Przedmiotem wynalazku jest mikrobiologiczny sposób wytwarzania nowego antybiotyku po- lieterowego, /l9-epi-dianemycyny/f który moze byc stosowany jako czynnik przeciwkokcydiozowy i przeciwbakteryjny, zwlaszcza w paszach dla bydla i swin.Kokcydioza, powszechna i szeroko rozprzestrzeniona choroba drobiu Jest wywolywana przez jeden lub kilka gatunków pasozytniczych pierwotniaków z rodzaju Eimeria. Znane sa dwa typy kokcydiozy, zoledkowa i jelitowa* Pierwszy typ jest wywolywany przez E.tenella i charakte¬ ryzuje sie ostrymi krwotokami. Drugi typ wywoluje rózne gatunki Eimeria, takie jak E.acer- vulina, E.necatrix, E.maxima, E.hagani, E.mitis, E.praecox i E.brunetti, Kokcydioze u in¬ dyków wywoluje E.adenoides i E.maleagrimitis. Skutki ekonomiczne kokcydiozy sa daleko idece i sted eliminacja lub leczenie tej choroby ma wielkie znaczenie w drobiarstwie.Opisano juz wiele zwiezków o róznej budowie i dzialaniu przeciw kokcydiozie, a tym antybiotyki polieterowe, takie jak monensyna ^3.Amer. Chem. Soc •, 89, 5737/l967/_7, nigery- cyna £ Bioch. Biophys. Res. Comm., 33, 29/1968/^, gryzoryksyna £*3. Chem. Soc. Chem. Comm., 1421/1970/J, dianemycyna £"3. Antibiotics, 22, 161/1969/J i opis patentowy St. Zjedn. Am. nr 3 577 531, salinomycyna £3* Antibiotics, 27, 814/1974/Ja X-537 A £*/D. Chem. Soc, Chem.Comm., 967/1972/J, X-206 £"3. Chem. Soc. Chem. Comm., 927/1971/^7, A204A £"*J. Amer. Chem.Soc, 95 3399/1973/^7, mutalomycyna £"3. Antibiotics, 30, 903/1977/^7,. jonomycyna £Tt).Amer. Chem. Soc, 101, 3344/1979/.7, K-41 b£d. Antibiotics, 32, 169/1979/^7, A-130B i A-130 C £"b. Antibiotics, 33, 94/1980/y, 1auseramycyna £"3« Antibiotics, 33/137/1980/^7, oraz A-28695 B /T3« Antibiotics, 33, 252/1980/.7. Przegled tych antybiotyków znajduje sie w pracy Westleya "Poliether Antibiotics", Adv. Appl. Microbiol., 22^177/1977/ oraz w pra¬ cy Shumarda i wsp. w Antimiorob. Agents and Chemother., 369-377/1967/.2 144 963 Czerwonka jest jedne z najbardziej powszechnych w Stanach Zjednoczonych chorób swin, wystepuje takze ona w wielu innych krajach i corocznie powoduje wielkie straty eko¬ nomiczne* Ostatnio odkryto, ze wielki kretek Treponena hyodysenteriae jeet co najmniej pierwotnym zródlem zakazen. Patrzt Harris D* L* i wsp* "Swina Dysentery-1 Inoculation of Pigs with Treponema Hyodysenteriae /New Species/ and Reproduction of the Dlsease", Vet* Med/SAC, 67, 61-64/1972* Innym, ekonomicznie pozedanym zadaniem nauk weterynaryjnych jest zwiekszanie wydajnosci tj• zwiekszanie szybkosci wzrostu i/lub zwiekszanie stopnia przy¬ swajania pokarmu, u zwierzat przezuwajacych, takich jak bydlo* Szczególne znaczenie ma przyspieszenie wzrostu poprzez zwiekszanie stopnia przy¬ swajania pokarmu* Mechanizm przyswajania glównego ekladnlka odzywczego pokarmu /weglowo¬ danów/ zwierzat przezuwajacych jest dobrze znany* Drobnoustroje w zwaczu zwierzat przek¬ sztalcaja weglowodany w monocukry, które nastepnie ulegaja konwersji w pirogroniany* Pi¬ róg roniany sa metabolizowane w procesach mikrobiologicznych w octany, maslany lub propio- nlany, okreslane lacznie jako lotne kwasy tluszczowe /VFA/* Bardziej szczególowe rozwa¬ zania na ten temat znalezc mozna w pracy Langa "Phyeiology of Digestion and Metabilism in the Ruminant", Phllipson i wsp* /wydawcy/, Orlel Press, Newcastle-upon-Tyne, Anglia, 1970, str. 408-410.Wzgledna wydajnosc przyswajania VFA jest dyskutowana przez McCullougha w "Feed- stuffs", 19 czerwca, 1971,str* 19; Eskelanda i wsp* w 0* An* Sci*, 33, 283/1971/; oraz Churcha 1 wsp* w MOigestive Physlology and Nutrition of Ruminanst", tom 2, 1971, str* 622 i 625* Aczkolwiek octany i maslany sa przyswajalne to lepiej przyswajane sa pro- pioniany* Ponadto, jesli jest obecna zbyt mala ilosc propionianów, wówczas u zwierzat mo¬ ze wystepowac ketoza* Pozyteczny zwiazek, stymuluje wiec wytworzenie wiekszej ilosci pro¬ pionianów z weglowodanów i tym samym zwieksza przyswajanie weglowodanów i zmniejsza ilosc przypadków ketozy* Nieoczekiwanie stwierdzono, ze nowy szczep Streptomyces hygros- copius, wyizolowany z próbki gleby z Waszyngtonu D*C*, wytwarza nowy i cenny antybiotyk o dzialaniu przeciwkokcydiozowym. Ten nowy antybiotyk wyodrebiono i zidentyfikowano jako 19-epi-dianemycyne• Wedlug wynalazku sposób wytwarzania 19-epi-dianemycyny polega na tym, ze hoduje sie streptomyces hygroscopicus /ATCC 39205/ w wodnej pozywce zawierajacej Jako skladniki odzywcze zródla przyswajalnego wegla, azotu i soli nieorganicznych, prowadzac hodowle w warunkach napowietrzania az do uzyskania znacznej ilosci 19-epi-dianemycyny, po czym wyodrebnia sie 19-epi-dianemycyne* Na ogól, 19-epi-dianemycyne izoluje sie droga ekstrak¬ cji brzeczki fermentacyjnej ketonem metylowoizobutylowym* Hodowla zawierajaca drobno¬ ustrój streptomyces hygroscopicus /AT CC 39205/ zdolna jest wytwarzac antybiotyk 19-epi- -dianemycyne w ilosci dajacej sie wyodrebniac w procesie fermentacji w wodnej pozywce za¬ wierajacej zródla przyswajalnego wegla, azotu i soli nieorganicznych* Drobnoustrój wytwarzajacy antybiotyk sposobem wedlug wynalazku zostal wyizolowany z próbki gleby w Waszyngtonie, D.C*, Stany Zjednoczone Ameryki* Oznaczono go jako drobno¬ ustrój N-483-29* Badania taksonomiczne tego drobnoustroju przeprowadzone przez L*H* Huanga, opisano ponizej* Na podstawie swoich badan Huang stwierdzil, ze jest to szczep Streptomyces hygroscopicus /Jensen/ Waksman i Henrici. Nowy drobnoustrój posiada waskie strzepki charak¬ terystyczne dla Actinomycetales, wytwarza lancuchy zarodników na grzybni powietrznej i nie- rozczlonkowanej grzybni spodniej* Wyniki analizy nienaruszonych komórek sa dalszym potwier¬ dzeniem przynaleznosci i drobnoustroju do rodzaju Streptomyces* Drobnoustrój N-483-29 zaszczepiono na agarze skosnym na pozywce ATCC 4 172 i hodo¬ wano w ciagu trzech dni w temperaturze 28 C, ne trzesawce* Nastepnie wirowano w ciagu 20 minut, przemyto trzykrotnie jalowa destylowana woda i zaszczepiono pozywki zwykle stosowa¬ ne dla identyfikacji Actinomycetales* Hodowle inkubowano w temperaturze 28°C* Wyniki moz¬ na bylo uzyskiwac po uplywie róznego okresu czasu, najczesciej po 14 dniach* Do opisu barw stosowano powszechnie uzywana terminologie, ele dokladnie barwe oznaczano przez po¬ równanie z wzorcami barw w "Color Hamony Manual", wydanie czwarte* Do analizy aminokwa-144963 3 sowej i cukrowej nienaruszonych komórek stosowano metody opisane przez B. Beckera 1 wsp. w Appl. Microbiol., 12, 421-423/1964/ i M.P. Lechevaliera w 0. Lab. Clin. Med., 71, 934-944/1968/• Do charakterystyki drobnoustroju stosowano nastepujace pozywki identyfikacyjne* /l/ Pozywka z tryptonem i wyciagiem drozdzowym ISP ^ 1 /Difco/, /2/ Agar z wyciegiem drozdzowym i wyciagiem slodowym ISP / 2 /Difco/, /3/ Agar owsiany ISP j* 3 /Difco/, /4/ Agar skrobiowy z solami nieorganicznymi ISP /.4 /Difco/, /5/ Agar Glicerynowo-asparaginowy ISP f* 5 /Difco/, /6/ Agar zelazowy z peptonem i wyciegiem drozdzowym ISP / 6 /Difco/, /7/ Agar Czapek*a z sacharoza - S.A. Waksman "The Actinomycetes*, tom 2, pozywka nr 1, str. 328, 1961, /8/ Agar glukozowo-asparaginowy, ibidem, pozywka nr 2, str, 328, /9/ Agar Bennetta, ibidem, pozywka nr 30, str* 331, /10/ Agar Emersona, ibidem, pozwyka nr 28, str. 331, /li/ Agar odzywczy, ibiolem, pozywka nr 14, str. 330, /12/ Agar tyrozynowy Gordona i Smitha, R.E. Gordon i M.M. Smith O.r., Bact., 69, 147150, 1955, /13/ Agar kazeinowy , ibidem, /14/ Agar z jablczanem wapniowym, S.A. Waksman, Bact. Rev., 21, 1-29, 1957, /15/ Zelatyna, R.E. Gordon i O.M. Mihm Jr., Bact., 73, 15-27, 1957, /16/ Skrobia, ibidem, /17/ Pozywka z organicznym azotanem, ibidem, /18/ Pozywka z dekstroze i azotanem, S.A. Waksman "The Actinomycetee", tom 2, pozywka nr 1, str. 328, 1961, zawierajaca 3 g dekstrozy zamiast 30 g sacharozy i nie zawie¬ rajeca agaru, /19/ Agar ziemniaczano-marchwiowy, M.P. Lechevalier Jr., Lab. and Clinical Med., 71, 934-944, 1968, zawierajecy jednak tylko 30 g ziemniaków, 2,5 g marchwi i 20 g agaru, /20/ 2% agar w wodzie wodociegowej, /2l/ Mleko zbierane /Difco/, /22/ Przyswajanie celulozy: /a/ H.L. Jensen, Proc. Linn. Soc. N.S.W., 55, 231-248, 1930, /b/ M.Levine i H.W. Schoenlein "A# Comilation of Culture Media", pozywka nr 2511, 1930, /23/ Weglowodany, pozywka IDP / 9 /Difco/, /24/ Zakres temperatur, pozywka ISP / 2 z dodatkiem 50 ml mleka kokosowego.Agar z wyciegiem drozdzowym i wyciegiem slodowym - Wzrost dobry, brunatny /okolo 3ie/ z zóltawymi /2ea/ krawedziami lub blonami, umiarkowanie podniesiony, pomarszczony do bloniastego , brak grzybni powietrznej; spód bladozólty /2ea/ z brezowymi liniami /3 gc, 3ic/; brezowy /31c, 3ne/ rozpuszczalny pigment.Agar owsiany - Wzorst umiarkowany, bialy, zóltawy do szarego /l 1/2 ea, 1 1/2 ga, okolo szarych serii 3 dc, 3fe/, cienki do nieco podniesionego, gladki, hygroskopijny w niektórych miejscach, grzybnia powietrzna taka sama jak powierzchnia; spod bezbarwny, kre¬ mowy do szarego /l 1/2 ca, okolo szarych serii 3dc, 3fe/; rozpuszczalny pigment barwy bla- dozóltej /l 1/2 ca/.Agar skrobiowy z solami nieorganicznymi - Wzrost umiarkowany do dobrego, zóltawy do szarego /lea, 1 1/2 ca, blisko szarych serii 3dc, 3fe, 3ih/, cienki do podniesionego, gladki lecz pomarszczony w poblizu krawedzi, hygroskopijny w niektórych miejscach, grzybnia powietrzna taka sama jak powierzchnia; spód bladozólty do szarego /2eaf blisko szarych serii 3dc, 3fe/; rozpuszczalny pigment barwy bladozóltej /l 1/2 ca/.4 144 963 Agar gllcerynowo-asparaginowy - Wzrost ubogi do umiarkowanego, bezbarwny do kre¬ mowego /blisko szarych serii 1 ba/, cienki, gladki, brak grzybni powietrznej; spód bez¬ barwny; brak rozpuszczalnego pigmentu* Agar gkukozowo-asparaginowy - Wzrost dobry, bialy do kremowego /2ca/, podniesio¬ ny, pomarszczony, biala grzybnia powietrzna; spód bladozóltawy /2ea/; rozpuszczalny, pigment bladozóltawej /2ca, 2ea/.Agar Czapek'a z sacharoze - Wzrost umiarkowany do dobrego, kremowy /2ca/, cien¬ ki, gladki z rozciagniete krawedzie, brak grzybni powietrznej, spód bezbarwny do kremo¬ wego /2ca/; kremowy /2ca/ rozpuszczalny pigment.Agar Emersoma - Wzrost dobry, brunatny /blisko 3gc/, podniesiony, gladki do nie¬ co pomarszczonego, brak grzybni powietrznej; 6pód taki sam jak powierzchnia; brazowy /31c/ rozpuszczalny pigment* Agar odzywczy - Wzrost umiarkowany, kremowy /l l/2ca, 2ca/, nieco podniesiony, gladki albo w postaci izolowanych kolonii, brak grzybni powietrznej; spód bladozólta¬ wy /2ca, 2ea/; brak rozpuszczalnego pigmentu.Agar Bennetta - Wzrost dobry, kremowy /2ca/, umiarkowanie podniesiony, pomarsz¬ czony do pofaldowanego, brak lub skepa grzybnia powietrzna, biala; spód kremowy do bla- dozóltawoszarawego /2ca, 2gc/; bladozóltawy, rozpuszczalny pigment /2ea/.Agar tyrozynowy Gordona i Smitha - Wzrost ubogi do umiarkowanego, zóltobrazowy do ciemnobrazowego /4ec. 4nl9 5ni/, cienki do nieco podniesionego, gladki, brak grzybni powie¬ trzne,}; spód brazowy do ciemnobrazowego /51g, 5ni/; rozpuszczalny pigment ciemnobrazowy do czarnego /5nl, 5pn/.Agar z jablczanem wapnia - Wzrost umiarkowany, kremowy /l 1/2 ca/, cienki do nie¬ co podniesionego, gladki, brak grzybni powietrznej; spód taki sam Jak powierzchnia; brak rozpuszczalnego pigmentu.Agar kazeinowy - Wzrost umiarkowany do dobrego, kremowy /2ca, 3ca/, nieco podnie¬ siony, gladki do nieco pomarszczonego,, brak grzybni powietrznej; spód kremowy; rózowa- wobrezowy rozpuszczalny pigment /4ia, 4ga/.Agar zelatynowy - Wzrost dobry, kremowy /blisko 2ca/, umiarkowanie podniesiony, gladki lecz pomarszczony w poblizu krawedzi, brak grzybni powietrznej, spód taki sam jak powierzchnia; kremowy rozpuszczalny pigment.Agar skrobiowy - Wzrost dobry, kremowy /blisko 2ca/, umiarkowanie podniesiony, po¬ marszczony ale moze byc gladki w kierunku krawedzi, brak grzybni powietrznej; spód taki sam jak powierzchnia; kremowy rozpuszczalny pigment.Agar ziemniaczano-marchwiowy - Wzrost umiarkowany, kremowy /l 1/2 ca/, cienki, gladki, skapa grzybnia powietrzna, biala; spód bezbarwny do kremowego; brak rozpuszczal¬ nego pigmentu.Agar z wode wodociagowa - Wzrost ubogi, bezbarwny do kremowego /blisko szarych serii 2ba/, cienki, gladki, w wiekszosci pod powierzchnie, skepa grzybnia powietrzna, biala; spód taki sam jak powierzchnia; brak rozpuszczalnego pigmentu.Cechy morfologiczne. Cechy morfologiczne obserwowano na agarze skrobiowym z so¬ lami nieorganicznymi po 14 dniach inkubowania. Masa zarodników na barwe mieszczece sie w serii szarej, lancuhy zarodników se spiralne, nieco otwarte, o malej srednicy /dlu¬ gosc 6 - 10 um, szerokosc 3 - 4,5/jm/, 3-6 zwojów w kazdej spirali, 8-30 zarodników w kazdym lancuchu; sporofory o jednym odnózu, czasami pionowym; zarodniki owalne do e- liptycznych, czasami o ksztalcie precików lub lódeczek, wielkosc 1,2 - 2,0 x 0,9 x x 1,2 /im, posiadajece wedlug obserwacji w mikroskopie elektronowym brodawki.Cechy biochemiczne. Me lanina nie jest wytwarzana; siarkowodór jest wytwarzany; uplynnia zelatyne; skrobia ulega hydrolizie; azotany ulegaje redukcji do azotynów w obu pozywkach; slaby wzrost i brak rozkladu na celulozie Oensena i celulozie Levine'a i Schoenleina; klaruje ale nie koaguluje mleka; testy na trawienie kazeiny, tyrozyny.144 963 5 1 jablczanu wapnia pozytywna; przyswajanie weglowodanów; glukoza* arabinoza, sacharoza, fruktoza, inozytol, mannltol, rafinoza, raronoza i ksyloza se przyswajalne* Zaleznosci temperaturowe .—«•••••—__——•—•—•.._«_•.•—__•——~_~——»«i. 21°C 28°C i -----v J 37°C 4— -r !Wzrost dobry do i Wzrost dobry JWzrost ;doskonalego 45°C ! - —I -4 l i < : •- j umiarko- | i wany Brak wzrostu J.Analiza nienaruszonych komórek* Sciana komórkowa zawiera kwas LL-dwuaainopinali¬ nowy ale nie zawiera charakterystycznych cukrów* Drobnoustrój N-483-29 charakteryzuje sie szarymi w masie zarodnikami, spiralnymi lancuchami zarodników, zarodnikami po po¬ wierzchni pokrytej brodawkami i negatywne reakcje melaniowe* Na niektórych podlozach grzybnia powietrzne jest w niektórych miejscach hygroskopijna.Z wyjetkiem przyswajania sacharozy i raflnozy, wyizolowany drobnoustrój odpowiada opisowi neotypu szczepu S*hyg- roscopicus podenemu w Int. 3* Syst. Bact., 22, 265-394/1972/. Przyswajanie zródel weg¬ la róznicuje szczepy wedlug H.D* Trensera i E*3. Backusa, którzy zaproponowali roz¬ szerzone koncepcje podzialu na gatunki, opisane w Applied Microbiology, 4, 243-250/ /1956/. Drobnoustrój okreslono wiec jako szczep Streptomyces hygroscopicus /Oensen/ Waksman 1 Henrici. Zostal on zdeponowany w American Type Culture Collection, Rockvllle Maryland, znanej kolekcji zapewniajecej przetrwanie depozytu i latwy dostep powszechny* Drobnoustrój okreslono Jako szczep Streptomyces hygroscopicus ATCC 39205* Dostep do drob¬ noustroju jest mozliwy podczas zalatwiania niniejszego zgloszenia dla uznanych przez Komisarza Urzedu Patentów i Znaków Towarowych St* Zjedn* ze upowaznionych zgodnie z 37 CFR 1* 114 i 35 USC 122* Wszystkie ograniczenia powszechnego dostepu do drobnoustroju zostane ostatecznie zniesione po udzieleniu patentu.Jest zrozumiale, ze wynalazek nie jest ograniczony do zastosowania tylko powyz¬ szego drobnoustroju odpowiadajacego w pelni przedstawionemu opisowi, podanemu tylko dle ilustracji. W szczególnosci w zakres wynalazku wchodzi takze zastosowanie naturalnych i sztucznie otrzymanych mutantów i/lub wariantów, takich jakie mozna otrzymywac z opisa¬ nego drobnoustroju róznymi sposobami, np* przez stosowanie promieniowenie rentgenowskie¬ go, promieniowania ultrafioletowego, iperytu azotowego itp* W zakres wynalazku wchodzi tez stosowanie kazdego drobnoustroju, niezaleznie od jego wygledu i zachowania fizjologicznego, który mozna otrzymywac droge transformacji, transdukcji, genetycznej rekombinacji lub innej metody genetycznej, w której stosuje sie kwas nuklsinowy lub równowazny fragment z opisanego gatunku, jesli wykazuje zdolnosc wy¬ twarzania opisanego produktu lub przenoszenia opisanych zmian biochemicznych* Hodowle szczepu S.hygroscopicus ATCC 39205 prowadzi sie podpowierzchniowo z napo- wistrzanism w tempereturze 21-27°C, mieszajec w wodnym roztworze odzywczej pozywki* Do typowych uzytecznych odzywczych pozywek naleze zródle przyswajalnego wegla, takie jak cukry, skrobie i gliceryna; zródla azotu organicznego, takie jak kazeina, enzymatyczny wycieg kazeiny, kwasy kazeinowe /casamino acids/, meka sojowa, meka z nasion bawelny, meka arachidowa, gluten z pszenicy, meka sojowa, wycieg drozdzowy, meczka miesna i mecz¬ ka rybne; zródla substancji wzrostowych, takie jak rozpuszczalne produkty po fermentacji alkoholowej ziarna, meczka rybna, meka z nasion bawelny i wycieg drozdzowy; sole mine¬ ralne, takie jek chlorek sodowy i weglan wapniowy, i pierwiastki sladowe,takie jak zela¬ zo, magnez, cynk, kobelt i mangan; oraz jako czynniki buforujece weglan wapniowy lub fosforany.6 144 963 Jesli podczas fermentacji wystepuje nadmierne plenienie, dodaje sie wtedy na ogól srodki przeciwpienne, takie Jak oleje roslinne lub silikonowe* Napowietrzanie hodowli pod¬ powie rzchnlowej w fermentorze prowadzi sie doprowadzajac poprzez belkotke korzyetnle od 0,5 do 2 objetosci Jalowego powietrza na 1 objetosc brzeczki* Mieszanie prowadzi sie sto* aujec mieszadla stosowane zwykle w procesach fermentacji*Szybkosc mieszania zalezy od typu stosowanego mieszadla* Kolby na trzesawce miesza sie zwykle przy 150-200 ruchach na minute, natomiast mieszadlo w fermentorach ma zwykle 300-1700 obrotów/minute* Podczas przenoszenia drobnoustroju jego wzrostu musze byc oczywiscie zachowywane jalowe warunki* Inokulum przygotowuje sie zeskrobujec komórki wegetatywne z hodowli na skosach lub w kolbach R0Ux drobnoustrojuN-483-29* Odpowiednim stalym podlozem dla wstepnej ho¬ dowli na skosach i w kolbach R0ux jest pozywka / 172.ATCC. atcc_i72 Srsss^liir Glukoza 10 Skrobia rozpuszczalna 20 Wyciegdrozdzowy 5 NZ Amine A /pepton zkazeiny 5 Weglanwapniowy 1 Destylowana woda do 1000 ml pH do 7,0 za pomoce KOH Agar 20 Komórki wegetatywne ze skosów stosuje sie do szczepienia kolb na trzesawke lub fermentorów szczepiennych albo alternatywnie fermentory szczepienne zaszczepia sie mate¬ rialem z kolb* W kolbach trzesawkowych wzrost generalnie osiega maksimum w 96 do 120 go¬ dziny, natomiast w fermentorach szczepiennych wzrost osiega optimum w 72-96 godziny* Fer- mentor szczepi sie wegetatywne brzeczke z kolb szczepiennych lub fermentora w absolutnie jalowych warunkach i fermentuje w ciagu 96-168 godzin. Napowietrzanie w kolbach zapewnia sie poprzez wstrzesanie a w fermentorach droge przepuszczania przez belkotke powietrza w ilosci 0,5-2 objetosci na 1 objetosc brzeczki na minute. Szybkosc mieszania zalezy od ty¬ pu mieszadla, jak to podano uprzednio. Temperature utrzymuje sie w zakresie od 24 do 36°C.Po zakonczeniu fermentacji antybiotyk odzyskuje sie droge ekstrakcji calej brzecz¬ ki nie mieszajecym sie z wode rozpuszczalnikiem, takim jak-n-butanol, keton metylowe— izobutyIowy octan etylu lub chloroform, przy pH 4,0-8,0. Alternatywnie, oddziela sie grzybnie i ekstrahuje jednym z powyzszych rozpuszczalników w celu wyizolowania antybio¬ tyku* Ekstrakt zateza sie, koncentrat rozpuszcza w heptanie i chromatografuje na zelu krzemionkowym.Postep w wytwarzaniu antybiotyku podczas fermentacji i aktywnosc biologiczne brzeczki fermentacyjnej mozna kontrolowac droge oznaczen biologicznych brzeczki, stosu- jec wrazliwy szczep Staphylococcus aureus lub Bacillus subtilis. Odpowiednimi do tego celu ea S.aureus ATCC 6538 i B.subtilis ATCC 6633* Stosuje sie standardowe technike ply¬ tkowe, w której jako miare aktywnosci antybiotycznej przyjmuje sie wielkosc strefy za¬ hamowania okrezajecej krezek bibulowy nasycony pozywke. Mozna tez stosowac chromato¬ graf ie cienkowarstwowe na zelu krzemionkowym do analizowania antybiotyku w brzeczce fer¬ mentacyjnej oraz skladu surowego i oczyszczonego materialu ekstrahowanego z brzeczek fer¬ mentacyjnych.Chroma tog ramy na zelu krzemionkowym GF firmy Analtech rozwija sie mieszanine 9 : 1 octanu etylu 1 metanolu lub mieszanine 9 : l chloroformu i metanolu. Chromato¬ grafii wywoluje sie spryskujec odczynnikiem wanilinowym /3 g waniliny w 75 ml etanolu i 25 ml 85% kwasu fosforowego/ i ogrzewajec plytke w temperaturze 80°C* Antybiotyk wywolu¬ je sie w postaci purpurowej plamki* Plytke mozna tez pokryc agarem zaezczepionym S.au¬ reus lub B.subtilis, do którego dodano jednowodzian chlorku 2,3,4-trójfenylo-2H-tetra-144 963 7 zoilowego. Taka plytke Inkubuje sie w temperaturze 37°C w ciegu 16 godzin, wywolujec antybiotyk w postaci bialej plamy na rózowym podlozu. 19-epi-dianemycyna wykazuje dzialanie hamujace przeciw wielu drobnoustrojom Gram- -dodatnim. W testach kazdym drobnoustrojem szczepiono serie probówek testowych zawiera¬ jecych odzywcze pozywke i dodawano rózne stezenia 19-epi-dianemycyny, w celu oznaczenia najmniejszego stezenia hamujecego /MIC/ antybiotyku w mcg/ml, hamujecego wzrost drobno¬ ustroju w ciegu 24 godzin. 19-epi-dianemycyny i jej kationowe sole wykazuje doskonale aktywnosc wobec kokcydiozy drobiu. Dodawane w ilosci 50 - 200 ppm do pokarmu dla kur¬ czeta zwlezki skutecznie zwalczaje zakazenie kokcydiowe wywolywane przez Eimeria te- nella, E.acen/ulina, E.maxima, E.brunrtti i E.necatrix.Dane dotyczece skutecznosci 19-epi-dianemycyny i jej soli w zakazeniach kokcy- diowych u kurczet otrzymywano w nastepujecy sposób. Grupy po 3-5 dziesieciodniowych mlodych kogutków rasy SPF bialy leghorn karmiono mieszanke zawierajece jednorodnie roz¬ proszone 19-epi-dianemycyne lub jej sól sodowe i/lub potasowe. Po 24 godzinach kazde kurcze;zakazono doustnie oocytami poszczególnych testowych gatunków Eimeria. Inne grupy po 3 - 5 sztuk dziesieciodniowych kurczet karmiono podobne mieszanke ale nie zawiera¬ jece 19-epidianemycyny i nie zakazano ich kokcydioze. Byly to grupy kontrolne. Wyniki obserwowano po uplywie 5 dni dla E.acervulina lub 6 dni dla wszystkich pozostalych szczepów.Kryteria przyjete dla oceny aktywnosci przeciwkokcydiozowej polegaje na ocenie uszkodzen wywolywanych przez E.tenella w skali od O do 4, wedlug 3.E. Lyncha w "A. New Method for the Primary Evaluation of Anticoccidial Activity", A.J.Vet. Res.., 22, 324-326 /1961/; oraz w skali od O do 3 dla pozostalych gatunków, wedlug zmodyfikowanej metody oceny opracowanej przez 3. Johnsona i W.M.Reida, "Anticoccial Drugs. Lesion Scoring Techniques in Battery and Floor Pen Experiments in Chicks", Exp. Parasit, 28, 30-36 /1970/. Ocene ustalono dzielec wartosc uszkodzen kazdej traktowanej grupy przez wartosc uszkodzen dla zakazonej grupy kontrolnej.Wartosc pokarmu dla zwierzet ocenia sie generalnie bezposrednio droge karmienia zwierzet. W brytyjskim opisie patentowym nr 1 197 826 przedstawiono szczególowo technike in vitro pracy zwacza, za pomoce której przemiany pokramu wywolywane przez drobnoustro¬ je oznacza sie latwiej i z wieksze dokladnoscie ocenia pasze zwierzet. Ta technika pole¬ ga na zastosowaniu aparatu, w którym procesy trawienia u zwierzet se prowadzone i ana¬ lizowane in vitro. Pokarmy zwierzece, inokulum ze zwacza i rózne stymulatory wzrostu wprowadza sie i usuwa z urzedzenia laboratoryjnego w dokladnie kontrolowanych warunkach 1 zachodzece zmiany se krytycznie i stopniowo analizowane podczas zuzywania pokarmu przez drobnoustrój. Wzrost zawartosci kwasu propionowego w plynie ze zwacza wskazuje na poza¬ dane zwiekszenie ogólnej sprawnosci przezuwania spowodowanej dodaniem stymulatora wzrostu do mieszanki paszowej. Zmiana zawartosci kwasu propionowego wyrazana jest w postaci % za¬ wartosci kwasu propionowego stwierdzonej w kontrolnym plynie ze zwacza. Dla wykazania wiarygodnej korelacji pomiedzy zwiekszeniem ilosci kwasu propionowego w plynie ze zwacza i lepszym rozwojem zwierzecia stosuje sie dlugotrwale badania karmienia in vivo.Plyn ze zwacza zbiera sie z przetoki u krowy karmionwej dawke tuczece i sianem.Plyn ze zwacza natychmiast seczy sie przez tkanine filtracyjne dla serów i 10 ml dodaje eie do kolby stozkowej o pojemnosci 50 ml zawierajecej 400 mg standardowego substratu /68% skrobi kukurydzianej, 17% celulozy i 15% ekstrahowanej meki sojowej/, 10 ml buforu o pH 6,8 i testowane zwlezki. Przez zawartosc kolby przepuszcza sie w ciegu okolo dwóch minut azot nie zawierajecy tlenu i inkubuje w ciegu okolo 16 godzin w temperaturze 39°C, wstrzesajec w lazni wodnej. Kazdy test wykonuje sie trzykrotnie.Po zakonczeniu inkubowania próbke 5 ml miesza sie z 1 ml 25% kwasu aetafosforo- wego. Po uplywie 10 minut dodaje sie 0,25 ml kwasu mrówkowego i mieszanine wiruje w ciegu 10 minut przy 1500 obrotach/minute. Próbki analizuje sie za pomoce cieczowej8 144 963 chromatografii gazowej, atosujec Metode opisane przez D.W* Kelloga w 0* Dalry Science, 52, 1690 /1969/* Oznacza sie wysokosc pików kwasu octowego, propionowego 1 maslowego dla traktowanych i nietraktowanych próbek* Dla poprawiania wykorzystywania pokarau przez zwierzeta przezuwajace, takie Jak bydlo 1 owce, 1 przez zwierzeta jednozoledkowe, takie Jak swinie i króliki, do pokarmu mozna dodawac 19-epi-dianemycyne w postaci wolnego kwasu lub soli sodowej albo potasowej lub ich mieszanin. Mozna taz oczywiscie dodawac do pokarmu w odpowiednim stezeniu suro¬ we 19-epi-dianemycyne albo suszone brzeczke fermentacyjne zawierajece antybiotyk* Po¬ nizsze przyklady ilustruje pelniej wynalazek, nie ograniczajec Jego zakresu.Przyklad I* Do kolb na trzesawke przygotowano nastepujece pozywke* Careloza 20,0 Mekasojowa 10,0 Rozpuszczalne pozostalosci po fermentacjialkoholowej 5,0 Siarczansodowy 0,5 Chlorekkobaltu 0,002 Weglanwapniowy 2 Po 100 ml pozywki umieszczono w kolbach trzesawkowych o pojemnosci 300 ml i ste¬ rylizowano w ciegu 30 minut w temperaturze 120°C, pod cisnieniem 98 kPa. Po ochlodzeniu pozywke zaszczepiono zawiesine wegetatywnych komórek z hodowli Streptomyces hygrosco- picus ATCC 39205 na pozywce agarowej ATCC 172* Kolby wstrzesano w temperaturze 28°C na trzesawce obrotowej o wychyleniu 3,8 -6,35 mprzy 150 - 200 obrotach na minute, w ciegu 3-4 dni* Oedne kolbe stosowano do zaszczepiania pieciolitrowego fermentora zawieraje¬ cego trzy litry ponizszej pozywki* ""- a^litr Cereloza 20,0 Mekasojowa 10,0 Rozpuszczalne pozostalosci po fermentacji alkoholowej 5,0 Siarczansodowy 0,5 Weglanwapniowy 2,0 Chlorekkobaltu 0,002 Woda do 1 litra pH 6,9 - 7,0 Jako srodek przeciwpienny dodano 1 ml silikonu L 61, po czym fermentory zamkniete i sterylizowano w ciegu 45 minut w temperaturze 120 C, pod cisnieniem 98 kPa. Fermentory zaszczepiano jedne /okolo 3% inokulum/kolbe i fermentowano w ciegu 96-168 godzin w tem¬ peraturze 30 C, mieszajec z szybkoscie 1700 obrotów/minute i przepuszczajec jedne obje¬ tosc fermentora na minute* Po zakonczeniu fermentacji, co stwierdzono na podstawie oznaczen na krezkach wobec B.subtillls ATCC 6633, brzeczke seczono przy naturalnym pH przez warstwe ziemi okrzemko¬ wej* Osad zawieszono w metanolu, przeseczono, przesecz zatezono pod zmniejszonym cis¬ nieniem, mzcienczono 2-3 objetosciami wody i ekstrahowano dwukrotnie 1/3 do 1/2 obje¬ tosci rozpuszczalnika, takiego jek keton metylowoizobutylowy* Warstwe organiczne oddzie¬ lono od wodnej droge odsysania lub wirowania, odgazowano i zatezono pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujec oleisty produkt*144 963 9 Alternatywnie, antybiotyk izolowano droge ekstrahowania calej brzeczki przy natu¬ ralnym pH ketonem metylowoizobutylowym' i zatezono ekstrakt do konsystencji gestego ole¬ ju. Oleisty produkt zawieszono w heptanie i porcjami traktowano zelem krzemionkowym 60 a nastepnie eluowano z zelu chloroformem, mieszanine chloroformu i octanu etylu oraz octa¬ nem etylu* Po zatezeniu frakcji octanowej otrzymano surowy produkt, z którego krystali¬ zowano 19-epi-dianemycyne w postaci mieszanej soli sodowej i potasowej.Stosujac chromatografie cienkowarstwowe surowego produktu w ponizszych ukladach, z których kazdy rozdziela mieszanine dianemycyny i 19-epi-dianemycyny, wykrywano tylko 19-epi-dianemycyne* Rf Rf Uklad Octanetylu 0,30 0,40 Chloroform-aceton /1:1/ 0,42 0,49 Octan etylu-chloroform /2:1/ 0,15 0,22 Podobne wyniki uzyskano zastepujec pozywke z tego przykladu nastepujecymi pozywkami E2&S&2-2 g^litr Cereloza 10,0 Skrobia kukurydziana 10,0 Mekasojowa 10,0 Staly produkt kukurydziany do fermentacji 5,0 Chloreksodowy 5,0 Weglanwapniowy 1,0 Woda do 1 litra pH 6.9 - 7,0 Pozywka_M S^lill Cereloza 10,0 Skrobia 20,0 Wyciegdrozdzowy 5,0 Chlorekkobaltu 0,002 NZ Amine A /pepton zkazeiny/ 5,0 Weglanwapniowy 1,0 Woda do 1 litra pH 6,9 - 7,0 Przyklad II. Proces z przykladu I ale w wiekszej skali w duzych fermen- torech, prowadzono przygotowujec inokulum w kolbach trzesawkowych zawierajecych 0,7 li¬ tra pozywki CL13M. Inokulum w kolbach fermentowano w ciegu 3-5 dni w temperaturze 28 C i stosowano do zaszczepienia 6434,5 litrów fermentora zawierajecego 4442 litrów pozywki CL13M. Uzywano okolo 1 litr /O,05%/ inokulum na jeden fermentor. Po trwajacej 4 dni fermentacji otrzymano okolo 4164 litrów brzeczki, które w calosci ekstrahowano 1/5 objetosci ketonu metylowoizobutylowego przy naturalnym pH, rozdzielono w ekstraktorze Podbielniaka i rozpuszczalnik zatezono pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujec 30,3 li¬ trów oleistego produktu.10 144 963 Oleisty produkt dalej zatezano do konsystencji syropu w wyparce cyklonowej. Po za- tezeniu olej zawieszono w heptanle 1 mieszano z zelem krzemionkowym 60 /Merck/, a na¬ stepnie eeczono przez warstwe zelu krzemionkowego 1 powtórnie przemyto heptanem. Anty¬ biotyk eluowano kolejno chloroformem, mieszanine chloroformu 1 octanu etylu, octanem etylu 1 50% roztworem acetonu w octanie etylu. Elucje kontrolowano za pomoce chromato¬ grafii cienkowarstwowej i oznaczen biologicznych kolejnych frakcji. Frakcje zawieraje¬ ce aktywny produkt poleczono, zatezono i powtórnie chromatografowano, wyodrebniejec an¬ tybiotyk. Podczas przerubu wystepowaly problemy z odbiorem wlasciwych frakcji podczas traktowania kolejnych frakcji zelem krzemionkowym. Przepuszczenie aktywnych frakcji przez granulowany wegiel Darco usuwalo przeszkadzajece materialy 1 poprawialo odzysk* Wyodrebniono okolo 40 g krystalicznej 19-epi-dianemycyny.Przyklad III. Powtarzajec postepowanie opisane w przykladzie II otrzy¬ mano okolo 4164 litrów brzeczki z fermentacji S. hygroscopicus ATCC 39205. Cale brzecz¬ ke ekstrahowano 1/5 objetosci ketonu metylowoizobutylowego i ekstrakt zatezono pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujec okolo 3,79 litra brazowego oleistego produktu. Kon¬ centrat dodano podczas mieszania do 11,4 litrów heptanu i otrzymane zawiesine prze¬ saczono przez warstwe ziemi okrzemkowej.Przesecz porcjami traktowano 3 kg zelu krzemionkowego 60 /Merck/ do chromato¬ grafii kolumnowej 0,24 - 0,062 mm. Zel przemyto kolejno 11,4 litrami heptanu, chlorofor¬ mu, acetonu i metanolu. Wszystkie frakcje badano za pomoce chromatografii cienkowarst¬ wowej 1 stwierdzono, ze 19-epi-dianemycyna znajdowala sie przede wszystkim we frakcjach acetonowych i chloroformowych.Frakcje acetonowe /180 g/ chromatografowano na kolumnie o wymiarach 8 x 100 cm, zaladowanej zelem krzemionkowym 60 /Merck/ do chromatografii kolumnowej /O,062-0,04 mm/ w octanie etylu. Do elucji stosowano octan etylu. Eluowano z szybkoscia 70 ml/minute i zbierano frakcje o objetosci okolo 1 litr. Frakcje badano za pomoce chromatografii cienkowarstwowej na zelu krzemionkowym GF /Analtech/, stosujec do rozwijania octan ety¬ lu. Plytki wywolywano spryskujec je odczynnikiem wanilinowym /3 g waniliny w 75 ml e- tanolu i 25 ml 8585 kwasu fosforowego/ i ogrzewajec w temperaturze 80°C. W tych warun¬ kach 19-epi-dianemycyna pojawila sie w postaci purpurowej plamy.Frakcje zawierajece 19-epi-dianemycyne poleczono i odparowano. Koncentrat roz¬ puszczono w 1 litrze chloroformu, przemyto 1 litrem zakwaszonej do pH 4 wody i nastepnie 1 litrem 5% roztworu dwuzasadowego fosforanu sodowego o pH 9, suszono nad bezwodnym siarczanem sodowym, przeseczono i odparowano. Koncentrat rozpuszczono w acetonie i do¬ dano male ilosc /okolo 10%/ wody 19-pidianemycyna krystalizowala w postaci soli sodo¬ wej, które odseczono i wysuszono pod zmniejszonym cisnieniem w pokojowej temperaturze.Wydajnosc soli sodowej wynosila 23 g.Frakcje chloroformowe z traktowania zelem krzemionkowym /280 g/ rozpuszczono w 1 litrze chloroformu i przepuszczono przez kolumne o wymiarach 7 x 120 cm zaladowane granulowanym weglem aktywnym w chloroformie. Eluowano chloroformem z szybkoscie 20 ml/mi¬ nute, zbierajec frakcje po 300 ml. Frakcje zawierajece antybiotyk poleczono i zatezono.Koncentrat krystalizowano tak jak opisano dla frakcji acetonowej i otrzymano 14 g soli sodowej. Z drugiego rzutu otrzymano dodatkowo 10 g surowego materialu.Sól sodowa 19-epi-dianemycyny ma temperature topnienia 193-195°C. Inne wlasci¬ wosci: UVmax « 232 nm, E**cm « 157; D ¦ + 11,0° /c ¦ 1, metanol/; analiza elementarna: obliczono dla C47H77C14Na: C - 63,49, H - 8,73, 0 - 27,78; znaleziono: C - 63,10 H - 8,86 0 /z róznicy/ - 28,04.Wolny kwas otrzymywano przemywajec roztwór chloroformowy soli sodowej zakwaszone wode /pH 4/ i nastepnie odparowujec chloroform. Zwiezek nie dal sie krystalizowac, ale otrzymano go w postaci szklistego osadu. UVmov ¦ 232 mm, Ej*^m « 163; D ¦ + 15,6° max i cm /e ¦ 1, metanol/. Analiza elementarna: obliczono dla C47H7g°14: C - 65,10 H - 9,06, 0 - 25,84; znaleziono: C - 64,46, H - 8,94, 0 /z róznicy/ - 26,61.144 963 11 Zastrzezeni 1. Sposób wytwarzania 19-epi-dianemy sie Streptomyces hygroscoplcus ATCC 39205 w odzywcze zródla przyswajalnego wegla, azotu w warunkach napowietrzania, az do uzyskania 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znam 19-epi-dianemycyne. 3. Sposób wedlug zastrz* 2, zmam izoluje sie droge ekstrakcji brzeczki fermei 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znam stosuje sie glukoze. a patentowe :yny, znamienny tym, ze hoduje wodnej pozywce zawierajecej Jako skladniki i soli nieorganicznych, prowadzec hodowle znacznej ilosci 19-epi-dianemycyny. lenny tym, ze wyodrebnia sie ienny tym, ze 19-epi-dianemycyne itacyjnej ketonem ;ne tylowoizobutylowym, ienny tym, ze jako zródlo wegla PL PL PL