NO143030B - Fremgangsmaate for fremstilling av polyeter-antibiotikumblandingen a-28086 eller dens bestanddeler faktor a, faktor b og faktor d - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av polyeter-antibiotikumblandingen A-28086 eller dens bestanddeler faktor A, faktor B og faktor D, samt acylestere og salter derav. De antibiotiske stoffer er egnet som antibakteri-

elle, soppdrepende, antivirale, anti-pleuro-pneumonia-lignende organismer, anticoccicide, insekticide og acaricide midler og for økning av f6r-utnyttelsen hos drøvtyggere.

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er kjennetegnet ved at man dyrker Streptomyces aureofaciens NRRL 5758 eller Streptomyces aureofaciens NRRL 8092 i et dyrkningsmedium som inneholder assimilerbare kilder for karbohydrat, nitrogen og uorganiske salter under neddykkede, aerobe dyrkningsbetingelser, fulgt av separering av A-28o86-antibiotikumblandingen fra kulturmediet, og eventulet

isolering av A-28086 faktor A,

isolering av A-28086 faktor D, og/eller

isolering av A-28086 faktor B fra den separerte A-280 86-antibiotikumblandingen,

og, om ønsket, omdannelse av et således erholdt antibiotikum til en acylester eller et salt derav.

I US-patent nr. 3•857-9^8 beskrives en forbind-

else som har likhet med de forbindelser som fremstilles ifølge foreliggende oppfinnelse. Blandingen og faktorene i foreliggende oppfinnelse er imidlertid mer effektive med hensyn til å fremme næringsmiddel-utnyttelseseffektivitet hos pattedyr som har en utviklet vomfunksjon, hvilket fremgår ved tester som viser propionsyreproduksj on.

Antibiotikum A-28086 faktor A er et hvitt krystallinsk stoff når det krystalliseres fra aceton-vann, det er oppløselig i lavere alkoholer, dimetylformamid, dimetylsulfoksyd, etylacetat, kloroform, aceton og benzen, men bare svakt oppløselig i hexan, og er uoppløselig i vann, smelter ved 98-100°C, stivner på nytt og smelter igjen ved 195_200°C og har:

a) molvekt lik 7&4 målt ved spektrometri,

b) en omtrentlig elementærsammensetning på 66,69 prosent karbon, 9,85 prosent hydrogen og 23,10 prosent oksygen,

c) empirisk formel C 4^72^11' b63''1'6111^ vec* massespektrometri,

d) spesifikk dreining lik -54° (c=0,2, metanol) ved 25°C,

e) IR-absorpsjonsspektrum i kloroform med følgende tydelige absorpsjonsmaksima: 2.<8>5, 3.34, 5.83, 6.82, 7.22, 7.53 (svak), 7.78 (svak), 8,75 (sterk), 8.95 (sterk), 9.15, 9.5O (sterk), 9.55 (sterk), 9.6O, 9.85, 10.15, 10.45 og 10.70 (svak) mikron, f) i ultrafiolett-spektrum i etanol bare slutt-absorpsjon under 200 mp, g) et NMR-spektrum i deuterokloroform med følgende karak-teristika: $ 6. 01, 4.21, 4.11, 3.99, 3.89, 3.8O, 3.67,

3-<6>5, 3-57, 3-55» 2.<8>3, 2.76, <2.>74, 2.68, 2.66, 2.5<8,>

2.56, 2.30, 2.22, 2.17, 2.10, 2.05, 1.96, 1.90, 1.85,

1.70, 1.62, 1.60, 1.47, 1.39, 1.31, 1.25, 1.18, O.95,

0.93, 0.90, 0.88, 0.85, O.77, O.75, 0.73, 0.68 og 0.66 ppm,

h) en titrerbar gruppe med pK 3.-verdi 7>9 i 80 prosentig

vandig dimetylformamid,

i) karakteristisk røntgen-pulverdiffraksjonsmønster (Cu++-stråling, 1,5405 \ > nikkelfilter) med følgende gitteravstander'i Ångstrøm (d):

j) R^-verdi lik 0,24 ved tynnsjiktskromatografi på silikagel med solventsystem benzen-etylacetat (3=2), med Bacillus subtilis ATCC 6633 som påvisningsorganisme, k) de følgende R^-verdier på papir-kromatografiske systemer som fremgår nedenfor, med Bacillus subtilis ATCC 6633 som påvisningsorganisme:

1) en syrefunksjon som kan danne salt- og esterderivater og

m) minst en hydroksylgruppe som kan forestres,

samt Cg-Cg-acylesterderivater og deres fysiologisk brukbare salter.

Antibiotikum A-28086 faktor B er en hvit krystallinsk forbindelse når den krystalliseres fra aceton-vann, er oppløselig i lavere alkoholer, dimetylformamid, dimetylsulfoksyd, etylacetat, kloroform, aceton og benzen, men er bare svakt oppløselig i hexan og uoppløselig i vann og har:

a) et smeltepunkt på 150-153°C,

b) molvekt lik 762 bestemt ved høyoppløsningsmassespektro-metri, c) empirisk formel lik C^^O^ll' målt ved høyoppløsningsmasse-spektrometri, d) IR-absorpsjonsspektrum i kloroform med følgende tydelige absorpsjonsmaksima: 2.82, 3.3O, 5.77, 5.85, 6.80, 7.20, 7.50 (svak), 7.72 (svak), 7.80 (svak), 8.57 (sterk), 8.68, 8.9O (sterk), 9.10, 9.5O, 9.83 (sterk), 9.9O, 10.10, 10.17 (sterk), IO.43 (svak), 10.80 (svak), 11.20 (svak), 11.35 (svak), I<I.>73 (svak) og 12.03 (svak) mikron, a) et iakttatt absorpsjonsmaksimum i etanol i UV-spekteret ved 220 mu (E^m=l37>5, e-10,477). f) NMR-spektrum i deuterokloroform med følgende data: 47.20, 7.<0>9, 6.26, 6.15, 4.19, 4.12, 4-05, 3-95» 3-89. 3-78, 3-62,

3-59, 3-52, 3-48, 2.8i, 2.73, 2.63, 2.54, 2.52, 1.99, 1.91, 1.84, 1.71, 1.67, 1.64, 1.55, 1.43, 1.33, 1.18, 1.11, 0.96, O.94, O.9O, O.87, O.84, O.77, O.74 og 0.68 ppm,

g) R^-verdi lik O.42 ved tynnsjiktskromatografi på silikagel i benzen-etylacetat (3:2), med Bacillus subtilis ATCC 6633

som påvisningsorganisme,

h) de nedenstående R^-verdier ved papirkromatografi med Bacillus subtilis ATCC 6633 som påvisningsorganisme:

i) en syrefunksjon som kan danne salter og esterderivater,

j) to ketonrester og

k) minst en hydroksylrest,

samt deres fysiologisk anvendelige salter.

Antibiotikum A-28086 faktor D er et hvitt krystallinsk stoff krystallisert fra aceton-vann, oppløselig i metanol, etanol, dimetylformamid, dimetylsulfoksyd, etylacetat, kloroform, aceton og benzen, men bare svakt oppløselig i hexan og uoppløselig i

vann, med smeltepunkt 96-98°C og hai':

a) molvekt lik 778 målt ved høy-oppløsningsmassespektrometri, b) omtrentlig elementærsammensetning på 67,59 prosent karbon, 9,38 prosent hydrogen og 22,77 prosent oksygen, c) empirisk formel lik c/^/^- j^ Gii målt ved høy-oppløsnings-massespektrometri, d) spesifikk dreining lik -56<0> (c=0,l, metanol) bestemt ved 25°C, e) IR-spektrum i kloroform med følgende absorpsjonsmaksima: <2.8>9, 3-39, 3-43» 3-50, 5-88, 6.90, 7.27, 7-6o, 7-84, 9-<00,>

9.26, 9.62, IO.3I, IO.58, 11.10 og H.49 mikron,

f) ingen observerbar UV-absorpsjon i 95 prosentig etanol,

g) NMR-spektrum i kloroform med følgende data: & 6.00, 4-20, 4.10, 4.00, 3.98, 3.92, 3.86, 3.83, 3.79, 3.<6>7, 3.64, 3.57, 3.54, 2.88, 2.81, 2.71, 2.62, 2.58, 2.48, 2.43, 2.37, 2.29, 2.21, 2.15, 2.10, 2.04, I.97, I.89, I.83, 1.76, 1.68, i.6l, I.58, 1.55, 1.47, 1.39, 1.30, 1.25, I.18, O.95, O.90, 0.88, O.84, O.74 og 0.68 ppm, h) en titrerbar gruppe med pK cl-verdi lik 8.67 i 80 prosentig vandig dimetylformamid, i) karakteristisk røntgen-diffraksjonsmønster (Cu -bestråling, 1,5405 X , nikkelfilter) med følgende gitteravstander i Ångstrøm (d): j) de følgende R^-verdier ved silikagel-tynnsjiktskromatografi med Bacillus subtilis ATCC 6633 som påvisningsorganisme : k) følgende R^-verdier i papirkromatografi-systemer som angitt nedenfor, med Bacillus subtilis ATCC 6633 som påvisningsorganisme:

1) syrefunksjon som kan danne salter og esterderivater og

m) minst en hydroksylgruppe som kan forestres,

samt Cr) - Cg-acylester-derivater og deres fysiologisk anvendelige ■■■ salter.

Selv om man kjenner mange antibakterielle midler idag er det stadig behov for nye og forbedrede antibiotika. Et problem ved aktuell antibiotisk terapi er at antibiotikaene har forskjellig effektivitet mot patogene organismer. Et annet problem er utvik-lingen av organismearter som er resistente overfor vanlige antibiotika.

Ennå et problem består i at enkelte pasienter ofte har alvorlige reaksjoner overfor spesielle antibiotika på grunn av hypersensitivitet og/eller giftvirkninger. På grunn av disse problemer ved den kjente behandling er det stadig behov for nye antibiotika.

I tillegg til etterspørselen for nye antibiotika

som er egnet for behandling av sykdommer hos mennesker, søker man også forbedrede antibiotika innen veterinærområdet. Som en viktig side behøves forbedrede antibiotika til befordring av veksten hos fjørkre og kveg. Man oppnår f.eks. forbedret vekst-ved å redusere sykdommene og øke forutnyttigsgraden.

En velkjent sykdom av økonomisk betydning for vete-rinærvitenskapen, mer spesielt fjørkreindustrien, er protozo-sykdommen coccidiosis. Coccidiose er et resultat av infeksjon med en eller flere arter av slekten Eimeria eller Isospora (se Lund og Farr i "Diseases of Poultry" (Fjørkresykdommer) 5« utg-Biester og Schwarte, Eds., Iowa State University Press, Ames, Ia., I965, s.IO56-IO96). På grunn av de store økonomiske tap som skyldes coccidiose og ulempene forbundet med enkelte kjente coccidiose bekjempende midler, fortsetter forskningen etter bedre anticoccidiose midler.

Enteritis er en annen sykdom som kan forårsake

store tap for husdyreiere. Enteritis forekommer hos høns, griser, kveg og sauer og skyldes hovedsakelig anaerobe bakterier, særlig Clostridium perfringens, og virus. Enterotoksemi hos drøvtyggere, et eksempel er "forspisningssykdom" hos sauer, er en tilstand som forårsakes av C. perfringens-infeksjon.

Vekstbefordring hos drøvtyggere som kveg- er et

annet økonomisk fordelaktig objekt for veterinærvitenskap. Av særlig interesse er vekstbefordring som oppnås ved øket forut-nyttelse. Mekanismen for utnyttelse av den hovedsakelige nærings-masse (karbohydrater) for kvegfor er vel kjent. Mikroorganismer i dyrets rumen nedbryter karbohydratene til monosaccharider og omdanner disse monosaccharider til pyruvatforbindelser. Pyruvater metaboliseres ved mikrobiologiske prosesser til acetater, butyrater eller propionater, samlet kjent som flyktige fettsyrer

(volatile fatty acids = VFA). En mer detaljert diskusjon er beskrevet av Leng i "Physiology of Digestion and Metabolism in the Ruminant", Phillipson et al., Eds., Oriel Press, Newcastle-upon-Tyne, England, 1970, s. 408-410.

Den relative VFA-utnyttingsgrad omtales av McCullough i "Feedstuffs", 19. juni I97L, s. 19, Eskeland et al. i J. An. Sei. 33, 282 (I97D og Church et al. i "Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants", bind 2, 1971 > s. 622 og 625. Selv om acetater og butyrater utnyttes, utnyttes propionater med større virknings-grad (effektivitet). Når det er tilgjengelig for lite propionat, kan dyrene dessuten utvikle 'ketosis. En gunstig forbindelse vil derfor stimulere dyrene til å produsere en høyere andel propionater fra karbohydratene, hvilket øker karbohydrat-utnyttelsesgraden og reduserer ketose-anfallene.

Antibiotikum A-28086 faktor A, B og D er nye medlemmer av en gruppe polyeter-antibiotika. Eksempler på

andre forbindelser innen denne gruppen er monensin (U.S.

patent 3«501«5^8)> dianemycin (R.L. Hamill, M.M. Hoehn,

G.E. Pittenger, J. Chamberlin og M. Gorman J. Antibiotics 22,

l6l (1969)), nigericin (L.K. Steinrauf, Mary Pinkerton og J.W. Chamberlin, Biochem. Biophys. Res. Comm. 33 29 (1968))

og salinomycin (japansk patent 47-<2>5392, (1972), ansøkning nr. I962O/197I, Derwent nr. 7696OT, U.S. patent 3.857.948,

og H. Kinashi, N. Otake, H. Yonehara, 3. Sato og Y. Saito, Tetrahedron Lett. 49, 4955-495<8> (1973).

Betegnelsen "antibiotikumkompleks" som benyttes innen fermenteringsområdet og i foreliggende beskrivelse refererer seg ikke til noe kjemisk kompleks, men en blanding av samproduserte, enkelte antibiotiske faktorer. Som fagfolk innen antibiotisk produksjon ved fermentering vil forstå, er forheldet mellom enkeltfaktorer som produseres i et antibiotisk kompleks variabelt og avhengig av de anvendte fermenteringsforhold.

A-28o86-komplekset produseres ved å dyrke den nye arten av Streptomyces aureofaciens NRRL 5758 under neddykket aerob fermentering inntil det er produsert en vesentlig mengde antibiotisk aktivitet. A-28o86-antibiotikumkompleks kan også fremstilles ved å dyrke ennå en annen type av Streptomvces aureofaciens, NRRL 8092. Produsert ved hjelp av enten S. aureofaciens NRRL 5758 eller S. aureofaciens NRRL 8092, ekstraheres A-2d086-antibiotikumkomplekset fra fermenteringsblandingen og fra mycelet med polare organiske oppløsningsmidler. Den ekstraherte antibiotiske blanding blir deretter separert ved å konsentrere oppløs-ningsmidlene, tilsette konsentratene til overskudd av petroleter for å utfelle forurensninger, filtrere og inndampe filtratene for fremstilling av A-28086-antibiotikumblandingen. Den antibiotiske blanding blir videre renset og separert til enkeltfaktorer ved kolonnekromatografering.

A-28086-forbindelsene inhiberer veksten av organismer som er patogene for dyre- og planteliv. Som en side av denne inhiberingsaktivitet er A-28086-forbindelsene anticocci-cider. I tillegg er A-28o86-forbindelsene antibakterielle, antivirale, anti-PPLO (pleuropneumonia-lignende organismer), insekticide og acaricide midler og øker forutnyttelsen hos drøvtyggere.

De følgende IR-absorpsjonsspektra i kloroform er gjengitt på figurene:

Figur 1 - Antibiotikum A-28086 faktor A

Figur 2 - Antibiotikum A-28086 faktor B

Figur 3 - Antibiotikum A-28086 faktor A, acetyl esterderivat. Figur 4 - Antibiotikum A-28086 faktor A, propionyl esterderivat Figur 5 - Antibiotikum A-28086 faktor A, butyryl- esterderivat Figur 6 - Antibiotikum A-28086 faktor A, valeryl- esterderivat Figur 7 - Antibiotikum A-28086 faktor A, caproyl esterderivat Figur 8 - Antibiotikum A-28086 faktor D

A-28086-faktorene har strukturell sammenheng med hverandre. Minst fire antibiotiske faktorer produseres samtidig under forgjæringen og fås som en blanding. Faktorene separeres og faktor A, B og D isoleres som enkeltforbindelser, som i det følgende skal beskrives. Blandingen av A-28086-faktorer er opp-løselig i de fleste organiske oppløsningsmidler, men uoppløselig i vann.

De følgende avsnitt beskriver de fysikalske og spek-trale egenskaper for A-28086 faktor A, B og D.

Antibiotikum A-28086 faktor A krystalliserer fra aceton-vann. A-28086 faktor A smelter ved 98-100°C, stivner igjen og smelter på nytt ved 195-200°C. Elementæranalyse for faktor A ga følgende midlere prosentsammensetning: karbon lik 66,69 prosent, hydrogen lik 9>85 prosent, oksygen lik 23,10 prosent. Den empiriske formel foreslått for faktor A er 640^72^11*

Faktor A har en tilsynelatende molvekt på 764> målt

ved massespektrometri.

IR-spektret for faktor A i kloroform er vist på fig.

1 av de vedlagte figurer. Man iakttar følgende absorpsjonsmaksima: 2.85, 3.34, 5.83, 6.82, 7.22, 7.53 (svak), 7.78 (svak), 8.75 (sterk), 8.95 (sterk), 9.<1>5, 9.5O (sterk), 9.55 (sterk), 9.6O, 9.85, 10.15, IO.45 °g 10.70 (svak) mikron.

UV-spektrum for faktor A i etanol viser bare endeabsorpsjon under 220 mp..

NMR-spektret for A-28086 faktor A i deuterokloroform viste følgende egenskaper: & 6.01, 4.21, 4.11, 3.99, 3.89, 3.80, 3.67, 3.65, 3.57, 3.55, 2.83, 2.76, 2.74, 2.68, 2.66, 2.58, 2.56, 2.30, 2.22, 2.17, 2.10, 2.05, I.96, I.90, I.85, I.70, 1.62, 1.60, 1.47, I.39, I.3I, 1.25, 1.18, O.95, O.93, 0.90, 0.88, O.85, O.77, °«75» °' 73> 0-68 og 0.66 ppm.

Antibiotikum A-28086 faktor A krystallisert fra aceton-vann har følgende karakteristiske røntgendiffraksjonsmønste-re (Cu<++->bestrålning, 1,5405 \ , nikkelfilter, d = gitteravstand i Angstrøm):

Den spesifikke dreining for antibiotikum A-28086 faktor A er -54° (c=0,2, metanol) målt ved 25°C. Denne spesifikke dreining er en middelverdi basert på flere målinger.

Elektrometrisk titrering av faktor A i 80 prosentig vandig dimetylformamid viser nærvær av en titrerbar gruppe med pK cl-verdi lik 7.9.

Antibiotikum A-28086 faktor A er oppløselig i en rekke organiske oppløsningsmidler som metanol, etanol, dimetylformamid, dimetylsulfoksyd, etylacetat, kloroform, aceton og benzen, men er bare svakt oppløselig i nonpolare organiske oppløs-ningsmidler som hexan og er uoppløselig i vann.

Antibiotikum A-28086 faktor A har en syrefunksjon som kan danne salter og esterderivater og minst en hydroksylgruppe som kan forestres.

På basis av de ovennevnte fysikalske egenskaper

kan det foreslås en struktur for antibiotikum A-28086 faktor A. Siden denne struktur bare postuleres,skal det imidlertid forstås at denne struktur bare presenteres som en arbeidshypotese. Den foreslåtte struktur for A-28086 faktor A er vist i formel I:

Antibiotikum A-2o086 faktor B er et hvitt krystallinsk stoff (fra aceton-vann) som har et smeltepunkt på ca. 150-153°c«

Målt ved høyopptøsningsmassespektrometri har faktor B en tilsynelatende molvekt lik 762 og en foreslått empirisk formel lik <c>43<h>70<o>i;l.

IR-spekteret for faktor B i kloroform fremgår av figur 2. Man får følgende "absorpsjonsmaksima: 2.82, 3*30, 5-77> 5.85, 6.80, 7.20, 7.5O (svak),"7.72 (svak), 7.80 (svak), 8.57 (sterk), 8.68, 8.9O (sterk), 9.10, 9.5O, 9.83 (sterk), 9.90, 10.10, 10.17 (sterk), 10.43 (svak), 10.80 (svak), 11.20 (svak), II.35 (svak), 11.73 (svak) og 12.03 (svak) mikron.

Ultrafiolett-spekteret for faktor B i etanol viser et absorpsjonsmaksimum ved 220 mu (E^m = 137,5, £=10.477-).

NMR-spekteret for A-28086 faktor B i deuterokloroform viste følgende egenskaper: 7.20, 7.O9, 6.26, 6.15, 4.I9, 4.12, 4.<0>5, 3-95» 3-<8>9, 3-7<8,> 3-62, 3.59, 3.5<2,> 3-4<8,><2.81,><2.>73, 2.63, 2.54, 2.52, 1.99, 1.91, 1.84, 1.71, 1-67, 1.64, 1-55, 1-43, <1>.33, 1.18, 1.11, O.96, O.94, 0.90, O.87, O.84, O.77, O.74 og 0.68 ppm.

Antibiotikum A-28086 faktor B er oppløselig i flere organiske oppløsningsmidler som f.eks. metanol, etanol, dimetylformamid, dimetylsulfoksyd, etylacetat, kloroform, aceton og benzen, men bare svakt oppløselig i upolare organiske oppløs-ningsmidler som hexan og er uoppløselig i vann.

Selv om den kjemiske struktur for A-28086 antibiotikum faktor B ikke er fremsatt, tyder de fysikalsk-kjemiske data som er tilgjengelige på at faktor B har en enkelt karboksylsyre-rest, to ketonrester og en eller flere hydroksylrester.

Antibiotikum A-28086 faktor D forekommer i mindre mengde når blandingen produseres av S. aureofaciens NRRL 5758, men når den produseres av S. aureofaciens NRRL 8092 er imidlertid A-28086 faktor D tilstede i mengder på opptil 10 % av den opparbeidede antibiotiske aktivitet.

Antibiotikum A—28086 faktor D er et hvitt krystallinsk stoff (fra vann-aceton) med et smeltepunkt på ca. 96-98°C. A-28086 faktor D har en tilsynelatende molvekt på

778 målt ved høy-oppløsningsmassespektrometri.

Elementærsammensetningen for toppen i massespekteret for natriumsaltet av A-28086 faktor D ble målt til 800,5050

(beregnet for C^H^O^Na = 800,5050). I massespekteret for A-28086 faktor D som fri syre fikk man en mindre topp ved 778 og en større topp ved 760,5117 (beregnet for C^H-^O^ <=> 760,5125). ^ 76O i massespekteret for den frie syre skyldes vanntapet fra molekyl-ionet. Molekyl-ion-sammensetningen for A-28086 faktor D som fri syre er derfor C^My/jOn*

Den empiriske formel som foreslås for A-28086 faktor D er C^Hr^O-Q. Elementæranalyse for faktor D ga følgende prosentvise sammensetning: karbon 67,59 prosent, hydrogen g,38 prosent, oksygen 22,77 prosent.

Den teoretiske prosentvise sammensetning for C/j^H^O-q er: karbon 67,87 prosent, hydrogen 9j51 prosent, oksygen 22,77 prosent.

IR-spekteret for A-28086 faktor D (figur 8) inneholder følgende observerbare absorpsjonsmaksima: 2.89, 3*39» 3*43» 3.50, 5.88, 6.90, 7.27, 7.60, 7.84, 9.00, 9.26, 9.62, 10.31, IO.58, 11.10, og 1<1>.49 mikron.

A-28086 faktor D viser i 96 prosentig vandig etanol

ingen ultrafiolett absorpsjon.

Det kjernemagnetiske resonans-spektrum for A-28086 faktor D i deuterokloroform viste følgende verdier: 6 6.00, 4«20, 4.<1>0, 4.0<0>, 3.98, .3.92, 3.<8>6, 3.<8>3, 3.79, 3-67, 3-<6>4, 3-57, 3.54» 2.88, 2.81, 2.71, 2.62, 2.58, 2.48, 2.43, 2.37, 2.29, 2.21, 2.15, 2.10, 2.04, 1.97, I.89, I.83, 1.76, 1.68, 1.61, 1.58, 1.55, 1.47, <1>.39, 1.30, 1.25, I.18, O.95, 0.90, 0.88,. O.84, O.74 og 0.68 ppm.

Antibiotikum A-28086 faktor D krystallisert fra aceton-vann har følgende karakteristiske røntgendiffraksjons-mønster (Cu -stråling, 1,5405 A > nikkelfilter, d = gitteravstand i Ångstrøm):

Den spesifikke dreining for antibiotikum A-28086-faktor D er -56<0> (c=0,l, metanol), målt ved 25°C.

Elektrometrisk titrering av A-28086 faktor D i

80 prosentig vandig dimetylformamid viste nærvær av en titrerbar gruppe med pK cl-verdi lik 8,67.

Antibiotikum A-28086 faktor D er oppløselig i flere organiske oppløsningsmidler som metanol, etanol, dimetylformamid, dimetylsulfoksyd, etylacetat, kloroform, aceton og benzen. A-28086 faktor D er bare svakt oppløselig i upolare organiske oppløsningsmidler som hexan og er uoppløselig i vann.

Antibiotikum A-28086 faktor D har en syrefunksjon som kan danne salter og esterderivater, og minst en hydroksylgruppe som kan forestres.

Basert på de fysikalske egenskaper som er nevnt, kan man foreslå en struktur for antibiotikum A-28086 faktor D. Siden denne struktur bare postuleres, vil man imidlertid forstå at den bare danner en arbeidshypotese. Den foreslåtte struktur for

A-28086 faktor D er vist ved formel II:

hvor enten: R-^ = CH^ og R^ = C^^-^

eller: R± = og R2 = CH^

Rf-verdiene for antibiotikum A-28086 faktor A, B og D ved forskjellige papir-kromatografiske systemer, med Bacillus subtilis ATCC 6633 som påvisningsorganismer, fremgår av tabell I.

I tabell II angis Rf-verdier for^åfåtibiotikum A-28086 faktor A, B og D i to tynnsjiktskromatografiske systemer på silikagel (forbelagte plater, "F-25V, sjikttykkelse lik 0,25 mm), med B. subtilis ATCC 6633 som påvisningsorganisme .

En annen forbindelse som tilfeldig betegnes A-28086-I produseres sammen med antibiotikum A-28086-kompleks. Selv om

Å-28o86-I ikké^^^jkikrobiologisk aktiv, er den struktur-beslektet med'.A-28086 antibiotikum-faktorene. A-28086-I er en hvit krystallinsk forbindelse (fra aceton-vann) og har et smeltepunkt på ca. •l60-l62°C. Sammenligninger mellom NMR-spektra og andre egenskaper for A-28086-I og syntetisk fremstilt A-28086 faktor A-T..métylester tyder på at A-28086-I er metylesteren av A-28086 • faktor A eller en nær beslektet forbindelse, eksempelvis en stereoisomer.. '■• 0.^S'elv om A-28086-I til å begynne med felles ut sammen med-de akfcJ^eKjL-28086 antibiotikum-f aktorer, skilles den lett fra ".dem. ved s^r^^^felkromatograf ering. A-28086-I har en omtrentlig :>';R;^.-verdi på^^^p. ved silikagel-tynns jiktskromatograf i med etyl-i;- acetat som'^é^|<:>ringsmiddel og med vanillin-dus jréagens (3 % vanil-•'"lin.'i metanol0,5 ml konsentrert I^SO^ pr. 100 ml oppløsning) for- påvisning, ;'Etter dusjing med vanillin og oppvarming gir -;.A-28o86-I en blå flekk mens A-28086-faktorene gir lyse rosa flek-ker som hurtig b^-frVnørkt brunblå. Antibiotikum A-28086 faktor A, B og D og de spesi-fiserte acylesterderivater av faktor A og D kan danne salter. "Fysiologisk anvendelige" salter er salter som også er farmasøy-tisk anvendelige-, dvs. salter hvis giftighet som helhet overfor varmblodige dyr ikke økes i forhold til den saltfrie form. Re-presentative og3 egnede alkalimetall- og jordalkalimetallsalter av A-28086 faktor A og B er natrium-, kalium-, litium-, cesium-, 'rubidium-, barium-, kalsium- og magnesiumsalter. Egnede amin- ']/ salter, av A-28086^f aktor A 'og B omfatter ammoniumsalter og det '".'.primære, sekundære og tertiære C j-C^-alkylammonium- og hydroksy-Cg-C^-^lkylammoniumsalter. Illustrerende aminsalter omfatter .'. salter dannet ved omsetning av A-28086 faktor A og B med ammonium-' hydroksyd, metylamin, sek.-butylamin, isopropylamin, dietyl-.amin,';:. diisopropylamin, etanolamin, trietylamin, 3-amino-l-propanol og-lignende. Alkalimetall- og jer dalkalimetall-kationsaltene av A-280<*>8.6 faktor A, B og D og av faktor A og D som acylesterderi-• vater, fremstilles som/kjent for syntese av kationsalter. F.eks. 'pppiøses den .f-.ri^.. syref orm av antibiotikum-f aktoren eller-dens r.resterderivWfr^i^et egnet oppløsningsmiddel som varm metanol eller "etanol, en oppløsning som inneholder den støkiometriske mengde

. av-den ønskede uorganiske base i vandig metanol tilsettes opp-

il: :

løsningen. Det dannede saltet kan isoleres ved rutinemetoder, f.eks. filtrering eller inndamping av oppløsningsmidlet.

Salter dannet med organiske aminer kan fremstilles på lignende måte. F.eks. kan det gassformige eller flytende amin settes til en oppløsning av antibiotikum-faktoren i en egnet oppløsning som aceton og oppløsningsmidlet og amin-overskuddet kan fjernes ved inndamping.

Det er vel kjent på veterinærområdet at den formen som antibiotikumet gis i ikke er av betydning når et dyr behandles. I de fleste tilfelle vil forholdene i dyret forandre stoffet til andre former enn administrasjonsformen. Den saltformen som benyttes på antibiotikumet er derfor uten betydning for be-handlingsmetoden. Man kan imidlertid velge en spesiell saltform av økonomiske, fremstillings- eller giftighets-grunner.

A-28086 faktor A danner acylesterderivater. For-estring skjer ved en av hydroksylgruppene for A-28086 faktor A ved behandling med et C2-Cg-syreanhydrid eller -syreklorid. Slike estere fremstilles typisk ved å omsette A-28086 faktor A med f.eks. det tilsvarende syreanhydrid ved romtemperatur. Disse esterderivater er også egnede som antibiotika og som midler som øker forutnyttingsgraden.

De følgende avsnitt beskriver de karakteristiske egenskaper for disse A-28o86-faktor A-acylesterderivater.

A-28086 faktor A som acetylesterderivat er en hvit krystallinsk forbindelse (fra aceton-vann) med et smeltepunkt på 100-103°C. A-28086 faktor A-acetylesterderivat har en empirisk formel lik C^<Hy>^<O>-^ og en molvekt på ca. 807 basert på den empiriske formel foreslått for A-28086 faktor A. Elementæranalyse av faktor A-acetylesterderivat ga følgende prosentvise sammensetning:

Beregnet for C^H^O^: C 66,97, H 9,24, 0 23,79

Funnet: C 67,67, H 8,71, 0 23,13

IR-spekteret for A-28086 faktor A som acetylesterderivat i kloroform er vist på figur 3. Man får følgende absorpsjonsmaksima: 2.85, 3.3<6,> 3.38 (sterk), 5.8O, 6.83, 7.25, 7.52 (sterk), 7.6O (svak), 7.8O (sterk), 8.45 (sterk), 8.80 (sterk), 8.95 (sterk), 9.10 (sterk), 9.20, 9.63, 9.8O (sterk), 10.12 (svak), 10.25 (svak) og 10.50 mikron.

Ultrafiolettspekteret for A-28086 faktor A som acetylester i etanol viser bare endeabsorpsjon.

Elektrometrisk titrering av A-28086 faktor A-acetylesterderivat i 80 prosentig vandig dimetylformamid tyder på nærvær av en titrerbar gruppe med pK 3.-verdi lik 8,5.

A-28086 faktor A-propionylesterderivat er et hvitt krystallinsk stoff (fra aceton-vann) med et smeltepunkt på °/6-98°C. A-28086 faktor A som propionylesterderivat har en empirisk formel C45H75O12°& en m°lekylvekt på ca. 821 basert på den empiriske formel som er foreslått for A-28086 faktor A. Elementæranalyse for faktor A-propionylesterderivat ga følgende prosentsammensetning:

Beregnet for C^H^O-^: C 67,29, H 9>33> 0 23,38

Funnet: C 66,06, H 9,17, 0 23,41

IR-spekteret for A-28086 faktor A-propionylesterderivat i kloroform er vist på figur 4« Man får følgende absorpsjonsmaksima: 2.85, 3.33, 3.38 (sterk), 3.45 (<s>terk), 5.75 (sterk), 5.82, 6.8l, 7.22, 7.3O (sterk), 7.5O (svak), 7.60 (svak), 7.8O, 8.43, <8>.75 (sterk), 8.9O, 9.O5, 9.15 (sterk), 9.5O (sterk), 9.63, 9.83 (svak), 10.05 (sterk), 10.13, 10.20 (sterk), 10.45 og 10.68 mikron.

Ultrafiolett-spekteret for A-28086 faktor A-propionylesterderivat i etanol viser bare endeabsorpsjonen.

Antibiotikum A-28086 faktor A som butyrylester-derivat er et hvitt krystallinsk stoff (fra aceton-vann) med et smeltepunkt på 96-98°C. A-28086 faktor A-butyrylester-derivat har en empirisk formel lik O^yH^gO-^, en molvekt lik ca. 835 og en omtrentelig sammensetning C 67,60 prosent, H 9,41 prosent, 0 22,99 prosent, beregnet ut fra den empiriske formel foreslått for A-28086 faktor A.

Infrarødt-spekteret for A-28086 faktor A som butyryl-esterderivat, i kloroform, er vist på figur 5, og man iakttok følgende absorpsjonsmaksima: 2.89, 3.4O, 3.45, 3.5I, 5.85, 5.92 (sterk), 5.97 (sterk), 6.9O, 7.3O, 7.84 (svak), 8.55, 8.85 (svak), 9.01 (sterk), 9.26, 9.76, 9.95, 10.31 og 10.64 mikron.

Antibiotikum A-28086 faktor A-valerylesterderi-

vat er et hvitt krystallinsk stoff (fra aceton-vann) med et smeltepunkt på 173-175°^. A<->2S086 faktor A som valerylester-

derivat har en empirisk formel lik C48H8o°12' en molvekt Pa ca* 849 og en omtrentlig sammensetning C 67,89 prosent, H 9,5° prosent, 0 22,6l prosent, beregnet fra den empiriske formel foreslått for A-28086 faktor A.

Infrarødt-spekteret for A-28086 faktor A som vale-rylesterderivat, i kloroform, fremgår av figur 6. Man får følgende absorpsjonsmaksima: 2,90, 3.4O, 3.45» 3-51» 5«87, 5*9<2 >(sterk), 5.99 (sterk), 6.9<1>, 7.3O, 7.69 (svak), 7.87 (svak), 8.16, 8.58, 8.85 (svak), 9.26, 9.76, 10.00 (svak), 10.31 og IO.64 mikron.

Antibiotikum A-28086 faktor A-caproylesterderivat er en hvit krystallinsk forbindelse (fra aceton-vann) med et smeltepunkt på l63-l6"7°C. A-28086 faktor A-caproylesterderivat har en empirisk formel lik C40^32^12' en m°lvekt Pa ca* 863 og en omtrentlig sammensetning C 08,18 prosent, H 9i5^ prosent, 0 22,24 prosent, beregnet ut fra den empiriske formel som er foreslått for A-28086 faktor A.

Infrarødt-spekteret for A-28086 faktor A-caproylesterderivat i kloroform er vist på figur 7« De følgende ab-sorps jonsmaksima kan iakttas: 2.9O, 3.4O, 3.45, 3.51, 5.<8>7, 5.92 (sterk), 5.97 (sterk), 6.9O, 7.3O, 7.66 (svak), 7.84 (svak), 8.16, 8.58, 8.85 (svak), 9.O5 (sterk), 9.17, 9.72, 9.95, 10.29, og 10.62 mikron.

Acylering av A-28086 faktor A gir de følgende for-andringer i <1>H-NMR-spektrum: earbinyl-resonansen som forekom ved ca. 4 PPm forskyves ned i feltet til ca. 5,3 PP<m> (den nøy-aktige stilling varierer noe i de forskjellige acylderivater), og vinyl-protonsignalene skifter også stilling. Dette er karakteristisk for den forandring som finner sted i partial-strukturen ved:

hvor R betegner Cj-C^-alkyl.

Denne delstruktur er i full overensstemmelse med 1 H-homonukleære avspaltingseksperimenter og <19->'C-kjernemagnetiske data fra acetyl- og propionylesterderivatene.

<C>2<-C>g-acylesterderivater av A-28086 faktor A er oppløselige i en rekke organiske oppløsningsmidler som metanol, etanol, dimetylformamid, dimetylsulfoksyd, etylacetat, kloroform, aceton og benzen, men er bare litt oppløselige i upolare organiske oppløsningsmidler som hexan og er uoppløselige i vann.

Alle C2-Cg-acylesterderivater av A-28086 har en syrefunksjon som kan danne salter og esterderivater.

Som tidligere nevnt fremstilles polyeter-antibiotikumblandingen A-28086 eller dens bestanddeler faktor A,

faktor B og faktor D ved at man dyrker Streptomyces aureofaciens NRRL 5758 eller Streptomyces aureofaciens NRRL 8092 i et dyrkningsmedium som inneholder assimilerbare kilder for karbohydrat, nitrogen og uorganiske salter under neddykkede, aerobe dyrkningsbetingelser, fulgt av separering av A-28o86-antibiotikumblandingen fra kulturmediet, og eventuelt isolering av A-28086 faktor A, isolering av A-28086 faktor D, og/eller isolering av A-28086 faktor B fra den separerte A-28086-antibiotikumblandingen. Isoleringen foretas under anvendelse av i og for seg kjente isolerings- og renseteknikker.

En av de nye organismer som er egnet for fremstilling av A-28o86-antibiotika ble isolert fra en jordprøve oppsamlet på Ararat-fjellet i Tyrkia. Denne organismen klassifiseres som en stamme av Streptomyces aureofaciens Duggar som beskrevet av E.B. Shirling og D. Gottlieb i "Cooperatlve Description of Type Cultures of Streptomyces. III. Additional Species Descriptions from First and Second Studies," Intern. Bull. Systematic Bacteriol. l8, 279-392 (1968). Denne klassifisering er basert på metoder som anbefales for "International Streptomyces'Project" (E.B. Shirling og D. Gottlieb, "Methods for Characterization of Streptomyces species," Intern. Bull. Systematic Bacteriol. 16, 313-340 (1966)) sammen med visse tilleggsprøver. Det ble til-knyttet fargenavn i henhold til ISCC-NBS-metoden (K.L. Kelly og D.B. Judd, "The ISCC-NBS Method of Designating Color and a Dictionary of Color Names", U.S. Dept. of Commerce, Circ. 553» 1955, Washington, D.C.). Tallene i parentes refererer seg til Tresner og Backus-fargeserien (H.D. Tresner og S.J. Backus, "System of 'Color"Wheels for Streptomyces Taxonomy," Appl. Micro-biol. 11, 335-338), fargeregister-betegnelser er under-streket. Maerz og Paul-fargeblokker (A. Maerz og M.R. Paul, "Dictionary of Color," McGraw-Hill Book Co., Inc., New York, N.Y., 1950) er tatt med i parenteser, Kulturene ble dyrket ved 30°C

i fjorten dager hvor intet annet er oppført.

KARAKTERISERING AV A-28086-PRODUSERENDE STAMMER NRRL 5758 Morfologi

Sporulerende lufthyfer består av kroker, løkker

og åpne spiraler. Man fant også morfologi representativ for rectus flexibilis-typen. Sporene er korte og sylindriske og ligger i kjeder på 10-50 sporer. Sporene måler 1,3 x 1,75 y-

med et område på 1,3 til 1,95 x 1>3 V- Sporoverflaten, iakttatt ved elektronmikroskopering, er glatt.

NRRL 5758-orSanismen ble undersøkt med hensyn på bestemte fysiologiske egenskaper ifølge standardmetoder. De egenskapene som ble observert og de karakteristiske resultater av forsøkene var som følger:

Resultatene av karbonutnyttingsforsøk med organismen NRRL 5758 er oppført nedenfor. De symboler som er brukt for å betegne veksten er:

+ god vekst, positiv utnyttelse

(+) god til middels vekst

(-) svak vekst, sannsynligvis ingen utnyttelse

- ingen vekst, ingen utnyttelse

En annen ny A-28o86-produserende organisme ble av-ledet fra S. aureofaciens NRRL 5758 ved en serie av naturlige utvalg fulgt av kjemisk mutasjon. Denne organismen,. med iden-tifikasjonsbetegnelsen NRRL 8092 klassifiseres også som en stamme av Streptomyces aureofaciens Duggar. Denne klassifisering ble basert på studier av organismen NRRL 8092 ved hjelp av de tidligere nevnte Streptomyces-klassifiseringsmetoder og lignende vekst-betingelser. De karakteristiske egenskaper for organismen NRRL 8092 som er observert under disse forsøk, finnes i de følgende avsnitt.

KARAKTERISTIKK AV A-28086-PR0DUSERENDE STAMME NRRL 8092

Morfologi

På medium ISP P7 (tyrosin-agar) danner kulturen tilfeldige krokformer, men for det meste korte og rette sporo-forer. Sporekjedene er på under 10 sporer pr. kjede, vanligvis 4-7 sporer pr. kjede. Korte og rette sporekjeder ble iakttatt i følgende media: ISP P3, Czapek<*>s oppløsningsagar og ISP 65.

Man fant rikelig koremi på Emerson's agar. Undersøkelser under elektronmikroskop ble gjort på tyrosin-agar (ISP P7) °g glucose-asparagin-agar. Sporene er glatte og har en størrelse på 1,2 til 2,0 u i lengde og ca. 1,0 u i diameter. Midlere spore-størrelse er 1,6 x 1,0 u.

Dyrkingsegenskaper for NRRL 8092 på forskjellige dyrkingsmedia

Organismen NRRL 8092 ble også undersøkt for å finne bestemte fysiologiske egenskaper, etter standardmetoder. Man fant følgende egenskaper:

Resultater av karbonutnyttingsforsøk med organismen NRRL 8092 er oppført nedenfor. De anvendte symboler er som tidligere :

Visse egenskaper av A-28o86-produserende S. aureofaciens-stammer skiller seg fra egenskapene hos organismer beskrevet av Shirling og Gottlieb. Disse forskjeller er oppsummert i Tabell III:

De egenskaper hos organismen NRRL 5758 som skiller seg fra egenskapene for organismen NRRL 80°/2 er oppført i tabell

IV.

Streptomyces aureofaciens-kulturer som er egnet for produksjon av A-28o86-antibiotika er innlevert og lagret som en del av kultursamlingen i Northern Marketing and Nutrition Research Division, U.S. Dept. of Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois, 6l604, hvorfra de er tilgjengelige for offentligheten under lagringsbetegnelsene NRRL 5758 og NRRL 8O92.

Til dyrking av Streptomyces aureofaciens NRRL 5758 eller Streptomyces aureofaciens NRRL 8092 kan man bruke en rekke dyrkingsmedia. For å oppnå billigste produksjon, optimalt ut-bytte og lett produktisolering, foretrekkes imidlertid visse kulturmedia. F.eks. foretrekkes som karbohydratkilder ved produksjon i større målestokk tapioca-dextrin og sucrose, selv om glukose, maisstivelse, fructose, mannose, maltose, lactose og lignende også kan brukes. Maisolje, peanøttolje, soyabønneolje. og fiskeolje er andre brukbare karbonkilder. En foretrukket nitrogenkilde er enzym-hydrolysert kasein, selv om peptoner, soyabønnemel, bomullsfrømel, aminosyrer som glutaminsyre og lignende også er egnet. Blant uorganiske næringssalter som kan tilsettes kulturmediet nevnes de vanlige salter som leverer natrium, magnesium-, kalsium, ammonium, klorider, karbonater, sulfater, nitrater og lignende ioner.

Essensielle sporelementer som er nødvendig for vekst og utvikling av organismene bør også finnes i kulturmediet. Slike sporstoffer finnes vanligvis som forurensninger i andre bestanddeler i mediet i tilstrekkelige mengder til å oppfylle organi-smens .behov.

Det kan være nødvendig å tilsette små mengder (dvs. 0,2 ml pr. 1) av et antiskummiddel som polypropylenglycol ved dyrking i større målestokk hvis oppskumming blir et problem.

Selv om det ikke er nødvendig, vil antibiotikum-produksjon fra A-28o86-produserende Streptomyces aureofaciens-stammer påskyndes ved tilsetning av en liten mengde olje som soyabønneolje.

For fremstilling av større mengder av A-28086-antibiotika foretrekkes neddykket aerob fermentering i tanker. Små mengder av A-28o86-antibiotika kan fremstilles ved ryste-kultur i kolber. På grunn av den forsinkelse som oppstår ved antibiotika-fremstilling i forbindelse med inokulering av store tanker med sporeformen av organismen er det en fordel å benytte et vegetativt inokulum. Dette vegetative inokulum fremstilles ved å inokulere en liten mengde kulturmedium med sporeformen eller mycel-fragmenter av organismen for fremstilling av en frisk aktivt voksende kultur av organismen. Det vegetative inokulum overføres deretter til en større tank. Mediet som brukes for dyrking av det vegetative inokulum kan være det samme som benyttet til større fermenteringer, men andre media kan også tas i bruk.

A-28086-produserende organismer kan dyrkes ved temperaturer mellom ca. 20 og 4-0°C. Optimal produksjon av A-28086 synes å foregå ved temperaturer mellom 27 og 30°C.

Som vanlig ved aerob dykk-kultur gjennombobles steril luft gjennom kulturmediet. For effektiv organismevekst

-bør luftvolumet som -benyttes i tankfremstillingen fortrinnsvis være over 0,1 volumdel luft pr. volumdel kulturmedium pr. minutt. For effektiv fremstilling av A-28o86-antibiotika ligger luft-mengden som brukes under tankfremstilling fortrinnsvis på over 0,25 volumdeler luft pr. volumdel kulturmedium pr. minutt. Høyt

innhold av-oppløst oksygen undertrykker ikke antibiotika-produksjonen.

Antibiotika-produksjonen kan følges under fermen-teringen ved å ta ut prøver av dyrkingsblandingen eller ekstrak-ter av mycel-tørrstoffet og måle den antibiotiske virkning mot organismer som man vet er følsomme for disse antibiotika. En forsøksorganisme som er egnet for testing av antibiotika i • -henhold til oppfinnelsen er Bacillus subtilis ATCC 6633. Denne bio-prøve gjennomføres fortrinnsvis med papirskiver på agar-plater.

Startstrek-pH i det ikke-inokulerte dyrkingsmedium varierer med mediet. Generelt bør pH ligge mellom 6,0 og 7>5« Høstings-pH etter avsluttet fermentering er vanligvis noe høyere,

i området 6,5 til 8,0.

Generelt kan antibiotisk aktivitet påvises på fer-menteringens andre dag. Maksimal antibiotika-produksjon foreligger vanligvis ved mellom sjette og tiende dag.

Etter produksjon under neddykket aerob tilstand,

kan de nevnte A-28o86-antibiotika opparbeides fra dyrkings-

mediet ved hjelp av metoder som vanligvis benyttes på området. Antibiotika-aktiviteten som produseres ved fermentering av en A-28o86-produserende organisme finnes både i mycel-massen og i

det filtrerte medium. Maksimal opparbeidelse av A-28o86-antibiotika oppnås derfor ved en kombinasjon av metoder som inklu-derer filtrering, ekstrahering og adsorpsjonskromatografi. Et foretrukket oppløsningsmiddel for separasjon av A-28o86-antibiotika fra enten hele eller den filtrerte fermenteringsblanding er etylacetat, selv om andre vanlige oppløsningsmidler også kan være tilfredsstillende.

En spesielt gunstig metode for separasjon av

A-28086 faktor A, B og D er å senke pH i hele fermenterings-buljongen til ca. 3,0 pH. Ved pH 3,0 vil A-280.86 faktor A, B

og D med letthet kunne separeres fra mycel-massen ved filtrering.

En annen fordelaktig metode til separasjon av A-28086-rfaktorene består i å tilsette et bikarbonat som f.eks. natriumbikarbonat til hele dyrkingsblandingen i en mengde-på -ca.-ett gram -pri- -literi A-28o86-faktorene kan da på enkel måte skilles fra mycel-massen

i saltform. Metanol er et foretrukket oppløsningsmiddel for fra-skilling av antibiotika fra mycel-massen, men andre lavere alkoholer og ketoner kan også brukes.

I 4DUJU

Azeotrop-destillasjon kan med fordel tas i bruk ved opparbeidelse av A-28o86-antibiotika. Etter denne metoden tilsettes et organisk oppløsningsmiddel som danner en egnet azeotrop med vann til den vandige fermenteringsblanding. Denne blanding av oppløsningsmiddel og kulturmedium gjennomgår azeotropisk destillasjon for å fjerne minst halvparten av vannet fra kulturmediet og etterlater en vann-oppløsningsmiddel-blanding hvor A-28o86-antibiotika er oppløst i det organiske oppløsningsmiddel. Uoppløselige biprodukter kan separeres på enkle måter som filtrering eller sentrifugering. A-28o86-antibiotika kan da opparbeides frå den organiske oppløsning på kjent måte som f.eks. inndamping av oppløsningsmidlet, utfelling ved tilsetning av et non-solvent, eller ekstraksjon.

Organiske oppløsningsmjdLer som danner egnede azeo-troper med vann for gjennomføring av en slik utvinningsprosess er f.eks. butylalkohol, amylalkohol, hexylalkohol, benzylalkohol, butylacetat, amylacetat, 1,2-dikloretan, 3-Pentanon» 2-hexanon, benzen, cyklohexanon, toluen, xylener og lignende.

Det er en spesiell fordel ved å utvinne produktene ved azeotrop destillasjon ved fermentering i større målestokk. Både vann og oppløsningsmiddel som avdestilleres i azeotropen kan separeres etter kjente metoder og deretter resirkuleres og brukes på nytt. Det fjernede vannet er således fritt for forurensninger og krever ikke rensing. Oppløsningsmidlet kan som nevnt resirkuleres .

Ytterligere rensing av A-28086-antibiotika omfatter ekstraksjon og adsorpsjon. Adsorberende stoffer som silikagel, karbon, "Florisil <®>" (magnesiumsilikat) og lignende kan med fordel benyttes.

Alternativt kan de faste stoffer i kulturen, blant annet bestanddeler i mediet og mycelet, benyttes uten ekstraksjon eller separasjon, men fortrinnsvis etter at vannet er fjernet, som en kilde for A-28o86-antibiotika. F.eks. kan kulturen etter produksjon av A-28o86-aktivitet tørkes ved frysetørking og blandes direkte i en f6i»forblanding.

Etter produksjon av A-28o86-aktivitet i kulturmediet kan, som en annen utførelse av oppfinnelsen, mycelet separeres og tørkes til et produkt som kan brukes direkte i en forblanding til for. Når man separerer mycelet for slik bruk, vil tilsetning av kalsiumkarbonat (ca. 10 g/l) hjelpe til filtreringen og gir et forbedret tørket produkt.

Under de betingelser som hittil er beskrevet, vil Streptomyces aureofaciens-artene med betegnelsene NRRL 575^ og NRRL 8092 produsere antibiotikum A-28086 faktor A i overveiende mengde. Selv om forholdet mellom antibiotika-faktorene varierer avhengig av de benyttede fermenteringsforhold vil generelt faktor A utgjøre mer enn 99 prosent av den totalt opparbeidede antibiotika-aktivitet fra NRRL 575^ og ca. 90 prosent av den totale aktivitet fra NRRL 8092. A-28086 faktor B er ansvarlig for meste-parten av den gjenværende antibiotiske aktivitet fra NRRL 5758

og faktor D utgjør en mindre mengde. På den annen side "utgjør A-28086 faktor D ca. 8-10 prosent av den totalt utvunne antibiotiske aktivitet fra NRRL 8092 og faktor B er en mindre faktor.

Antibiotikum A-28086 faktor A, B og D skilles fra hverandre og isoleres som enkelte forbindelser ved hjelp av kjente metoder som kolonnekromatografering, tynnsjiktskromatografering,

og lignende. F.eks. brukes kolonnekromatografering på silikagel til separasjon av faktor A, B og D ved eluering av kolonnen med forskjellige solvent-blandinger som benzen-etylacetat. Med benzen-etylacetat-blandinger som elueringsmiddel på silikagelkolonner vil faktor B elueres først, og faktor A og D senere. Tynnsjiktskromatografi som beskrevet tidligere er en egnet metode til å følge elueringsprosessen.

A-28o86-forbindelsene inhiberer veksten av bakterier og sopp som er patogene for plante- og dyreliv. De relative mikrobiologiske aktiviteter for A-28086 faktor A og B er beskrevet i tabell V som følger.

. Forsøksmetoden var vanlig skivediffusjonsmetode

(6 mm skiver ble dyppet i oppløsninger inneholdende 1 mg forbindelse/ml oppløsning, skivene ble anbragt på agar-plater som inneholdt forsøksorganismene).

Som et viktig trekk inhiberer A-28o86-forbindelsene veksten av anaerobe bakterier. Den minimale hemmingskonsentra-sjon (minimal inhibitory concentrations = MIC) hvor A-28086-faktor A inhiberer forskjellige anaerobe bakterier, målt ved standard agar-fortynningsforsøk, er oppsummert i tabell VI. Endepunktene ble avlest etter 24 timers inbibering.

C2-Cg-acylesterderivater av A-28086 faktor A har

også antibakteriell og antifungal virkning. Som en side av oppfinnelsen hadde disse derivater øket gram-positiv virkning. Den relative gram-positive virkning for visse av disse derivater ble sammenlignet med virkningen av faktor A. Forbindelsene ble undersøkt ved turbidometriske forsøk på et halvautomatisert system ("Autoturb®" mikrobiologisk forsøkssystem fra "Elanco") beskrevet av N.R. Kuzel og F.W. Kavanaugh i J. Pharmaceut. Sei. 60 (5)>

764 og 767 (I97I). Under forsøk med A-28o86-antibiotika ble følgende forsøksparametere brukt: Staphylococcus aureus (H-Heatley) NRRL B-314 i næringsmedium (pH 7)j inkubert i fire timer ved

37°C. Forsøksforbindelsen og standardforbindelsen ble oppløst i metanol-vann (10:90). Standardprøven, A-28086 faktor A, ble fylt på Autoturb-karusellen i konsentrasjoner på 2, 3> 4 °g 5 mikrogram/ml. Forsøksforbindelsen ble fortynnet til å inneholde ca. 3 eller 4 mikrogram aktivitet pr. ml, i karusellen. De relative aktiviteter for forsøksforbindelsene, sammenlignet med aktiviteten for standardforbindelsene er oppført nedenfor:

Aktivitet mot Mycoplasma er en annen viktig side ved den antimikrobielle virkning for A-28o86-forbindelsene. Mycoplasma-arter, også kjent som pleuropneumonia-arter (PPLO)-organismer er patogene overfor mennesker og flere dyr. Forbindelser som er aktive mot PPLO-organismer er spesielt etter-søkt innen fjørkre-industrien. Minimal inhiberingskonsentrasjon (MIC) for antibiotikum A-28086 faktor A mot forskjellige Mycoplasma-arter, målt ved ih vitro-fortynnings-studier i dyrkings-miljø er oppsummert i tabell VII:

Oppløsninger som inneholder helt ned til 10 mikrogram antibiotikum A-28086 pr. milliliter oppløsning er nyttig for desinfeksjon av overflater for beskyttelse av dyrene mot forskjellige mycoplasma-arter.

A-28o86-forbindelser er også antivirale stoffer. A-28086 faktor A er aktiv mot type III poliovirus, vaccinia-virus, herpes-virus og Semliki Forest-virus, hvilket vises ved in vitro-forsøk med plate-inhibering, i likhet med metoden beskrevet av Siminoff, Applied Microbiology 3 (1), 66-72 (I96I). A-28086 faktor A er også aktiv mot overførbar Gastro-enteritis-virus, Newcastle-sykdom-virus, og mot Rhinotracheitis-virus, som forårsaker kveg-infeksjon, demonstrert ved lignende vevskultur-forsøk.

En A-28086-forbindelse gis oralt, topisk eller parenteralt til pattedyr for undertrykkelse av virus. Bruk-

bare doseringsnivåer for forebyggelse eller behandling av virus-sykdommer varierer fra ca. 1 til ca. 5 mg/kg kroppsvekt avhengig av virusen og om legemidlet skal brukes profylaktisk

eller terapeutisk.

Videre kan oppløsninger som inneholder en A-28086-forbindelse, fortrinnsvis sammen med et overflateaktivt middel, brukes til rensing av steder in vitro hvor virus som polio-

eller herpesvirus foreligger. Oppløsninger som inneholder fra ca. 1 til I5OO mikrogram/ml A-28o86-forbindelse er effektive for kontroll av virus-utbredelsen.

Den akutte toksisitet for antibiotikum A-28086 faktor A når den gis intraperitonealt til mus, uttrykt som LD50, er 7,15 mg/kg.

A-28o86-forbindelsene er også insekticider og acaricider. A-28o86-forbindelsene er aktive mot insekter som meksikansk bønnebille, melkeurt-lus og husflue og mot midd som dobbeltflekket edderkoppmidd i konsentrasjoner på helt ned til 500 ppm. Videre er A-28o86-forbindelsene virksomme mot moskito-larver helt ned til en ppm.

Anti-coccidia-virkning er en viktig egenskap hos A-28o86-forbindelser. F.eks. viser foreksperimenter at en A-28086-forbindelse, når den gis i foret til unge høner i innhold på ned til 0,003 prosent, befordrer vektøkning og helt ned til 0,005 prosent hindrer dødelighet og nedsetter antall lesjoner hos høns som er utsatt for coccidia. Resultater av forsøk med faktor A i høner som er utsatt for forskjellige Eimeria-arter fremgår av tabell VIII til X.

For profylakse eller behandling av coccidiosis

hos fjørkre administreres en giftfri mengde A-28o86-forbindelse til fugler, særlig oralt, på dagsbasis. A-28o86-forbindelsen kan gis på mange måter, men mest fordelaktig sammen med en fysiologisk bærer, fortrinnsvis foret som fuglene inntar. Selv om man må ta en rekke faktorer i betraktning når man skal bestemme den egnede konsentrasjon av A-28o85-forbindelse, vil administrasjons-mengden vanligvis være innenfor området 0,003 til 0,04 prosent av ubehandlet formengde, fortrinnsvis mellom 0,005 °g 0,02 prosent.

Evnen til å forbedre f6r-utnyttelsesgraden hos

dyr er en annen viktig egenskap for A-28086-forbindelser. F.eks. - vil A-28o86-forbindelser forbedre f6r-utnyttelsen hos drøvtyggere som har en utviklet rumenfunksjon.

Som tidligere omtalt økes effekten av karbohydrat-utnyttelsen hos drøvtyggere ved behandlinger som stimulerer dyrets rumenflora til å produsere propionatforbindelser heller enn acetat- eller butyratforbindelser. For-utnyttelsesgraden kan måles ved å observere produksjon og konsentrasjon av propionatforbindelser i rumen, ved hjelp av følgende metoder:

Man tapper rumenvæske fra en stut ved hjelp av en kirurgisk plassert kanyle som åpner inn i rumen. Stuten holdes på en rasjon som inneholder mye korn. En<*>prøve rumenvæske siles gjennom fire lag osteklede og filtratet oppsamles. Partikkel-bestanddelene som holdes tilbake av kledet suspenderes i til-strekkelig fysiologisk bufferoppløsning til at man oppnår det opprinnelige rumen-væskevolum og suspensjonen siktes igjen. Den anvendte buffer har følgende sammensetning:

som beskrevet av Cheng og medarbeidere i J. Dairy Sei. 38, 1225-1230 (1950).

De to filtrater slås sammen og hensettes til par-tikkelformede bestanddeler separerer ut på toppen. Det klare sjiktet skylles fra, fortynnes med samme buffer (1:1) og juste-res til mellom pH 6,8 og 7,0.

Den fortynnede rumenvæske (10 ml) anbringes i en 25 ml kolbe med 4-0 mg av ovenstående foring, ytterligere 1 mg soyabønneprotein og den forbindelse som skal prøves. Fire kolber benyttes pr. behandling. To sett på hver fire kontrollkolber brukes også. Man benytter en nulltids-kontrollprøve og en inkubert 16 timers-kontrollprøve. Alle forsøkskolber inku-beres 16 timer ved 38°C. Etter inkubering måles pH og 25 prosent metafosforsyre (2 ml) tilsettes hver kolbe. Prøvene hensettes til sedimentering og den overflytende væske analyseres ved gass-kromatografi for å finne mengden propionat-, acetat- og butyratforbindelser. Aktive forbindelser vil betraktelig øke propionat-produksjonen i forhold til kontrollprøvene.

Resultatene sammenlignes statistisk med kontroll-resultatene. Tabell XI viser forholdet mellom konsentrasjoner av flyktige fettsyrer i de behandlede kolber og konsentrasjonene i kontrollkolbene.

Den bedrede karbohydratutnyttingsgrad demonstreres videre ved in vivo-forsøk som utføres med dyr- som har installert avrenningsrør i rumen som gjør det mulig å ta ut prøver av rumen-innholdet.

De forsøk som er oppsatt i tabell XII er gjennom-ført med voksne stuter som veier ca. 450 kg og med plasserte av-tappingsrør til rumen. To stuter mottok normal foring og fire stuter innen hver behandlingsgruppe ble gitt en identisk diett tilsatt A-28086 faktor A. Til hver prøve (100 ml) rumenvæske tilsatte man 10 prosent metafosforsyre (100 ml). Prøvene ble satt til side, og den overflytende væske ble analysert ved gass-kromatografering for bestemmelse av propionsyrekonsentrasjonen.

Resultatene i tabell XII er midlere prosentvis økning i propionsyrekonsentrasjonen i rumen, utregnet som middelverdi av fem analyser over 14 dagers behandlingsperiode. Kontroll-dyrene hadde ca. 20 molprosent propionsyre.

Videre demonstrerte in vivo-forsøk at f6r-utnyttings-graden hos sauer øket med A-28086 faktor A som tilsetning. Resultater av disse forsøk som ble gjennomført i løpet av 56 dager er oppført i tabell XIII.

A-28086 faktor D-forbindelsene er antivirale forbindelser. A-28086 faktor D er aktiv mot Maryland B-virus, poliovirus type III, COE-virus, herpes-virus og Semliki Forest-virus, hvilket vises ved in vitro plate-inhibering, i likhet med metoden beskrevet av Siminoff, Applied Microbiology 9 (1), 66-72 (I96I). A-28086 faktor D er også aktiv mot smittsom Gastro-enteritis-virus, Newcastle-sykdom-virus og Rhinotracheitis-kveginfeksjonsvirus som vist ved lignende vevskulturforsøk.

Det faktum at A-28086 faktor D-forbindelser har virkning både mot virus og mot anaerobe bakterier gjør disse stoffer særlig gunstige for behandling eller til forebyggel ;e av enteritis hos høner, griser, kveg og sauer. A-28o86-faktor L ■ forbindelsene er også egnet for behandling av entero-toksemi hes drøvtyggende dyr.

Anticoccidial-virkning er en viktig egenskap for A-28086 faktor D-forbindelser ifølge oppfinnelsen. -Eksperimenter in vitro viser anticoccidial-virkning hos A-28086 faktor D mot Eimeria tenella. Man benyttet følgende metode (for flere detaljer se L.R. McDougald og R.B. Galloway i Exper. Parasitology 34> 189-I96 (1973)): Vertcelle-kulturer fremstilles etter vanlige metoder ved hjelp av Leighton-rør, plastskiver eller -plater eller andre egnede kulturbeholdere. Etter 2-3 dagers vekst i egnet kulturmedium (Eagle's minimal essential medium, lactalbuminhydrolysat i Earle's saltvann eller Hank's saltvann, Medium 199> etc.) dannes .et egnet enkeltsjikt som vanligvis er klar for infeksjon og behandling med forsøksforbindelse. Primærkulturer av hønse-nyre-oeller ble brukt til disse undersøkelser.

Levende oocyster av Eimeria tenella tas ut fra feces fra infiserte høner og renses og steriliseres før bruk. Oocystene sporuleres ved inkubering ved romtemperatur og gjennom-bobling av luft gjennom suspensjonen eller forsiktig rysting på en rundrystemaskin eller ved hjelp av andre egnede metoder. Kaliumdikromat eller svovelsyre (eller andre kjemikalier) kan brukes for å hindre bakterievekst eller soppvekst under sporu-leringen.

Frigjøring av infeksjons-sporozoiter fra oocystene oppnås ved en kombinasjon av mekanisk knusing av oocystveggen og behandling med trypsin og gallesalter for å påskynde sporozoitene til å befri seg fra sporocystene.

Cellekulturene infiseres ved innføring av levende sporozoiter i kulturmediet. Forsøkskjemikalier kan innføres på samme tidspunkt eller senere. Forsøksforbindelsen innføres i egnet konsentrasjon i 10 prosentig dimetylformamid i fysiologisk saltvann. Forsøkets endepunkt er inhibering av aseksuelle utviklingstrinn og bestemmes ved mikroskopisk undersøkelse av kulturer som fikseres og farges 96 timer etter infeksjon. Resultatene oppsettes som aktive A, inaktive N eller cytotoksiske C avhengig av nærvær eller fravær av andre generasjons-schizonter og eventuell toksisitet overfor celle-monosjiktet.

Anticoccidiose-virkningen for A-28086 faktor D

som demonstreres ved dette forsøk er oppsatt i tabell VII.

Et annet egnet trekk ved A-28086 faktor D-forbindelsene er deres evne til å forbedre f6r-utnyttingsgraden hos drøvtyggere som har en utviklet rumen-funksjon. Mekanismen for utnyttelse av hoved-næringsbestanddelen (karbohydrater) i drøvtygger!" or er vel kjent. Mikroorganismer i rumen hos dyret nedbryter karbohydrater til monosaccharider og omdanner mono-l \ccharidene til pyruvatforbindelser. Pyruvatforbindelsene mei.abdiseres ved mikrobiologiske prosesser under dannelse av acetater, butyrater og propionater, som har fellesbetegnelsen flyktige fettsyrer (volatile fatty acids = VFA). For en mer detaljert beskrivelse se Leng i "Physiology of Digestion and Metabolism in the Ruminant", Phillipson et al., Eds. Oriel Press, Newcastle upon Tyne, England, 1970, s. 408-4IO.

Den relative VFA-utnyttigsgrad omtales av McCullough i Feedstuffs, 19. juni I97I, s. 19, Eskeland et al. i J. An. Sei. 33,. 282 (1971) og Church et al. i "Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants", bind 2, 1971» s. 622 og 625. Selv om acetater og butyrater blir benyttet, utnyttes propionater med større virkning. Når det foreligger for lite propionat, kan dessuten dyrene utvikle ketose. En gunstig forbindelse stimulerer således dyrene til å produsere en høyere relativ mengde propionater fra karbohydratene hvilket øker karbohydrat-utnyttings-graden og reduserer ketosetilfellene.

Virkningen av en slik gunstig forbindelse kan bestemmes ved å observere virkningen på produksjon og konsentrasj )n av propionatforbindelser i rumen etter samme metode som ble benyttet for faktor A i det foregående.

Resultater fra forsøksseriene sammenlignes statistisk med resultater fra kontrollserier. Tabell VIII viser forholdet mellom de flyktige fettsyrer i A-28086 faktor D-behandlede kolber i forhold til konsentrasjonene i kontrollkolber.

De aktuelle forbindelser er typisk effektive når det gjelder økning av propionatinnholdet og således økning av forutnyttingsgraden når forbindelsene gis oralt til drøvtyggere i mengder på fra ca. 0,05 til 5>0 mg/kg/dag. De beste resultater oppnås ved å gi mengder på ca. 0,1 mg/kg/dag opptil ca. 2,5 mg/ kg/dag. En foretrukket administrasjonsmetode består i å blande forbindelsen med dyreforet, men forbindelsene kan også gis på andre måter, f.eks. som tabletter, sukkerkuler eller kapsler. Sammensetningen av disse forskjellige doseringsformer kan skje som kjent på området. Hver individuell doseringsenhet bør inneholde en stoffmengde som er direkte knyttet til den egnede dags-dose for dyret som behandles.

A-28086 kan brukes i forsammensetninger som benyttes til feting av kveg og inneholde fra ca. 1 til 30 gram forbindelse pr. tonn for.

Det vil være klart for fagfolk at kvegfor er forskjellig fra andre fortyper som fjørkrefor. Kvegfor inneholder grovstoffer som f.eks. bomullsfrøskall og maissilorester. IT-tillegg inneholder kvegfor ofte e-n høy prosent, fra ca. 15-25 prosent nitrogenkilder uten protein. En proteinfri nitrogenkilde er urea.

Som beskrevet tidligere er A-28o86-forbindelsene antivirale midler og er også virksomme mot anaerobe bakterier, særlig Clostridium perfringens. A-28o86-forbindelsene er således egnet for behandling eller forebyggelse av enteritis hos høns, griser, kveg og sauer. A-28o86-forbindelsene er også egnet for behandling av enterotoksemi hos drøvtyggere.

Eksempel 1

A. Rystekolbe-fermentering av A28086 med S. aureofaciens NRRL 5758

En kultur av Streptomyces aureofaciens NRRL 575^ ble fremstilt og dyrket på skråagar med følgende sammensetning:

Skrå-agaren ble inokulert med Streptomyces aureofaciens NRRL 5758 og den inokulerte agar inkubert ved 30°C 1 seks til ti dager. Den modne skråkultur ble dekket med kjøttserum og skrapt med en steril løkke for å løsne sporene. Den resulterende kjøttserum-suspensjon av sporer og mycel-fragmenter ble fryse-tørket til seks perler.

En frysetørket perle fremstilt på denne måten ble brukt til inokulering av 50 ml vegetativt medium med følgende Sc-mmensetning:

Det inokulerte vegetative medium i 250 ml Erlenmeyer-kolbe ble inkubert ved JO°C i 72 timer på en rystemaskin som ble rystet i en bue 5 cm i diameter ved 25O omdr./min.

B. Tank-fermentering av A-28086 med-S. aureofaciens NRRL 5758

For å lage en større mengde inokulum ble 10 ml av ovennevnte inkuberte vegetative medium brukt til inokulering av 400 ml vegetativt vekstmedium av annet trinn, med samme sammensetning som i det vegetative medium. Dette andre-trinnsmedium i en 2 liters beholder, ble inkubert ved 30°C i 24 timer på rystemaskin.

Det andre-trinns vegetative medium (1 liter) ble brukt til inokulering av 100 liter sterilt produksjonsmedium med følgende sammensetning:

Mediets pH var 6,7 etter sterilisering og autoklavering ved 120°C i 30 minutter ved 7-10 kg's trykk. I en 165 1 fermenteringstank forgjæret man det inokulerte produksjonsmedium i 10 dager ved en temperatur på 29°C. Fermenteringsmediet ble gjennomboblet med steril luft i en mengde på 0,4 volumdeler luft pr. volumdel kulturmedium pr. minutt. Mediet ble omrørt med vanlige rørere ved 250 omdr./min.

Eksempel 2

Man produserte A-28086 antibiotika i henhold til fremgangsmåten som beskrevet i eksempel 1, men benyttet et kolbe-medium med følgende sammensetning:

Eksempel 3

Separasjon av A-28086 antibiotikum-kompeks produsert av

S. aureofaciens NRRL 5758

Hele fermenteringsblandingen (132 1) fremstilt som beskrevet i eksempel 1, ble filtrert ved hjelp av filter-hjelpe-stoff ("Hyflo Super-cel", en diatomejord forhandlet av Johns-Manville Products Corp.) og ga 97 liter filtrert væske. Den filtrerte buljong ble ekstrahert med omtrent like stort volum etylacetat. Etylacetatekstraktet ble separert fra vannfasen og konsentrert til et volum på ca. 500 ml. Dette konsentrerte etyl-acetatekstrakt ble tilsatt til et stort overskudd av petroleter fSkelly Solve F", ca. 10 liter) for utfelling og derved separasjon av uønsket materiale. Det separerte filtratet ble inndampet i vakuum og ga en råmengde av A-28086 antibiotikum-kompleks (6,9 g) .

Mycel-delen av A-28086 antibiotikum-kompleks ble utvunnet ved å ekstrahere det filtrerte mycelium to ganger med omtrent halve volumet metanol (62 1 og 59 1) • De to metanolekstrakter ble slått sammen og konsentrert i vakuum for å fjerne metanolen. Etter denne konsentrering var det tilbake ca. 10 1 vann-fase. Denne vannfasen ble innstilt på ca. pH 7>5 meci- fortynnet natriumhydroksyd. Den resulterende oppløsning ble ekstrahert to ganger med ca. like store volumer etylacetat (9 1 og 10 1). Etyl-\cetatekstraktene ble slått sammen og konsentrert til ca. 4-00 ml velum. Dette konsentrerte etylacetatekstraktet ble tilsatt til et trtort overskudd av petroleter for å fjerne uønsket materiale,

på samme måten som ovenfor beskrevet for det konsentrerte, filtrerte, ekstrakt. Mycel-delen av A-28086-antibiotikum-kompleks utvunnet fra filtratet veide 20,6 g.....

Eksempel 4-

Isolering av A- 28o86- faktorer A og B, individuelt

Mycel-delen av A-28086 antibiotikum-kompleks (235 g>

fremstilt som beskrevet i eksempel 3) ble oppløst i ca. 80 ml benzen. Denne benzenoppløsning ble påfylt en silikagel-kolonne (9 x I30 cm, 8 1, siligagel, "Matheson grade 62"). Kolonnen ble eluert med varierende blandinger av benzen-etylacetat. Man fulgte elueringsprosessen ved hjelp av tynnsjiktskromatografi. Med benzen-etylacetat som solventsystem (90:10), ble faktor B eluert først og isolert som enkeltfaktor. Faktor B (43 mg) ble krystallisert fra.aceton-vann, smeltepunkt 150-153°C.

Ved å fortsette å eluere med benzen-etylacetat-blandinger hvor innholdet av etylacetat stadig øket, eluerte m.-n faktor A, de forskjellige fraksjoner inneholdende faktor A ble slått - sammen og konsentrert i vakuum til et inndampingsresiduum. Denne inndampingsrest ble oppløst i aceton (ca. 150 ml), vann ble tilsatt (ca. I50 ml) til acetonoppløsningen. Oppløsningens pH ble innstilt på pH 3 ved å tilsette IN saltsyre. Den sure blanding ble omrørt ca. en time og det dannet seg da en felling. Fellingen ble frafUtrert og omkrystallisert fra aceton (ca. 150 ml) ved tilsetning ay vann (ca. 60 ml). Produktet ble tørket over natten under vakuum og ga faktor A (ca. 6,6 g). Etter delvis inndamping av aceton fra filtratet fikk man en sekundær mengde av faktor A (ca. 1,2 g).

Eksempel 5

A- 28086 faktor A- acetyle sterderivat

Antibiotikum A-28086 faktor A (7,4 g) ble oppløst i pyridin (150 ml). Man tilsatte eddiksyreanhydrid (50 ml) til denne oppløsning. Oppløsningen ble blandet grundig og hensatt over natt ved romtemperatur.

Man tilsatte vann (200 ml) og blandet omhyggelig. Denne blanding ble hensatt i fire timer ved romtemperatur. Det felte seg ut et hvitt fast stoff som ble frafiltrert, vasket med vann og tørket i luft. Stoffet ble oppløst i aceton (100 ml) og acetonoppløsningen inndampet til tørrhet i vakuum. (Man gjentok dette tre ganger.) Det fremstilte residuum krystalliserte fra aceton (100 ml)-vann (50 ml) og ga A-28086 faktor A som acetylesterderivat (6,14 g), smeltepunkt 100-103°C.

Eksempel 6-9

Antibiotikum A-28086 faktor A som propionylesterderivat, fremstilt ved å omsette faktor A med propionsyreanhydrid i nærvær av pyridin som beskrevet i eksempel 5> smeltepunkt 96-98°C.

Antibiotikum A-28086 faktor A n-butyrylester-

derivat ble fremstilt ved å omsette faktor A med n-smørsyre-

anhydrid i nærvær av pyridin som beskrevet i eksempel 5> smelte-

punkt 79-8l°C.

Antibiotikum A-28086 faktor A som n-caproylester-

derivat ble fremstilt ved å omsette faktor A med capronsyre-

anhydrid i nærvær av pyridin på samme måten som beskrevet i eksempel 5> smeltepunkt l63-l67°C.

Antibiotikum A-28086 faktor A n-valerylester-

derivat ble fremstilt ved å omsette faktor A med valeriansyre-

anhydrid i nærvær av pyridin som angitt i eksempel 5> smelte-

punkt 173-175°C.

Eksempel 10

Fremstilling av A- 28086 faktor A- natriumsalt

Man oppløste antibiotikum A-28086 faktor A (5OO mg)

i aceton (50 ml). Man tilsatte vann til denne oppløsning (50 ml)

og 5N '.natriumhydroksyd ble tilsatt slik at pH for oppløsningen ble 10,5-11- Oppløsningen ble omrørt i en time og ekstrahert med etylacetat. Etylacetatekstraktet ble inndampet til tørrhet i vakuum. Inndampingsresten ble utfelt fra aceton-vann-oppløsning og ga 378 mg A-28086 faktor A-natriumsalt, smeltepunkt 120-123°C.

Eksempel 11-15

Antibiotikum'A-28086 faktor A-bariumsalt ble frem-

stilt fra antibiotikum A-28086 faktor A (500 mg) og mettet bariumhydroksyd på samme måten som i eksempel 10 for fremstilling av 369 mS A-28086 faktor A som bariumsalt, smeltepunkt l88-190°C.

Antibiotikum A-28086 faktor A-kaliumsalt ble frem-

stilt fra antibiotikum A-28086 faktor A (500 mg) og 5N kalium-

hydroksyd etter metoden i eksempel 10, og ga 3^3 mg A-28086

faktor A-kaliumsalt, smeltepunkt l65-l67°C.

Antibiotikum A-28086 faktor A-cesiumsalt ble frem-

stilt fra antibiotikum A-28086 faktor A (500 mg) og IN cesium-

hydroksyd etter metoden i eksempel 10 og ga da 540 mg A-28086 faktor A som cesiumsalt, smeltepunkt 190-210°C.

Antibiotikum A-28086 faktor B-natriumsalt, frem-

stilt fra antibiotikum A-28086 faktor B og 5N natriumhydroksyd

i henhold til metoden fra eksempel 10.

Eksempel 16

Rystekolbe-fermentering av A-28086 med S. aureofaciens NRRL 8092

En kultur av Streptomyces aureofaciens NRRL 8092 ble fremstilt og dyrket på agar (skrå-agar) med følgende sammensetning:

Skrå-agaren ble inokulert med Streptomyces aureofaciens NRRL 8092 og den inokulerte agar ble inkubert ved 30°0 i omkring syv dager. Den ferdige skråkultur ble dekket med sterilt kjøttserum og skrapet med en steril løkke for fremstilling av en spore- og mycel-suspensjon fra skråkulturen. Suspensjonen ble frysetørket til høyst seks perler.

En av de frysetørkede perlene fremstilt på denne måten ble brukt for inokulering av 50 ml vegetativt medium med følgende sammensetning:

Det inokulerte vegetative medium ble i en 25O ml Erlenmeyer-kolbe inkubert ved 30°C i 48 timer på rystemaskin ved

25O omdr./min. med svingbue 5 cm.

Det inkuberte vegetative medium beskrevet ovenfor

(0,5 ml, 1 prosent) ble brukt til inokulering av 50 ml fermenteringsmedium med følgende sammensetning:

Eksempel 17

Tank-fermentering av A-28086 med S. aureofaciens NRRL 8092

Utgangsprosedyren beskrevet i eksempel 16 for rystekolbe-fermentering av A-28086 ble også brukt for tank-forgjæringeh.

For å fremstille et større volum av inokulum ble 10 ml inkubert vegetativt medium benyttet til inokulering av /\. 00 ml av annet

trinns vegetative medium med samme innhold som første vegetative mtiium. Dette andre trinns medium ble i en 2 liter Erlenmeyer-

kolte inkubert ved 30°C 1 24 timer i rystemaskin ved 250 omdr./

min.

Det inkuberte andre trinns vegetative medium

(800.ml) inokulerte 100 liter sterilt fermenteringsmedium med følgende sammensetning:

Mediets pH var 6,8 + 0,1 etter sterilisering ved autoklavering ved 121°C i 30 minutter ved 7-10 kg's trykk. I

en 165 liters fermenteringstank ble det inokulerte produksjonsmedium forgjæret i 10-12 dager ved 28 + 1°C. Fermenteringsmediet ble gjennomluftet med steril luft i en mengde på 0,4 volumdeler luft pr. volumdel kulturmedium pr. minutt. Mediet ble omrørt med vanlig rører ved 300 omdr./min.

Eksempel l8

A-28086 antibiotika ble produsert som beskrevet i eksempel 17, men med rystekolbe/tank-medium med følgende sammensetning:

Mediets pH var 6,4 etter sterilisering ved autoklavering som beskrevet i eksempel 1"] •

Eksempel 19

Separasjon av A-28o86-antibiotikum-kompleks produsert av S. aureofaciens NRRL 8O92

Hele fermenteringsmassen (60 liter) fremstilt som beskrevet i eksempel 17 ble regulert til pH 3 ved tilsetning av fortynnet HC1. Den dannede oppløsning ble filtrert gjennom filterhjelpestoff ("Hyflo Super-cel"). Den separerBe mycel-kaken ble ekstrahert med 30 1 metanol under tilsetning av 1,56 kg NaHCO^ til ekstraktet, under røring. Etter at ekstraktet var skilt fra, ble mycel-kaken ekstrahert på nytt med 30 1 metanol. De to metanolekstrakter ble slått sammen og konsentrert i vakuum for å avdampe metanolen. Den gjenværende vandige oppløsning (ca. 7 liter) ble innstilt på pH 7,5 med fortynnet HC1. Den dannede oppløsning ble ekstrahert to ganger med etylacetat (7 liters porsjoner). Etylacetatekstraktene ble slått sammen og konsentrert i vakuum til en oljeaktig rest. Denne olje-resten ble oppløst i I5OO ml aceton. Man tilsatte vann (15OO ml) til acetonoppløsningen. Denne oppløsning ble justert til pH 3 med fortynnet HC1 og omrørt i en time. Fellingen som hadde dannet seg ble frafiltrert og oppløst i aceton (I5OO ml), man tilsatte vann (400 ml). Oppløsningen ble hensatt i 16 timer for krystal-lisasjon. De dannede krystaller ble filtrert fra og tørket i vakuum og ga 74 g råkrystaller som inneholdt A-28086 faktor A og D samt andre krystallinske forurensninger.

Dette krystallinske råprodukt (40 g) ble oppløst i ca. 25O ml benzen. Benzenoppløsningen ble fylt på en silikagel-kolonne (9 x 120 cm, silikagel, kvalitet 62). Kolonnen ble =luert suksessivt med 40 1 av hver av følgende:

1) benzen

2) benzen : etylacetat (9=1)

3) benzen : etylacetat (4:1)

4) benzen : etylacetat (7=3)

5) benzen : etylacetat (1:1)

6) etylacetat

7) metanol

Man oppsamlet en liters fraksjoner. Hver fraksjon ble under-søkt ved forsøk med Bacillus subtilis og ved tynnsjiktskromatografi for å identifisere de eluerte stoffer. A-28086I ble eluert med benzen : etylacetat (4:1). A-28086 faktor B ble eluert med benzen : etylacetat (7=3)' A-28086 faktor A og D ble eluert i fraksjonene som kom ut med benzen : etylacetat

(7:3 °S 1:1)» fraksjoner II9-I56. Disse fraksjoner ble slått sammen og inndampet til tørrhet i vakuum. Det dannede residuum ble oppløst i aceton (500 ml). Man tilsatte vann (500 ml) til acetonoppløsningen og den resulterende oppløsning ble justert til pH 3 med fortynnet HC1 og omrørt i en time. Den dannede felling ble filtrert fra og krystallisert fra aceton (5OO ml)-vann (l80 ml). De dannede krystaller ble frafUtrert og tørket i vakuum og ga 20,1 g av en blanding av A-28o86-faktor A og -D.

Eksempel 20

Separasjon og rensing av separate faktorer A og D

Krystallblandingen av A-28086 faktor A og D fra eksempel 18 (18,8 g) ble oppløst i benzen (50 ml). Benzenopp-løsningen ble påført på en silikagelkolonne (7 x 100 cm, "Merck gradering 60"-silikagel, finere enn 23O mesh ASTM). Kolonnen ble eluert med en utstrømning på 90 ml pr. time, fortløpende med:

1) 12 liter benzen

2) 12 liter benzen : etylacetat (9=1)

3) 12 liter benzen : etylacetat (4^1)

4) 32 liter benzen : etylacetat (7:3)

5) 10 liter metanol

Tynnsjiktskromatografering på cellulose (cellulose på aluminiumunderlag) ble fulgt ved hjelp av B. subtilis som påvisningsorganisme for å følge elueringsprosessen. Man benyttet følgende solventsystem: vann:metanol:aceton (12:3=1)» justering av første oppløsning til pH 10,5 med NH^OH og deretter til pH 7,5 med HC1.

Man oppsamlet en- til to liters fraksjoner inntil aktivitet ble påvist, deretter 200 ml fraksjoner. De fraksjoner som inneholdt bare A-28086 faktor D ble slått sammen og inndampet under vakuum. Inndampingsresten krystalliserte fra aceton-vann (1:1). Krystallene ble separert og tørket i vakuum til 140 mg krystallinsk A-28086 faktor D.

Fraksjoner inneholdende A-28086' faktor D med spor av A-28086 faktor A ble behandlet på samme måten og ga i tillegg. 150 mg krystallinsk A-28086 faktor D inneholdende en liten mengde A-28086 faktor A.

Fraksjoner som inneholdt bare A-2J3.086 faktor A ble behandlet på samme måten og ga 4,7 g krystallinsk "A-28086 faktor

A.

Eksempel 21 A-28086 antibiotika ble produsert i henhold til beskrivelsen i eksempel 16, men med et skftåmedium som hadde følgende sammensetning:

og inkubering av den inokulerte skrå-agar ved 28°C i omkring syv dager.

Eksempel 22 \ A-28086 antibiotika ble produsert s|fiL angitt i eksempel 17, men med et kolbe/produks jonsmediunr fned':. X'øi^ende sammensetning:

I 4 J U J vJ

Eksempel 23

A-28086 antibiotika ble produsert som angitt i eksempel 21, men med et mellomliggende tredje trinns vegetative medium som hadde følgende sammensetning:

Eksempel 24

A- 28086 faktor D- acetylesterderivat

Antibiotikum A-28086 faktor D oppløses i pyridin.

En støkiometrisk mengde eddiksyreanhydrid tilsettes oppløsningen. Den dannede oppløsning blandes grundig og hensettes over natt

ved romtemperatur.

Mari tilsetter et vannoverskudd, blander grundig og lar blandingen st.å flere timer ved romtemperatur. Fellingen som dannes frafiltrerefe, vaskes med vann og tørkes. Det dannede faste stoffet oppløses i aceton og inndampes til tørrhet under vakuum til A-28086 faktor D-acetylesterderivat.

Eksempel 25_28

Antibiotikum A-28086 faktor D-propionylesterderivat fremstilles ved å omsette A-28086 faktor D med propionsyreanhydrid i nærvær av pyridin som beskrevet i eksempel 24.

Antibiotikum A-28086 faktor D-n-butyrylester-derivat fremstilles ved å omsette A-28086 faktor D med n-smørsyre-anhydrid i nærvær av pyridin som angitt i eksempel 24.

Antibiotikum A-28086 faktor D-n-caproylesterderivat fremstilles ved å omsette A-28086 faktor D med capronsyre-anhydrid i nærvær av pyridin i henhold til metoden fra eksempel 24.

Antibiotikum A-28086 faktor D-n-valerylester-derivat fremstilles ved å omsette A-28086 faktor D med valerian-syreanhydrid i nærvær av pyridin i henhold til metoden fra eksempel 2 4.

Eksempel 29

Fremstilling av A- 28086 faktor D- natriumsalt

Antibiotikum A-28086 faktor D oppløses i aceton. En ekvivalent mengde vann tilsettes til oppløsningen og tilstrekke-lig 5N natriumhydroksyd til å bringe oppløsningens pH opp til ca. pH 11. Oppløsningen røres i ca. en time og ekstraheres med etylacetat. Etylacetatekstraktet inndampes i vakuum og gir A-28086 faktor D som natriumsalt.

Eksempel 30-32

Antibiotikum A-28086 faktor D-kaliumsalt fremstilles fra A-28086 faktor D og 5N kaliumhydroksyd som beskrevet i eksempel 29.

Antibiotikum A-28086 faktor D-bariumsalt fremstilles fra A-28086 faktor D og mettet bariumhydroksyd i henhold til metoden i eksempel 29.

Antibiotikum A-28086 faktor D-cesiumsalt fremstilles ut fra A-28086 faktor D og IN cesiumhydroksyd i henhold til eksempel 29.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av polyeter-antibiotikumblandingen 'A-28086 eller dens bestanddeler faktor A, faktor B og faktor D, acylestere og salter derav, karakterisert ved at man dyrker Streptomyces aureofaciens NRRL 5758 eller Streptomyces aureofaciens NRRL 8092 i et dyrkningsmedium som inneholder assimilerbare kilder fer karbohydrat, nitrogen og uorganiske salter under neddykkede, aerobe dyrkningsbetingelser, fulgt av separering av A-28086-antibiotikumblandingen fra kulturmediet, og eventuelt isolering av A-28086 faktor A, isolering av A-28086 faktor D, og/eller isolering av A-28086 faktor B fra den separerte A-28086-antibiotikumblandingen,

   og, om ønsket, omdannelse av et således erholdt antibiotikum til en acylester eller et salt derav.