FI77263B - Foerfarande foer framstaellning av 19-epi-dianmycin. - Google Patents

Description

! 77263

Menetelmä 19-epidiaanimysiinin valmistamiseksi

Keksintö koskee mikrobiologista menetelmää uuden polyeetteriantibiootin valmistamiseksi ja menetelmää sen 5 talteenottamiseksi. Tarkemmin ilmaistuna se koskee 19-epi-diaanimysiinin valmistusta fermentoimalla aerobisesti uutta Streptomyces hygroscopicus -kantaa ja sen talteenottoa fermentointiliemestä. 19-epidiaanimysiini on käyttökelpoinen itiöloisten ja bakteerien vastaisena aineena.

10 Kokkidioosia, yleistä ja laajalle levinnyttä sii pikarjan infektiota, aiheuttaa moni alkueläinloissuvun Eimeria lukuisista lajeista. Tunnetaan kaksi kokkidioosi-tyyppiä, umpisuolen ja suoliston kokkidioosi. Ensimmäistä tyyppiä aiheuttaa E. tenella ja sille on luonteenomaista 15 vakava verenvuoto. Toista tyyppiä aiheuttavat erilaiset

Eimeria-lajit, kuten E. arveculina, E. maxima, E. necatrix, E. hagani, E. mitis, E. praecox ja E. brunetti. Kalkkunoissa ovat E. adenoides ja E. maleagrimitis kokkidioosia aiheuttavia organismeja.

20 Kokkidioosin taloudelliset vaikutukset ovat suuret ja taudin poistaminen tai hallinta on siksi hyvin tärkeää siipikarjateollisuudelle.

Monia erilaisia yhdisteiden rakennetyyppejä on kuvattu itiöloisten vastaisina aineina mukaanluettuina po-25 lyeetteriantibiootit, kuten monensiin! [3. Am. Chem.

Soc. 89 (1967) 57377; nigerisiini /jSiochem. Biophys. Res. Comm. 33 (1968) 2^7, grisoriksiini [3. Chem. Soc. Chem. Commun. (1970) 142JJ; diaanimysiini (3. Antibiotics 22 (1969) 161; US-patenttijulkaisu 3 577 531, 4.5.197Γ7;

30 salinomysiini (3. Antibiotics 27 (1974) 8147: X-537A

£j. Chem. Soc. Chem. Commun. (1972) 9677; X-206 13. Chem. Soc. Chem. Commun. (1971) 9277: A204A /3. Am. Chem. Soc.

95 (1973) 3397; mutalomysiini [J. Antibiotics, 30 (1977) 90j£7; ionomysiini /j. Am. Chem. Soc. 101 (1979) 334_47; .

35 K-413B [3. Antibiotics 32 (1979) 169~7: A-130B ja A-130 C

2 77263 [_J. Antibiotics 33 (1980) 947; lauseramysiini /J. Antio-nitocis 33 (1980) 1377, jaA-28695 B /X. Antibiotics 33 (1980) 25jT7. Westley on tehnyt aiheesta katsauksen "Polyether Antibiotics", Adv. Appi. Microbiol. 22 (1977) 177, 5 sanoin Shumard et ai., Antimicrob. Agents & Chemother.

(1967) 369-377.

Sian punatauti, eräs yleisimmistä sikojen sairauksista Yhdysvalloissa, on yleinen myös monissa muissa maissa ja aiheuttaa vuosittain suuria taloudellisia menetyk-10 siä. Viime aikoina on havaittu, että suuri spirokeetta, Treponema hyodysenteriae., on, ainakin pääasiallinen, infektiolähde /Harris, D.L. et ai. "Swine Dysentery-1 Inoculation of Pigs with Treponema hyodysentreriae (New Species) and Repruduction of the Disease". Vet.

15 Med/SAC 67 (1972) 61-647.

Hyötysuhteen paraneminen (parantunut kasvunopeus ja/tai ravinnon hyväksikäyttösuhteen paraneminen) märehtijöillä, kuten nautakarjalla, on toinen taloudellisesti toivottava eläinlääketieteen päämäärä. Erityisen mielen-20 kiinnon kohteena on kasvun edistäminen, joka saavutetaan parantamalla ravinnon hyväksikäyttöä. Märehtijöiden rehun pääravinneosan (hiilihydraattien) hyväksikäytön mekanismi on hyvin tunnettu. Eläinten pötsissä olevat mikro-organismit hajoittavat hiilihydraatteja monosakkari-25 deiksi,jotka muuttuvat sitten pyruvaateiksi. Pyruvaatit muuttuvat mikrobiologisten prosessien kautta asetaateik-si, butyraateiksi tai propionaateiksi, jotka ryhmänä tunnetaan haihtuvina rasvahappoina (VFA). Tarkempia tietoja on teoksessa Leng. "Physiology of Digestion and 30 Metabolism in the Ruminant" Phillipson et ai., toim.

Oriel Press, Newcastle-upon-Tyne, England, 1970, 408-410.

VFA:n hyväksikäyttösuhdetta käsitellään julkaisuissa McCullough "Feedstruffs", 19. toukokuuta 1971, 35 s. 19: Eskeland et ai., J. An. Sei. 33 (1971) 282; ja Church et ai. teoksessa "Digestive Physiology and il 3 77263

Nutrition of Ruminats" 2 (1971) 622 ja 625. Vaikka asetaat-teja ja butyraatteja käytetään hyväksi, on propionaattien hyväksikäyttö tehokkaampaa. Lisäksi, jos saatavissa on liian vähän propionaattia, voi eläimille kehittyä ketoosi.

5 Edullinen yhdiste stimuloi tästä syystä eläimiä tuottamaan suuremman määrän propionaatteja hiilihydraateista parantaen siten hiilihydraattien hyväksikäyttötehoa ja pienentäen ketoosin esiintymistiheyttä.

Nyt on havaittu, että uusi Streptomyces hygroscopi-10 cus-kanta, joka on eristetty Washington D.Crstä kerätystä maanäytteestä, tuottaa uutta ja arvokasta antibioottia, jolla on itiöloisien vastaisia ominaisuuksia. Tämä uusi tuote eristettiin ja tunnistettiin 19-epidiaanimysiiniksi. 19-epidiaanimysiinillä on kaava: 15

3· V

' 0(45 1' F 6'

36 °H O

20 Me Jl IjpMe 39 o _ f f23 32ML 27 Γλ X 7 i9 a j/τα vc J/i^y7 V.31 ! Ah 13 0 » k u 21 2/ CO-H ife Me Me ~~T ,30

25 40 38 35 OH tl^OH

lST-epidiaanimysiiniä valmistetaan keksinnön mukaisesti siten, että viljellään kantaa Streptomyces hygroscopicus 3g ATCC 39205 vesipitoisessa ravinneliuoksessa, joka sisältää assimiloituvia hiilen ja typen lähteitä ja epäorgaanisia suoloja, aerobisissa olosuhteissa, kunnes on muodostunut oleellinen määrä 19-epidiaanimysiiniä.

Keksinnön mukaista antibioottia tuottava mikro-35 organismi eristettiin maanäytteestä, joka kerättiin 4 77263

Washington D.C:stä USA:sta. Se nimitettiin viljelmäksi N-483-29. Tämän mikro-organismin taksonomiset tutkimukset teki L.H. Huang, joka antoi seuraavan kuvauksen. Tutkimustensa perusteella hän päätteli, että se on Strepto-5 myces hygroscopicus (Jensen) Waksman and Henrici -kanta.

Uudella viljelmällä on Actinomycetales-lahkon kapeat hyyfit, se tuottaa itiöketjuja alustalta kohoavalla myseelillä sekä jakautumattoman alustamyseelin. Kokonaisille soluille tehdyn analyysin tulokset vahvistavat 10 lisäksi sen, että se kuuluu Streptomyces-sukuun.

Viljelmä N-483-29 siirrostetaan vinopinnalta ATCC 172-liemeen ja kasvatetaan kolme vuorokautta 28°C:ssa ravistimessa. Sitten sitä sentrifugoidaan 20 min., pestään kolmesti steriilillä tislatulla vedellä ja siirrostetaan 15 alustoille, joita tavallisesti käytetään Actinomycetales-lahkon jäsenten tunnistamiseen.

Viljelmää inkuboidaan 28°C:ssa. Tulokset, jotka on voitu lukea vaihtelevina aikoina, on yleensä otettu 14 vrk:n aikana. Värejä kuvataan tavanomaista terminolo-20 giaa käyttäen, mutta tarkat värit on määritetty vertaamalla käsikirjan the Color Harmony Manual (4. painos) väriliuskoihin. Kokonaisille soluille tehdyissä amino-happoanalyyseissä sekä sokerianalyyseissä käytetyt menetelmät ovat julkaisuissa Becker, B., et ai., Appi. Micro-25 biol. 12 (1964) 421-423 ja Lechevalier. M.P., J. Lab.

Clin. Med. 71 (1968) 934-944 kuvattuja.

Viljelmän karakterisoinnissa käytetyt tunnistus-alustat ja niiden koostumukset lyhyesti esitettyinä olivat seuraavat: 30 1. Tryptoni-hiivauuteliemi (nro 1 ISP-alusta, Difco) 2. Hiivauute-mallasuuteagar (ISP-alusta nro 2, Difco) 3. Kaurajauhoagar (ISP-alusta nro 3, Difco) 4. Epäorgaanisia suoloja sisältävä tärkkelysagar (ISP-alusta nro 4, Difco) 35 5. Glyseroli-asparagiiniagar (ISP-alusta nro 5, Difco) 6. Peptoni-hiivauute-rauta-agar (ISP-alusta nro 6, Difco) 11 5 77263 7. Czapek-sakkaroosiagar, S.A. Waksman, The Actinomycetes, vol. 2, alusta nro 1, s. 328, 1961 8. Glukoosi, asparagiiniagar, ibid, alusta nro 2, s. 328 9. Bennettin agar, ibid, alusta nro 30, s. 331 5 10. Emersonin agar, ibid, alusta nro 28, s. 331 11. Ravintoaineagar, ibid, alusta nro 14, s. 330 12. Gordonin ja Smithin tyrosiiniagar, R.E. Gordon ja M.M. Smith, Jr. Bact. 69 (1955) 147-150 13. Kaseiiniagar, ibid 10 14. Kalsiummalaattiagar, S.A. Waksman, Rev. 21 (1957) 1-29 15. Gelatiini, R.E. Gordon ja J.M. Mihm, Jr. Bact. 73 (1957) 15-27 16. Tärkkelys, ibid 17. Orgaaninen nitraatti -liemi, ibid 15 18. Dekstroosi-nitraattiliemi, S.A. Waksman, The Actinomy cetes, voi. 2 alusta nro 1, s. 328, 1961, jossa 30 g sakkaroosia on korvattu 3 g:11a dekstroosia ja agar jätetty pois.

19. Peruna-porkkana-agar, M.P. Lechevalier, Jr. Lab. and 20 Clinical Med. 71 (1968) 934-944, mutta käytetään vain 30 g perunaa, 2,5 g porkkanoita ja 20 g agaria 20. 2 % vesijohtovesiagar 21. Kuorittu maito, Difco 22. Selluloosan hyväksikäyttö: 25 a) H.L. Jensen, Proc. Linn. Soc. N.S.W. 55 (1930) 231-248 b) M. Levine ja H.W. Schoenlein. A. Compilation of Culture Media, väliaine nro 2511, 1930 23. Hiilihydraatit, ravintoalusta ISP nro 9, Difco 30 24. Lämpötila-alue, ravintoalusta ISP nro 2 + 50 ml kookosmaitoa

Hiivauute-mallasuuteagar:Kasvu hyvä, kullanruskea (lähellä 3ie:tä), kellertäviä (2ea) kohojuovia tai kalvoja, kohtalaisen korkea, ryppyinen-kalvoinen, ei alustas-35 ta kohoavia hyyfejä; kääntöpuoli vaalean kellertävä (2ea), ruskeita juovia (3gc, 3ic); liukoinen pigmentti ruskeaa (31c, 3ne).

6 77263

Kaurajauhoagar: Kasvu kohtalaista, valkea, kellertävä-harmaa (1½ ea, 1½ ga. lähellä harmaata sarjaa 3dc, 3fe), litteä hieman kohonnut, sileä, hygroskooppinen joiltakin alueilta, alustasta kohoavat myseelit samanlaiset 5 kuin pinta; kääntöpuoli väritön, kermanvärinen - harmaa (1½ ca. lähellä harmaata sarjaa 3dc, 3fe); liukoinen pigmentti vaaleankellertävää (1½ ca).

Epäorgaanisia suoloja sisältävä tärkkelysagar: Kasvu kohtalainen - hyvä, kellertävä - harmaa (lea, 1½ ea, 10 lähellä harmaata sarjaa 3dc, 3fe, 3ih), litteä kohonnut, sileä, mutta ryppyinen reunan lähellä, hygroskooppinen joiltakin alueilta, alustasta kohoavat myseelit samanlaiset kuin pinta; kääntöpuoli vaalean kellertävä - harmaa (2ea, lähellä harmaata sarjaan 3dc, 3fe); liukoinen 15 pigmentti vaalean kellertävää (1½ ca).

Glyseroli-asparagiiniagar: Kasvu heikkoa kohtalaista, väritön - kermanvärinen (lähellä harmaata sarjaa lba), ohut, sileä, ei alustasta kohoavia myseelejä; kääntöpuoli väritön; ei liukoisia pigmenttejä.

20 Glukoosi-asparagiiniagar: Kasvu hyvä, valkea - kermanvärinen (2ca), kohonnut, ryppyinen, alustasta kohoavat myseelit valkeita; kääntöpuoli vaalean kellertävä (2ea); liukoinen pigmentti vaaleankellertävää (2ca, 2ea) .

25 Czapek-sakkaroosiagar: Kasvu kohtalainen - hyvä, kermanvärinen (2ca), ohut, leviävä,ei alustasta kohoavia myseelejä. Kääntöpuoli väritön - kermanvärinen (2ca); liukoinen pigmentti kermanväristä (2ca).

Emersonin agar: Kasvu hyvä, kullanruskea (lähellä 30 3gc:tä), koholla, sileä - hieman ryppyinen, ei alustasta kohoavia myseelejä; kääntöpuoli samanlainen kuin pinta, liukoinen pigmentti ruskeaa (31c).

Ravintoaineagar: Kasvu keskinkertainen, kermanvärinen (1½ ca, 2ca), hieman koholla, sileä tai esiin-35 tyy erillisinä pesäkkeinä ei kohoavia myseelejä; kääntöpuoli vaalean kellertävä (2ca, 2ea); ei liukoisia pigmenttejä.

il 7 77263

Bennetin agar: Kasvu hyvä, kermanvärinen (2ca), kohtalaisesti koholla, ryppyinen - harjänteinen, ei alustasta kohoavia myseelejä tai harvoja valkeita kohoavia myseelejä; kääntöpuoli kermanvärinen - vaalean harmah-5 tavan keltainen (2ca, 2gc); liukoinen pigmentti vaalean kellertävää (2ea).

Gordonin ja Smithin tyrosiiniagar: Kasvu heikko -keskinkertainen, kellertävän ruskea - tummanruskea (4ec, 4nl, 5nl), ohut - hieman kohonnut, sileä, ei alustasta 10 kohoavia myseelejä; kääntöpuoli ruskea - tummanruskea (51g, 5ni); liukoinen pigmentti tummanruskeaa - mustaa (5nl, 5pn).

Kalsiummalaatti - agar: kasvu kohtalainen, kermanvärinen (1½ ca), ohut - hieman kohonnut, sileä, ei alus-15 tästä kohoavia myseelejä; kääntöpuoli kuten pinta; ei liukoisia pigmenttejä.

Kaseiiniagar: Kasvu keskinkertainen - hyvä, kermanvärinen (2ca, 3ca), hieman kohonnut, sileä - hieman ryppyinen, ei alustasta kohoavia myseelejä; kääntöpuoli 20 kermanvärinen; liukoinen pigmentti vaaleanpunertavan ruskeaa (4ia, 4ga).

Gelatiiniagar: Kasvu hyvä, kermanvärinen (lähellä 2ca:ta), kohtalaisen kohonnut, sileä, mutta ryppyinen reunan lähellä, ei alustasta kohoavia myseelejä; kääntö-25 puoli kuten pinta; liukoinen pigmentti kermanväristä.

Tärkkelysagar: Kasvu hyvä, kermanvärinen (lähellä 2ca:ta), kohtalaisesti koholla, ryppyinen, mutta voi siletä reunaa kohden, ei alustasta kohoavia myseelejä; kääntöpuoli kuten pinta; liukoinen pigmentti kermanvä-30 ristä.

Peruna-porkkana-agar: Kasvu kohtalainen, kermanvärinen (1½ ca), ohut, sileä, harvoja alustasta kohoavia valkeita myseelejä: kääntöpuoli väritön - kermanvärinen; ei liukoisia pigmenttejä.

35 Vesijohtovesiagar: Kasvu heikkoa, väritön - ker manvärinen (lähellä harmaata sarjaa 2ba), ohut, sileä, 8 77263 pääasiassa pinnan alla, harvoja valkeita alustasta kohoavia myseelejä; kääntöpuoli kuten pinta; ei liukoisia pigmenttejä.

Morfologiset ominaisuudet: Morfologisia ominaisuuk-5 siä tarkasteltiin epäorgaanisia suoloja sisältävällä tärk-kelyaagarilla 14 vrk:n inkuboinnin jälkeen; itiömassa harmaassa värisarjassa; itiöketjut ryhmässä Spirales, hieman avoimia, läpimitta pieni (6-10 pm pitkiä ja 3-4,5 |im leveitä), 3-6 kierrosta rihmaa kohden, 8-30 itiötä itiö-10 ketjua kohden; sporoforit monopodiaalisesti haaroittuneita, joskus pystysuoraan haaroittuneita; itiöt ovaaleja - elliptisiä, satunnaisesti sauvamaisia tai veneenmuo-toisia, 1,2 - 2,0 x 0,9 - 1,2 |im, kyhmyisiä pyyhkäisevällä elektronimikroskoopilla tarkasteltuna.

15 Biokemialliset ominaisuudet: Ei tuota melaniinia; tuottaa rikkivetyä; nesteyttää gelatiinia; hydrolysoi tärkkelystä; pelkistää nitraattia nitriitiksi kummassakin nitraattiliemessä; kasvaa heikosti eikä saa aikaan hajoamista Jensenin selluloosassa eikä Levinen ja Schoen-20 leinin selluloosassa; saa aikaan maidon kirkastumista, mutta ei koaguloitumista; kaseiinin hajoitus positiivinen; kalsiummalaatin hajoitus positiivinen; tyrosiinin hajoitus positiivinen. Hiilihydraattien hyväksikäyttö: käyttää hyväksi glukoosia, arabinoosia, fruktoosia, ino-25 sitolia, mannitolia, raffinoosia, ramnoosia, sakkaroosia ja ksyloosia.

Kasvun lämpötilariippuvuus:

21°C 2 8°C 37°C 45°C

Hyvä - erin- Hyvä Kohtalai- Ei kasvua 3Q omainen kas- kasvu nen kasvu vu

Kokonaisten solujen analyysi: Soluseinä sisältää LL-diaminopimeliinihappoa, muttei karakteristisia sokereita.

35 Viljelmälle N-483-29 ovat tunnusmerkillisiä harmaa itiömassa, kierteiset itiöketjut, kyhmypintaiset itiöt

II

9 77263 ja negatiivinen melaniinireaktio. Joissakin alustoissa on alustasta kohoava myseeli hygroskooppista joiltakin alueilta. Sakkaroosin ja raffinoosin hyväksikäytön positiivisuutta lukuunottamatta eristetty kanta sopii kuvauk-5 seen, joka on tehty S. hygroscopicusin neotyyppikannas-ta ja julkaistu lehdessä Int. J. Syst. Bact. 22 (1972) 265-394. Hiililähteiden hyväksikäyttö vaihtelee kantojen kesken H.D. Tresnerin ja E.J. Backusin mukaan, jotka ovat ehdottaneet laajennettua lajikäsitettä /Applied Micro-10 biology 4 (1956) 243-2507. Siten viljelmää pidetään

Streptomyces hygroscopicus (Jensen) Waksman and Henrici -kantana. Se on talletettu talletuslaitokseen the American Type Culture Collectioniin, Rockville, Maryland. Tälle mikro-organismille on annettu nimi Streptomyces 15 hygroscopicus ATCC 39205.

Viljelmää S. hygroscopicus ATCC 39205 kasvatetaan submersseissa aerobisissa olosuhteissa lämpötilassa 21-37°C sekoittaen ravinteita sisältävässä vesipitoisessa alustassa. Viljelyyn käyttökelpoinen tyypillinen ra-20 vinnealusta sisältää assimiloituvaa hiililähdettä, kuten sokereita, tärkkelystä ja glyserolia; orgaanista typpi-lähdettä, kuten kaseiinia, entsymaattisesti hajoitettua kaseiinia, kasaminohappoja, soijapapujauhoa, puuvillan-siemenjauhoa, maapähkinäjauhoa, vehnägluteiinia, soija-25 jauhoa, hiivauutetta ja kalajauhoa; kasvuainelähteitä, kuten jyvien liukoisia osia, kalajauhoa, puuvillansiemen-jauhoa ja hiivauutetta, samoin kuin mineraalisuoloja, kuten natriumkloridia ja kalsiumkarbonaattia, sekä hivenaineita, kuten rautaa, magnesiumia, sinkkiä, kobolt-30 tia ja mangaania; ja kalsiumkarbonaattia tai fosfaatteja puskuroivina aineina.

Jos fermentoinnin aikana tapahtuu liiallista vaah-toamista, lisätään fermentointialtistaan yleensä vaahdonestoaineita, kuten kasviöljyjä tai silikoneja.

35 Submerssiviljelysäiliöissä olevaa kasvatusalustaa ilmas- ίο 77263 tetaan yleensä syöttämällä siihen fermentointialustan tilavuuteen nähden 1/2-2-kertainen tilavuus steriiliä ilmaa minuutissa jakolaitteen avulla. Sekoitus suoritetaan sekoittimilla, jotka ovat fermentointialan asiantuntijoi-5 den yleisesti tuntemia. Sekoitusnopeus riippuu käytettävästä sekoitintyypistä. Ravistuspulloa pyöritetään yleensä nopeudella 150-200 kierrosta minuutissa, kun taas fer-mentorissa sekoitusnopeus on tavallisesti 300-1700 kierrosta minuutissa. Olosuhteet tulee tietenkin pitää asep-10 tisina organismin siirrostuksen ja koko sen kasvun aikana.

Siirroste valmistetaan raapimalla vegetatiivisolu-ja vinopinnoilta tai Roux-pulloista,joihin on siirrostettu N-483-29-viljelmä. vinopinnoilla ja Roux-pulloissa tapahtuvaan alkukasvatukseen soveltuva kiinteä kasvatusalusta 15 on ATCC-kasvatusalusta nro 172.

ATCC 172 q/1

Glukoosia 10

Liukoista tärkkelystä 20

Hiivauutetta 5 20 "NZ Amiini A:ta" 5

Kalsiumkarbonaattia 1 Täytetään tislatulla vedellä 1000 ml:ksi; pH säädetään 7:ksi KOH:lla

Lisätään agaria 20 25 Vinopinnoilta otettuja vegetatiivisoluja käytetään joko ravistuspullojen tai ymppisäiliöiden siirrostuk- seen; tai vaihtoehtoisesti siirrostussäiliöt siirrostetaan ravistuspulloista. Ravistuspulloissa kasvu saavuttaa maksiminsa 96-120 h:ssa, kun taas siirrostussäiliöissä kasvu 30 on edullisimmassa vaiheessaan 72-96 h:n kuluttua. Fermen-tori siirrostetaan siirrostuspulloista tai -säiliöistä otetulla vegetatiivisoluja sisältävällä liemellä täysin aseptisissa olosuhteissa ja fermentoidaan 96-168 h. Ilmastus suoritetaan ravistuspulloissa ravistimen avulla 35 tai säiliöissä johtamalla liemeen steriiliä ilmaa nopeudella 1/2-2 tilavuus-osaa ilmaa yhtä tilavuusosaa kohti

II

χι 77263 lientä minuutissa. Ravistus (sekoitus)-nopeus riippuu käytettävästä sekoitintyypistä, kuten edellä mainittiin. Lämpötila pidetään alueella 24-36°C.

Kun fermentointi on saatettu loppuun, antibiootti 5 otetaan talteen uuttamalla koko liemi veteen sekoittumat-tomalla liuottimena, kuten n-butanolilla, metyyli-iso-butyyliketonilla, etyyliasetaatilla tai kloroformilla pH

4,0-8,0:ssa. Vaihtoehtoisesti erotetaan myseeli ja uutetaan sitä jollakin edellä luetelluista liuottimista an-10 tibiootin eristämiseksi. Uute väkevöidään, tiiviste sekoitetaan heptaaniin ja puhdistetaan kromatografisesti silikageeIillä.

Antibioottituotannon edistymistä fermentoinnin aikana ja fermentointiliemen biologista aktiivisuutta voidaan 15 seurata tutkimalla liemi biologisesti käyttäen Staphylococcus aureuksen tai Bacillus subtiliksen herkkää kantaa. S. aureus ATCC 6538 ja B. subtilis ATCC 6633 ovat tähän tarkoitukseen soveltuvia kantoja. Käytetään tavanomaista maljakoetekniikkaa, jossa liemellä kyllästettyä 20 suodatinpaperikiekkoa ympäröivä estovyöhyke on antibiootti tehokkuuden mittana. Myös ohutkerroskromatografia, jossa käytetään silikageeliä, on käyttökelpoinen menetelmä analysoitaessa fermentointialustassa syntynyttä antibioottia ja fermentointiliemestä uutettujen epäpuhtaiden 25 ja puhdistettujen materiaalien koostumusta. "Analtech silica gel GF"-levyt eluoidaan etyyliasetaatti/metanoli (9:1)-seoksella tai kloroformi/metanoli(9:1)-seoksella. Antibioottituote saadaan näkyviin ruiskuttamalla vanil-liinireagenssilla (3 g vanilliinia, 75 ml etanolia ja 30 25 ml 85 % fosforihappoa) ja lämmittämällä TLC-levy 80°C:seen.

Antibiootti näkyy purppuranpunaisena täplänä. Malja voidaan myös peittää agarilla, johon on siirrostettu joko S. aureusta tai B. subtilista, ja johon on lisätty 2,3,4-trifenyyli-2H-tetratsoliumkloridimonohydraattia, 35 ja inkuboida 37°C:ssa 16 h, jolloin antibiootti saadaan näkyviin (valkea vaaleanpunaisella taustalla).

12 77263

Massaspektritiedot osoittivat, että keksinnön mukaisesti valmistettu yhdiste natriumsuolansa muodossa oli isomeerinen diaanimysiinin natriumsuolan kanssa. Verrattaessa näiden kahden suolan ‘‘‘H-NMR-tietoja havaitaan, et-5 tä yhdisteet muodostuvat samoista rakenneyksiköistä. Di-aanimysiiniluokan tunnetuilla polyeetteriantibiooteilla tunnetaan kaksi permutaatiota. Toinen koskee A-renkaan metyyliryhmän asemaa ja toinen sokeriosan asemaa. Metyy-liryhmän todettiin olevan 10-asemassa analysoimalla kopio lattujen protonien sekvenssi H7:stä Hiireen. Koska diaani-mysiinissä on ainoastaan yksi sekundäärinen alkoholifunk- tio, sokeriosan asema määritettiin lähtien siitä, että 2 ....

metiinihiili, jolla on geminaalinen O H-isotooppisiirtymä, oli sitoutunut Hiireen. Erot diaanimysiinin ja keksinnön 15 mukaisesti valmistetun yhdisteen natriumsuolojen NMR-spek-treissä ovat C-renkaassa. Tämän renkaan rakenneyksikköjen sekvenssi on muuttumaton (^H-dekoplaus), mutta koplaus-vakiot vaihtelevat, mikä osoittaa stereoisomeerien läsnäoloa. Diaanimysiinin C-renkaan rakenne on esitetty 20 seuraavassa kaaviossa I.

\“ CH TV°T0 C16_ $2^1 C16_)^^C„3 16 ^ H h'' Clf'1* E \£ u I C^2 ? II *722 °* v _ ' ' / N» **

Keksinnön mukaisesti valmistetussa yhdisteessä (Na-suola bentseeni-d,rssa) sekä H19 että H17 ovat liit- ® 3 tyneet samaan Hl8-protoniin koplausvakion J„ „ ollessa n f rl 11 Hz, mikä viittaa trans-diaksiaaliseen järjestelmään. Välttämätön ehto tälle on rakenteen inversio joko 17-tai 19-asemassa; edellinen tapaus vaatisi myös konfor-35 maation muutosta vastakkaiseen "tuolimuotoon". Koska

II

13 77263 koplausvakio H19:n ja H20:n välillä on pieni (5 Hz), kon-formaation muutos vaatisi myös inversion C20:ssa; täten mahdolliset vaihtoehdot ovat joko inversio C19:ssa ilman konformaation muutosta tai inversiot C19:ssa ja C20:ssa 5 sekä konformaation muutos. Koska koplausvakiot eivät kerro mitään konfiguraatiosta C21:ssa, neljä konfiguraation permutaatiota on mahdollista C-renkaassa. Rakenne II kuvaa pienintä mahdollista muutosta osoittaen yhdisteen olevan diaanimysiinin 19-epimeeri. Kaavoissa I ja II 10 symboli "F" esittää F-rengasta, diaanimysiinin ja epi-diaanimysiinin sokeriosaa.

19-epidiaanimysiini-antibiotilla on inhiboiva vaikutus erilaisia gram-positiivisia mikro-organismeja vastaan.

15 Tämän tutkimiseksi kutakin organismia siirrostetaan sarjaan koeputkia, jotka sisältävät ravinnealustaa ja 19-epidiaanimysiiniä vaihtelevina pitoisuuksina, jolloin saadaan määritetyksi pienin antibioottipitoisuus (pg/ml), joka estää organismin kasvun 24 h:n aikana (MIC).

20 19-epidiaanimysiinillä ja sen kationisuoloilla on erinomainen aktiivisuus siipikarjan itiöloisinfektioita vastaan. Kun näitä yhdisteitä sisällytetään kanojen ravintoon pitoisuutena 50-200 ppm, ne estävät tehokkaasti infektioita, joita aiheuttavat Eimeria tenella, E. arveculi-25 na, E. maxima, E. brunetti ja E. necatrix.

19-epidiaanimysiinin ja sen suolojen tehokkuus kanojen itiöloisinfektioita vastaan määritettiin seuraavasti. Ryhmiä, joissa on 3-5 10 vrk:n ikäistä valkeaa leg-horn-SPF-kukkoa, syötettiin hienonnetulla ravinnolla, 30 joka sisälsi 19-epidiaanimysiiniä tai sen natrium- ja/tai kaliumsuolaa tasaisesti sekoitettuna. Kun kananpojat olivat olleet 24 h tällä ravinnolla, kukin niistä infektoitiin suun kautta tutkittavan Eimeria-lajin itiö-rakkuloilla. Muut ryhmät, joissa oli 3-5 10 vrk:n ikäis-35 tä kananpoikaa,ruokittiin samanlaisella hienonnetulla ravinnolla, joka ei sisältänyt 19-epidiaanimysiiniä, ei- 77263 14 kä näitä kanoja infektoitu itiöloisilla. Nämä eläimet toimivat normaaleina vertailueläiminä. Käsittelyn tulokset arvioitiin viiden vrk:n kuluttua E. arveculinan ollessa kyseessä ja kuuden vrk:n kuluttua kaikissa muissa 5 tapauksissa.

Itiöloisten vastaisen aktiivisuuden mittaamiseen käytettyinä arvosteluperusteina olivat vaurioille annetut pisteet 0-4 E. tenellan ollessa kyseessä /J.E. Lynch, "A New Method for the Primary Evaluation of Anticoccidial 10 Activity", Am. J. Vet. Res. 22 (1961) 324-3267: ja 0-3 muiden lajien ollessa kyseessä, jolloin käytettiin J. Johnsonin ja W.H. Reidin pisteytysmenetelmän muunnosta O' Anticoccidial Drugs. Lesion Scoring Techniques in Battery and Floor Pen Experiments in Chicks", Exp.

15 Parasit. 28 (1970) 30-36?· Vakiosuhde saatiin jakamalla kunkin käsitellyn ryhmän saama vauriopistemäärä infektoidun vertailuryhmän samalla vauriopistemäärällä.

Eläinten ravinnon arvo on yleensä määritetty suoraan syöttämällä eläintä. GB-patenttijulkaisussa 20 1 197 826 kuvataan yksityiskohtaisesti in vitro-pötsi- menetelmää, jolla mikro-organismien aikaansaamat muutokset ravinnossa mitataan helpommin ja suurella tarkkuudella eläinten ravinnon arvoa arvioitaessa. Tässä menetelmässä käytetään laitetta, jossa eläinten ruuan-25 sulatusprosesseja simuloidaan ja niitä tutkitaan in vitro. Eläinten rehut, pötsin siirroste ja erilaiset kasvunedistäjät syötetään laboratorioyksikköön ja poistetaan siitä huolellisesti valvotuissa olosuhteissa, ja tapahtuvia muutoksia tutkitaan kriittisesti ja koko 30 ajan mikro-organismien kuluttaessa ravintoa. Propioni-happopitoisuuden kasvu pötsinesteessä osoittaa, että ravintokoostumuksessa ollut kasvutekijä on saanut aikaan halutun vasteen märehtijän kokonaishyötysuhtees-sa. Propionihappopitoisuuden muutos ilmoitetaan pro-35 sentteinä vertailupötsinesteen propionihappopitoisuu-desta. Pitkäaikaisia ruokintatutkimuksia in vivo käyte-

II

15 77263 tään osoittamaan luotettavaa korrelaatiota pötsinesteen propionihappopitoisuuden kasvun ja eläimen parantuneen hyötysuhteen välillä. Pötsinestettä kerätään lehmästä, jolle on tehty avanne, ja jota syötetään kaupallisella 5 lihotusrehulla ja heinällä. Pötsineste suodatetaan välittömästi juustokankaan läpi, ja sitä lisätään 10 ml 50 ml:n erlenmeyerpulloon, joka sisältää 400 mg standar-disubstraattia (68 % maissitärkkelystä + 17 % selluloosaa + 15 % uutettua soijapapujauhoa), 19 mg puskuriliuos-10 ta, pH 6,8, ja tutkittavat yhdisteet. Pulloihin syötetään hapetonta typpeä noin 20 min ja inkuboidaan ravistaen vesihauteessa 39°C:ssa noin 16 h. Kaikki kokeet tehdään kolmena kappaleena.

Inkuboinnin jälkeen sekoitetaan 5 ml näytettä 15 1 mlraan 25 % metafosforihappoa. 10 min:n kuluttua li sätään 0,25 ml muurahaishappoa, ja seosta sentrifugoidaan nopeudella 1500 rpm 10 min. Sitten näytteet analysoidaan kaasu-nestekromatografilia D.W. Kellogin menetelmällä /J. Dairy Science 52 (1969) 169Ö7. Etikka-, propioni-20 ja voihappopiikkien korkeudet määritetään näytteille, jotka ovat peräisin käsittelemättömistä ja käsitellyistä inkubointipulloista.

Jotta saataisiin parannetuksi märehtijöiden, kuten nautakarjan ja lampaiden, sekä yksimahaisten eläinten, 25 kuten sikojen ja kaniinien, ravinnon hyväksikäyttöä, voidaan 19-epidiaanimysiiniä sisällyttää ravintokoostumuk-siin vapaana happona, natriumsuolana, kaliumsuolana tai näiden seoksena. 19-epidiaanimysiinin epäpuhtaita muotoja tai antibioottia sisältävää kuivattua fermentointi-30 lientä voidaan luonnollisesti sisällyttää ravintokoos-tumuksiin sellaisina pitoisuuksina, että saavutetaan haluttu teho.

Seuraavat esimerkit valaisevat tätä keksintöä tarkemmin .

16 77263

Esimerkki 1

Valmistettiin ravistuspullot seuraavaa kasvatus-alustaa käyttäen: CL13M q/1 5 Glukoosia (Cerelose^ 20,0

Soijajauhoa 10,0

Liukoisia tislausjätteitä 5,0

Natriumsulfaattia 0,5

Kobolttikloridia 0,002 10 Kalsiumkarbonaattia 2 100 ml kasvatusalustaa laitettiin 300 ml:n ra-vistuspulloihin ja steriloitiin 120°C:ssa ja 1 atm:n paineella 30 min. Jäähdytyksen jälkeen alustaan siirros-tettiin Streptomyces hygroscopicus ATCC 39205:n, jota 15 oli viljelty ATCC 172-agaralustassa, vegetatiivisolu-suspensiota. Pulloja ravisteltiin 28°C:ssa pyöröravis-timella, jonka siirtymä oli 3,8-6,4 cm ja nopeus 150-200 kierrosta minuutissa (CPM), 3-4 vrk. Yhden pullon sisällöllä siirrostettiin 5 l:n fermentointiastia, jo-20 ka sisälsi 3 1 seuraavaa kasvatusalustaa: CL13M q/1

Glukoosia (Cerelose^ 20,0

Soijajauhoa 10,0

Liukoisia tislausjätteitä 5,0 25 Natriumsulfaattia 0,5

Kalsiumkarbonaattia 2,0

Kobolttikloridia 0,002 Täytetään vedellä 1 l:ksi pH 6,9-7,0 30 Lisättiin 1 ml L61-silikonia vaahtoamisen estäjäk si, ja astiat suljettiin ja steriloitiin 120°C:ssa 1 atm:n paineella 45 min. Astiat siirrostettiin yhdellä pullolla (noin 3 % siirrostetta), fermentointiin 96-168 h 30°C:ssa sekoittaen nopeudella 1700 rpm ja syöttäen ilmaa nopeu-35 della yksi tilavuusosa ilmaa yhtä tilavuusosaa kohti nestettä minuutissa.

Il it 77263

Kun fermentointi oli saatettu loppuun (B. subtilis ATCC 6633;n vastaisen antibioottipaperikiekkokokeen perusteella) , fermentorit pysäytettiin ja liemet suodatettiin niiden luonnollisessa pH:ssa piimään avulla. Suodatus-5 kakku lietettiin metanoliin, suodatettiin, liuotinta väkevöitiin alipaineessa, laimennettiin 2-3-kertaisella tilavuudella vettä ja uutettiin sitten kahdesti 1/3-1/2-kertaisella määrällä liuotinta, kuten metyyli-iso-butyyliketonia. Liuotinkerros erotettiin vesikerrokses-10 ta imemällä tai sentrifugoimalla, kuumennettiin kiehuvaksi ja väkevöitiin alipaineessa jäykkäliikkeiseksi öljyksi.

Antibiootti eristettiin vaihtoehtoisesti uuttamalla koko liemi sen luonnollisessa pH:ssa metyyli-iso-15 butyyliketonilla ja väkevöimällä liuotin jäykkäliikkeiseksi öljyksi, öljy suspendoitiin heptaaniin ja käsiteltiin panoksittain silikageeli 60:11a. Silikageeli-kakku eluoitiin kloroformilla, kloroformi/etyyliasetaa-tilla ja etyyliasetaatilla. Väkevöinnin jälkeen etyyli-20 asetaatista saatiin epäpuhdas tuote, josta 19-epidiaa-nimysiini kiteytyi natrium/kaliumsuolaseoksena.

Seuraavilla seoksilla, jotka kaikki erottavat diaanimysiinin ja 19-epidiaanimysiinin seoksen, eluoi-duilla ohutkerroskromatografialevyillä näkyi vain 19-25 epidiaanimysiini.

Rf Rf

Systeemi Diaanimysiini 19-epidiaanimysiini

Etyyliasetaatti 0,30 0,40

Kloroformi/asetöni 30 (1:1) 0,42 0,49

Etyyliasetaatti/ kloroformi(2:1) 0,15 0,22

Samanlaisia tuloksia saavutettiin, kun tämän esimerkin mukainen kasvatusalusta korvattiin jollakin 35 seuraavista: is 77263

Kasvatusalusta q/1

Glukoo siä (Cerelose^l 10,0

Maissitärkkelystä 10,0

Soijapapujauhoa 10,0 5 Maissin fermentoituvia kiintoaineita 5,0

Natriumkloridia 5,0

Kalsiumkarbonaattia 1,0 Täytetään vedellä 1 l:ksi 10 pH 6,9-7,0

Kasvatusalusta q/1

Glukoosia (Cerelose^l 10,0 Tärkkelystä 20,0

Hiivauutetta 5,0 15 Kobolttikloridia 0,002 "NZ Ainiini A" 5,0 Täytetään vedellä 1 l:ksi pH 6,0-7,0

Esimerkki 2 20 Esimerkin 1 mukainen menettely toistettiin suurem massa mittakaavassa valmistamalla ravistuspullot, jotka sisälsivät 0,7 1 CLl3M-alustaa. Ravistuspullosiir-rostetta fermentoitiin 3-5 vrk 28°C:ssa ja sitä käytettiin 6434,5 l:n fermentorin,siirrostukseen, joka sisälsi 25 4542 1 CL13M-kasvatusalustaa. Säiliöön käytettiin noin 1 1 (0,05 %) siirrostetta. 4 vrk:n fermentoinnin jälkeen fermentori tyhjennettiin (noin 4164 1). Koko liemi uutettiin 1/5-kertaisella tilavuudella metyyli-isobutyy-liketonia sen luonnollisessa pH:ssa, erotettiin Podbiel-30 niack-uuttolaitteella ja liuotin väkevöitiin alipaineessa öljyksi (30,1 1).

öljyä väkevöitiin edelleen syklonihaihduttimella siirapiksi. Väkevöinnin jälkeen öljy suspendoitiin hep-taaniin, sekoitettiin silikageeliin (Merck silica gel 35 60), suodatettiin silikageelikerroksen läpi ja pestiin

II

19 77263 useaan kertaan heptaanilla. Eluoinnin jälkeen suoritettiin ohutkerroskromatografinen ja fraktioiden biologinen tutkimus. Aktiiviset jakeet yhdistettiin, väkevöitiin ja puhdistettiin uudelleen kromatografisesti antibiootin eris-5 tämiseksi. Käsittelyn aikana ilmeni ongelmia silikageeli-panoskäsittelystä tulevien aktiivisten jakeiden suhteen. Aktiivisten jakeiden johtaminen rakeisen Darco-hiilen läpi poisti häiritsevät materiaalit ja paransi saantoa. Saatiin noin 40 g kiteistä 19-epidiaanimysiiniä.

10 Esimerkki 3

Valmistettiin noin 4200 l:n S. hygroscopicus ATCC 39205-fermentointipanos esimerkin 2 mukaisesti. Koko liemi uutettiin 1/5-kertaisella tilavuudella metyyli-isobu-tyyliketonia ja uute väkevöitiin alipaineessa ruskeaksi 15 öljyksi (noin 3,8 1). Tiiviste kaadettiin 11,4 Iraan hep-taania samalla sekoittaen ja saatu liete suodatettiin piimaakerroksen läpi.

Suodos käsiteltiin panoksittaan 3 kg:11a silikagee-liä (Merck "colum grade silica gel 60", 70-230 mesh n.

20 0,2-0,07 mm). Silikageeli pestiin 11,4 1:11a heptaania, kloroformia, asetonia ja metanolia kutakin. Nämä fraktiot tutkittiin ohutkerroskromatografisesti ja 19-epidi-aanimysiinin havaittiin olevan pääasiallisesti asetoni-ja kloroformifraktioissa.

25 Asetonifraktio (180 g) puhdistettiin kromatografi- sesti 8 x 100 cm:n kolonnissa, johon oli pakattu silika-geeliä (Merck "colum grade silica gel 60", 230-400 mesh n. 0,07-0,04 mm) etyyliasetaattiin sekoitettuna. Eluent-tina käytettiin etyyliasetaattia. Virtausnopeus oli 30 70 ml/min ja kerättiin noin 1 l:n fraktioita. Fraktiot tutkittiin ohutkerroskromatografisesti "Analtech GF" si-likageelilevyillä etyyliasetaatilla eluoiden. Täplät saatettiin näkyviin ruiskuttamalla vanilliinireagenssilla (3 g vanilliinia, 75 ml etanolia ja 25 ml 85 % fosfori-35 happoa) ja kuumentamalla 80°C:seen. 19-epidiaanimysiini näkyy näissä olosuhteissa purppuranpunaisena täplänä.

20 77263 19-epidiaanimysiiniä sisältävät fraktiot yhdistettiin ja haihdutettiin. Tiiviste liuotettiin 1 Iraan kloroformia, pestiin 1 1:11a hapanta vettä (pH 4), sitten 1 1:11a 5 % kaksiemäksistä natriumfosfaattia sisältäväl-5 lä puskurilla (pH 9), kuivattiin vedettömällä natrium-sulfaatilla, suodatettiin ja haihdutettiin. Tiiviste sekoitettiin asetoniin ja lisättiin pieni määrä vettä (noin 10 %), minkä jälkeen 19-epidiaanimysiini kiteytyi natriumsuolana. Kiteet kerättiin suodattamalla ja kuivat-10 tiin alipaineessa huoneenlämpötilassa. Saanto oli 23 g natriumsuolaa .

Silikageeli-panoskäsittelystä saatu kloroformifrak-tio (280 g) liuotettiin uudelleen 1 Iraan kloroformia ja johdettiin 7 x 120 cm:n kolonniin, johon oli pakattu 15 rakeista aktiivihiiltä kloroformissa. Kolonni eluoitiin kloroformilla nopeudella 20 ml/min ja kerättiin 300 ml:n fraktioita. Antibioottia sisältävät fraktiot yhdistettiin ja väkevöitiin. Tiiviste kiteytettiin natriumsuolana kuten edellä kuvattiin asetonifraktion yhteydessä.

20 Saanto oli 14 g. Lisäksi saatiin 10 g raakatuotetta toisena erotustuotteena.

19-epidiaanimysiinin natriumsuolan sulamispiste oli 193-205°C. Muut ominaisuudet ovat: 25 UVA = 232 nm, E** = 157,oi = +11'° (c=1' ^etanolissa)

max lcm C

Alkuaineanalyysi: Laskettu C^H^O^Na: lie C H O+Na (vähentämällä) 3Q 63,49 8,73 27,78

Saatu: 63,30 8,86 28,04

Yhdisteen IR-absorptiospektrissä, joka määritettiin KBr-brikettimenetelmällä, havaittiin seuraavat 47 35 huippua: 3770, 3690, 3659, 3529, 3487, 3446, 3351, 3186, 2967, 2931, 2874, 2787, 2731, 2701, 2651, 2515, 1716, 1667,

II

21 77263 1566, 1462, 1406, 1373, 1333, 1320, 1293, 1271, 1237, 1191, 1164, 1117, 1098, 1065, 1003, 984, 946, 912, 897, 868, 843, 786, 775, 732, 664, 590, 496, 232, 214 cm"1.

Vapaa happo muodostettiin pesemällä natriumsuolan 5 kloroformiliuos happamalla vedellä (pH 4) ja haihduttamalla sitten kloroformi. Yhdistettä ei saatu kiteytymään, vaan se saatiin lasimaisena tuotteena.

υνλ = 232 nm, E?-* = 163, CLn = +15,6° (c=l, metanolissa) max icm c 10

Alkuaineanalyysi: Laskettu :lie C H O(vähentämällä) 65,10 9,06 25,84 15 Saatu: 64,45 8,94 26,61

Claims (3)

22 7 7 2 6 3

1. Menetelmä 19-epidiaanimysiinin valmistamiseksi, jolla on kaava: 5 7' 3' OMe OH O^O^V' 36 m _ o Me 10 -e JL f 32Me iU v γ/ΐ]\ΐ4 ^lysJ f 33 Λ 27 “e 3 I 7 i A J/X\_17C Km4\/_ZT\ 31 o'12>°°-2>°^/\0L/ Me C02H Tr. T 3’ 35 OH αί“θΗ 15 40 38 2 tunnettu siitä, että viljellään kantaa Streptomyces hygroscopicus ATCC 39205 vesipitoisessa ravinneliuokses-20 sa, joka sisältää assimiloituvia hiilen ja typen lähteitä ja epäorgaanisia suoloja, aerobisissa olosuhteissa, kunnes on muodostunut oleellinen määrä 19-epidiaanimy-siiniä, ja 19-epidiaanimysiini otetaan talteen.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että hiililähde on glukoosi.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 19-epidiaanimysiini otetaan talteen uuttamalla fermentointiliemi metyyli-iso-butyyliketonilla. Il