DE3880845T2 - Durch fermentation hergestellte antibiotika. - Google Patents

Durch fermentation hergestellte antibiotika.

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Description

  • Diese Erfindung befaßt sich mit einer neuen antibiotischen Verbindung der Efrotomycin-Gruppe, mit Zusammensetzungen, welche die erwähnte Verbindung enthalten, und mit einem Verfahren zur Verwendung der Verbindung. Inbesondere befaßt sich diese Erfindung mit einer Verbindung, die mit der Efrotomycin-Familie der Antibiotika eng verwandt ist, die solche Wirkstoffe wie Efrotomycin, Mocimycin, Aurodox, Heneicomycin, Factumycin, Azdimycin und Kirrothricin einschließen. Dieser Gegenstand wurde durch Parmeggiani et al., "Properties and Action of Kirromycin (Mocimycin) and Related Antibiotics", Top. Antibiot. Chem., 5, 159- 221 (1980) überprüft.
  • Die US-Patentschrift 4 515 793 beschreibt bestimmte Verbindungen der Efrotomycin-Klasse. Das Journal of Antibiotics, Vol. XXXV, Nr. 8, Seiten 948-956 (1982) beschreibt Kirrothricin, ein neues Mitglied der Kirromycin-Gruppe. Das Canadian Journal of Chemistry, Vol. 58, Nr. 5, Seiten 501-526 (1980) beschreibt das Antibiotikum Aurodox. In diesen Schrifttumsstellen werden die Verbindung durch die Verwendung von bestimmten Streptomyces-Stämmen erhalten.
  • Bei der Suche nach neuen Antibiotika wird die strukturelle Modifizierung von bekannten Antibiotika, wenn immer dies möglich ist, versucht. Diese Methode ist jedoch auf Modifikationen beschränkt, welche die gewünschte Aktivität beibehalten. Viele Antibiotika, einschließlich der Efrotomycine, haben derart komplexe Strukturen, daß sogar geringfügige Anderungen durch chemische Mittel nur schwierig durchzuführen sind. Die Entdeckung von neuen, durch Fermentationsverfahren hergestellten Antibiotika, bleibt dahin weiterhin von hoher Bedeutung, sogar in Fällen, wo das Antibiotikum, sobald erkannt, einem früher bekannten Antibiotikum ziemlich ähnlich ist.
  • Die oben aufgeführten bekannten Antibiotika sind gegen einen Bereich von grampositiven und gramnegativen Bakterien aktiv und sie wurden mit variierenden Erfolgsgraden in der Behandlung von bakteriellen Infektionen und in der Förderung des Wachstums und/oder für die Verbesserung des Futternutzungsgrads bei Tieren in der Landwirtschaft verwendet.
  • Unter einer Anzahl von Zuständen, die mit diesen Mitteln behandelt werden können, sind Schweinedysenterie und Enteritis aufzuführen.
  • Schweinedysenterie ist eine der in den Vereinigten Staaten am häufigsten vorkommenden Schweinekrankheiten. Die Krankheit nimmt in verstärktem Maße in vielen anderen Ländern zu und verursacht jährlich rund um die Welt beträchtliche Verluste im Bestand der Schweinezüchter. Es wurde in jüngster Zeit entdeckt, daß eine große Spirochäte der verursachende Organismus der Krankheit ist. Dieser Organismus, Treponema hyodysenteriae, wurde nun isoliert und es wurde gezeigt, daß er fähig ist, die Krankheit zu verursachen [D. L. Harris et al., "Swine Dysentery-1, Innoculation of Pigs with Treponema hyodysenteriae (New Species) and Reproduction of the Disease", Vet. Med./SAC, 67, 61-64 (1972)].
  • Die nachstehend angeführten Untersuchungsergebnisse betreffen mit diesem Organismus durchgeführte Versuche. Es muß bemerkt werden, daß es nicht bekannt ist, ob T. hyodysenteriae der einzige verursachende Organismus von Schweinedysenterie ist. Aus den verfügbaren Daten kann jedoch geschlossen werden, daß er eine Hauptquelle der Infektion ist.
  • Enteritis ist eine andere Krankheit, die schwere ökonomische Verluste bei Viehzüchtern bewirken kann. Enteritis kommt bei Hühnchen, Schweinen, Rindvieh und Schafen vor und ist hauptsächlich auf anaerobe Bakterien, insbesondere Clostridium perfringens, und Viren, zurückzuführen. Die Enterotoxemie bei Wiederkäuern, für welche ein Beispiel die "Überfreß-Krankheit" beim Schaf ist, ist ein durch eine C. perfringens-Infektion verursachter Zustand.
  • Die Steigerung der Leistung (erhöhte Wachstumsrate und/oder erhöhter Wirkungsgrad der Futterverwertung) bei Wiederkäuern, wie beim Rindvieh, und in monogastrischen Tieren, wie beim Schwein, ist ein anderes ökonomisch erwünschtes Ziel der Veterinärmedizin. Von besonderem Interesse ist eine verbesserte Leistung, erzielt durch Erhöhung des Wirkungsgrades der Futterverwertung. Der Mechanismus für die Verwertung des Nährstoff enthaltenden Hauptteils der Wiederkäuter-Futter ist bekannt. Mikroorganismen in dem Pansen des Tiers bauen Kohlehydrate unter Bildung von Monosacchariden ab und wandeln dann diese Monosaccharide in Pyruvat-Verbindungen um. Pyruvate werden durch mikrobiologische Verfahren unter Bildung von Acetaten, Butyraten oder Propionaten, insgesamt als flüchtige Fettsäuren bekannt, umgesetzt. Für eine detailliertere Diskussion siehe Leng in "Physiology of Digestion and Metabolism in the Ruminant", Phillipson et al., Eds., Oriel Press, Newcastle-upon-Tyne, England, Seiten 408- 410 (1970).
  • Der relative Nutzungsgrad der Verwertung von flüchtiger Fettsäure wird diskutiert von McCullough in "Feedstuffs", 19. Juni, Seite 19 (1971); Eskeland et al., in J. An. Sci., 33, 282 (1971); und Church et al., in "Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants", Vol. 2, Seiten 622 und 625 (1971). Obwohl Acetate und Butyrate verwertet werden, werden Propionate mit größerem Wirkungsgrad verwertet. Außerdem können die Tiere Acetonämie entwickeln, wenn zu wenig Propionat verfügbar ist. Eine vorteilhafte Verbindung stimuliert daher die Tiere, einen höheren Anteil an Propionaten aus Kohlehydraten zu produzieren, wodurch der Wirkungsgrad der Kohlehydrat-Verwertung erhöht und auch das Auftreten von Acetonämie reduziert wird.
  • Diese Erfindung befaßt sich mit dem neuen, sauren, als UK- 69,753 bezeichneten Antibiotikum, produziert durch submerse aerobische Fortpflanzung des Mikroorganismus Amycolatopsis orientalis ATCC 53550, isoliert aus einer Bodenprobe aus England, in wässerigen Nährmedien. Dieses Antibiotikum und seine kationischen Salze sind aktiv gegen eine Vielzahl von grampositiven und gramnegativen Bakterien. Sie sind wirksam zur Bekämpfung von Schweine-Dysenterie und Enteritis, als auch wirksam für die Förderung des Wachstums und für die Erhöhung der Wirksamkeit der Futterverwertung bei Geflügel, Schweinen und Wiederkäuern.
  • Der hierin als Amycolatopsis orientalis ATCC 53550 bezeichnete Mikroorganismus, der für die Herstellung des Antibiotikums UK-69,753 brauchbar ist, wurde aus einer in Yorkshire, United Kingdom gesammelten Bodenprobe isoliert. Er wurde am 9. Oktober 1986 in der ATCC hinterlegt. Biologisch reine Kulturen von diesem Mikroorganismus bilden einen Teil dieser Erfindung, sowie Mutanten und rekombinante Formen davon, die fähig zur Herstellung des Antibiotikums der Erfindung sind.
  • Eine hierin als N731-15 bezeichnete Kultur von ATCC 53550 wurde von einer Schrägfläche aus in ATCC Nr. 172-Bouillon eingeimpft und vier Tage lang bei 28ºC in einem Shaker gezüchtet. Sie wurde dann 20 Minuten lang zentrifugiert, dreimal mit sterilem destillierten Wasser gewaschen und auf Medien überimpft, wie sie gewöhnlich für die Identifikation von Mitgliedern der Actinomycetale verwendet werden. Die Kultur wurde bei 28ºC inkubiert und die Ergebnisse wurden bei variierenden Zeiten, jedoch am häufigsten bei vierzehn Tagen abgelesen. Die Farben wurden in üblicher Terminologie beschrieben, jedoch wurden exakte Farben durch Vergleiche mit Farbchips von der Colour Harmony Manual, vierte Auflage, bestimmt. Die Methoden der Gesamtzell-Aminosäure- und Zuckeranalysen sind diejenigen, die von B. Becker et al., Appl. Microbiol., 12, 421-423 (1964) und von M. P. Lechevalier, J. Clin. Med., 71, 934-944 (1968) beschrieben wurden. Etwa 30 Gramm von im Autoklav behandeltem, feuchten Mycel wurden für Mycolat- Analysen verwendet, unter Verwendung der von M. P. Lechevalier et al. in J. Bacteriol., 105, 313-318 (1971) beschriebenen Methode. Für Phospholipid-Analysen wurde die von D. E. Minnikin et al. in J. Microbiol. Method, 2, 233-241 (1984) beschriebene Methode angewandt.
  • Die Kennzeichnung der für die Charakterisierung der Kultur und der Angaben über ihre Zusammensetzung oder ihre Lieferanten verwendeten Nährmedien sind folgende:
  • 1. Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar - (ISP-Nährmedium Nr. 2, Difco).
  • 2. Hafermehl-Agar - (ISP-Nährmedium Nr. 3, Difco).
  • 3. Anorganische Salze-Stärke-Agar - (ISP-Nährmedium Nr. 4, Difco).
  • 4. Glycerin-Asparagin-Agar - (ISP-Nährmedium Nr. 5, Difco).
  • 5. Czapek-Saccharose-Agar - S. A. Waksman, The Actinomycetes, Vol. 2, Nährmedium Nr. 1, Seite 328 (1961).
  • 6. Glucose-Asparagin-Agar - Ibidem, Nährmedium Nr. 2, Seite 328.
  • 7. Emerson's-Agar - Ibidem, Nährmedium Nr. 28, Seite 331.
  • 8. Nähragar - Ibidem, Nährmedium Nr. 14, Seite 330.
  • 9. Bennett's-Agar - Ibidem, Nährmedium Nr. 30, Seite 331.
  • 10. Gordon and Smith's-Tyrosin-Agar - R. E. Gordon und M. M. Smith, J. Bact., 69, 147-150 (1955).
  • 11. Calciummalat-Agar; S. A. Waksman, Bact. Rev. 21, 1-29 (1957).
  • 12. Casein-Agar - Ibidem.
  • 13. Gelatine-Agar - R. E. Gordon and J. M. Mihm, J. Bact., 73, 15-27 (1957).
  • 14. Stärke-Agar - Ibidem.
  • 15. Kartoffel-Karotte-Agar - M. B. Lechevalier, J. Lab. and Clinical Med., 71, 934-944 (1968); man verwende nur 30 g Kartoffeln, 2,5 g Karotten und 20 g Agar.
  • 16. 2 % Leitungswasser-Agar.
  • Die Beobachtungen von Wachstum und Aussehen des Organismus waren wie folgt:
  • Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar
  • - Wachstum gut, cremefarben bis blaßgelblich (2ca, 2ea); aufgegangen, runzelig, ohne Luftmycel; Rückseite blaßgelblich (2ea, 2ga); lösliches Pigment gelblichbraun (31c).
  • Hafermehl-Agar
  • - Wachstum schlecht bis mäßig, cremefarben, (2ca), dünn, gleichmäßig, kein Luftmycel; Rückseite cremefarben (2ca); lösliches Pigment cremefarben (2ca).
  • Anorganische Salze-Stärke-Agar
  • - Wachstum schlecht, farblos bis cremefarben (2ca), dünn, gleichmäßig, ohne Luftmycel; Rückseite gleich wie Oberfläche; kein lösliches Pigment.
  • Glycerin-Asparagin-Agar
  • - Wachstum schlecht bis gemäßigt, cremefarben (2ca), leicht aufgegangen, gleichmäßig bis körnig, kein Luftmycel; Rückseite cremefarben bis blaßgelblich (2ca, 2ea); kein lösliches Pigment.
  • Czapek-Saccharose-Agar
  • - Wachstum schlecht bis gemäßigt, cremefarben (2ca), dünn, gleichmäßig, kein Luftmycel; Rückseite farblos bis cremefarben (2ca); kein lösliches Pigment.
  • Glucose-Asparagin-Agar
  • - Wachstum gemäßigt, cremefarben (2ca), leicht bis mäßig aufgegangen, gleichmäßig bis körnig, kein Luftmycel; Rückseite cremefarben bis blaßgelblich (2ca, 2ea); kein lösliches Pigment.
  • Emerson's-Agar
  • - Wachstum gut bis ausgezeichnet, cremefarben, blaßgelblich bis gelblich (2ca, 2ea, 2ga); aufgegangen, runzelig, kein Luftmycel; Rückseite dunkelgelblich (2ic, 2nc); lösliches Pigment gelblichbraun (31c).
  • Nähragar
  • - Wachstum gemäßigt, blaßgelblich (2ea), leicht aufgegangen, gleichmäßig, kein Luftmycel; Rückseite gelblich (2ia, 21a); kein lösliches Pigment.
  • Bennetts-Agar
  • - Wachstum gut, cremefarben (2ca), aufgegangen, gleichmäßig bis runzelig, kein Luftmycel; Rückseite gelblich (2ga, 2ia); lösliches Pigment blaßgelblich (2ea).
  • Gordon and Smith's-Tyrosin-Agar
  • - Wachstum gemäßigt, dunkelgelblich bis braun (21e, 4ng), leicht bis mäßig aufgegangen, gleichmäßig bis runzelig gegen Ende der Schicht, kein Luftmycel; Rückseite braun (3ne); lösliches Pigment dunkelbraun (4pl).
  • Calciummalat-Agar
  • - Wachstum gemäßigt, cremefarben (2ca), dünn bis gemäßigt aufgegangen, gleichmäßig bis körnig, kein Luftmycel; Rückseite blaßgelblich (2ea); kein lösliches Pigment.
  • Casein-Agar
  • - Wachstum gut, blaßgelblich bis braun (2ea, 41g), gemäßigt aufgegangen, runzelig, kein Luftmycel; Rückseite braun (31e); lösliches Pigment dunkelbraun (4ni).
  • Gelatine-Agar
  • - Wachstum gut, gelblich (2ga), gemäßigt aufgegangen, gleichmäßig, jedoch runzelig gegen die Ecke, kein Luftmycel; Rückseite gelblich (2ga); kein lösliches Pigment.
  • Stärke-Agar
  • - Wachstum gut, gelblich (2ga), gemäßigt aufgegangen, gleichmäßig, jedoch runzelig gegen Ende der Schicht, kein Luftmycel; Rückseite gelblich (2ec, 2ic); kein lösliches Pigment.
  • Kartoffel-Karotte-Agar
  • - Wachstum schlecht bis gemäßigt, cremefarben (2ca); dünn, gleichmäßig, kein Luftmycel; Rückseite cremefarben (2ca); kein lösliches Pigment.
  • Leitungswasser-Agar
  • - Wachstum schlecht, farblos bis cremefarben (1 ¹/&sub2;ca), dünn, gleichmäßig, kein Luftmycel; Rückseite gleich wie Oberfläche; kein lösliches Pigment.
  • Morphologische Eigenschaften
  • - Die Kultur N731-15 versagte bei der Herstellung eines Luftmycels oder von Sporen auf irgendeinem der verwendeten Nährmedien, sogar bei einer Inkubation von bis zu vier Wochen. Auf anorganischen Salzen-Stärke-Agar bildete sie kurze Ketten von sporenartigen Strukturen aus, entlang irgend welcher Segmente der Substrathyphen, jedoch mögen diese der Kondensation des Cytoplasmas entsprechen. Auf Leitungswasser-Agar entwickelte sie endständige Schwellungen an den Spitzen der Substrathyphen, was Sporen ähnlich sieht. Die vegetativen Hyphen an Hafermehl waren eng, verzweigt und maßen 0,4 bis 0,9 um im Durchmesser.
  • Biochemische Eigenschaften
  • - Die Ergebnisse der biochemischen Eigenschaften und der Säureproduktion aus Kohlehydraten werden in der Tabelle 1 und der Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 1 Biochemische Eigenschaften der Kultur N731-15 Zersetzung von: Adenin Calciummalat Casein Cellulose Hypoxanthin Tyrosin Xanthin Hydrolyse von: Aesculin Hippurat Stärke Produktion von: Schwefelwasserstoff Melanin Gelatinase Nitratreduktase Phosphatase Urease Wachstum in: Lysozymbouillon Klärung und Koagulation von: Magermilch Verwertung von: Acetat Benzoat Citrat Dextrin Lactat Malat Mucat Oxalat Phenol Propionat Pyruvat Succinat Tabelle 2 Säureproduktion aus (und Verwertung von) Kohlehydraten der Kultur N731-15* Glucose Arabinose Fructose Inosit Mannit Raffinose Rhamnose Saccharose Xylose Adonit Cellobiose Dulcit Erythrit Galaktose Glycerin Lactose Maltose Mannose Melecitose Melibiose α-Methyl-D-glucosid Ribose Salicin Sorbit Sorbose Stärke Trehalose * R. E. Gordon et al., Int. J. Syst. Bacteriol., 24, 54-63 (1974). ** Die Kultur verwertete Raffinose nicht, wenn die Methode von Shirling und Gottlieb (Int. J. Syst. Bacteriol., 16 313-340 (1966)) verwendet wurde.
  • Temperaturverhältnisse
  • - Die Kultur zeigte kein Wachstum bei 10º, 37º oder 45ºC, gutes Wachstum bei 20ºC und gutes bis ausgezeichnetes Wachstum bei 28ºC.
  • Zellwand-Analysen
  • - Die Gesamtzell-Hydrolysate enthielten meso- Diaminopimelinsäure, Galaktose und Arabinose.
  • Mycolat-Analyse
  • - Die Zellwand enthielt keine Mycolate.
  • Phospholipid-Analyse
  • - Die Extrakte der Zellmembran enthielten Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylglycerin und Diphosphatidylglycerin.
  • Summarisch ist die Kultur N731-15 durch das cremefarbige bis blaßgelbliche Substrat-Mycel, den Mangel an Luftmycel und den Mangel an Sporen gekennzeichnet. Die folgenden biochemischen Versuche waren positiv: Zersetzung von Adenin, Calciummalat, Casein, Hypoxanthin, Tyrosin und Xanthin; Hydrolyse von Stärke; Produktion von Hydrogensulfid; Produktion von Gelatinase, Nitratreduktase, Phosphatase und Urease; Wachstum in 5%iger NaCl; Klärung und Koagulierung von Milch; Verwertung von Acetat, Citrat, Lactat, Malat, Propionat, Pyruvat und Succinat. Negative Eigenschaften waren: Zersetzung von Cellulose; Hydrolyse von Aesculin und Hippurat; Produktion von Melanin; Wachstum in Lysozym-Bouillon; Verwertung von Benzoat, Dextrin, Mucat, Oxalat und Phenol. Säure wurde produziert aus Glucose, Arabinose, Fructose, Mannit, Raffinose, Rhamnose, Xylose, Adonit, Cellobiose, Erythrit, Galactose, Glycerin, Mannose, Ribose, Sorbit, Stärke und Trehalose; jedoch nicht von Inosit, Saccharose, Dulcit, Lactose, Maltose, Melezitose, Melibiose, α-Methyl-D- glucosid, Salicin und Sorbose. Die Zellwandung, welche meso-Diaminopimelinsäure, Galactose und Arabinose enthielt, ist vom Typ IV, wie dies von Lechevalier und Lechevalier definiert wurde. Die Kultur enthielt keine Mycolate, jedoch enthielt sie Phosphatidylethanolamin außer Phosphatidylglycerin und Diphosphatidylglycerin - ein Typ PII Phospholipid-Muster. Diese Eigenschaften passen in die Beschreibung des Genus Amycolatopsis, in jüngster Zeit durch Lechevalier et al. in Int. J. Syst. Bacteriol., 36, 29-37 (1986) vorgeschlagen.
  • Unter den darin beschriebenen Spezies erinnert A. orientalis stark an die Kultur N731-15 in den meisten der biochemischen Untersuchungen. Mehrere Unterschiede wurden festgestellt. Die Kultur N731-15 unterscheidet sich von A. orientalis in der Zersetzung von Adenin, dem Mangel an Aesculinase, dem Mangel an Säureproduktion aus Inosit, Lactose und α-Methyl-D-glucosid. Auf der Basis der oben erwähnten Daten ist die Kultur N731-15 als ein neuer Stamm von Amycolatopsis orientalis (Pittenger & Brigham) Lechevalier, Prauser, Labeda & Ruan, anzusehen. Er wurde bei der American Type Culture Collection 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, unter den Bedingungen des Budapester Vertrags am 9. Oktober 1986 unter der Eintrittsnummer ATCC 53550 hinterlegt.
  • Die Züchtung von Amycolatopsis orientalis ATCC 53550 und die Isolierung des Antibiotikums UK-69,753 können unter Bedingungen durchgeführt werden, ähnlich denjenigen, wie sie ganz allgemein zur Herstellung von Antibiotika durch Fermentation verwendet werden. Die Züchtung findet bevorzugterweise in wässerigen Nährmedien unter submersen aerobischen Bedingungen und unter Rühren bei einer Temperatur von 24º bis 36ºC statt. Für die Züchtung brauchbare Nährmedien umfassen eine Quelle von assimilierbarem Kohlenstoff, wie von Zuckern, Stärken und Glycerin; eine Quelle von organischem Stickstoff, wie Casein, enzymatische Verdauung von Casein, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Erdnußmehl, Weizengluten, Sojamehl, Fleischmehl und Fischmehl. Eine Quelle von Wachstumssubstanzen, wie lösliches Korn, Fischmehl, Baumwollsamenmehl und Hefeextrakt, als auch Mineralsalze, wie Natriumchlorid und Calciumcarbonat, und Spurenelemente, wie Eisen, Magnesium, Kupfer, Zink, Cobalt und Mangan, können ebenfalls mit vorteilhaften Ergebnissen verwendet werden. Wenn ein übermäßiges Schäumen während der Fermentation auftritt, können Antischaummittel, wie Polypropylenglykole oder Silicone, zu dem Fermentationsmedium zugesetzt werden. Die Belüftung des Mediums in Tanks für submerses Wachsum wird bevorzugterweise in der Rate von etwa 1/2 bis 2 Volumina an steriler Freiluft pro Volumen der Fermentationsbrühe pro Minute aufrechterhalten, eingepreßt in die Brühe durch einen Verteiler. Das Rühren kann mittels Rührwerken aufrechterhalten werden, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind. Die Rate der Rührung hängt von dem Typ des verwendeten Rührers ab. Eine Schüttelflasche wird üblicherweise mit 150 bis 200 Zyklen pro Minute betrieben, wohingegen ein Fermenter gewöhnlich mit 100 bis 1700 Umdrehungen pro Minute arbeitet. Aseptische Bedingungen müssen selbstverständlich während des Transfers des Organismus und während seines Wachstums aufrechterhalten werden.
  • Impfmaterial für die Herstellung des Antibiotikums gemäß dieser Erfindung kann erhalten werden, indem man ein Wachstum von einer Schrägfläche der Kultur oder mit der Kultur geimpfte Roux-Flaschen verwendet. Ein festes, für das anfängliche Wachstum des Organismus auf Schrägflächen und in Roux-Flaschen geeignetes Medium ist ATCC-Medium Nr. 172. Die Züchtung kann zur Impfung von entweder Schüttelflaschen oder von Impfmaterial-Behältern verwendet werden, oder es können die Impfmaterial-Behälter aus den Schüttelflaschen besät werden. Das Wachstum in geschüttelten Flaschen wird im allgemeinen sein Maximum in 4 bis 5 Tagen erreicht haben, wohingegen Impfmaterial in submersen Impfmaterial-Behältern gewöhnlich in 3 bis 6 Tagen im günstigsten Zeitraum sein wird. Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Silicagel ist ein brauchbares Werkzeug zur Ermittlung des in dem Fermentationsmedium erzeugten Antibiotikums und zur Analyse der Zusammensetzung von aus den Fermentationsbrühen extrahierten rohen und gereinigten Materialien. Die Chromatogramme werden mit Chloroform:Methylalkohol (90:10) entwickelt und die antibiotische Verbindung durch UV-Licht bei 254 nm sichtbar gemacht.
  • Das durch Fermentation von Amycolatopsis orientalis, ATCC 53550 erzeugte Antibiotikum UK-69,753 kann durch Extrahieren der gesamten, nicht filtrierten Fermentationsbrühe mit einem organischen Lösungsmittel, wie Chloroform Ethylacetat, Methylisobutylketon oder Butanol bei dem natürlicherweise herrschenden pH- Wert gewonnen werden. Andererseits kann das Mycel abgetrennt werden, nachdem das Wachstum beendet und das Filtrat mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert worden ist. Der Lösungsmittelextrakt kann dann zu einem dünnen Sirup eingeengt und die reinen Antibiotika durch Chromatographie erhalten werden, oder es kann, frei nach Wahl, ein Lösungsmittel, wie Hexan zu dem dem Lösungsmittelextrakt zugesetzt werden, um einen mit dem Antibiotikum angereicherten Feststoff auszufällen. Dieser Feststoff kann dann durch Chromatographie und/oder Gegenstromverteilung aufgearbeitet werden, um das reine Antibiotikum zu isolieren.
  • Das bevorzugte Verfahren zur Abtrennung und Gewinnung der antibiotischen Verbindung der Erfindung ist folgendes:
  • Das Filtrat von einer Fermentation von Amycolatopsis orientalis ATCC 53550 wird mit Ethylacetat extrahiert. Der Lösungsmittelextrakt liefert bei der Verdampfung des Lösungsmittels im Vakuum einen dunklen Sirup. Zusatz von Hexan fällt einen dunklen Feststoff aus, welcher das Antibiotikum enthält, wie dies durch Dünnschichtchromatographie gezeigt wird. Eine weitere Anreicherung des Antibiotikums wird durch Gegenstromverteilung und/oder Säulenchromatographie bewirkt. Das Produkt kann, falls gewünscht, durch Säulenchromatographie oder Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie weiter gereinigt (und voneinander getrennt) werden.
  • Die antibiotische Verbindung der Erfindung ist sauer und wird kationische Salze durch Reaktion mit basischen Mitteln liefern. Alle derartigen Salze sind innerhalb des Rahmens der Erfindung. Diese Salze können mittels herkömmlicher Methoden für Antibiotika dieser Klasse hergestellt werden.
  • Bei einem Verfahren wird eine Lösung des Antibiotikums in einem flüchtigen, mit Wasser nicht mischbaren, organischen Lösungsmittel mit einer wässerigen Lösung gewaschen, die zumindest ein stöchiometrisches Äquivalent, und bevorzugterweise einen großen Überschuß, eines geeigneten basischen Mittels enthält. Nach Trocknen der organischen Lösungsmittel-Lösung wird diese im Vakuum verdampft und liefert das gewünschte kationische Salz. Typische basische Mittel, die für diesen Zweck verwendet werden können, schließen Alkalimetallhydroxide, wie Natriumhydroxid und Kaliumhydroxid, Erdalkalimetallhydroxide, wie Calciumhydroxid und Bariumhydroxid, und Ammoniumhydroxid, ein.
  • Analytische und Spektraldaten für UK-69,753 zeigen, daß die Verbindung die nachfolgende Struktur besitzt:
  • Das Antibiotikum UK-69,753 zeigt hemmende Wirkung gegen das Wachstum einer Anzahl von Mikroorganismen. In der nachstehenden Tabelle I sind die Ergebnisse von in vitro-Untersuchungen summarisch wiedergegeben. Für diese Untersuchung wurde jeder Organismus in einer Reihe von Teströhrchen, enthaltend Nährmedium und variierende Konzentration des Antibiotikums UK-69,753, zur Bestimmung der Mindestkonzentration der Verbindung in mcg/ ml, welche das Wachstum des Organismus über einen Zeitraum von 24 Stunden (MIC) inhibiert, geimpft. Tabelle I Antibakterielle Aktivität Organismus Stamm-Nr. MIC, mcg/ml Antibiotikum UK-69,753 Staphylococcus aureus Actinomyces pyogenes Pasteurella multocida Clostridium perfringens Bacteroides fragilis Fusobacterium necrophorum Treponema hyodysenteriae Moraxella bovis
  • Gegen die gramnegativen Bakterien, wie Escherichia coli waren die MIC-Werte > 50.
  • Aus den obigen in vitro-Daten ist zu ersehen, daß UK-69,753 besonders brauchbar in der Bekämpfung von T. hydodysenteriae- Infektionen beim Schwein sein sollte.
  • Für die Zwecke der Bekämpfung von Schweinedysenterie kann das Antibiotikum UK-69,753 an Schweine als solches verabreicht werden, oder bevorzugterweise in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung, in welcher das Antibiotikum mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel gemischt ist.
  • Die erwähnte pharmazeutische Zusammensetzung wird nach Standardverfahren für ein Veterinär-Antibiotikum hergestellt.
  • Die Verbindung der Formel (I) kann beispielsweise oral in der Form von Elixieren, Sirupen, Lösungen und Suspensionen verabreicht werden, z.B. in einer Menge von 1 bis 50 mg pro kg des Körpergewichts des Tieres pro Tag. Lösungen und Suspensionen können wässerig, nicht-wässerig oder partiell wässerig sein. Für parenterale Verabreichung werden sterile, wässerige Lösungen bevorzugt. Die parenterale Verabreichung schließt intramuskuläre, intraperitoneale, subkutane und intravenöse Anwendung ein. Für intravenöse Anwendung sollte die Gesamtkonzentration der gelösten Stoffe einreguliert werden, um das Präparat isotonisch zu machen.
  • Das proportionale Verhältnis des Antibiotikums zu dem pharmazeutisch verträglichen Träger wird von der ins Auge gefaßten Dosis und dem Wege der Verabreichung abhängen; jedoch wird das proportionale Verhältnis normalerweise in dem Bereich von 1:10 bis 2:1, insbesondere von 1:5 bis 1:1, liegen.
  • Auch wenn das Antibiotikum der Erfindung zur Bekämpfung von Schweinedysenterie verwendet wird, ist es sehr geeignet, die Verbindung durch Einmischen in das Tierfutter zu verabreichen. In diesem Falle wird das Antibiotikum dem Tierfutter in einer Menge zugesetzt, welche die geeignete Tagesdosis des Antibiotikums sicherstellt, z.B. in einer Menge von 1 bis 100 ppm.
  • Der verschreibende Veterinär wird letzten Endes die Dosis des Antibiotikums, das zur Bekämpfung der Schweinedysenterie verabreicht wird, bestimmen, und diese Dosis wird gemäß dem Verabreichungswege und der Schwere der Symptome der Tiere variieren.
  • Der Wert von tierischen Futtermitteln wurde gewöhnlich direkt durch Füttern des Tieres bestimmt. Die Britische Patentschrift 1 197 826 beschreibt im Detail eine in vitro-Pansentechnik, wodurch die durch Mikroorganismen verursachten auftretenden Änderungen in Futtermitteln leichter und mit größerer Genauigkeit in der Bewertung von Tierfuttermitteln gemessen werden. Diese Arbeitsweise umfaßt die Verwendung eines Apparats, in welchem die Verdauungsprozesse der Tiere durchgeführt und in vitro studiert werden. Die tierischen Futtermittel, das Pansen-Impfmaterial und viele, das Wachstum fördernde Mittel werden eingeführt in und abgezogen aus einer Laboratoriumseinheit unter sorgfältig gesteuerten Bedingungen und die stattfindenden Änderungen kritisch und progressiv während des Verbrauchs des Futters durch den Mikroorganismus studiert. Ein Anstieg im Propionsäure-Gehalt der Pansenflüssigkeit zeigt an, daß eine erwünschte Reaktion in der gesamten Leistungsfähigkeit des Wiederkäuers durch das wachstumfördernde Mittel in der Futterzusammensetzung bewirkt wurde. Die Änderung im Propionsäure-Gehalt wird in Prozenten des Propionsäure-Gehalts angegeben, die in der Kontroll-Pansenflüssigkeit gefunden werden. Es wurden langzeitige in vivo-Fütterungsuntersuchungen angewandt, um eine zuverlässige Korrelation zwischen dem Propionsäure-Anstieg in der Pansenflüssigkeit und dem verbesserten tierischen Verhalten zu zeigen.
  • Pansenflüssigkeit wird von einer fistulierten Kuh gesammelt, die mit einer kommerziellen mästenden Ration plus Heu gefüttert wurde. Die Pansenflüssigkeit wird sogleich durch weitmaschige Gaze filtriert und 10 ml in einen konischen 50 ml- Kolben, enthaltend 400 mg Standardsubstrat (68 % Maisstärke + 17 % Cellulose + 15 % extrahiertes Sojabohnenmehl), 10 ml eines pH 6,8-Puffers und die Testverbindung, eingefüllt. Die Kolben wurden mit sauerstoffreiem Stickstoff etwa 2 Minuten lang begast und in einem gerüttelten Wasserbad bei 39ºC etwa 16 Stunden lang inkubiert. Alle Versuche wurden dreifach ausgeführt.
  • Nach der Inkubation wurden 5 ml der Probe mit 1 ml 25%iger Metaphosphorsäure gemischt. Nach 10 Minuten wurden 0,25 ml Ameisensäure zugesetzt und die Mischung 10 Minuten lang bei 1500 UpM zentrifugiert. Proben wurden dann mittels Gas-Flüssig- Chromatographie nach dem Verfahren von D. W. Kellog, J. Dairy Science, 52, 1690 (1969) analysiert. Peak-Höhen für Essigsäure, Propionsäure und Buttersäure wurden für Proben aus unbehandelten und behandelten Inkubationskolben bestimmt.
  • Wenn das Antibiotikum UK-69,753 in einer Menge von 1,3 Mikrogramm pro Milliliter nach diesem in vitro-Verfahren getestet wurde, bewirkte dies einen Anstieg von etwa 33 % in der Produktion von Propionsäure über derjenigen, die in der Kontroll-Lösung ohne zugesetztes Antibiotikum UK-69,753 produziert worden war. Vergleichsweise produzierte die kommerziell verfügbare Verbindung Salinomycin (ein Polyether-Antibiotikum) bei 10 mcg/ml etwa einen Anstieg von 61 % von Propionsäure über den Kontrollversuch.
  • Diese Ergebnisse zeigen, daß das Antibiotikum UK-69,753 die Futterwertung bei Wiederkäuern, wie Rindvieh und Schaf, verbessern wird. Die Verbindung wird auch einen ähnlichen Effekt bei monogastrischen Tieren, wie Schweinen und Kaninchen, aufweisen. Das Antibiotikum UK-69,753 kann in Futerzusammensetzungen als freie Säure, Natriumsalz, Kaliumsalz oder Mischungen derselben inkorporiert werden. Rohe Formen des Antibiotikums UK-69,753 oder getrocknete Fermentationsbouillon, enthaltend das Antibiotikum, kann ebenfall in Futtermittelzusammensetzungen in den gewünschten Wirksamkeitskonzentrationen inkorporiert sein.
  • Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung
  • Beispiel 1 1. Herstellung des Impfmaterials
  • Es wurde ein steriles wässeriges Medium der folgenden Zusammensetzung hergestellt. Bestandteil Gramm/Liter Glucose Stärke "Oxoid"-(Handelsmarke)-Pepton "Oxoid"-(Handelsmarke)-Hefe "Lab Lemco"-(Handelsmarke)-Fleischextrakt Calciumcarbonat Wasser (zugesetzt nach Einstellung des Mediums auf pH 7)
  • Fünfzig ml des Mediums werden in 300 ml-Schüttelkolben verteilt und 30 Minuten lang bei 120ºC und 15 psi sterilisiert. Nach dem Abkühlen wird das Medium mit einer vegetativen Zellsuspension aus einer Schrägkultur von Amycolatopsis orientalis ATCC 53550 geimpft.
  • Die Kolben werden bei 28ºC auf einem Rotationsshaker mit einer Verlagerung von 1-1/2 bis 2-1/2 inches und 150 bis 200 Zyklen pro Minute zwei Tage lang geschüttelt.
  • 2. Herstellung des Zweitstufen-Impfmaterials
  • Ein die entwickelte Kultur enthaltender Schüttelkolben wurde zum Impfen eines 2,8 Liter-Fermentationskolbens (ein "Fernbach"), enthaltend einen Liter des sterilen Mediums der oben beschriebenen Zusammensetzung, verwendet. Der "Fernbach" wird bei 28ºC auf einem Rotationsshaker mit einer Verlagerung von 1-1/2 bis 2-1/2 inches und 150 bis 200 Zyklen pro Minute zwei Tage lang geschüttelt.
  • 3. Herstellung von UK-69,753
  • Es wurden zwei "Fernbachs", enthaltend die entwickelte Kultur, zum Impfen eines 130 Liter-Fermentationsbehälters, enthaltend 70 Liter eines sterilen wässerigen Mediums der folgenden Zusammensetzung, verwendet: Bestandteil Gramm/Liter "Cerelose"-(Handelsmarke)-Glucosemonohydrat Maisstärke "Trusoy"-(Handelsmarke)-Sojabohnenmehl Brennerei-Lösliches Natriumchlorid Calciumcarbonat Cobaltchlorid Wasser pH 7,2
  • Die Fermentation wurde bei 28ºC unter Rühren mit 450 Umdrehungen pro Minute und einer Belüftung von einem Volumen Luft pro Volumen Brühe pro Minute durchgeführt, bis eine wesentliche Aktivität beobachtet wurde (auf Basis von HPLC-Assay), gewöhnlich nach 4 bis 9 Tagen. Das Antibiotikum wurde unter Anwendung von HPLC-Bedingungen wie folgt ermittelt:
  • Säule : Waters C&sub1;&sub8; u "Bondapak" (Handelsmarke) 15 cm x 4,0 mm
  • Eluiermittel: 0,1M KH&sub2;PO&sub4; (pH 3,5): Acetonitril, 65:35
  • Fluß : 1,5 ml/min
  • UV : 350 nm
  • Temperatur : 40ºC
  • Die Retentionszeit von UK-69,753 beträgt unter diesen Bedingungen typischerweise 11 Minuten.
  • Die antibiotische Komponente in der Brühe und den Rückgewinnungsströmen kann auch erfaßt werden unter Verwendung von Silicagel-Platten, entwickelt mit Chloroform:Methanol (90:10) und sichtbar gemacht werden durch UV-Licht bei 254 nm.
  • Am Ende dieses Zeitraums wurde die gesamte Brühe mit Ethylacetat extrahiert, und das Lösungsmittel abgetrennt und eingeengt, wobei man einen öligen Rückstand erhielt. Zusatz von Hexan (500 ml) fällte einen Feststoff aus, der durch Filtration abgetrennt wurde (100 mg). Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung eines Waters "Prep 500"-(Handelsmarke)-Systems mit einem C&sub1;&sub8;-Umkehrphase-"Prep-Pak" und einer mobilen Phase von 0,1M Kaliumdihydrogenphosphat:Acetonitril (65:35) lieferte Fraktionen, die reich an UK-69,753 waren. Das organische Lösungsmittel wurde durch Verdampfen unter Vakuum entfernt und das Antibiotikum in Ethylacetat extrahiert. Abtrennung der organischen Schicht und Verdampfung des Lösungsmittels lieferte UK-69,753 als gelben Feststoff (5 mg).
  • Beispiel 2
  • Ein 2000 Liter-Fermenter, enthaltend 1200 Liter steriles Medium der folgenden Zusammensetzung, wurde mit 70 Liter eines Impfmaterials von Amycolatopsis orientalis, ATCC 53550, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, geimpft. Bestandteil Gramm/Liter "Cerelose"-(Handelsmarke)-Glucosemonohydrat Maisstärke "Trusoy"-(Handelsmarke)-Sojabohnenmehl Brennerei-Lösliches Natriumchlorid Calciumcarbonat Cobaltchlorid Wasser pH 7,2
  • Der Fermenter wurde auf 28ºC unter Belüftung und Rühren mit 180 Umdrehungen pro Minute gehalten. Nach 168 Stunden wurde die gesamte Brühe filtriert und das Filtrat mit 850 Liter Ethylacetat extrahiert. Die Solvat-Extrakte wurden abgetrennt und unter Vakuum bis auf 1 Liter eines öligen Rückstands eingeengt, von dem geschätzt wurde, daß er etwa 20 g UK-69,753 nach der oben beschriebenen HPLC-Methode enthält. Bei Zugabe von 4 Liter Hexan wurde ein Feststoff ausgefällt und durch Filtration gesammelt (128 g).
  • Sechsundfünfzig Gramm des erwähnten 128 g-Feststoffs wurden einer Sechs-Rohr-Gegenstromverteilung unter Verwendung von 3:1 Ethanol/Wasser (2 Liter Gesamtvolumen) als die unteren Schichten und Toluol (2 Liter) als die oberen Schichten, unterworfen. Das Antibiotikum konzentrierte sich in den ersten drei unteren Schichten. Diese wurden vereinigt und das Ethanol unter vermindertem Druck entfernt. Die zurückbleibende wässerige Phase wurde dreimal mit 1,5 Liter Methylenchlorid extrahiert. Diese Extrakte wurden vereinigt, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft, wobei man 12,2 g eines halbfesten Stoffes erhielt. Dieses Material wurde in 300 ml Ethylacetat aufgenommen und langsam in 700 ml rasch gerührtes Hexan eingegossen. Nach 30 Minuten langem Rühren des resultierenden Niederschlags wurde filtriert und im Vakuum getrocknet, wodurch man 9,05 g eines gelb-lohfarbenen Feststoffs erhielt. 2,0 g dieses Feststoffs wurden der Silicagel-Chromatographie unterworfen, wobei mit 12:1 Chloroform:Methanol eluiert wurde. Nach Fraktionsanalyse durch Dünnschichtchromatographie wurden die reinen Fraktionen vereinigt und man erhielt 0,8 g UK-69,753 als einen amorphen, gelben Feststoff.
  • Wenn man die gesamten 128 g des rohen Feststoffs auf diese Weise verarbeitete, betrug die Gesamtausbeute 3,9 g UK-69,753; Fp. : 153º bis 155ºC.
  • Analyse für C&sub5;&sub8;H&sub8;&sub6;N&sub2;O&sub1;&sub8;:
  • Berechnet: C 63,39 %, H 7,83 %, N 2,55 %;
  • Gefunden : C 62,88 %, H 8,19 %, N 2,26 %.
  • In methanolischer Lösung hat UK-69,753 herausragende UV- Absorptionsmaxima bei 233 und 253 nm. Zugabe einiger weniger Tropfen von 0,1n-Natriumhydroxid-Lösung verschiebt diese Maxima nach 226 und 348 nm und die Zugabe einiger weniger Tropfen von 0,1n-HCl bewirkt einen Anstieg auf Absorptionsmaxima bei 212, 233 und 361 nm. Infrarot-Spektrum (KBr) cm&supmin;¹: 3416, 2967, 2926, 1648, 1585, 1453, 1414, 1380, 1259, 1083, 1025.

Claims (6)

1. Die antibiotische Verbindung der Formel
in welcher R
oder ein Salz davon, ist.
2. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums der Formel (I) gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es das Züchten des Mikroorganismus Amycolatopsis orientalis ATCC 53550, oder eines Mutanten oder einer rekombinanten Form davon, der die Fähigkeit besitzt, das erwähnte Antibiotikum in einem wässerigen Kulturmedium, enthaltend eine assimilierbare Quelle von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganischen Salzen, unter submersen aerobischen Fermentationsbedingungen zu produzieren, bis eine zurückgewinnbare Menge des erwähnten Antibiotikums erhalten wird, umfaßt.
3. Eine Futtermittelzusammensetzung für Schwein, Wiederkäuer oder Geflügel, dadurch gekennzeichnet, daß sie das Antibiotikum der Formel (I), wie beansprucht in Anspruch 1, oder ein Salz davon, enthält.
4. Verfahren zur Unterstützung des Wachstums und/oder der Erhöhung des Nutzungsgrads der Nahrungsmittelverwertung bei Geflügel, Schwein oder Wiederkäuern, dadurch gekennzeichnet, daß es das Verabreichen einer wirksamen Menge des Antibiotikums der Formel (I), oder eines Salzes davon, wie in Anspruch 1 beansprucht, umfaßt.
5. Biologisch reine Kultur des Mikroorganismus Amycolatopsis orientalis ATCC 53550, oder eines Mutanten oder einer rekombinanten Form davon, dadurch gekennzeichnet, daß sie fähig ist, das Antibiotikum der Formel (I), wie in Anspruch 1 beansprucht, in einer zurückgewinnbaren Menge nach Kultivierung in einem wässerigen Nährmedium, enthaltend assimilierbare Quellen von Kohlenstoff, stickstoff und anorganischen Salzen, zu produzieren.
6. Veterinärzusammensetzung, enthaltend ein Antibiotikum der Formel (I), wie in Anspruch 1 beansprucht, oder ein Salz davon, und ein nicht-toxisches Verdünnungsmittel oder Träger.
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