bildning av en högre andel propionater ur kolhydra- ter, varigenom verkningsgraden vid utnyttjandet av kolhydraterna ökar och även risken för ketos minskar.

Faktorerna A och D av antibiotikum A-28086 är nya medlemmar i en grupp av polyeterantibiotika. Exempel på medlemmar i denna grupp är monensin (amerikanska patentskriften 3 501 568), dianemycin [§.L.

Hamill, M.M. Hoehn, G.E. Pittenger, J. Chamberlin och M. Gorman, §¿ Antibiotics, 22, p. 161 (1969[7; nigericin [I.K. Steinrauf, Mary Pinkerton och J.W. Chamberlin, Biochem. Biophys. Res. Comm. 33, p. 29, (1968[7; och salinomycin [japanska patentskriften 47-25392 av den 20 oktober 1972, motsvarande japansk patentansökan 1962071971; Der- 7905655-2 went nr.76960T, amerikanska patentskriften 3 857 948; och H. Kinashi, N. Otake, H. Yonehara, S. Sato och Y. Saito, Tetrahedron Lett. 49, p. 4955-4958 (1973[].

Uttrycket "antibiotiskt komplex" såsom det användes inom jäsnings- tekniken och i denna beskrivning avser icke något kemiskt komplex utan en blandning av samtidigt bildade individuella antibiotiska faktorer.

Såsom även inses av fackmän inom området framställning av antibiotika genom jäsning kommer förhållandet mellan de enskilda faktorerna som bildas i ett antibiotiskt komplex att variera beroende på de använda jäsningsbetingelserna.

Komplexet av A-28086-antibiotika framställes genom odling av den nya stammen av Streptomyces aureofaciens NRRL 5758 under submersa aero- ba Jäsningsbetíngelser tills en väsentlig antibiotisk'aktivitet bildats.

Komplexet av A-28086 antibiotika kan även framställas genom odling av ännu en annan ny stam av Streptomyces aureofaciens, NRRL 8092. Då komplexet bildas antingen medelst Streptomyces aureofaciens NRRL 5758 eller medelst Streptomyces aureofaciens NRRL 8092 extraheras det från odlingslösningen och från myceliet med polära organiska lösningsmedel.

Den extraherade blandningen av antibiotika avskíljes genom koncentre- ring av lösningsmedlen, tillsättning av koncentraten till överskott av petroleumeter i och för utfällning av föroreningar, filtrering och in- dunstning av filtraten för erhållande av en blandning av A-28086 anti- biotika. Denna antibiotikablandning renas ytterligare och uppdelas 1 individuella faktorer genom pelarkromatografi.

Följande infraröd«absorptionsspektra i kloroform visas i ritning- ärna 2 Fig. 1 - antibiotikum A-28086 faktor A Fig. 2 - antibiotikum A-28086 faktor B Fig. 3 - antibiotikum A-28086 faktor A acetylesterderivat Fig. 4 - antibiotikum A-28086 faktor A propionylesterderivat Fig. 5 - antibiotikum A-28086 faktor A butyrylesterderivat Fig. 6 - antibiotikum A-28086 faktor A valerylesterderivat Fig. 7 - antibiotikum A-28086 faktor A kaproylesterderivat Fig. 8 - antibiotikum A-28086 faktor D A-28086 faktorerna ärtill sin struktur besläktade med varandra.e Åtminstone fyra antibiotiska faktorer bildas samtidigt under jäsningen och erhålles som en blandning. Faktorerna skiljes från varandra, och *faktorerna A, B och D isoleras som enskilda föreningar; de i förelig- 7905655-2 7 . gande sammanhang intresserande ämnena är såsom ovan omnämnts faktor A och faktor D, och dessa kommer att ytterligare beskrivas nedan. Bland- ningen av A-28086 faktorer är löslig i de flesta organiska lösningsme- del men olöslig i vatten.

Antibiotikum A-28086, faktor A, kristalliserar ur aceton-vatten.

A-28086, faktor A, smälter vid ca 98-1000C, stelnar på nytt och smäl- ter igen vid ca 195-200°C. Elementaranalys av faktor A gav följande genomsnittliga procentuella sammansättning: kol 66,69%, väte 9,85%, syre 23,10%. Den empiriska formeln för faktor A är C43H72011.

Faktor A har en skenbar molekylvikt av 764 bestämd genom mass- spektrometri.

Infrarödspektrum för faktor A i kloroform visas i fig. 1 på bi- fogade ritningar. Följande absorptionsmaxima iakttas: 2,85, 5,54, 5:83: 6:82: 7:22: 7:55 (svagt-Jr (svaßth (kraftigt-Öl (kraftigt), 9,15, 9,50 (kraftigt), 9,55 (kraftigt), 9,60, 9,85, 10,15, 10,45 och 10,70 (svagt) pm.

Ultraviolettspektrum för faktor A i etanol visar absorption endast i ändomràdet under 220 pm.

WMR-spektrum för A-28086, faktor A, i deuterokloroform visade för-Jamie egenskaper: 66,01. 4,21, 4.11. 3.99- 3,89. 5.80, 3.67. 3,65. 3,57, 3,55, 2,85, 2,76, 2,74, 2,68, 2,66, 2,58, 2,56, 2,30, 2,22, 2,17, 2,10, 2,05, 1,96, 1,90, 1,85, 1,70, 1,62, 1,60, 1,ü7, 1,59, 1,51, 1,25, 1,18, 0,95, 0¿9§, 0,90, 0,88, 0,85, 0,77, 0,75, 0,75, 0,68 och 0,66 ppm- ' i ~ Antibiotikum A-28086, faktor A, kristallíserad ur aceton-vatten, har följande karakteristiska röntgendiffraktionsmönster i pulverform (Cu++-strålning, l,5405 Å , nickelfilter, d = gitterkonstant i Å): d Relativ intensitet 12,00 100 10,10 50 9,25 90 8,00 40 7,50 15 6,92 90 6,40 40 5,98 05 5,68 15 5,20 40 4,98 40 79-(15655-2 s d Relativ intensitet 4,62 40 4,21 20 3,48 10 Den specifika vridningsförmågan för antibiotikum A-28086, faktor A, är -54° (c = 0,2, metanol), bestämd vid 25°C. Denna specifika vrid- ningsförmåga är ett medelvärde baserat på flera bestämningar.

Elektrometrisk titrering av faktor A i 80%-ig vattenhaltig di- metylformamid indikerade närvaro av en titrerbar grupp med ett pKa- värde av 7,9. 0 Antibiotikum A-28086, faktor A, är löslig i en mängd olika orga- niska lösningsmedel, såsom metanol, etanol, dimetylformamid, dimetyl- sulfoxid, etylacetat, kloroform, aceton och bensen, men är endast svagt löslig i icke polära, organiska lösningsmedel, såsom hexan,och är olöslig i vatten.

Antibiotikum A-28086, faktor A, har en syrafunktion som kan bil- da salter och esterderivat samt minst en hydroxylgrupp, som kan föres- tras.

\ Antibiotikum A-28086, faktor A, har på basis av ovan angivna fy- sikaliska egenskaper antagits ha nedanstående strukturformel I, vars riktighet har bekräftats. ß Ha -CHz~CHa /ÉTK/ Q Ha mißwmmuwtkl _ \ ___ /wm \_/ Hö \./ o H; ' Ha H2 Ha Ha Ha I Ha Formel I Antibiotikum A-28086, faktor13, är då den framställes medelst Streptomyces aureofaciens NRRL 5758, en mindre faktor. Då den fram- ställes medelst Streptomyces aureofaciens NRRL 8092 är emellertid A- 28086, faktor D, närvarande i mängder av upp till 10% av den utvun- na antibiotiska aktiviteten. 9 7905655-2 Antibiotikum A-28086, faktor D, är ett vitt kristallint material (ur vatten-aceton) med en smältpunkt av ca 96-98°C. A-28086, faktor D, har en skenbar molekylvikt av 778, bestämd medelst masspektrometri med hög upplösningsförmâga.

Elementaranalysen för toppen i masspektrum för natriumsaltet av A-28086, faktor D, observerades vara 800,505O (beräknat för C44H73O11 Na = 800,5050). I masspektrumet för den fria syran av A-28086, faktor D, iakttogs en mindre topp vid 778 och en större topp vid 760,5117 (beräknat för C44H72010 = 760,5125). m/e = 760 i masspektrum för den fria syran är resultatet av en förlust av vatten från molekyljonen.

Molekyljonsammansättningen för fri syra av antibiotikum A-28086, faktor D, är därför C H O 44 74 11' Den empiriska formeln för A-28086, faktor D, är C44H74O11. Ele- mentaranalys av faktor D gav följande procentuella sammansättning: kol 67,59%, väte 9,38%, syre 22,77%.

Den teoretiska procentuella sammansättningen för Cn¿H7¿0l1 är: kol 67,87%, väte 9,51%, syre 22,77%.

Det infraröda absorptionsspektrumet för A-28086, faktor D, (fig. 8) innehåller följande iakttagbara absorptionsmaxima: 2,89, 3,39, 3,43, 3,50, 5,88, 6,90, 7,27, 7,60, 7,84, 9,00, 9,26, 9,62, 10,31, 10,58, 11,10 och 11,49 Pm.

A-28086, rektor D, 1 95%-ig vettenne1t1g etanol viser ingen ultraviolett absorption.

NMR-spektrumet för A-28086, faktor D, i Heuterokloroform uppvi- sade fö1jende egenskaper: 46,00, h,2o, 4,10, h,00, 3,98, 3,92, 3,86. 3,83, 3.79, 3,67, 3,611, 3,57, 3,511, 2,88, 2,81, 2,71, 2,62, 2,58, 2,48, 2,43, 2,37, 2,29, 2,21, 2,15, 2,10, 2,0Ä, 1,97, 1,89, 1,83, 1,76, 1,68, 1,61, 1,58, 1,55, 1,27, 1,39, 1,30, 1,25, 1,18, 0,95, 0,90, 0,88, 0,84, 0,7Ä och 0,68 ppm. Äntibiotikum A-28086, faktor D, kristallíserad ur aceton-vatten, har följande karakteristiska röntgendiffraktíonsmönster i pulverform (0u++-etrà1n1ng, 1,5u05 >., niekelrilter, d = gitterkenetent 1 Å)= d ' Relativ intensitet 12,40 2 100 10,20 70 8,85 90 7,80 ' 30 6,80 10 . 6,30 100 7905655-2 10 d Relativ intensitet 5,70 20 5,35 20 5,10 20 4,90 10 -4,65 20 4,45 40 4,20 30 3,30 10 p 3,15 10 2,99 05 2,77 05 2,28 05 Den specifika vridningsförmågan för antibiotikum A-28086, faktor D, är -560 (c = 0,1 metanol) bestämd vid en temperatur av 25°C. l Elektrometrisk titrering av A-28086, faktor D, i 80%-ig vatten- haltig dimetylformamid antydde närvaron av en titrerbar grupp med ett pKa-värde av 8,67.

Antibiotikum A-28086, faktor D, är löslig i en mängd olika orga- niska lösningsmedel: metanol, etanol, dimetylformamid, dimetylsulfoxid, etylacetat, kloroform, aceton och bensen. A-28086, faktor D, är endast sagt löslig i icke polära organiska lösningsmedel, såsom hexan, och är olöslig i vatten. _ Antibiotikum A-28086, faktor D, har en syrafunktion, som är istând att bilda salter och esterderivat, samt minst en hydroxylgrupp som kan förestras.

Antibiotikum A-28086, faktor D, har på basis av ovan angivna fysikaliska egenskaper antagits ha nedanstående strukturformel II, vars riktighet (med R1 = etyl och R2 = metyl) har bekräftats. ïHa ïna -cfiz-CH» »__-_ i H i / \_/ ° ï 0\\ H _§H2 0 //0-- -- Hoi H.. / -äírïïfi i / \ \_ you H2 H3 \O/ 2 Ha Ha 1 Formel II 7905655-2 11 Rf-talen för antibiotikum A~28086, faktorerna A och D, i olika papperskromatografisystem under användning av Bacillus subtilis ATCC 6633 som bestämningsorganism anges i tabell I.

Tabell I Rf-tal Faktor A Faktor D Lösningsmedelssystem 0,11 0,10 vatten mättat med metylisobutyl- _ keton (MIBK) 0,41 0,26 vatten mättat med MIBK plus 2% p- -toluensulfonsyra och 1% piperi- din 0,54 0,36 vattenzmetanolzaceton (12:3:1) - inreglerat till pH 10,5 med NH OH och därpå sänkt till pH 7,5 me H3PO4 0,48 0,29 1% MIBK, 0,5% NH4OH i vatten 0,15 0,25 17,4 g K HPO4, 30 ml etanol per liter va ten 0,24 0,26 _ bensen mättat med vatten 0,24 0,09 vatten 0,75 0,64 vatten:MIBK:ety1acetat (98:1:1) I tabell II anges Rf-talen för antibiotikum A-28086, faktorerna A och D, i två tunnskiktskromatografisystem på kiseldioxidgel (på förhand belagda plattor, E. Merck, Darmstadt, F-254, skikttjocklek 0,25 mm), varvid Bacillus subtilis ATCC 6633 även här användes såsom bestämningsorganism.

Tabell II Rf-tal Faktor A Faktor D Lösningsmedelssystem 0,24 0,26 bensen-etylacetat (3:2) 0,54 0,66 4 etylacetat-dietylamin (95:5) En annan substans, som godtyckligt betecknas A-28086-I, bildas samtidigt med det antibiotiska komplexet A-28086. Ehuru A-28086-I icke är mikrobiologiskt aktiv, är den strukturellt besläktad med de antibiotiska faktorerna A-28086. A-28086-I är en vit kristalliserad förening (ur aceton-vatten) och har en smältpunkt av ca 160-162oC.

Jämförande studier av NMR-spektra och andra egenskaper för A-28086-I och syntetiskt framställd A-28086, faktor A-metylester, gav bevis för att A-28086-I är metylestern av A-28086, faktor A, eller en nära besläktad förening, såsom en stereoisomer. 7905655-2 12 Ehuru A-28086-I från början utfaller samtidigt med de aktiva an- tibiotiska faktorerna A-28086, kan denna substans lätt avskiljas från de antibiotiska faktorerna genom kromatografi på kiseldioxidgel.

Antibiotikum A-28086, faktorerna A och D,samt de angivna acyl- esterderivaten av faktorerna A och D kan bilda salter. "Fysiologiskt accepterbara“ salter är salter, hos vilka toxiciteten för föreningen som sådan gentemot varmblodiga djur icke ökas i förhållande till icke-saltformen. Exempel på lämpliga alkalimetall- och alkaliska jord- artsmetallsalter är natrium-, kalium-, litium-, cesium-, rubidium-, barium-, kalcium- och magnesiumsalterna. Lämpliga aminsalter är ammo- nium- och de primära, sekundära och tertiära C1-C4-alkylammonium- och hydroxi-C2-C4-alkylammoniumsalterna. Exempel på aminsalter är de sal- ter, som bildas genom reaktion mellan avsedd faktor av A-28086 och am- moniumhydroxid, metylamin, sek.butylamin, isopropylamin, dietylamin, di- isopropylamin,etanolamin,trietylamin, 3-amino-1-propanol och liknande.

Alaklimetall- och alkaliska jordartsmetallkatjonsalterna av A-28086, faktorerna A och D, och av acylesterderivaten av faktorerna A och D framställes enligt förfaranden, som vanligen användes för fram- ställning av katjoniska salter. Den antibiotiska faktorn i fri syra- form eller esterderivat löses i ett lämpligt lösningsmedel,sâsom varm metylalkohol eller etanol,varpå den lösning innehållande den stökio- metriska mängden av den önskade oorganiska basen i vattenhaltig metanol sättes till denna lösning. Det så bildade saltet kan isoleras enligt välkända metoder, såsom filtrering eller indunstning av lösningsmedlet.

De salter, som bildas med organiska aminer, kan framställas på liknande sätt. Exempelvis kan den gasformiga eller flytande aminen sättas till en lösning av den antibiotiska faktorn i ett lämpligt lös- ningsmedel, sâsom aceton, och lösningsmedet och överskottet av amin kan avlägsnas genom indunstning.

A-28086, faktor A, bildar acylesterderivat.Förestring sker vid ' en av hydroxylgrupperna i A-28086,faktor A, vid behandling med en C2-C6-syraanhydrid eller -syraklorid. Dylika estrar framställes typiskt genom omsättning av A-28086,faktor A, med exempelvis motsvarande syra- anhydrid vid rumstemperatur.Även esterderivaten är användbara såsom medel, som ökar verkningsgraden för födans utnyttjande.

Följande stycken beskriver egenskaperna hos dessa acylesterderi- vat av A-28086, faktor A.

A-28086, faktor A, acetylesterderivat är en vit kristalliserad förening (ur aceton-vatten) med en smältpunkt av ca 100-103°C.

A-28086, faktor A, acetylesterderivat har en empirisk formel av C45H74O12 och en molvikt av ca 807, beräknat på den empiriska formeln 13 7905655 -2 som föreslås för A-28086, faktor A. Elementaranalys av faktor A-acetyl- esterderivat gav följande procentuella sammansättning: Beräknat för c45H74o12 = c s6,97%, H 9,24% o 23,79% Funnnet: C 67,67%, H 8,7I%, 0 23,13% Infrarödspektrumet för A-28086, faktor A, acetylesterderivat i kloroform visas i fig. 3 på bifogade ritningar. Följande absorptions- maxima iakttas: 2,85, 5,56, 3.58 (KP&ffiï8Ü)n 5-80, 6185» 7:25: 7,52 (kraftigt), 7.60 (svagt), 7.80 (kraftigt), 8.45 (kraftigt), 8.80 (kraf- tigt), 8,95 (kraftigt), 9,10 (kraftigt). 9.20, 9.63, 9,80 (kraffi1ßfi)» 10,12 (svagt), 10.25 (svagt) och l0»50 rm- Det ultravioletta spektrumet för A-28086, faktor A, acetylester 1 etanol visar endast ändabsorption.

Elektrometrisk titrering av A-28086, faktor A, acetylesterderiva! i 80%-ig vattenhaltig dimetylformamid antydde närvaro av en titrerbar grupp med ett pKa-värde av 8,5- A-28086, faktor A, propionylesterderivat är en vit kristalliserad förening (ur aoetonivatten) med en smältpunkt av ca 96-9800. A-28086, faktor A, propíonylesterderivat har en empirisk formel av C¿6H76O12 och en molvikt av ca 821, beräknat på den empiriska formel, som foreslàs för A-28086, faktor A. Elementaranalys av faktor A-propionylesterderi- vat gav följande procentuella sammansättning: 46H76O12: C 67,29%, H 9,33%, O 23,38% Funnet: C 66,06%, H 9,17%, O 23,41% Infrarödspektrumet för A-28086, faktor A, propionylesterderivat Beräknat för C i kloroform visas i fig. 4 på bifogade ritningar. Följande absorptions- maxima iakttas: 2,85, 3,33, 3,38 (kraftigt), 3,45 (kraftigt), 5,75 (kraftigt), 5,82, 6,81, 7,22, 7,30 (kraftigt), 7,50 (svagt), 7,60 (svagt), 7,80, 8,43, 8,75 (kraftigt), 8,90, 9,05, 9,15 (kraftigt), 9,50 (kraftigt) 9,63, 9,83 (svagt), 10,05 (kraftigt), 10,13, 10,20 (kraf- tigt) 10,45 och 10,68Åpm.

Det ultravioletta spektrumet för A-28086, faktor A, propionyles- terderivat i etanol visar endast ändabsorption.

Antibiotiuum A-28086, raktor.A, butyryiesteraerivat är en vit kristalliserad förening (ur aceton-vatten) med en smältpunkt'av ca 96- 9800. A-28086, faktor A, butyrylesterderivat har en empirisk formel av Cu7H78012, en molvikt av ca 835 och en approximativ sammansättning av C 67,60ß, H 9,H1%, O_22,99%, såsom erhålles av den empiriska formel* som föreslås för A-28086, faktor A. lnfrarödspektrumet för A-28086, faktor A, butyrylesterderivat 1 kloroform visas i fig. 5 pà bifogade ritningar. Följande absorptions- maxifflfl iaktta* 2-å32; 3-"0- 3»_,'+_51eeš_»eâ_l;_i§_-š55,-eeß-9ëikäëšëiåifll5»9I____. 7905655-2 14 (kraftigt). 6.90. 7.50. 7.84.(svasr). 8.55. 8.85 (svagt). 9.01 (kraf- tigt), 9,26, 9,76, 9,95, 10,51 och 10,64 Pm. _ Antibiotikum A~28086, faktor A, valerylesterderivat är en vit kristalliserad förening (ur aceton-vatten) med en smältpunkt av ca 173-175°c. A-28o86. faktor A, vaisrylsscsrasrivat har sn empirisk for- mel av C¿8H80Ol2, en molvíkt av ca 849 och en approximativ sammansätt- ning av C 67,89%, H 9,50%, O 22,6l%, såsom erhålles av den empiriska formel, som föreslås för A-28086, faktor A.

Infrarödspektrumet av A-28086, faktor A, valerylesterderivat i kloroform visas i fig. 6 på bifogade ritningar. Följande absorptions- maxima iakttas: 2,90, 5,40, 5,45, 5,51, 5,87, 5,92 (kraftigt), 5,99 (kraftigt), 6,91, 7,30, 7,69 (svagt), 7,87 (svagt), 8,16, 8,58, 8,85 (svagt), 9,26, 9,76, 10,00 (sagt), 10516611 10,64 pm.

Antibiotikun1A-28086, faktor A, kaproylesterderivat är en vit kristalliserad-förening (ur aceton-vatten) med en smältpunkt av ca 165- 16700.. A-28086, faktor A, kaproylesterderivat har en empirisk formel av C¿9H820l2, en molvikt av ca 865 och en approximativ sammansättning av C 68,l8%, H 9,58%, 0 22,2ü%, såsom erhålles av den empiriska formel som föreslås för A-28086, faktor A.

Infrarödspektrumet för A428O86, faktor_A, kaproylesterderivat i kloroform visas í fig. 7 på bifogade ritningar. Eöljande absorptions- maxima iakttas: 2,90, 3,40, 3,45, 3,51, 5,87, 5,92 (kraftigt), 5,97 (kraftigt), 6,90, 7,30, 7,66 (svagt), 7,84 (svagt), 8,16, 8,58, 8,85 (svagt), 9,05 (kraftigt), 9,17, 9,72, 9,95, 10,29 och 10,62/um. 1 Acylering av A-28086, faktor A resulterar i följande förändringar i H NMR-spektrumet: den karbinylresonans, som uppträder vid ca 4 ppm, förskjutes nedåt i fältet till ca 5,3 ppm ( det exakta läget varierar något litet i de olika acylderivaten), och vinylprotonsignalerna för- skjutes även. Detta är karakteristiskt för den förändring, som repre- senteras i den partiella strukturen genom: _ oï Ok /\ i ' /\ häl I-H 4. RCOX -¥ H/ I-H / //ïï Ü? /fi' där R betecknar C1-C5-alkyl. Denna partiella struktur är i full över- ensstämmelse med experiment med 1H homonukleär urkoppling och 130- kärnmagnetisk bevisning med acetyl- och propionylesterderivaten.

C2-C6~acylesterderivaten av A-28086, faktor A är lösliga i en 15 7905655-2 mängd olika organiska lösningsmedel, såsom metanol, etanol, dimetyl- formamid, dimetylsulfoxid, etylacetat, kloroform, aceton och bensen, men är endast svagt lösliga i icke polära organiska lösningsmedel, så- som hexan, och är olösliga i vatten.

Var och en av C2-C6-acylestrarna av A-28086 har en syrafunktion, som kan bilda salter och esterderivat.

De nya antibiotika kan framställas genom odling av en A-28086- bildande stam av Streptomyces aureofaciens under swmmrsa aeroba beting- elser i ett lämpligt odlingsmedium, tills en väsentlig antibiotisk ak- tivitet bildats. Antibiotika utvinnes genom användning av olika isole- rings- och reningsmetoder, som vanligen användes och är kända inom den- na teknik.

Förmågan att förbättra födoämnesutnyttjandet i djur är en bety- delsefull egenskap hos A-28086-föreningarna. Sålunda förbättrar dessa föreningar födoämnenas utnyttjningsgrad hos idisslare,som har en utverklædvomfunktion.

Såsom omtalas ovan ökas verkningsgraden vid utnyttjandet av kol- hydrater hos idisslare genom behandlingar, som stimulerar djurets vom- flora till att bilda propionatföreningar snarare än acetat- eller bu- tyratföreningar. Verkningsgraden vid utnyttjandet av födan kan över- wææs genom att man observerar bildningen och koncentrationen av pro- pionatföreningar i vommen under användning av följande förfaranden: Vomvätska erhålles från en ungtjur med en kirurgiskt anlagd fistelöppning i vommen. Ungtjuren utfodras med en stor andel spann- mål. Ett prov på Vomvätska pressas genom fyra skikt gasväv, och filt- ratet tillvaratas. Det partikelformiga material, som kvarstannar på gasväven, suspenderas på nytt i en tillräcklig mängd fysiologisk buffertlösning för erhållande av den ursprungliga volymen av Vomväts- ka, och denna suspension pressas pâ nytt igenom. Den använda buffert- lösningen hade följande sammansättning: Beståndsdel g/liter Na2HPO4 0,316 KH2PO4 0,152 NaHCO3 2,260 KCl 0,375 NaCl 0,375 MgSO4 0,112 CaCl2-2H2O 0,050 FeSO -7H2O 0,008 4 MnSO4°H2O 0,004 7905655-2 16 Beståndsdel g/liter ZnSO4'7H2O 0,004 CuSO4'5H2O 0,002 C0Cl2'6H2O 0,001 såsom beskrives av Cheng et al. i J. Dairy Sci. QQL p. 1225-1230 (1955).

De bägge filtraten sammanslås och får stå tills partikelformigt material avskiljes på ytan. Det klara skiktet avskiljes, utspädes med samma buffert (1:1) och inregleras sedan till ett pH av 6,8-7,0.

Den utspädda vomvätskan (10 ml) införes i en 25 ml kolv till- sammans med 40 mg av ovan beskrivna föda, ytterligare 1 mg sojabön- protein och den förening som skall prövas. Fyra kolvar användes per behandling. Två uppsättningar om fyra kontrollkolvar användes även.

Ett kontrollprov vid tidpunkten noll och ett efter 16 tfinmeråinkuba- tion användes. Alla provkolvarna inkuberas under 16 timmar vid 38°C.

Efter inkubationen mätes pH-värdet, och 25%-ig metafosforsyra (2 ml) sättes till varje kolv. Proven får avsätta sig, och överstående väts- ka analyseras medelst gaskromatografi beträffande propionat-, acetat- och Ufiqmatföreningar. Aktiva föreningar ökar väsentligt propionat- bildningen i förhållande till propionatbildningen i kontrollproven.

Resultaten med provföreningarna jämföres statistiskt med resul- taten från kontrollproven. Tabell III visar förhållandet mellan kon- centrationerna av flyktiga fettsyror (FFS) i.behandlade kolvar och koncentrationen i kontrollkolvarna. 7905655 -2 Pl. mwwo . . »min ßmå wæ~o .H .Hwuwmfinonmmx |< .Houxmmlmwøwwfå Ä mmÄ. mßqo Nmqo a hmnmmfihnwam> _ wa |< hoßxmhtwwøwmld . _ fi .o Hm.o ._ mmummfnhhudß 3 H wm H w ..< nopxmm|wwoww|< m _ nbÄ . qo omflo H nmumwaßüofiaonm N .U æw å pøpxmm|wæowwv< OÄ o~N wflo mfo H nwummflæumum z d m ..< .Hopxmm-mæowwé ÅS EQ gå ÅS F 4 uowxwmèmøwwfm H\ZE umcoflmohm umnhußn umumod .må uwcms üšoa »Loa månš »Tüš ~x$m>so> w: m . kfonafiflohucox :oo >onm nwfløcmsmo. cmflnæë wvfimflflmsnwm fi Emm HC hmm HHH .HHwQmE 7905655-2 18 Utbytet vid utnyttjandet av kolhydrater illustreras ytterligare genom försök in vivo, som utfördes på djur, som hade fistlar anlagda i deras vommar, varigenom det blev möjligt att avtappa prov av inne- hållet i vommen.

Det prov, varav resultatetangçs i tabell IV, genomfördes med fistelförsedda ungtjurar, som vägde ca 450 kg vardera. Tå ungtjurar uppföddes på en normal diet och fyra ungtjurar i varje behandlingsgrupp uppföddes på en identisk diet, till vilken A-28086, faktor A hade tillsatts. Till varje prov (100 ml) av vomvätska som togs sattes 10%- ig metafosforsyra (100 ml). Proven fick sätta sig, och överstående vätska analyserades medelst gaskromatografi för bestämning av koncen- trationen propionsyra.

Resultaten i tabell IV är den genomsnittliga procentuella ök- ningen i propionsyrakoncentrationen i vomvätskan,tagen såsom ett me- dehzl av fem analyser under en behandlingsperiod av 14 dygn. Kontroll- proven hade ca 20 mol% propionsyra.

Tabell IV A-28086, faktor A Procent ökning i förhållande till (m /d n) kontrollprov 25 17,4 100 54,0 Prov in vivo visade vidare att A-28086, faktor A ökar utbytet vid födans utnyttjande hos får. Resultaten av dessa prov, som genom- fördes under en tidsrymd av 56 dygn, har sæmenställts i tabell V.

Tabell V A-28086- Antal djur Genomsnitt- Intag av Intag/ Procen- faktor A, g lig daglig föda vikt- tuell för- per ton föda viktökning (kg/dygn) ökning bättring (kg/dygn) 9 13 0,20 1,49 7,40 12 18 13 0,17 1,43 8,31 1 1 Kontroll 17 0,19 1,62 8,38 - Även beträffande A-28086, faktor D-föreningar gäller, - . att de har förmåga att förbättra utbytet vid utnyttjandet av födoämnen hos idisslare, som har en utvecklad vomfunktion.

Mekanismen för utnyttjande av huvuddelen av näringsbeståndsdelarna (kolhydraterna) i idisslares födoämnen är såsom ovan omnämntsvälkänd; jfr. Leng loc.citq McCullough loc.cit¿ Eskeland et al, loc. cit; och Church et al loc.cit.. Ehuru acetater och butyrater utnyttjas, utnytt- jas propionaterna med större verkningsgrad. Om vidare alltför liten 19 7905655-2 mängd propionat är tillgänglig, kan djuren utveckla ketos. En välgö- , rande förening stimulerar därför djuren att bilda en högre andel pro- pionater av kolhydraterna, varigenom graden av kolhydratutnyttjande ökas och även risken för ketos minskas.

Aktiviteten av en sådan välgörande förening kan bestämmas genom att man observerar dess verkan på bildningen av koncentrationen av propionatföreningar i vommen enligt samma förfarande, som användes för faktor A ovan.

Resultaten med provföreningen jämföres statistiskt med kontroll- resultat. Tabell VI visar förhållandet mellan koncentrationerna av flyktiga fettsyror i kolvar behandlade med A-28086, faktor D och koncentrationerna i kontrollkolvar.

Tabell VI A-28086, D, Mol-% Mol-% Mol-% Total FFS, /ug/ml acetat butyrat propionat ml/1 1,0 O,8715 0,7973 1,7981 1,1979 0,3 0,8976 0,8726 1,5871 1,0630 Föreningarna ökar propionatmängderna och därigenom graden av födoämnenas utnyttjande, när föreningarna tillföres idisslare oralt i mängder från ca 0,05 mg/kg/dygn till ca 5,0 mg/kg/dygn. De bästa resultaten uppnås vid mängder av från ca 0,1 mg/kg/dygn till ca 2,5 mg/kg/dygn. Föreningarna inblandas i djurfodret.

A-28086 kan användas i foderblandningar avsedda att göda boskap, innefattande nötkreatursfoder och från 1 till 30 g per ton av före- ningen.

Såsom inses av fackmannen skiljer sig ett kreatursfoder från andra foder, såsom foder för fjäderfä. Nötkreatursfoder innehåller grovmaterial, såsom bomullsfröskal och majsensilage. Dessutom inne- håller nötboskapsfoder en högre andel, ofta 15-25% av icke protein- haltiga kvävekällor. En vanlig, icke proteinhaltig kvävekälla är karb- amid.

Följande exempel avser att ytterligare illustrera uppfinningen.

Exempel 1.

Med A-28086, faktor A, förbättrat nötkreatursfoder Ett avvägt, spannmâlsrikt nötkreatursfoder beredes enligt föl- jande: 7905655-2 20 Beståndsdel Finmalen majs Malda majskolvar Torkat alfalfamjöl, 17% protein Från skal befriat sojabönmjöl, extraherat med lösningsmedel, 50% protein Sockerrörsmelass Karbamid A-28086, faktor A Dikalciumfosfat, foderkvalitet Kalciumkarbonat Natriumklofia Förblandning av spårelement Vitamin A och DZ-förblandning* Vitamin E-förblandning** Kalciumpropionat å 67,8 10 9,9956 5 0,6 0,0044 ' 0,5 0,5 0,3 0,03 0,07 0,05 0,15 .ha 1356 zoo 100 199,91z 1oo,o 12,0 o,oss 1o,o 1o,o 6,o °'5 1,4 1,0 3,0 * Innehållande per kg: 4 400 000 I.E. vitamin A; 500 000 I.E. vitamin D2 och 850 kg sojabönfoder med 1% olja tillsatt.

* Torkad majsdrav med lösligt material, innehållande 44 000 I.E. d- -¿-tokoferylacetat per kg.

Det blandade fodret pressades till pellets. Vid en genomsnitt- lig daglig ranson av 6,8 kg foder per djur tillför detta foder ca 300 mg A-28086, faktor A per djur per dygn.

Exempel 2.

Nötkreatursfoder, innehållande A-28086, faktor D Ettavvägt,spannmålsrikt nötkreatursfoder framställdes enligt följande: Beståndsdel Finmalen majs Malda majskolvar Torkat alfalfamjöl, 17% protein Från skal. befriat sojabönmjöl, extraherat med lösningsmedel, 50% protein Rörsockermelass Karbamid A-28086, faktor D Dikalciumfosfat, foderkvalitet Kalciumkarbonat Natriumklorid 3 67,8 10 s 9,9956 5 0,6 0,0044 0,5 0,5 0,3 .Ei 1356 zoo 1oo 1 199,912 100,0 12,0 0,088 10,0 10,0 6,0 7905655-2 21 Beståndsdel å _kg Spårelementförblandning 0,03 0,6 Vitamin A och D2~förbl:ndning* 0,07 1,4 Vitamin E-förblandning 0,05 1,0 Kalciumpropionat 0,15 3,0 * Innehållande per kg: 4 400 000 I.E. vitamin A; 500 000 I.E. vita- min D2 och 850 g sojabönfoder försatt med 1% olja.

** Torkad majsdrav med lösligt material innehållande 44 000 I.E. d-&-tokoferylacetat per kg.

Det blandade fodret pressades till pellets. Vid en genomsnittlig daglig ranson av 6,8 kg foder per djur tillför detta foder ca 300 mg A-28086, faktor D per djur per dygn.

Claims (2)

7 905655 - 2 22 Patentkrav

1. Fodermedel ägnat att öka foderutnyttjningsgraden hos idiss- lare med utve lad vomfunktion, särskilt nötkreatur, k ä n n e - t e c k n a t a v att det per ton innehåller 1-30 g av en före- ning, som utgöres av antibiotikum A-28086, faktor A, antibiotikum A-28086, faktor D, en C2-C6-acylester av nämnda faktor A eller D, eller ett fysiologiskt accepterbart salt av nämnda faktor A eller D eller av nämnda ester, varvid antibiotikum A-28086, faktor A, är en förening som har ett infrarödabsorptionsspektrum enligt bif. fig. 1 och har struktur- formeln H: ïH ï//ï\\qÛ~Ch2~CHa H3 ï/ i: \_/ mi. t. /°\ H EZ. J. Zl. /°\ fö* \.,.;H H2 :Ha iHs - \\o o// Ha \\i// Ha \\3// H Ha Ha och varvid antibiotikum A-28086, faktor D, är en förening som har ett infrarödabsorptionsspektrum enligt bif. fig. 8 och har struk- /ïïï ïHa -ï -CHz~@Hs / i” \_/' turformeln I' Ha vi lß iriiílí: Å (tïs-.zf \ / å: 1% “ß *ß vw t' u Ha gH5 3 7905655 - 2 23

2. Användning av ett fodermedel enligt krav 1 för ökande av fo- derutnyttjningsgraden hos idisslare med utvecklad vomfunktion, sär- skilt nötkreatur, varvid djuren, när de utfodras med fodermedlet, oralt tillföres en propionatökande mängd av den angivna föreningen.