DD220336A5 - Verfahren zur herstellung von 19-epi-dianemycin - Google Patents

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DD220336A5
DD220336A5 DD84260075A DD26007584A DD220336A5 DD 220336 A5 DD220336 A5 DD 220336A5 DD 84260075 A DD84260075 A DD 84260075A DD 26007584 A DD26007584 A DD 26007584A DD 220336 A5 DD220336 A5 DD 220336A5
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Walter P Cullen
Hiroshi Maeda
John C Ruddock
Junsuke Tone
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Pfizer
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Abstract

ANTIBIOTISCHES 19-EPI-DIAMEMYCIN, VERFAHREN ZU SEINER DURCH FERMENTIEREN EINES NEUEN STAMMES VON STREPTOMYCES HYGROSCOPICUS, SEINE ISOLIERUNG AUS DER FERMENTATIONSBRUEHE UND SEINE VERWENDUNG ALS MITTEL GEGEN KOKZIDIEN UND ANTIBAKTERIELLES MITTEL GEGENUEBER GRAMPOSITIVEN BAKTERIEN.

Description

P,C. (Ph) 6599
PFIZER INC
235 East 42nd Street New York, N.Y. 10017 USA
Verfahren zur Herstellung von 19-Epi-dianemycin
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung bezieht sich auf ein neues Polyether-Antibiotiküm, auf ein mikrobiologisches Verfahren zu seiner Herstellung und ein Verfahren zu seiner Gewinnung, insbesondere bezieht sie sich auf -19-Epi-dianemycin, seine Erzeugung durch aerobes Fermentieren eines neuen Stammes von Streptomyces hygroscopicüs, seine Gewinnung aus Fermentationsbrühe und seine Verwendung als Mittel gegen Kokzidien und als antibakterielles Mittel.
Die Kokzidiose, eine gewöhnliche und weit verbreitete Infektion bei Geflügel, wird durch eine oder mehrere verschiedener Arten von Protozoen-Parasiten der Gattung Eimeria verursacht. Zwei Arten von Kokzidiose, caecale und intestinale,, sind bekannt. . Die erste Art wird von E. tenella verursacht und zeichnet sich
durch starke Blutungen aus. Die zweite Art wird von verschiedenen' Arten von Eimeria, wie E. acervulina, E. necatrix, E. maxima, E. hagani, E. mitis, E. praecox und E. brunetti, verursacht. Bei Truthühnern sind E. adejioides und E. maleagrimitis Verurscher der Kokzidiose.
Die wirtschaftlichen Auswirkungen von Kokzidiose sind weitreichend, und die Beseitigung oder Steuerung der Krankheit ist daher von großer Bedeutung für die Geflügelindustrie.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen und Ziel der Erfindung '/ : ' ' .' · '-'..'" ''.
Eine große Anzahl von Strukturtypen von Verbindungen ist als Antikokzidienmittel beschrieben worden, darunter Polyether-Antibiotika, wie Monensin (J. Amer. Chem. Soc., 89, 5737 (1967)); Nigericin (Biochem. Biophys. Res. Comm., 33, 29 (1968)); Grisorixin (J. Chem. Sqc. Chem. Conunun., 1421 (197O)); Dianemycin (J. Antibiotics 22, 161 (1969); US-PS 3 577 531 vom 4. Mai 1971); Salinomycin (J. Antibiotics, 27, 814 (1974)); X-537A (J. Chem. Soc. Chem. Commun., 967 (1972)); X-206 (J. Chem. Soc. Chem. Commun., 927 (1971)) ; A2O4A (J. Amer. Chem. Soc., 95, 3399 (1973)); Mutalomycin (JV Antibiotics, 30, 903 (1977)); Ionomycin (J. Amer* Chem. Soc., 101 , 3344 (1979)); K-41B (J. Antibiotics, 3^, 169 (1979)); A-130B und A-130C (J. Antibiotics 3_3, 94 (198O)); Leuseramycin (J. Antibiotics, 3_3 ,137 (198O)); und Ä-28695 B (J. Antibiotics, 3^, 252 (1980)). Die Materie ist von Westley in einer Übersicht, "Polyether Antibiotics", Adv.
ppl. Microbiol., 22, 177 (1977) und von Shumard et al., Antimicrob. Agents & Chemother. 369-377 (1967) zusammengestellt wor-
Schweine-Dysenterie, eine der gewöhnlichsten Schweineerkrankungen in den Vereinigten Staaten, herrscht auch in vielen anderen Ländern und verursacht alljährlich große wirtschaftliche -Vex-r;.: ; iuste. Es wurde jüngst gefunden, daß eine große Spirochaete,
63 421 18
' — 3 — ( ' ' - -.- '
Treponema hyodysenteriae, zumindest eineHauptquelle der In- : folcfcion (Harris, D. L. et al., "Swine Dysentery-1- Inoculation of Pigs with Treponema hyodysenteriae (Hew Species) and Reproduction of the Disease", Vet. Med/SAC 62, 61-64 (1972).
Loistungcsteigerung (erhöhte Y/achstumsgeschwindigkeit und/oder ge .'steigerte. Putter-Nutzleistung) in Wiederkäuern, wie Rindern, ist ein weiteres, wirtschaftlich wünschenswertes Ziel der VetorinärWissenschaft. Von "besonderem Interesse ist die Wachs-· tumsfordcrung, die durch Steigerung der Futter-Nutzleistung erzielt wird. Der Mechanismus der Ausnutzung des 'Nährstoff-·. liauptanteils (Kohlenhydrate) von Wiederkäuer-Futtermitteln ist gut bekannt. Mikroorganismen im Pansen der Tiere "bauen Kohlenhydrate zu Monosacchariden ab, die dann in Pyruvate übergeführt werden. Pyruvate werden im Stoffwechsel, durch mikrobiologische Prozesse zu Acetaten, Butyraten oder Propionaten abgebaut, die susa.üuien als flüchtige Fettsäuren (fFS) bekannt sind. Bezüglich einar stärker ins einzelne gehenden Erb'rterung s. Leng in ^Physiology of Digestion and Metabolism in the Ruminant11, Phillipson et al., Oriel Press, Newcastle-upon-Tyne, lilngland, 1970, 3. 408-410.
Bio relative·fFS-Nutzleistung wird von McCuIlough in "Feedstuffs", \19.6.1971, S. 19 üskeland et al. in J. An. Sei. ^3, 282 (4971). und Church et al. in "Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants", Bd. 2, 1971, S. 622 und 625, diskutiert. Obgleich Acetate und Butyrate verwertet werden, werden Propionate mit größerer Nutzleistung verwertet. -Ferner können, wenn zu wenig Propionat verfügbar'ist, Tiere Ketose entwickeln. Bine vorteilhafte Verbindung simuliert daher Tiere zur Produktion eines höheren Anteils an Propionaten aus Kohlenhydraten, v/odurch die Kohlenliydrat-NutzIeistung gesteigert und auch das Auftreten von Ketose herabgesetzt wird. . - ,
Darlegung des Wesens der Erfindung ' i ' . ·
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neues Vorfahren
63 421 18 — 3a ~
aar Herstellung von 19-ßpi-aianemycin zur Verfügung zu Stellen. ' : . " . ;
Is wurde nun gefunden, daß ein neuer Stamm von Streptomyces
hygroscopicus, isoliert aus einer in Washington, D.C, genommenen Bodenprobe , ein neues und wertvolles Antibiotikum mit gegen Kokzidien gerichteten Eigenschaften hervorbringt. Dieses neue Produkt wurde isoliert und als 19-Epi-dianemycin identifiziert.
" '. ' . ' ' ' A '
Der erfindungsgemäße, das Antibiotikum erzeugende Mikroorganis- . ..· . \i ,
mus wurde aus einer in Washington, D.C, USA, genommenen Bodenprobe isoliert. Er wurde.als Kultur N-483-29 bezeichnet. Taxonomische Untersuchungen dieses Mikroorganismus erfolgten durch L. H. Huang, der die folgende Beschreibung lieferte. Auf ,der Grundlage seiner Untersuchungen schloß er, daß dies ein Stamm von Streptomyces hygroscopicus (Jensen) Waksman und Henrici, ;.is't. .·.; ' , . ' ''
Die neue Kultur besitzt die engen Hyphen der Actinomycetalen, produziert Spdrenketten am Luftmyzel und ein unfragmentiertes Substratmyzel/ Die Ergebnisse der Ganzzeil-Analyse sichern ferner, daß es zur Gattung Streptomyces gehört.
Die Kultur N-483-29 wird von einer Schrägkultur in eine ATCC Nr. 172-Brühe verpflanzt und 3 Tage bei 28°C auf einem Schüttler wachsen gelassen. Dann wird 20 min zentrifugiert, dreimal mit sterilem, destilliertem Wasser gewaschen und auf Medien verpflanzt, die gewöhnlich zum Identifizieren von Vertretern der Actinomycetalen verwendet werden.
Die Kultur wird bei 28 C inkubiert. Die Ergebnisse, die zu. verschiedenen Zeiten abgelesen werden können, werden am übliehsten nach 14 Tagen genommen. Die Farben werden in üblicher Terminologie beschrieben, aber exakte Farben werden durch Vergleich mit Farbstreifen aus dem Color Harmony Manual, 4. Auflage, bestimmt. Die Methoden der Ganzzell-Aminosäure- und -Zucker-Analysen sind die in Becker, B.' et al., Appl. Micro- biol., V2, 421-423 (1964) und in Lechevalier, M. P., J. Lab. Clin. Med. 71, 934-944 (1968) beschriebenen.
Die zum Charakterisieren der Kultur und von dergleichen auf ihre Zusammensetzung hin verwendeten Identifikationsmedien wären wie folgt:
1. Trypton-Hefeextrakt-Brühe - (ISP Nr. 1-Medium, Difco)
2.. Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar - (ISP Nr. 2-Medium, Difco).
3. Hafermehl-Agar - (ISP Nr. 3-Medium, Difco) . ,·'...
4. Anorganische Salze-Stärke-Agar - (ISP Nr. 4-Medium, Difco) .. ·'
5. Glycerin-Asparagin-Agar - (ISP Nr. 5-Medium, Difco).
6.-. Pepton^-Hefeextrakt-Eisen-Agar - (ISP Nr. 6-Medium, Difco).
7. Czapek-Saccharose-Agar - S. A. Waksman, The Actinömycetes, Bd. 2, Medium Nr. 1, S. 328, 1961.
8. Glucose-Asparagin-Agar - ibid., Medium Nr. 2, S.328.
9. Bennett"s-Agar - ibid., Medium Nr. 30, S* 331. 10. Emerson.1 s-Agar - ibid. , Medium Nr. 28, S. 331.
• 11. Nähr-Agar - ibid., Medium Nr. 14, S. 330.
12. Gordon and Smith's Tyrosin -Agar - R. E. Gordon und M. M. Smith, Jr. Bact. ££, 147-150, 1955.
13. Casein-Agar - ibid.
14. Calciummalat-Agar - S.. A. Waksman, Bact. Rev. 21 , 1-29, 1957.
15. Gelatine - R. E. Gordon und J.'M-. Mihm, Jr. Bact. 73, 15-27, 1957.
16. Stärke - ibid.
17. Organische Nitrat-Brühe - ibid.
18. Dextrose-Nitrat-Brühe - s. A. Waksman, The Actinomycetes, Bd. 2, Medium Nr. 1,-S. 328, 1961, mit 3 g
Dextrose, Ersatz für 30 g Saccharose und Agar weggelassen. -
19. Kartoffel-Möhren-Agar - M. P. Lechevalier, Jr. Lab.' and Clinical Med. 7±, 934-944, 1968, aber nur 30 g Kartoffeln, 2,5 g Möhren und 20 g Agar verwendet.
20. 2 % Leitungswasser-Agar.
21. Magermilch - Difco.
22. Cellulose-Verwertung -
a) H. L. Jensen, Proc. Linn. Soc. N.S.W. j55_, 231^24 8, .1930. '.' ..
b) M. Levine und H. W. Schoenlein, A Compilation of Culture Media, Medium Nr. 2 511, 1930.
23. Kohlenhydrate - ISP Nr. 9-Medium, Difco. ,
24. Temperaturbereich - ISP Nr. 2-Medium plus 50 ml Kokosnußmilch.
Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar - Wachstum gut, gelbbraun (nahe 3 ie) mit gelblichen· (2ea) Falten oder Membranen, mäßig erhöht, zu membranartigem Nicht-Luft-Myzel gefaltet;vUnterseite blaßgelblich (2ea) mit braunen Linien (3gc, 3ic) ; lösliches Pigment braun (3 Ic, 3 ne).
Hafermehl-Agar - Wachstum mäßig, weiß, gelblich bis grau (1 1/2 ea, 1 1/2 ga, nahe Grau-Reihe 3dc, 3fe), dünn bis leicht erhoben, glatt, hygroskopisch in manchen Bereichen, Luftmyzel gleich wie Oberfläche; Unterseite farblos, cremefarben bis grau (1 1/2 ca, nahe Grau - Reihe 3dc, 3fe); lösliches Pigment blaßgelblich (1 1/2 ca).
Anorganische Salze-Stärke-Agar - Wachstum mäßig bis gut, gelblich bis grau (1ea, 1 1/2 ea, nahe Grau-Serie 3dc, 3fe, 3in) , dünn bis erhoben, glatt, aber nahe der Kante faltig, hygrosko-
pi sch in manchen Bereichen, Luftmyzel gleich wie Oberfläche; Unterseite blaßgelblich bis grau (2ea, nahe Grau-Reihe 3dc, 3fe) ; lösliches Pigment blaßgelblich (1 1/2 ca).
Glycerin-Asparagin-Agar - Wachstum dürftig bis mäßig, farblos bis cremefarben (nahe Grau-Serie 1ba), dünn, glatt, kein Luftmyzel; Unterseite farblos; kein lösliches Pigment.
Glucose-Asparagin-Agar - Wachstum gut, weiß bis cremefarben (2ca), erhöht, faltig, Luftmyzel weiß; Unterseite blaßgelblich (2ea) ; lösliches Pigment blaßgelblich (2ca, 2ea).
Czapek-Sacchardse-Agar - Wachstum mäßig bis gut, cremefarben (2ca), dünn, glatt, mit sich ausbreitender Kante, kein Luftmyzel; Unterseite farblos bis cremefarben (2ca); lösliches Pigment cremefarben (2ca). .
Emersons' Agar - Wachstum gut, gelbbraun (nahe 3gc), erhöht, glatt bis leicht faltig, kein Luftmyzel; Unterseite wie Oberfläche; lösliches Pigment braun (3 Ic).
Nähr-Agar - Wachstum mäßig, cremefarben (1 1/2 ca, 2ca), leicht erhöht, glatt oder als isolierte Kolonien auftretend, kein Luftmyzel; Unterseite blaßgelblich (2ca, 2ea); kein lösliches Pigment.
Bennett's-Agar - Wachstum gut, cremefarben (2ca), mäßig erhöht, faltig bis firstartig, Luftmyzel kein bis spärlich, weiß; Unterseite cremefarben bis blaß gräulich-gelb (2ca, 2gc); lösliches Pigment blaßgelblich (2eaj.
Gordon and Smith's Tyrosin-Agar - Wachstum dürftig bis mäßig, gelblich braun bis dunkelbraun (4ec, 4nl, 5nl), dünn bis leicht erhöht, glatt, kein Luftmyzel; Unterseite braun bis dunkelbraun (5 Ig, 5ni); lösliches Pigment dunkelbraun bis schwarz (5nl, 5pn).
Q
Calciummalat-Agar - Wachstum mäßig, cremefarben (1 1/2 ca), dünn bis leicht erhöht, glatt, kein Luftmyzel; Unterseite wie Oberfläche; kein lösliches Pigment.
Kasein-Agar - Wachstum mäßig bis gut, cremefarben (2ca, 3ca), leicht erhöht, glatt bis leicht faltig, kein Luftmyzel; Unterseite cremefarben; lösliches Pigment rosa-braun (4ia, 4ga) .
Gelatine-Agar - Wachstum gut, cremefarben, (nahe 2ca), mäßig erhöht, glatt,aber nahe der Kante faltig, kein Luftmyzel; Unterseite wie Oberfläche; lösliches Pigment cremefarben.
Stärke-Agar - Wachstum gut, cremefarben (nahe 2ca), mäßig erhöht, faltig, aber kann gegen die Kante glatt sein, kein Luftmyzel; Unterseite wie Oberfläche; lösliches Pigment cremefarben. - '
Kartoffel-Möhren-Agar - Wachstum mäßig, cremefarben (1 1/2 ca), dünn, glatt, Luftmyzel spärlich, weiß; Unterseite farblos bis cremefarben; kein lösliches Pigment.
Leitungswasser-Agar - Wachstum dürftig, farblos bis cremefarben (nahe Grau-Reihe-2ba), dünn, glatt, meist untergetaucht, Luftmyzel spärlich, weiß; Unterseite wie Oberfläche; kein lösliches Pigment.
Morphologische Eigenschaften: Die morphologischen Eigenschaften wurden an anorganische Salze-Stärke-Agar nach 14 Tagen Inkubation beobachtet: Sporenmasse in der Grau-Farbserie; Sporenketten in Abschnitt-Spiralen, leicht offen, von geringem Durchmesser (6 - 10 pm lang und 3 - 4,5 pm breit), 3 - 6 Windungen pro Schlange, 8-30 Sporen pro Sporenkette; Sporophoren ein-., füßig verzweigt; zuweilen quirlig verzweigt; Sporen oval bis elliptisch, gelegentlich stabförmig oder bootförmig, 1,2 - 2,0 χ 0,9 - 1,2 um, warzig, wie sich durch Rasterelektronen-Mikroskopie zeigt.
Biochemische Eigenschaften; Melanin nicht erzeugt; Schwefelwasserstoff erzeugt; Gelatine verflüssigt; Stärke hydrolysiert; Nitrat zu Nitrit in beiden Nitratbrühen reduziert; dürftiges Wachstum und keine Zersetzung auf Jensen's Cellulose und Levine und Schoenlein's Cellulose; Klärung, aber keine Koagulation auf Milch; Kaseinabbau positiv; Calciummalat-Abbau positiv; Tyrosin-Abbau positiv. Kohlenhydratverwertung: Glucose, Arabinose, Fructose, Inosit, Mannit, Raffinose, Rhamnose, Saccharose und Xylose werden alle verwertet.
Temperaturbeziehungen;
21°C -' 28°C 37°C 45bC
gutes bis gutes mäßiges kein ausgezeichnet Wachstum Wachstum Wachstum tes Wachstum
Ganzzeil-Analyse: ;
Die Zellwand enthält LL-Diaminopimelinsäure, aber keine charakteristischen Zucker.
Die Kultur N-483-29 zeichnet sich durch graue Sporen in Masse, Spiral-Sporenketten, Sporen mit einer warzigen Oberfläche und negative Melanin-Reaktion aus. Auf manchen Medien ist das Luftmyzel in manchen Bereichen hygroskopisch. Mit Ausnahme der positiven Verwertung von Saccharose und Raffinose paßt das Isolat in die Beschreibung des Neotyp-Stamms von S. hygroscopicus, veröffentlicht in Int. J.Syst. Bact., 22, 265-394, 1972. Die Verwertung von Kohlenstoffquellen unterscheidet unter Stämmen gemäß H. D. Tresner und E. J. Backus, die ein verbreitertes Konzept der in Applied Microbiology, 4> 243-250, 1956, veröffentlichten Arten vorschlugen. Die Kultur wird somit als ein Stamm von Streptomyces hygroscopicus (Jensen)v Waksman und Henrici angesehen. Sie wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, einer anerkannten Hin-
terlegungsstelle, hinterlegt, die dauerhafte Hinterlegung und leichte Zugänglichkeit für die Öffentlichkeit bietet, wenn auf diese Anmeldung ein Patent erteilt wird. Dieser Mikroorganismus erhielt die Bezeichnung Streptomyces hygroscopicus ATCC 39205. Während der Anhängigkeit dieser Anmeldung steht einem vom Commissioner of the United States Patent and Trademark Office gemäß 37 CFR 1.114 und 35 USC 122 Bestimmten der Zugang zum Mikroorganismus offen. Alle Beschränkungen der Zugänglichkeit für die Öffentlichkeit zum hinterlegten Mikroorganismus werden bei Erteilung des Patents unwiderruflich beseitigt.
Es versteht sich, daß die vorliegende Erfindung nicht auf die Verwendung des vorgenannten Organismus beschränkt ist, der voll auf die obige Beschreibung paßt, und die nur zu Zwecken der Veranschaulichung gegeben ist. Die Verwendung natürlich vorkommender oder künstlich induzierter Mutanten und/oder Varianten soll erwünschtermaßen und gewollt einbegriffen sein, wie z.B. solche, die aus dem beschriebenen Organismus durch verschiedene Maßnahmen, einschließlich Röntgen-, UV-Bestrahlung, Behandeln mit Stickstofflost und dergleichen, erzeugt werden können.
Einbezogen ist auch jeder Organismus, unabhängig von seinem Aussehen oder physiologischen Verhalten, der mit Hilfe der
ϊ
Transformation, Transduktion, genetischen Rekombination oder nach einer anderen genetischen Arbeitsweise entwickelt werden ' <ann, unter Verwendung einer Nukleinsäure oder eines äquivalenten Materials von der hier beschriebenen Spezies, wodurch er die Fähigkeit zur Produktion des herausgearbeiteten, hier beschriebenen Produkts oder zum Weitertragen der hier beschriebenen biochemischen Änderung erworben hat.
Das Kultivieren der Kultur S. hygroscopicus ATCC 39205 erfolgt unter untergetauchten aeroben Bedingungen bei 21 bis 37 C unter Rühren in wässrigen Nährmedien. Typische, zum KuI-
tivieren brauchbare Nährmedien umfassen eine Quelle assimilierbaren Kohlenstoffs, wie Zucker, Stärken und Glycerin; eine Quelle organischen Stickstoffs,wie Kasein, enzymatische Abbauprodukte von, Kasein, Kasaminosäuren, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Erdnußmehl, Weizengluten, Sojamehl, Hefeextrakt, Fleischmehl und Fischmehl; eine Quelle für Wachstumssubstanzen, wie Kornlösliches, Fischmehl, Baumwollsamerünehl und Hefeextrakt, sowie Mineralsalze, wie Natriumchlorid und Calciumcarbonat, und Spurenelemente, wie Eisen, Magnesium, Zink, Kobalt und Mangan; und Calciumcarbonat oder Phosphate als Puffermittel.
Tritt beim Fermentieren zu starkes Schäumen auf, werden im all- ; gemeinen Antischaummittel, wie pflanzliche Ölender Silicone, dem Fermentationsmedium zugesetzt. Belüften des Mediums in . Tanks für das Wachstum im untergetauchten Zustand erfolgt vorzugsweise mit einer Geschwindigkeit von etwa 1/2 bis; 2 Volumi- > ha steriler freier Luft pro Volumen Fermentationsbrühe pro Minute, in die Brühe durch einen Sprenkler gepreßt. Bewegen erfolgt mit Hilfe von dem Fachmann auf dem Fermentationsgebiet im allgemeinen vertrauten Rührern. Die Bewegungsgeschwindigkeit hängt von der Art des verwendeten Rührers ab. Ein Schüttelkolben wird gewöhnlich bei 150 - 200 UpM betrieben, während ein Fermentierbehälter gewöhnlich mit 300 bis 1700 UpM betrieben wird. Aseptische Bedingungen müssen natürlich über die Übertragung des Mikroorganismus und sein gesamtes Wachstum hinweg aufrecht erhalten bleiben.
Inoculum wird durch Abkratzen j vegetativer Zeilen von Schrägkulturen oder mit der N-483-29-Kultur beimpften Roux-Flaschen her/gestellt. Ein festes ·, für das Anfangswachstum auf Schrägkulturen und Roux-Flaschen geeignetes Medium ist das ATCC-,' •Medium Nr. 172.
ATCC 172 g/l
Glucose 10
lösliche Stärke ' 20
Hefeextrakt 5 ...'..
NZ-Amin A 5 ;
Calciumcarbonat 1
destilliertes Wasser auf 1000 ml; ·
pH mit KOH auf 7,0
Agar-Zusatz .. · 20
' ' ' . . ' .' ' ' ' ' \
Vegetative Zellen von Schrägkulturen werden zum Beimpfen von entweder Schüttelkolben oder Impfbehältern verwendet öder alternativ werden die Impfbehälter aus Schüttelkolben beimpft. In Schüttelkolben wird das Wachstum im allgemeinen sein Maximum in 96 bis 120 h erreicht haben, während in den Impfbehältern das Wachstum gewöhnlich in 72 4 96 h in der günstigsten Periode sein wird. Ein Fermentierbehälter wird mit vegetativer Brühe aus den Impfkolben oder -behältern unter völlig aseptischen Bedingungen beimpft und 96 bis 168 h fermentiert. Die Belüftung wird-im Schüttelkolben durch Bewegen eines Schutt-" lers oder in Behältern durch Einpressen steriler Luft durch einen Spre.nkler mit einer Geschwindigkeit von 1/2 bis 2 Volumina Luft pro Volumen Brühe pro Minute aufrecht erhalten. Die ·,.. Bewegungsgeschwindigkeit (Rühren) hängt von der Art des verwendeten Rührers ab, wie oben bemerkt. Die Temperatur wird auf zwischen 24 C und 36 C eingeregelt.
Nach ,Abschluß der Fermentierung wird das Antibiotikum durch Extrahieren der gesamten Brühe mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie n~Butanol, Methylisobutylketon, Ethylacetat oder Chloroform, bei einem pH von 4,0 bis 8,0.gewonnen. Alternativ wird das Myzel mit einem der oben aufgezählten Lösungsmittel abgetrennt und extrahiert, um das Antibiotikum zu isolieren. Der Extrakt wird eingeengt, das Konzentrat in Heptan aufgenommen und an Kieselgel chromatogra-'.phi ort.
Das Fortschreiten der Erzeugung des Antibiotikums beim Fermentieren und die Bioaktivität der Fermentationsbrühe können durch biologischen Test der Brühe unter Verwendung eines empfindlichen Stamms von Staphylococcus aureus oder Bacillus subtilis verfolgt werden. S. aureus ATCC 6538 und B. subtilis ATCC 6633 sind für diesen Zweck.geeignete Stämme. Eine Standard-Plattentesttechnik wird angewandt, wobei die eine mit der Brühe gesättigte Filterpapierscheibe umgebende Hemmzone als Maß der antibiotischen Stärke herangezogen wird. Auch pünnschichtchroinatographie mit Siliciumdioxidgel eignet sich zum Analysieren des in Fermentationsmedien produzierten Antibiotikums und der Zusammensetzung roher und gereinigter, aus den Fermentationsbrühen extrahierter Materialien. Die Analtech-Kieselgel-GF-Chromatogramme werden mit Ethylacetat/Methanol (9:1) oder Chloroform/Methanol (9:1) entwickelt. Die antibiotische Verbindung wird durch Besprühen mit Vanillin-Reagens (3 g Vanillin in 75 ml Ethanol und 25 ml 85%iger Phosphorsäure) und Erwärmen der DC-Platte auf 80 C sichtbar gemacht. Das Antibiotikum erscheint als purpurfarbener Fleck. Die Platte kann auch mit Agar überlagert werden, bekeimt mit entweder S. aureus oder B. subtilis, wozu 2,3,4-Triphenyl-2H-tetrazoliumchlorid-Monohydrat gegeben worden ist, und 16 h bei 37 C inkubiert werden, um das Antibiotikum sichtbar zu machen (weiß gegen einen rosafarbenen Hintergrund).
Antibiotisches 19-Epi-dianemycin entwickelt eine Hemmwirkung
. ' *
gegenüber einer Vielzahl grampositiver Mikroorganismen.
Für diesen Test wird jeder Organismus in eine Reihe von Teströhren eingeimpft, die Nährmedium und unterschiedliche Konzentrationen an 19-Epi-dianemycin enthalten, um die Mindestkonzentration des Antibiotikums in }ig/ml zu bestimmen, die das Wachstum des Organismus über einen Zeitraum von 24 h hemmt (MHK). .
i9-Epi-dianemyciri und seine kationischen Salze entwickeln
ausgezeichnete Aktivität gegenüber Kokzidieninfektionen in Geflügel. Wenn es in die Nahrung von Hühnchen bei Gehalten von 50 bis 200 TpM eingearbeitet ist, sind diese Verbindungen wirksam für die Steuerung von durch Eimeria tenella, E. acervulina, E. maxima, E. brunetti und E. necatrix verursachten Infektionen.
Leistungsdaten für 19-Epi-dianemycin und seine Salze gegenüber Kokzidieninfektionen in Hühnchen wurden wie folgt erhalten. Gruppen von 3 bis 5 weiße Leghorn-SPF-Hahnküken im Alter von 10 Tagen wurden mit einer Breidiät gefüttert, die 19-Epi-dianemycin oder sein Natrium- und/oder Kaliumsalz gleichförmig darin verteilt enthielt. Nach 24 h mit diesem Futter wurde jedes Küken per os mit Oocysten der speziell zu testenden Eimeria-Ärt beimpft. Andere Gruppen von 3 bis 5 Küken im Alter von Tagen erhielten eine ähnliche Breinahrung frei von 19-Epidianemycin und wurden nicht mit Kokzidien infiziert. Diese dienten als normale Kontrolltiefe. Die Behandlungsergebnisse wurden nach 5 Tagen im Falle von E. acervulina und 6 Tagen für alle anderen Testorganismen ausgewertet..
Die zur Messung der gegen Kokzidien gerichteten Aktivität angewandten Kriterien bestanden in Schädigungswerten von 0 bis 4 für E. tenella nach J. E. Lynch, "A New Method for the Primary Evaluation of Anticoccidial Activity", Am. J. Vet. Res. 2_2, 324-326 (1961); und 0 bis 3 für die anderen Arten auf der Grundlage einer Abwandlung des Bewertungssystems, wie es von J. Johnson und W. H. Reid, "Anticoccidial Drugs. Lesion Scoring Techniques in Battery and Floor Pen Experiments in Chicks", Exp. Parasit. 28^, 30-36 (1970) vorgeschlagen wurde. Ein konstantes Verhältnis ergab sich durch Dividieren des Schädigungswertes einer jeden behandelten Gruppe durch den Schädigungswert der infizierten Kontrollgruppe.
Der Wert von Tierfuttern ist im allgemeinen direkt durch Füttern des Tieres bestimmt worden. Die GB-PS 1 197 826 gibt
eine in vitro-Pansentechnik im einzelnen an, wodurch die durch Mikroorganismen hervorgebrachten Änderungen in Futtermitteln leichter und mit großer Genauigkeit bei der Auswertung von Tierfuttermitteln gemessen werden. Diese Technik umfaßt die Verwendung einer Vorrichtung, in der die»Verdauungsvorgänge der Tiere in vitro durchgeführt und untersucht werden. Die Tieriuttermittel, Pansen-Inokulum und verschiedene Wachstumsförderer werden unter sorgfältig kontrollierten Bedingungen in eine Laboreinheit eingeführt und daraus abgezogen, und die erfolgten Änderungen werden kritisch und nach und nach während des Verbrauchs des Futters durch die Mikroorganismen untersucht. Eine Steigerung des Propionsäuregehalts in der Pansenflüssigkeit zeigt an, daß eine wünschenswerte Reaktion in der Wiederkäuer-Gesamtleistung durch den Wachstumsförderer in der Futtermitteizusammensetzung erreicht worden ist. Die Änderung im Propionsäuregehalt wird als Prozentsatz des Propionsäuregehalts in der Pansen-Kontrollflüssigkeit ausgedrückt. Langzeitfütterungsversuche in vivo werden herangezogen, um eine zuverlässige Korrelation zwischen Propionsäure-Erhöhung in der Pansenflüssigkeit und verbesserter tierischer Leistung aufzuzeigen.
Pansenflüssigkeit wird von einer mit einem Schlauch versehenen Kuh gesammelt, die ,mit einer kommerziellen, fettansetzenden Ration plus Heu ernährt wird. Die Pansenflüssigkeit wird sofort durch Käsetuch filtriert, und 10 ml werden in einen konischen 50 ml-Kolben gegeben, der 4OO mg Standardsubstrat (68 % Maisstärke plus 17 % Cellulose plus 15 % extrahiertes Sojabohnenmehl), 10 ml eines pH 6,8-Puffers und die Testverbindungen enthält. Die Kolben werden mit Sauerstoff-freiem Stickstoff etwa 2 min begast und in einem schüttelnden Wasserbad bei 39 C etwa 16 h inkubiert. Alle Tests werden dreifach durchgeführt.
Nach der Inkubation werden 5 ml der Probe mit 1 ml 2 5%iger Metaphosphorsäure gemischt. Nach 10 min werden 0,25. ml Ameisensäure zugesetzt und das Gemisch 10 min bei 1500 UpM zentrifugiert. Proben werden dann durch Gas-Flüssigkeitschromatographie
- ;.··' ' - 16 - . ' - ,; .
nach der Methode von D. W. Kellog, J. Dairy Science 5_2, 1690 (1969) analysiert. Peak-Höhen für Essig-, Propion- und Buttersäure werden für Proben aus unbehandelten und behandelten Inkubationskolben bestimmt.
Zur Verbesserung der Futtermittelverwertung durch Wiederkäuer, wie Rinder und Schafe, und durch monogastrische Tiere, wie Schweine und Kaninchen, kann 19-Epi-dianemycin in Futtermittelzusammensetzungen als freie Säure, Natriumsalz, Kaliumsalz oder deren Gemische eingearbeitet sein. Rohe Formen von 19-ΕρΊ-dianemycin oder getrocknete, das Antibiotikum enthaltende Fermentationsbrühe können natürlich in Futtermittelzusammen-t-Setzungen in den gewünschten Stärkekonzentrationen eingearbeitet sein.
Ausführungsbeispiele
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung noch weiter. Sie sollen jedoch nicht als den Erfindungsumfang beschränkend angesehen werden.
Beispiel 1
Schüttelkolben wurden unter Verwendung des folgenden Mediums vorbereitet:
CLT3.M g/l \
Gerelose - v 20,0
Sojamehl . 10,0
Schlempelösliches 5,0
Natriumsulfat ' 0,5
'je
Kobaltchlorid 0,002
Calciumcarbonat 2
100 ml Medium wurden in 300 ml-Schüttelkolben verteilt und bei 120°C und 1,05 bar (15 psi) 30 min sterilisiert. Nach dem Kuh-
len wurde das Medium mit einer Suspension vegetativer Zellen von Streptomyces hygroscopicus ATCC 39205, gewachsen auf ATCC 172-Agärmedium, beimpft. Die Kolben wurden bei 28°C auf einem Rotationsschüttler mit einer Verschiebung von 3,81 bis 6,35cm (1,5 bis 2,5") und 150 bis 200 UpM 3 bis 4 Tage geschüttelt. Ein Kolben wurde verwendet, um einen 5 1-Fermentationsbehälter zu beimpfen, der 3 1 der folgenden Medien enthielt:
CLI3M ' g/l :
Cerelose 20,0 ·. .'
Sojamehl " 10,0
Schlempelösliches 5,0 Natriumsulfat ^ 0,5
Calciumcarbonat 2,0
Kobaltchlorid 0,002
Wasser zu 1 1 ,' :
pH 6,9 - 7,0
1 ml L6i-Silicon wurde als Antischaummittel zugesetzt, dann wurden die Behälter hermetisch verschlossen und 45 min bei 120 C und 1,05 bar (15 psi) sterilisiert. Die Behälter wurden dann mit einem (ca. 3 % Impfstoff) Kolben beimpft, 96 bis 168h bei 30°C fermentiert, gerührt bei 1700 UpM mit einer Luftgeschwindigkeit von 1 Volumen Luft pro Volumen Flüssigkeit pro Minute.
Nach Abschluß der Fermentation (auf der Grundlage eines antibiotischen Scheibentests gegen B. subtilis ATCC 6633) wurden die Fermentationsbehälter angehalten, filtriert beim natürlichen pH mit Hilfe von Diatomeenerde. Der Filterkuchen wurde in Methanol aufgeschlämmt, filtriert, das Lösungsmittel im Vakuum eingeengt, mit 2 bis 3 Volumina Wasser verdünnt, dann zweimal mit 1/3 bis 1/2 Volumen eines Lösungsmittels, wie Methylisobuty!keton,extrahiert.
Die Lösungsmittelschicht wurde von der wässrigen Phase durch Absaugen oder Zentrifugieren abgetrennt, gesprudelt und im Vakuum zu einem viskosen öl eingeengt.
Alternativ wurde das Antibiotikum durch.Extraktion der ganzen Brühe bei natürlichem pH·mit Methylisobutylketon und Einengen des1 Lösungsmittels zu einem viskosen Öl isoliert. Das Öl wurde in Heptan suspendiert und chargenweise mit Kieselgel 60 behandelt. Der Kieselgelkuchen wurde mit Chloroform, Chloroform/Ethylacetat und Ethylacetat eluiert. Nach dem Einengen liefert die Ethylacetat-Fraktion ein Rohprodukt, aus dem 19-Epi-dianemycin als Natrium/Kalium-Mischsalz kristallisierte. ' ' ~ .
Dünnschichtchromatographie des Rohprodukts in den folgenden Systemen, von denen jedes ein Gemisch von Dianemycin und 19-Epi-dianemycin trennt, wies nur 19-Epi-dianemycin nach.
Rf Rf
System Dianemycin 1 9 -Ep i-dianemycin
Ethylacetat 0,30 0,40
Chloroform/Aceton (1:1) 0,42 0,49
Ethylacetat/Chloroform (2:1) 0,15 0,22
Ähnliche Ergebnisse wurden erzielt, wenn eines der folgenden Medien an die Stelle des Mediums dieses Beispiels tritt.
Medium C g/l
Cerelose 10,0
Maisstärke 10,0
Sojabohnenmehl 10,0
fermentierbare Maisfeststoffe 5,0
Natriumchlorid 5,0
Calciumcarbonat 1,0
Wasser zu 1 1
pH 6,9-7,0
Medium M g/l
Cerelose 10,0
Stärke 20,0
Hefe-Extrakt 5,0
Kobaltchlorid 0,002
NZ Amin A 5,0 ,
Calciuracarbonat 1,0
Wasser zu 1 1
pH 6,9 - 7,0
Beispiel 2
Maßstäbliche Vergrößerung der Arbeitsweise von Beispiel 1 in großen Fermentern erfolgte unter'Vorbereiten von Schüttelkolben mit 0,7 1 CL13M-Medium, Das Schüttelkolben-Inokulum wurde 3 bis 5 Tage bei 28°C fermentiert und zum Beimpfen eines 6434,5 1 (1700 gaL)-Fermenters verwendet, der 4542 1 (1200 gal.) CL13M-Medium enthielt. Etwa 1 1 (0,05 % ) Inokulum wurde in dem Behälter eingesetzt. Der Fermenter wurde nach 4_Tagen Fermentieren geerntet (ca. 4164 1, 1100 gal.)·. Die gesamte Brühe wurde mit 1/5 Volumen Methylisobutylketon bei natürlichem pH extrahiert, auf einem Podbielniack-Extraktor getrennt und das Lösungsmittel im Vakuum zu einem Öl (30,3 1, ,8 gal.) eingeengt.
Das Öl/wurde weiter in einem Zyklon-Verdampfer zu einem Sirup eingeengt. Nach dem Einengen wurde das Öl in Heptan suspendiert^ mit Kieselgel (Merck Kieselgel 60) gerührt, dann durch ein Kieselgelbett filtriert und wiederholt mit Heptan gewaschen. Das Antibiotikum wurde stufenweise mit Chloroform, Chloroforra/Ethylacetat, Ethylacetat und schließlich 50 % Aceton in Ethylacetat eluiert. Der Elution folgte Dünnschichtchromatographie und Biotest der Fraktionen. Die aktiven Schnitte wurden vereinigt, eingeengt und erneut chrovmatographiert, um das Antibiotikum zu isolieren. Während der Aufarbeitung traten Probleme mit den aktiven Schnitten aus der Kieselgel-Chargenbehandlung auf. Durchlauf der aktiven Eluate durch körnige
1 ι . ',
Darco-Kohle entfernte die störenden Materialien und verbesserte die Gewinnung. Ca. 40 g kristallines 19-Epi-dianemycin wurden gewonnen.
Beispiel 3 .
Eine etwa 4164 1.(1100 gal.)-Fermentation yon.S. hygroscopicus ATCC 39205 wurde nach Beispiel 2 hergestellt. Die gesamte Brühe wurde mit 1/5 Volumen Methylisobutylketon extrahiert und der· Extrakt im Vakuum zu einem braunen öl (etwa 3,79 1,1 gal.) eingeengt. Das Konzentrat wurde in 11,4 1 (3 gal.) gerührten Heptans gegossen'und der anfallende Brei durch ein Diatomeenerdebett filtriert.
Das Filtrat wurde chargenweise mit 3 kg Kieselgel 60 (Merck) von Säulenqualität (210-62 um bzw. 70-230 mesh) behandelt. Das Kieselgel wurde mit jeweils 11,4 1 (3 gal.) Heptan, Chloroform, Aceton und Methanol gewaschen. Diese Fraktionen wurden dünnschichtchromatographisch geprüft, und das 19-Epi-dianemycin fand sich hauptsächlich in den Aceton- und Chloroform-Fraktionen .
Die Acetonfraktion (180 g) wurde an einer 8 χ 100 cm-Säule, gepackt mit Merck Kieselgel 60 von Säulenqualität (62-37 μΐη bzw. 230-400 mesh) in Ethylacetat, chromatographiert. Ethylacetat wurde als Elutionsmittel verwendet. Die Strömungsgeschwindigkeit war 70 ml/min, und es wurden jeweils Fraktionen von etwa 1 1 genommen. Die Schnitte wurden dünnschichtchromatographisch auf Analtech GF-Kieselgelplatten, entwickelt in Ethylacetat, geprüft. Die Platten wurden durch Besprühen mit Vanillin-Reagens (3 g Vanillin in 75 ml Ethanol und 25 ml N 85%iger Phosphorsäure) und Erwärmen auf 80 C sichtbar gemacht. 19-Epi-dianemycin erscheint als purpurfarbener Fleck unter diesen Bedingungen. .-.'. .' -'.;
Die 19-Epi-dianemycin enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und eingeengt. Das Konzentrat wurde in 1 1 Chloroform gelöst,-.
mit 1 1 saurem Wasser (pH 4), dann 1 1 5%igem zweifaasigem Natriumphosphatpuffer (pH 9) gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Das Konzentrat wurde in Acetat aufgenommen und eine kleine Menge (etwa 10 %) Wasser zugesetzt, worauf 19-Epi-dianemycin als Natriumsalz kristallisierte. Die Kristalle wurden durch FiI-
-. <' · ' '.' ' '' .·
trieren gesammelt und im Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet, Die Ausbeute betrug 23 g Natriumsalz.
Die Chloroformfraktion aus der Kieselgel-Chargenbehandlung (280 g) wurde Wieder in 11 Chloroform gelöst und durch eine 7.x 120; cm-SäuIe., gepackt mit körniger Aktivkohle in Chloroform, geführt. Eluiert wurde mit Chloroform bei 20 ml/min, und Fraktionen von 300 ml wurden aufgefangen. Die das Antibiotikum enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und eingeengt. Das Konzentrat wurde als Natriumsälz kristallisiert, wie oben für die Acetonfraktion beschrieben. Ausbeute 1.4 g. Weitere 10 g Rohmaterial wurden als zweite Ausbeute erhalten.
Das Natriumsälz von 19-Epi-dianemycin schmolz bei 193-2O5°C. Andere Eigenschaften:
^* max = 232 nm' Eicm= 157 D = +11,0° (c=l, Methanol)
Analyse für C 47H7 7O14Na: > 8 H ' 0 (aus der Differenz)
C 8 ,73 27, 78
ber. : 63 ,49 ,86 28, 04 . .
gef. : 63 ,10
Die freie Säure bildete sich durch Waschen einer Chloroformlösung des Natriumsalzes mit saurem Wasser (pH 4), dann Ver-
dampfen des Chloroforms. Die Verbindung konnte nicht zum Kristallisieren angeregt werden, sondern wurde als Glas erhalten.
UV. λ =232 nm, e]% = 163 max 1 cm
D = +15,6° (c=l, Methanol)
Analyse für C 8°14/ 9 H C (aus der Differenz)
8 ,06 25 ,84
ber. : 10 ,94 26 ,61
gef. : 45
:47H7
C
65.,
64,
<; >

Claims (1)

  1. (57) Antibiotisches 19-Ερί-dianemycin, Verfahren zu seiner Herstellung durch Fermentieren eines neuen Stammes von Streptomyces hygroscopicus, seine Isolierung aus der Fermentationsbrühe und seine Verwendung als Mittel gegen Kokzidien und antibakterielies Mittel gegenüber grampositiven Bakterien.
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