HU192536B - Process for preparing 19-epi-dianemycine - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás új poliéter antibiotikum, az (I) képletű 19-epi-dianemicin előállítására és kinyerésére, valamint az ezen antibiotikumot tartalmazó antiíkokcidiális és antibakteriális szerek előállítására.

A 19-epi-dianemicmt egy új Streptomyces hygroscopicus törzs aerob fermentációjával állítjuk elő.

A kokcidiózist, a baromfiak közönséges és széles körben elterjedt betegségét az Eimeria fajhoz tartozó egy vagy több különböző fajta protozoa okozza. A kokcidiózisnak két típusa ismert, a cekális és az intesztinális kokcidiózis. Az első típust az E. tenella okozza, és a betegséget komoly vérzés kíséri. A második típust az Eimeria különböző fajtái, így az E. acervulina, E. necatrix, E. maxima, E. hagami,

E. mitis, E. praecox és az E. brunetti, okozzák. Pulykákban az E. adenoides és az E. maleagrimitis okoz kokcidiózist.

A kokcidiózis gazdasági hatásai széleskörűek, ezért igen fontos a baromfitenyésztésben a betegség meggátolása vagy befolyásolhatósága.

Antikokcidiális szerként igen különböző szerkezetű vegyületeket írtak le eddig, ide tartoznak a poliéter típusú antibiotikumok is, így a monensin [J. Amer. Chem. Soc., 89. 5737. (1967·)]; a nigericin [Bioohem. Biophys. Rés. Comm, 33., 29. (1968.)]; grisorixin [J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1421. (1970.)]; a dianemycin [J. Antibiotics 22., 161. (1969.)1; 3 577 531 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, [1971. 05. 4.]; a salinomycin [J. Antibiotics 27., 814. (1974.)]; az X—537A [J. Chem. Soc. Chem. Commun., 967. (1972.)]; az X—206 [J. Chem. Soc. Chem. Commun., 927. (1971.)]; az A204A [J. Amer. Chem. Soc., 95., 3399. (1973.)]: az ionomycin [J. Amer. Chem. Soc, 101, 3344. (1979.)] ; a mutalomycin [J. Antibiotics, 30., 903. (1977.)]; a K—41B [J. Antibiotics, 32., 169. (1979.)]; az A—130B és A—130C [J. Antibiotics, 33., 94. (1980.)]; a leuseramycin [J. Antibiotics, 33., 137. (1980.)]; és az A—28695 B [J. Antibiotics, 33., 252. (1980.)]. A témát Westley („Polyether Antibiotics”, Adv. Appl. Microbiol, 22., 177. (1977.)], valamint Shumard és társai [Antimicrob. Agents et Chemother, 369—377. (1967.)] ismertetik részletesen.

A sertés dizentéria, az amerikai egyesült államokbeli egyik legközönségesebb és legelterjedtebb sertésbetegség, más országokban is elterjedt és évenként igen nagy gazdasági veszteségeket okoz. Nemrég fedezték fel, hogy a fertőzés elsődleges okozója egy nagy spirocheta, a Treponema hyodysenteriae [Harris, D. L. és társai, „Swine Dysentery-1 Inoculation of Pigs with Treponema hyodysenteriae (New Species) and Reprodiotion of the Disease”, Vet. Med/SAC, 67, 61—64. (1972.)].

Az állatgyógyászat másik gazdaságilag jelentős problémája kérődzők, így a szarvasmarha esetében a teljesítmény fokozás, vagyis a nagyobb sebességű növekedés és/ vagy hatékonyabb fápanyaghasznosítás. Kü2 lönös jelentőségű a hatékonyabb tápanyaghasznosítással elérhető nagyobb növekedési sebesség. A kérődző-eleség fő tápláló részének, a szénhidrátoknak a hasznosítási mechanizmusa jól ismert. Az állat bendőjében lévő mikroorganizmusok lebontják a szénhidrátokat monoszacharidokká, majd a monoszacharidofcat piroszőlősavészterekíké alakítják. A piroszőlősavészterek mikrobiológiai folyamatok által metabolizálódnak, és acetátok, butirátok vagy propionátok keletkeznek, amelyek együttesen illékony zsírsavakként (VFÁ) ismertek. A témát az alábbi irodalmak ismertetik részletesebben: Leng, „Physiology of Digestion and Metabolism in the Ruminant,” Phillipson és munkatársai, Eds, Oriel Press, Newcastle-upon-Tyne, England, (1970.) 408—410. oldalak.

A VFA hasznosítás relatív hatékonyságát tárgyalják az alábbi irodalmak is: McCullough „Feedstuffs”-ban, 1971. június 19. 19. oldal; Éskeland és munkatársai, J. An. Sci, 33., 282. (1971.); valamint Church és társai, „Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants”. 2. kötet, 1971, 622. és 625. oldal. Bár az acetátokat és a butirátokat is hasznosítják az állatok, a propionátokat nagyobb hatékonysággal hasznosítják. Sőt, ha túl kevés propionát áll rendelkezésre, az állatokban ketózis léphet fel. Egy megfelelő hatású vegyület elősegítheti azt, hogy az állatok nagyobb százalékban alakítsanak át szénhidrátokból propionátokat, ezzel megnövelve a szénhidrát hasznosítás hatékonyságát és egyidejűleg jcsökkentve a ketózis előfordulását.

Azt találtuk, hogy egy új Streptomyces hygroscopicus törzs, amelyet egy Washingtonban (D.C, USA) vett talajmintából izoláltunk, egy antikokcidiális tulajdonságokkal rendelkező új és értékes antibiotikumot termel. Az új terméket izolálás után 19-epi-dianemicinként azonosítottuk.

A találmány szerinti eljárás antibiotikumtermelő mikroorganizmusait egy Washingtonban (D.C, USA) gyűjtött talajmintából izoláltuk. A tenyészet az N-483—29 jelölést kapta. A mikroorganizmus taxonomikus tanulmányozása után Huang L. H. úgy találta, hogy a törzs Streptomyces hygroscopicus (Jensen) Waksman és Henrid törzs.

Az új tenyészet az Actinomycetales kevés gombafonalát tartalmazza, a légmicéliumon spóraláncokat és fragmentálatlan szubsztrátumos nuoéliumot termel.

Az egész-sejtes analízis eredményei ismét azt bizonyították, hogy az új törzs a Streptomyces fajhoz tartozik.

Az N-483-29 tenyészetet egy ferde agaros tenyészetről ATCC 172 táptalajra oltottuk és három napig 28 °C-on rázógépben tartottuk. Ezután kivettük a tenyészetet a rázógépből, 20 percig centrifugáltuk, 9teril desztillált vízzel háromszor átmostuk, majd az Antinomycetales tagok azonosítására közönségesen használt közegekre telepítettük.

A tenyészeteket 28 °C-on dnkubáltuk. Az

192 536 eredményeket a megszokott módon 14 napos inkubálás után jegyeztük fel. A színeket az általános terminológiának megfelelően írtuk le, de a pontos színárnyalatokat a Color Harmony Manual negyedik kiadásának színmintáival való összehasonlítás alapján határoztuk meg.

Az egész-sejtes aminósav és cukor analízisek módszereit az alábbi irodalmak írják le; Becker, B. és munkatársai, Appl. Microbiol.,

12., 421—423. (1964.) és Lechevalier, Μ. P.,

J. Láb. Clin. Med., 71., 934—944. (1968.).

A tenyészet jellemzésére használt azonosító közegeket és az összetételükre vonatkozó referenciákat az alábbiakban soroljuk fel:

1. Tripton-Élesztőkivonat Táptalaj — (ISP közeg, Difco).

2. Élesztőkivonat — Malátakivonat — Agár (ISP 2 közeg, Difco).

3. Durva zabliszt — Agar (ISP 3 közeg, Difco)?

4. Szervetlen sók — Keményítő — Agár (ISP3# 4 közeg, Difco).

5. Glicerin — Aszparagin — Agar (ISP 4+· 5 közeg, Difco).

6. Pepiton — Élesztőkivonat — Vas — Agar (ISP4+ 6 közeg, Difco).

7. Czapek — Szacharóz — Agár — Waksman S. A., The Actionmycetes, 2. kötet, közeg száma 1, 328. oldal, 1961.

8. Glükóz — Aszparagin — Agar — ugyanott, közeg száma 2, 328. oldal.

9. Bennet féle Agar — ugyanott, közeg száma 30, 331. oldal.

10. Emerson féle Agar — ugyanott, közeg száma 28, 331. oldal.

11. Húsleves (Nutrient) Agár — ugyanott, közeg száma 14. 330. oldal.

12. Gordon és Smith féle Tyrosin Agar — Gordon R. E. és Smith Μ. M., Jr. Bact.

69., 147—150., 1955.

13. Kazein Agar — ugyanott.

14. Kalcium malát Agar — Waksman S. A., Bact. Rév. 21., 1—29., 1957.

15. Zselatin — Gordon R. E. és Mihm J. M., Jr. Bact., 73., 15—27., 1957.

16. Keményítő — ugyanott.

17. Szerves nitrátos táptalaj — ugyanott.

18. Dextróz nitrátos táptalaj — Waksman

S. A., The Actinomycetes, 2. kötet, közeg száma 2, 328. oldal, 1961., 30 g szacharóz helyett 3 g dextróz, az agar elhagyva.

19. Burgonya Sárgarépa Agar — Lechevalier Μ. P., Jr. Láb. and Clinioal Med., 71., 934—944., 1968., de csak 30 g burgonyát,

2,5 g sárgarépát és 20 g agart használtunk.

20. 2% csapvizes Agar.

21. Lefölözött tej — Difco.

22. Cellulóz hasznosítás —

a) Jensen H. L., Proc. Linn. Soc. N.S.W.,

55., 231—248., 1930.

b) Levin M. és Schoenleip H. W., A Compilation of Culture Media, 2511es számú közeg, 1930.

23. Szénhidrátok — ISP^S közeg, Difco.

24. Hőmérséklettartomány — ISP 4^:2 közeg + 50 ml kókusztej.

Az új tenyészetet az alábbiak szerint jellemezzük a különböző közegekben:

Elesztőkivonat — Malátakivonat — Agar — a növekedés jó, sárgásbarna (3ie-hez közel), sárgás (2ea) taréjokkal vagy hártyákkal, mérsékelten kidomborodó, redőzött, hártyaszerű, légmicélium nincs, a hátoldal halványsárgás (2ea) barna vonalaikkal (3gc, Sic); barna (31c, 3ne) oldható pigment.

Durva zabliszt Agar — a növekedés mérsékelt, fehér, sárgástól a szürkésig (1 1/2 ea,

1/2 ga, közel a 3dc szürke isorozáthoz, 3fe), vékonytól az enyhén kidomborodóig, sima, bizonyos helyeken higroszkópos, a légmicélium ugyanolyan, mint a felület; a hátoldal színtelen, a krémszínűtől a szürkéig (1 1/2 ca, közel a 3 de, 3 fe szürke sorozathoz); halványsárgás oldható pigment (1 1/2 oa).

Szerves sók — Keményítő Agar — a növekedés mérsékelttől a jóig. Sárgától a szürkéig (lea, 1 1/2 ea, közel a 3dc, 3fe, 3ih szürke sorozathoz), vékonytól a kidomboro.dóig, sima, de a szélekhez közel redőzött, bizonyos területeken higroszíkópos, a légmicélium ugyanolyan, mint a felület; a hátoldal világossárgától szürkéig (2ea; a 3dc, 3fe szürke sorozathoz közel); halványsárgás oldható pigment (1 1/2 ca.)

Glicerin — Aszpiragin Agar — a növekedés gyengétől a mérsékeltig, színtelentől a krémszínűig (az lba szürke sorozathoz közel), vékony, sima, légmioélium nincs, a hátoldal színtelen, oldható pigment nincs.

Glükóz — Aszparagin Agar — a növekedés jó, fehértől a krémszínűig (2ca), kidomborodó, redőzött fehér légmioélium; a hátoldal világossárga (2ea); világossárgás oldható pigment (2ca, 2ea).

Czapek — Szacharóz Agar — a növekedés a mérsékelttől a jóig, krémszínű (2ca), vékony, sima, elterült szélekkel; légmicélium nincs; a hátoldal a színtelentől a krémszínűig (2ca); krémszínű oldható pigment (2ca).

Emerson-féle Agar — a növekedés jó, sárgásbarna (3gc-hez közel), kidomborodó, simától az enyhén redőzőttig, légmicélium nincs; a hátoldal ugyanolyan mint a felület; barna (31c) oldható pigment.

Húsleves (Nutrient) Agar — a növékedés mérsékelt, krémszínű (1 1/2 ca, 2oa), enyhén kidomborodó, sima, vagy elkülönült telepek vannak, légmicélium nincs; a hátoldal világossángás (2ca, 2 ea); oldható pigment nincs.

Bennett-féle Agar — a növekedés jó, krémszínű (2ca), mérsékelten kiemelkedő, redőzöttől a taré j ősig, légmicélium vagy nincs, vagy csak elszórtan van, fehér; a hátoldal krémszínűtől a halvány szürkés sárgáig (2ca, 2gc); halványsárgás (2ea) oldható pigment.

Gordon és Smith-féle Tyrosin Agar — a növekedés gyengétől a mérsékeltig, sárgásbarnától a sötétbarnáig (4ec, 4nl, 5nl), vékonytól az enyhén kidomborodóig, .sima, légmicélium nincs; a hátoldal barnától a sötét3

192 536 barnáig (5nl, 5pn); sötétbarnától a feketéig (5nl, 5pn) oldható pigment.

Kalcium-malát Agar — a növekedés mérsékelt, krémszínű (1 1/2 cd), vékonytól az (enyhén kidomborodóig, sima, légmicélium nincs; a hátoldal ugyanolyan mint a felület; oldható pigment nincs.

Kazein Agar — a növekedés mérsékelttől a jóig, krémszínű (2oa, 3ca), enyhén kidomborodó, simától az enyhén redőzöttig, légmicélium nincs: a hátoldal krémszínű; rózsaszínes barna (4ia, 4ga) oldható .pigment.

Zselatin Agar — a növekedés jó, krémszínű (2ca-hoz közel), mérsékelten kidomborodó, sima, de a szélekhez közel redőzött, légmicélium nincs; a hátoldal ugyanolyan, mint a felület; krémszínű oldható pigment.

Keményítő Agar — a növekedés jó, krémszínű (2ca-hoz közel), mérsékelten kidomborodó, redőzött, de a szélek felé esetenként sima, légmicélium nincs, a hátoldal ugyanolyan mint a felület; krémszínű oldható pigment.

Burgonya Sárgarépa Agar — a növekedés mérsékelt, krémszínű (1 Ϊ/2 ca), vékony, sima, elszórtan légmicéliumok, fehér; a hátoldal a színtelentől a krémszínűig; oldható pigment ninos.

Csapvíz Agar — a növekedés gyenge, színtelentől a krémszínűig (a 2ba szürke (sorozathoz közel), vékony, sima, legtöbbnyire alámerült, elszórtan légmicélium, fehér; a hátoldal ugyanolyan, (mint a felület; oldható pigment nincs.

A morfológiai tulajdonságokat szervetlen sók — keményítő agarán, 14 napig tartó inkubálás után figyeltük meg: szürkeszínű spóratömeg; a ispóraláncok enyhén nyitott, kis átmérőjű (6—10 um hosszú és 3—4,5 ,um széles) tekercsenként 3—6 fordulatot tartalmazó spirális szelvényekben láthatók, amelyek spóralánconként 8—30 spórát tartalmaznak; a termőtestek monopódiálisan, néha virágtakar ászerű en elágazottak; a spórák oválisak vagy ellipszis alakúak, néha pálcaszerűek vagy navikulárisak, 1,2—2,0X0,9—1,2 fim, elektromikroszkóppal vizsgálva szemölcsös.

A biokémiai tulajdonságokat az alábbiakban foglaljuk össze:

Melanin nem termelődik; kénhidrogén termelődik; a zselatin elfolyósodiik; a keményítő hidrolizál; a nitrát nitritté redukálódik mindkét nitrátos táptalaj esetében; gyér növekedés Jensen-, Levine- és Sohoenlein-féle cellulózon, valamint egyiken sincs lebomlás; koaguláció nélkül feltisztulás tejen; a kazein emésztés pozitív; a kalcium malát emésztés pozitív; a tyrozin emésztés pozitív. Szénhidrogén hasznosítás: glükóz, arabinóz, fruktóz, inozít, mannit, raffinóz, rarnnóz, szacharóz és xilóz hasznosítás van.

A hőmérsékletnek a növekedésre gyakorolt hatása a következőkben látható:

°C 28 °C 37 °C 45 °C A jótól a Jó nőve- Mérsékelt Nincs kiválóig kedés növekedés növekedés terjedő növekedés

Egész-sejtes analízis: a sejtfal LL-diamino-pimelinsavat tartalmaz, de nem tartalmaz semmiféle jellemző cukrot.

Az N-483-29 tenyészetet szürkeszínű spóratömeg, spirális spóraláncok, rüoskös felületű spórák és melaminfcépzésre való képtelenség jellemzi. Néhány közegben bizonyos területeken a légmicélium higroszkópos. A szacharóz és a raffinóz pozitív hasznosításának kivételével, az izolátum megfelel az újtípusú S. hygroscopicus törzsről adott leírásnak (Int. J. Syst. Bact., 22., 265—394. 1972.). A szénforrások hasznosítása különbözik a Tresner H. D. és Backus E. J. által leírt törzsekétől, akik az Applied Microbiology-ban (4., 243—250., 1956.) leírt fajták tágabb megfogalmazását javasolták. A tenyészet így a Streptomyces hygroscopicus (Jensen) Waksman és Henrici egyik törzsének (tekintendő. A tenyészet letétbehelyezésének helye: American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. A mikroorganizmus a Streptomyces hygroscopicus ATCC 39205 deponálási számot kapta.

A találmány oltalmi köre nem korlátozódik az előbb leírt mikroorganizmus használatára, annak leírása csak illusztratív célokat szolgál. Az oltalmi kör kiterjed minden természetesen létrejött vagy mesterségesen előidézett mutáns és/vagy változat használatára. Ilyenek a fent leírt mikroorganizmusból különféle módon, igy röntgensugárzás, ultraibolya sugárzás, musltárnitrogének és hasonlók hatására jöhetnek létre.

Az S. hygroscopicus ATCC 39205 mikroorganizmus tenyésztését süllyesztett aerob körülmények között, 21 ^rC és 37 °C közötti hőmérsékleten, keverés közben vizes tápközegben hajtottuk végre. Tipikus tenyésztéshez használt tápközeg lehet bármely emészthető szénforrás, így cukrok, keményítők és glicerin; szerves nitrogénforrás, így kazein, kazein enzimatikus kivonata, savasan hidrolízált kazein, durva szójaliszt, gyapotmag liszt, mogyoróliszt, búzasikér, szójaliszt, élesztőkivonat, húsliszt és halliszt; növekedést elősegítő anyag lehet: gabona oldható része, halliszt, gyapotmag liszt és élesztőkivonat, valamint ásványi sók, így nátrium-klorid és kalcium-karbonát, 'valamint (nyomelemek, így vas, magnézium, cink, kobalt és mangán; végül pufféiként kalcium-karbonát vagy foszfátok.

Ha a fermentáció alatt erőteljes habzás következik be, a fermentációs közeghez habzásgátló anyagokat, így növényi olajokat vagy szilikonokat adunk. A fermentorokban a közeg levegőztetését úgy oldhatjuk meg előnyö-41

192 536 sen, hogy a fermentációs táptalaj térfogatára nézve körülbelül 1/2—2 térfogat steril levegőt áramoltatunk át a táptalajon egy levegőeloszlató segítségével. A keverést a fermentációs irodalomban ismeét keverek bármelyikével biztosíthatjuk. A keverés sebessége az alkalmazott keverő típusától függ. Egy rázólombik általában 150—200 percenkénti fordulatszámmal forog, míg egy fermentor percenként általában 300—1700 fordulattal. Természetesen fontos az aszeptikus körülmények fenntartása az egész tenyésztés alatt.

A találmány szerinti eljárással előállított antibiotikum előállításához szükséges oltóanyagot úgy nyerjük, hogy az N-483-29 tenyészettel beoltott ferde tenyészetről vagy Roux palackról ledörzsöljük a vegetatív sejteket. A ferde tenyészeten vagy Roux palackon induló növekedéshez szükséges szilárd közeg ATCC 41172 közeg.

ATCC 172 grammfliter

Glükóz 10

Oldható keményítő 20

Élesztőextraktum 5

NZ Amin A 5

Kalcium-karbonát 1

Desztillált víz 1000 ml-re a pH-érték 7,0 kálium-hidroxiddal beállítva

Agar 20

A ferde tenyészetből származó vegetatív sejteket egyaránt felhasználhatjuk rázólombikok vagy inokulum fermentorok beoltásához: az inokulum f érmén torokat beolthatjuk rázólombikokból is. Rázólombikökban a növekedés maximális értéke általában 96—120 óra alatt érhető el, míg inokulum fermentorokban a növekedés rendszerint 72—96 óra alatt éri el legelőnyösebb periódusát. A fermentort a rázólomibifcokból vagy inokulum fermemtorokból származó, élő sejteket tartalmazó oltóanyaggal teljesen aszeptikus körülmények között oltjulk be, a fermentációt 96—168 óráig végezzük. A levegőztetést a rázólombikban keveréssel, a fermentorban pedig steril levegő átáramoltatásával biztosítjuk. Az átáramló levegő mennyisége percenként 1/2—2 térfogat, a táptalaj térfogatára számítva. A keverés sebessége az alkalmazott keverő típusától függ. A hőmérsékletet 24 °C és 36 °C között tartjuk.

A fermentáció befejeződése után az antibiotikumot úgy nyerjük ki, hogy a táptalajt valamilyen vízzel nem elegyedő oldószerrel, például n-butanollal, metil-izobutil-ketonnal, etil-acetáttal vagy kloroformmal extraháljuk 4,0—8,0 pH-éntéíken. Hasonló módon a micéliumot is elkülönítjük és az előbb felsorolt oldószerek valamelyikével extraháljuk az antibiotikum izolálása céljából. Az extraktumot koncentráljuk, a koncentrátumot heptánban oldjuk és szilikagélen kromatografáljuk.

A fermentáció alatt az antibiotikum termelődés előrehaladását és a fermentációs táptalaj bioaikitivitását a táptalaj biológiai vizsgálatával ellenőrizhetjük, egy érzékeny Staphylococeus aureus vagy Bacillus subtilis törzs felhasználásával. Erre a célra megfelel az S. aureus ATCC 6538 és a B. subtilis ATCC 6633 törzs. Standard lemezes vizsgáló módszert alkalmazunk, amelynél a 'táptalajjal átitatott szűrőpapír gyűrű által körülvett gátló zónát használjuk az antibiotikus hatóképesség mértékéül. Szilikagéles vékonyrétegkromatográfia is használható a fermentációs közegben termelődött antibiotikum és a fermentációs táptalajból extrahált nyers és tisztított anyagok összetételének analizálására. Az Analtech GF szilikagél kromatogramakat etil-aeetát/metanollal (9:1) vagy kloroform/ metanollal (9:1) futtatjuk. Az antibiotikumot oly módon hívhatjuk elő, hogy a lemezt vanillin reagenssel (3 g vanillin 75 ml etanolban és 25 ml 85%-os foszforsavban) fújjuk be, és 80 °C hőmérsékletre melegítjük. Az antibiotikum bíborpiros foltként tűnik elő. Az antibiotikum előhívását elvégezhetjük úgy is, hogy a lemezt S. aureus-szal vagy B. subtilis-szel beoltott agarral vonjuk be, amelyhez 2,3,4-trif enil-2H-tetrazoliumklorid-monohidrátot adtunk, és 37 °C-on 16 óra hosszat inkubáljuk. Ekkor az antibiotikum rózsaszín háttérben fehér foltként jelentkezik.

A találmány szerinti eljárással előállított 19-epi-dianemicin antibiotikum gátló hatást mutat számos Gram-pozitív mikroorganizmussal szemben.

A vizsgálatban a mikroorganizmusokat olyan kémesősorozatba oltottuk, amelyek a tápközeget és különböző koncentrációban 19-epi-dianemicint tartalmaztak. A vizsgálat annak a minimális antibiotikum koncentrációnak a meghatározására szoigál mcg/mlben, amely 24 óra alatt meggátolja a mikroc.-ganizmus szaporodását. (MIC = minimális gátlókonceniráció).

A 19-epi-dianemicin és kationos sói kiváló aktivitást mutatnak a baromfik kokcidiális fertőzéseivel szemben. A csirkék táplálékába 50—200 ppm mennyiségben bekeverve, ezek a vegyületek hatékonyak az Eimeria tenella, E. acervulina, E. maxima, E. brunetti és E. neoatrix okozta fertőzésekkel szemben.

A 19-epi-dianemieinnek és sóinak csirkék kekoidiumos fertőzéseivel szemben mutatott hatékonysági adatait a következő módon kaptuk meg. 3—5 darab tíznapos SPF fehér leghorn kakasokat olyan élelemmel etettünk, amely a 19-epi-dianemicint vagy annak nátrium- és/vagy káliumsóját tartalmazta, egyenletesen elkeverve. 24 óra után minden csirkét per os beoltottunk a vizsgálni kívánt Eimeria fajta oocytáival. Egy másik 3—5 darab tíznapos csirkéből álló csoportot olyan táplálékkal etettünk, amely nem tartalmazott 19-epi-dianemicint, ezeket nem fertőztük meg kokcidiummal. Ez volt a normál kontrollcsoport. A kezelés eredményeit E. acervulina esetében 5 nap után, minden más mikroorganizmus esetében 6 nap után értékeltük lei.

Az antikokcidiális aktivitás mérésére hasz5

192 536 nált ismérvek: E. tenella esetében ezt O-tól

4-ig terjedő sérülési pontszámnokkal fejezzük ki, az alábbi irodalomban leírtak alapján: Lynch J. E., „A New Method fór the Primary Evaluation of Anticoccidial Aotivity”, Am. J. Vet. Rés., 22., 324—326. (1961.); más fajták esetében pedig O-tól 3-ig terjedő pontszámokkal, a pontozási rendszer módosított változata alapján, amelyet Johnson J. és Reid

W. H. írt le az alábbi munkájában: „Anticoccidial Drugs. Lesion Scoring Techniques ín Battery and Floor Pen Experiments in Chiks”. Exp. Parasit., 28., 30—36. (1970.). Az arányszámot úgy kapjuk meg, hogy minden kezelt csoport sérülési pontszámát elosztjuk a fertőzött kontroll sérülési pontszámával.

Az állati takarmányok értékét általában közvetlenül az állat etetésével határoztuk meg. Az 1 197 826 számú angol szabadalmi leírás egy olyan in vitro bendő-módszert ismertet, amellyel a táplálékokban a mikroorganizmusok által létrehozott változások könynyen és nagy pontossággal mérhetők, és így az állati takarmány értékelhető. Ez a módszer egy olyan berendezés alkalmazását foglalja magában, amelyben az állatok emésztési folyamatai in vitro befolyásolhatók és figyelhetők. Az állati eledeleket, bendő-inokulumot és különféle növekedést serkentő anyagokat gondosan szabályozott körülmények között egy laboratóriumi egységbe helyezzük, majd onnan visszanyerjük: miközban a mikroorganizmusok emésztik a táplálékot, a bekövetkezett változásokat folyamatosan figyeljük és értékeljük. A bendő-folvadékban a propionsav-itartalom növekedése azt jelzi, hogy a táplálékkeverékben a növekedést serkentő anyagok megfelelően befolyásolták a kérődzők táplálékhasznosítását. A propionsavtartaloro változása a kontrollcsoport bendő-folyadékában talált propionsavtartalom százalékában van kifejezve.

A bendő-folyadék propionsavtartalmának növekedése, és a megnövekedett tápanyaghasznosítás közti kölcsönhatás megbízható kimutatására hosszú időtartamú in vivő etetetési vizsgálatok szolgálnak.

A vizsgálatban bendő-folyadekot gyűjtenek egy olyan sipolyozott tehénből, amelyet normálisan hizlaló táplálókkal és szénával etetnek. A bendő-folyadékot rögtön átszűrik egy sajt-vásznon, és 10 ml-t tesznek belőle egy 50 ml-es Erlenmeyer lombikba, amely 400 mg standard táptalajt (68% kukoricakeményítő + 17% cellulóz15% extrahált szójaliszt), 10 ml 6,8 pH-értékű puffért és a vizsgálandó vegyületeket tartalmazza. A lombikot oxigénmentes nitrogéngázzal telítik körülbelül 2 percig, majd egy rázott vízfürdőn körülbelül 16 óra hosszat linkubálják 39 °C hőmérsékleten. Minden vizsgálatot háromszoi’ megismételnek.

Az inkubálás után a minta 5 ml-ét 1 ml 25% -os metafoszforsavval összekeverik. 10 perc után 0,25 ml hangyasavat adnak hozzá, és a keveréket 1500 fordulat/perc sebesség6 gél 10 percen át centrifugálják. A mintákat ezt követően Kellog D. W. (j. Dairy Science, 52., 1690. /1969./) módszere szerint gáz-folyadék kromatográfiával analizálták. A csúcsok magasságát ecetsav, propionsav és vaj sav esetében kezeletlen és kezelt inkubációs lombikokból származó minták alapján határozzák meg.

A tápanyaghasznosítás megjavítása céljából a 19-epi-dianemicint bekeverhetjük az állatok — kérődzők, így szarvasmarha, kecske, egygyomrúak, így disznó, nyúl — táplálékába szabad sav, 'nátriumsó, káliumsó, vagy ezek keveréke formájában. A nyers 19-epi-dianemicin vagy az antibiotikumot tartalmazó megszárított fermentációs táptalaj természetesen szintén belekeverhető a táplálékba, a kívánt hatékony koncentrációban.

Az alább következő példák a találmány szerinti eljárást szemléltetik anélkül, hogy bejelentésünk oltalmi körét ezekre a példákra korlátoznánk.

1. példa

Rázólombikba az alábbi közeget helyezzük:

CL13M	q'liter
Keményítőcukor	20,0
Szójaliszt	10,0
Desztilláló oldható maradéka	5,0
Nátrium-szulfát	0,5
Kobalt-klorid	0,002
Kalcium-karbonát	2

A „desztilláló oldható maradéka” szerves nitrogénforrás, amelyet úgy állítanak elő, hogy a cefre desztillációjakor kapott fenékterméket leszűrik és a szűrletet szárazra párolják.

A közeg 100 ml-ét 300 ml-es rázólombikba töltjük és 120 °C hőmérsékleten 100 kPa nyomáson 30 percig sterilizáljuk. Lehűtés után a közeget ATCC 172 agar közegen tenyésztett Streptomyces hygroscopicus ATCC 39205 vegetatív sejtszuszpenziójával oltjuk be. A lombikokat 28 °C hőmérsékleten, körforgó rázógépben rázzuk 3—4 napig. A gép elmozdulása percenként 3,8—6,3 cm és 150—200 körfordulat (CPM). Egy lombik tartalmával egy

5-literes fermentort oltunk be. A fermentor 3 liter alábbi összetételű közeget tartalmaz:

CL13M g/liter

Keményítőcukor 20,0

Szójaliszt 10,0

Desztilláló oldható maradéka 5,0

Nátrium-szulfát 0,5

Kalcium-karbonát 2.0

Kobalt-klorid 0,002

Víz 1 literhez pH = 6,9-7,0

Habzásgátló szerként 1 ml L61 szilikont adunk hozzájuk, majd a fermentáló edényeket lezárjuk és 120 °C hőmérsékleten, 100 kPa nyomáson 45 percig sterilizáljuk őiket. Az edényeket egy lombik tartalmával (körülbelül 3% inokulum) beoltjuk, 96—168 óráig 30 °C hőmérsékleten fermentáljuk, 1700 fordulat/perc (RPM) sebességgel keverjük, a levegőztetés sebessége percenként 1 térfogat le-6192536 vegő a folyadék térfogatára vonatkoztatva.

Amikor a fermentáció befejeződött — a vizsgálati módszer: antibiotikus korong vizsgálat B. subtilis ATCC 6633-mal szemben — a fermentorokat leállítjuk, semleges pH-η diatómaföld hozzáadásával leszűrjük. A szűrőpogácsát metanollal szuszpendáljuk, szűrjük, az oldószert vákuumban bepároljuk, 2—3 térfogat vízzel hígítjuk, majd kétszer 1/3—1/2 térfogatnyi oldószerrel, így metil-izobutil-ketonnal extraháljuk. Az oldószeres fázist szívással vagy centrifugálással elválasztjuk a vizes fázistól, és vákuumban viszkózus olajkonzisztencia eléréséig pároljuk.

Az antibiotikumot úgy is izolálhatjuk, hogy az egész táptalajt semleges pH-η metil-izobutil-ketonnal extraháljuk, és az oldószert viszkózus olajkonzisztencia eléréséig koncentráljuk. Az olajat heptánban szuszpendáljuk, és szilikagél 60 hozzáadásával a következőképpen kezeljük: A szilikagél-pogácsát kloroformmal, majd kloroform/etil-acetát elegyével, végül etil-acetáttal eluáljuk. Koncentrálás után az etil-acetátos frakcióból nyersterméket kapunk, amelyből a 19-epi-dianemicinst vegyes nátrium/kálium sója formájában kristályosítjuk ki.

A nyerstermék vékonyrétegkromatográfiás vizsgálata az alábbi rendszerekben — amelyek mindegyike alkalmas a dianemicin és a 19-epi-dianemicin elválasztására — csak a 19-epi-dianemicin jelenlétét mutatja. Rendszer Rf Rf dianemicin 19-epi-dianemicin etil-acetát 0,30 0,40 kloroform-aceton (1:1) 0,42 0,49 etil-acetát/kloroform (2:1) 0,15 0,22

Hasonló eredményeket kapunk, ha a példában alkalmazott közeget az alább leírt közegek bármelyikével helyettesítjük:

C közeg g/liter

Keményítőcukor 10,0 kukoricakeményítő 10,0 szójaliszt 10,0 kukorica koncentrálható szilárd anyaga 5,0 nátrium-klorid 5,0 kalcium-karbonát 1,0 víz 1 literhez pH = 6,9-7,0

M közeg g/liter

Keményítőcukor 10,0 keményítő 20,0 élesztőextraktum 5,0 kobalt-kl orid 0,002

NZ Amin A 5,0 kalcium-karbonát 1,0 víz 1 literhez pH = 6,9-7,0

2. példa

Arányosan megnövelve az 1. példában leírt meninyiségéket, az 1. példa szerinti eljárást egy nagy fermentorban hajtjuk végre, 0,7 liter CL13M közeget tartalmazó rázólombikokat használva inokulumként. A rázólombikos inokulumot 3—5 napig 28 °C hőmérsékleten fermentáljuk, és olyan 6434,5 literes fermentort oltunk be vele, ami 4542 liter CL13M közeget taralmaz. Az inokulumból körülbelül 1 litert (0,05%) használunk fel a fermentorhoz. 4-napos fermentáció után a fermentor tartalmát (körülbelül 4164 liter) feldolgozzuk. Az egész .táptalajt semleges pHn 1'5 térfogat metil-izobutil-ketonnal extraháljuk, Podbielniack szeparátorral elválasztjuk és az oldószert vákuumban olajos maradók eléréséig pároljuk (30,3 liter).

Az olajat egy ciklon bepárlóban tovább pároljuk, amíg szirupszerű anyagot kapunk. Ezután ezt heptánban szuszpendáljuk, szilikagéllel keverjük össze (Merck 60-as szilikagél), majd szilikagél ágyon átszűrjük és ismételten átmossuk heptánnal. Az antibiotikumot egymás után kloroformmal, kloroform/ etil-acetát elegyével, majd etil-acetáttal, és végül 50% acetont tartalmazó etil-acetáttal eluáljuk. Az eluálás után a frakciókat vékonyrótegfcromatografáljuk és biológiai vizsgálatnak vetjük alá. Az aktív frakciókat egyesítjük, koncentráljuk és az antibiotikum izolálása céljából újra kromatografáljuk. A feldolgozás alatt problémák jelentkeztek az aktív frakcióknak a szilikagél ágyról való kinyerésével. Ezen úgy segített, hogy az aktív eluátumokat granulált Daroo szénen szűrtük át, ami eltávolította a szennyező anyagokat és javította a (kinyerésit. Ily módon körülbelül 40 g kristályos 19-epi-dianemicinit kaptunk.

3. példa

A 2. példában leírtak szerint eljárva, egy körülbelül 4164 literes fermentorban S. hygroscopicus ATCC 39205 fermentációt hajtottunk végre. Az egész táptalajt 1/5 térfogat metil-izobutil-ketonnal extraháljuk, majd az extraktumot vákuumban barna olajig koncentráljuk (körülbelül 3,79 liter). A konoentrátumot 11,4 liter kevert heptánba öntjük, és a kapott iszapos anyagot diatómaföldágyon szűrjük át.

A szűrletet adagonként Merck 60 szilikagéllel (70—230 finomság) kezeljük. A szilikagélt egymás után 11,4 liter heptánnal, kloroformmal, acetonnal és metanollal mossuk. A frakciókat vékonyréitegkromatográfiával vizsgáljuk, a 19-epi-dianemicint főként az acetonos és a kloroformois frakciókban találjuk.

Az acetonos frakciót (180 g) 8x100 cm-es oszlopon kromatografáljuk. A töltet Merck 60 szilikagél (230—400 finomság). Az eluáló oldószer etil-iacetát. Az átfolyás /sebessége 70 ml/perc és körülbelül 1 literes frakciókat veszünk. A frakciókat vékonyrétegkromatográfieával vizsgáljuk Analtech GF ezili'kagéles lemezeken, etil-acetáttal futtatva. A lemezeket úgy hívjuk elő, hogy vanillin reagenssel (3 g vanillin 75 ml etanolban és 25 ml 85%os foszforsavban oldva) befújjuk, majd 80 °C hőmérsékletre melegítjük őket. A 19-epi-dia7

192 536 nemicin ilyen körülmények között bíborpiros foltként jelentkezik.

A 19-epi-dianemicint tartalmazó frakciókat egyesítjük és bepároljuk. A koncentrátumot 1 liter kloroformban oldjuk, 1 liter savas vízzel (pH = 4), majd 1 liter 5% dinátrium-foszfát pufferrel mossuk, vízmentes nátrium-szulfát felett szárítjuk, szűrjük és bepároljuk. A koncentrátumot acetonban oldjuk és kevés (körülbelül 10%) vizet adunk hozzá, ekkor a 19-epi-dáanemicin nátriumsója formájában kikristályosodik. A kristályokat szűréssel elkülönítjük, és szobahőmérsékleten vákuumban szárítjuk. A hozam: 23 g nátriumsó.

A szálikagéles kezelés után kapott kloroformos frakciót (280 g) újra feloldjuk 1 liter kloroformban és 7x120 cm-es oszlopon engedjük át, amelynek töltete granulált aktív faszén kloroformban. Kloroformmal eluáljuk 20 ml/perc sebességgel és 300 ml-es frakciókat gyűjtünk. Az antibiotikum tartalmú frakciókat egyesítjük és koncentráljuk. A koncentrátumot nátriumsó formájában kristályosítjuk, az acetonos frakciónál leírt módon eljárva. A hozam: 14 g. Még további 10 g nyers anyagot kapunk a második feldolgozásból.

A 19-epi-diane)micin tnátriumsó olvadáspontja 193—205 °C. Egyéb tulajdonságai: UV λ max = 232 mm, Ε i _Cm =157 o ö = +11,0° (c — 1, metanol)

Analízis a C₄7H77O₁₄Na összegképlet alapján: számított: C 63,49%, H8,73%

O (a különbségből) 27,78%; talált: C 63,10% H 8,86%,

O (a különbségből) 28,04%.

A szabad savat úgy kapjuk meg, hogy a nátriumsó kloroformos oldatát savas vízzel (pH = 4) mossuk, majd elpárologtatjuk a kloroformot. A vegyületet üvegszerű anyagként kapjuk meg.

UVl max = 232 ram, E jcm = 163 α n = + 15,6° (c = 1, metanol)

Analízis a C^H-On összegképlet alapján: számított: C 65,10%, H 9,06%,

O (a különbségből) 25,84%;

₁₀ talált: C 64,45%, H 8,94%,

Ö (a különbségből) 26,61%.

Claims (5)

1. Eljárás az (I) képletű 19-epi-dianemioin és bázikus sóinak az előállítására, azzal j e 11 e m e ζ v e, hogy Streptomyces hygrascopicus ATCC 39205 törzset vagy annak vala2Q mely mutánsát vagy variánsát aerob körülmények között, asszimilálható szén-, nitrogén- és szervetlen só forrásokat tartalmazó vizes közegben tenyésztünk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal

25 jellemezve, hogy a 19-epi-dianemicint kinyerjük.

3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szénforrásként glükózt alkalmazunk.

2Q

4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 19-epi-dianemicint a fermentációs táptalaj metil-izobutiPketonos extrakció javai nyerjük ki.

5. Eljárás gyógyászati készítmények előálIrtására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti eljárással előállított 19-epi-dianemicint vagy bázikus sóját a gyógyszerfcészítésben szokásos módon, hordozóés/vagy egyéb segédanyagokkal gyógyászati készítménnyé elkészítjük.

1 db rajz

-8192 536