AT388564B - Biologisch reine kultur von actinomadura yumaense sp. nov. nrrl 12515 sowie verfahren zur herstellung der neuen antibiotika ll-c23024alpha, beta und jota, zur bekaempfung von nematoden und zur bekaempfung von coccidiosis-infektionen - Google Patents

Biologisch reine kultur von actinomadura yumaense sp. nov. nrrl 12515 sowie verfahren zur herstellung der neuen antibiotika ll-c23024alpha, beta und jota, zur bekaempfung von nematoden und zur bekaempfung von coccidiosis-infektionen

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AT388564B
AT388564B AT0386982A AT386982A AT388564B AT 388564 B AT388564 B AT 388564B AT 0386982 A AT0386982 A AT 0386982A AT 386982 A AT386982 A AT 386982A AT 388564 B AT388564 B AT 388564B
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Joseph Jacob Goodman
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John Henry Edward James Martin
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Robert L Jr Dr Kennett
Irwin B Wood
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American Cyanamid Co
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/03—Actinomadura

Description


   <Desc/Clms Page number 1> 
 
 EMI1.1 
 Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganischen Salzen, die Antibiotika LL-C23024 alpha. beta und jota in isolierbaren Mengen zu bilden. 



   Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung der neuen Antibiotika LL-C23024 
 EMI1.2 
 von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze, aerob fermentiert, bis die   Fermentationsbrühe   eine wesentliche antibiotische Aktivität aufweist, und anschliessend das Antibiotikum von derselben isoliert. 



   Ausserdem hat die Erfindung ein Verfahren zur Bekämpfung von Nematoden bei   warmblütigen   Tieren und im Erdboden, enthaltend die Nematoden, zum Gegenstand, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine 
 EMI1.3 
 Antibioticum erhalten wird, den Tieren oral verabreicht oder auf den mit Nematoden verseuchten Erdboden aufbringt. 



   Schliesslich betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Bekämpfung von Coccidiosis-Infektionen bei 
 EMI1.4 
 Das Antibiotikum LL-C23024 alpha hat folgende Struktur 
 EMI1.5 
 das gemäss der vorliegenden Erfindung erhältliche Antibiotikum LL-C23024 beta unterscheidet sich von bekannten Verbindungen aufgrund seiner physikalischen und chemischen Eigenschaften,   u. a.   durch seine Mikroanalyse, seine optische Rotation, seines IR-Spektrums, sein   13C-NMR-Spektrum   und sein 1H-NMR. 



  Spektrum. 



   Das   Antibiotikum   LL-C23024 beta hat die folgende postulierte Struktur 
 EMI1.6 
   wobei R I   und R2 verschieden sind und jeweils ausgewählt sind unter H und CH3. 



   Die obige, postulierte Struktur beruht auf der Elementaranalyse, der optischen Drehung, dem mittels Felddesorptionsmassenspektroskopie ermittelten Moloekulargewicht, dem Schmelzpunkt, dem Infrarot (IR)- 
 EMI1.7 
 

 <Desc/Clms Page number 2> 

   ! rum Tabelle 1    
 EMI2.1 
 
<tb> 
<tb> 13C-NMR-Spektrum <SEP> von <SEP> LL-C23024ss <SEP> MM <SEP> relativ <SEP> zu <SEP> TMS)
<tb> Chemische <SEP> Verschiebung <SEP> Anzahl <SEP> der <SEP> Kohlenstoffatome
<tb> 10. <SEP> 5 <SEP> 1
<tb> 11. <SEP> 0 <SEP> 1
<tb> 12. <SEP> 2 <SEP> 1
<tb> 17. <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 17. <SEP> 7 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 17. <SEP> 9 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 22. <SEP> 3 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 26. <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 26. <SEP> 8 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 27. <SEP> 6 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 30. <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 32. <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 33. <SEP> 3 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 33.

   <SEP> 7 <SEP> 2
<tb> 33. <SEP> 8 <SEP> 2
<tb> 36. <SEP> 5 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 36. <SEP> 8 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 39. <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 39. <SEP> 9 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 45. <SEP> 5 <SEP> 2
<tb> 57. <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 59. <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 60. <SEP> 7 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 66. <SEP> 9 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 67. <SEP> 6 <SEP> - <SEP> 1
<tb> 70. <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 71. <SEP> 3 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 72. <SEP> 9 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 74. <SEP> 9 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 75. <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 79. <SEP> 9 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 80. <SEP> 8 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 82. <SEP> 1 <SEP> 2
<tb> 84. <SEP> 5 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 84. <SEP> 7 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 85. <SEP> 6 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 86. <SEP> 9 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 95. <SEP> 8 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 96. <SEP> 9 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 97. <SEP> 7 <SEP> 1
<tb> 107.

   <SEP> 5 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 179.2 <SEP> Gesamtzahl <SEP> der <SEP> 1
<tb> Kohlenstoffatome <SEP> 46
<tb> 
 
 EMI2.2 
 C23024 jota scheint vier Methoxygruppen aufzuweisen sowie den gleichen Zucker, der im Polyäther-   Antibiotikum X-14368A   (US-PS 4 278 663) beobachtet wurde, sowie eine Carboxylgruppe. Bei dem einzigen anderen Polyäther-Antibiotikum mit einem Molekulargewicht von 930, das bisher beschrieben wurde, handelt es   sich um das Antibiotikum A28695B (Hedroxyseptamycin) [J. Anúbioûcs 33 (2), 252 (1980)), welches sich hinsichtlich seiner strukturellen und biologischen Eigenschaften signifikant von dem erfindungsgemäss   

 <Desc/Clms Page number 3> 

 erhältlichen Antibiotikum unterscheidet.

   Die obigen Beobachtungen beruhen auf der Elementaranalyse, der optischen Drehung, dem berechneten Molekulargewicht mittels Felddesorptionsmassenspektroskopie, dem IRSpektrum, dem 13C-NMR-Spektrum und dem   1 H-NMR-SpekU1Jm.   Die Ergebnisse dieser Messungen sind in den Beispielen im Detail erläutert und in den Zeichnungen dargestellt ; es zeigen :
Fig. IV das   IR-Spektrum   von LL-C23024 jota in   KBr ;  
Fig. V das 1H-NMR-Spektrum von LL-C23024 jota; 80 MHz in CDC13, TMS als interner Standard ;
Fig. VI das 13C-NMR-Spektrum von LL-C23024 jota ; 20 MHz in CDC13. TMS als interner Standard ;
Fig. VII das 13C-NMR-Spektrum von   LL-C23024 jota ;   (expandierte Skala : 0-50 TpM), 20 MHz in CDC13, TMS als interner   Standerd ;  
Fig.

   VIII das 13C-NMR-Spektrum von LL-C23024 jota; (expandierte Skala: 50-110 TpM). 20 MHz in CDC13, TMS als interner Standard. 
 EMI3.1 
   Chloroform (CDC13)Tabdien.    
 EMI3.2 
 
<tb> 
<tb> Chem. <SEP> Verschieb. <SEP> Zahl <SEP> d. <SEP> C-Atome <SEP> Chem. <SEP> Verschieb. <SEP> Zahl <SEP> d. <SEP> C-Atome
<tb> 10.6 <SEP> 1 <SEP> 59.9 <SEP> 1
<tb> 10. <SEP> 9 <SEP> 1 <SEP> 60. <SEP> 8 <SEP> 2
<tb> 11. <SEP> 7 <SEP> i <SEP> 68. <SEP> 5 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 16. <SEP> 4 <SEP> 1 <SEP> 68. <SEP> 8 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 17. <SEP> 6 <SEP> 1 <SEP> 71. <SEP> 3 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 18. <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 72. <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 21. <SEP> 7 <SEP> 1 <SEP> 76. <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 22. <SEP> 9 <SEP> 1 <SEP> 76. <SEP> 9 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 24. <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 78. <SEP> 5 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 28. <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 81. <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 31.

   <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> 81. <SEP> 3 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 32. <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 81. <SEP> 8 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 33. <SEP> 4 <SEP> 1 <SEP> 84. <SEP> 8 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 33. <SEP> 8 <SEP> 2 <SEP> 85. <SEP> 3 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 34. <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 85. <SEP> 6 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 36. <SEP> 7 <SEP> 1 <SEP> 86. <SEP> 8 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 37. <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 88. <SEP> 5 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 39. <SEP> 4 <SEP> 1 <SEP> 95. <SEP> 9 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 40. <SEP> 3 <SEP> 1 <SEP> 97. <SEP> 9 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 44. <SEP> 5 <SEP> 1 <SEP> 99. <SEP> 6 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 45. <SEP> 5 <SEP> 1 <SEP> 107. <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 47. <SEP> 6 <SEP> 1 <SEP> 173. <SEP> 0 <SEP> 1
<tb> 56.8 <SEP> 1 <SEP> Total <SEP> 48
<tb> 
 
 EMI3.3 
 beispielsweise Natrium, Kalium, Calcium, Magnesium und Ammonium in Frage sowie organische Aminkationen, wie   Tri- (niederalkyl)-amin (z.

   B.   Triäthylamin, Triäthanolamin), Procain und dgl. Die kationischen Salze des Antibiotikums LL-C23024 B sind im allgemeinen kristalline Feststoffe, relativ unlöslich in Wasser und löslich in den meisten herkömmlichen, organischen Lösungsmitteln, wie Methanol, Ätylacetat, Aceton, Chloroform, Heptan, Äther und Benzol. Für die Zwecke dieser Erfindung ist das Antibiotikum in Form der freien Säure ihren pharmazeutisch annehmbaren, nichttoxischen Salzen   äquivalent.   



   Die Antibiotika LL-C23024 ss und jota sind in vitro gegen grampositive Bakterien aktiv, wenn sie mittels des   Standard-Agarverdunnungsverfahrens   untersucht werden. Die als minimale Hemmkonzentration (MIC) in   g) ml ausgedrückten   Ergebnisse sind in den Tabellen III und IV zusammengestellt. Die Antibiotika LLC23024 ss und jota sind bei Konzentrationen von 256   gg/mi   oder weniger nicht wirksam gegenüber gramnegativen Organismen. 

 <Desc/Clms Page number 4> 

 



   Tabelle m in vitro antibakterielle Akdvität von LL-C23024 ss 
 EMI4.1 
 
<tb> 
<tb> Organismus <SEP> MIC <SEP> ( g/ml)
<tb> Straphylococcus <SEP> aurus <SEP> Smith <SEP> 64
<tb> sec <SEP> 80-11 <SEP> 64 <SEP> 
<tb> SSC80-32 <SEP> 64
<tb> SSC <SEP> 80-38 <SEP> 64
<tb> LL-14 <SEP> 64 <SEP> 
<tb> LL-45 <SEP> 64 <SEP> 
<tb> LL-27 <SEP> 128
<tb> ATCC <SEP> 25923 <SEP> 64
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> C <SEP> 203 <SEP> 1
<tb> ss-hemo <SEP> ! <SEP> yüe <SEP> Keller <SEP> T623 <SEP> 8
<tb> " <SEP> pneumoniae <SEP> 78.1 <SEP> 8
<tb> Enterococcus <SEP> SSC-80-62 <SEP> 64
<tb> SSC-80-63 <SEP> 128
<tb> 
   Tabelle IV    
 EMI4.2 
 
<tb> 
<tb> in <SEP> vitro <SEP> antibakterielle <SEP> Aktovität <SEP> von <SEP> LL-C23024 <SEP> jota
<tb> Organismus <SEP> MIC <SEP> (mg/ml)

  
<tb> Enterococcus <SEP> OSU <SEP> 75-1 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> Fnterococcus <SEP> SM <SEP> 77-15 <SEP> 1
<tb> Staphylococcus <SEP> aurcus <SEP> SSC <SEP> 79-18 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> PU <SEP> 79-19-2 <SEP> 2
<tb> Micrococcuslutea <SEP> PC <SEP> ! <SEP> 1001 <SEP> l <SEP> 
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> Smith <SEP> 0. <SEP> 5 <SEP> 
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> ATCC <SEP> 25923 <SEP> 0. <SEP> 5 <SEP> 
<tb> 
 
Wie aus den obigen Daten hervorgeht, inhibieren die Antibiotika LL-C23024 alpha, beta und jota das Wachstum bestimmter grampositive Bakterien und sind somit als topische oder Oberflächen-Antiseptika in Waschlösungen für die Haut, für Ausrüstungsgegenstände, für Wände, Fussböden und dgl. brauchbar. 



   Es wurde darüber hinaus festgestellt, dass die antibakteriellen Mittel   LL-C23024   alpha, beta und jota in vivo wirksam sind, und zwar als Anticoccidia-Mittel bei Geflügel. Das wird durch die nachfolgenden Tests   erläutert.   



   2 Tage vor der Inokulation wird mit Medikamenten behandeltes Futter, welches die Wirkstoffe mit 
 EMI4.3 
 
 EMI4.4 
 
<tb> 
<tb> worden <SEP> :yg
<tb> Vitamin-Aminosäure-Prämix <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 
<tb> Spurenmineralien <SEP> 0,1
<tb> Natriumchlorid <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> 
<tb> Dicalciumphosphat <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP> 
<tb> gemahlener <SEP> Kalkstein <SEP> 0,5
<tb> stabilisiertes <SEP> Fett <SEP> 4, <SEP> 0 <SEP> 
<tb> getrocknetes <SEP> Alfalfa, <SEP> 17% <SEP> Protein <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP> 
<tb> Maisklebermehl, <SEP> 41 <SEP> % <SEP> Protein <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> 
<tb> Menhadenfischmehl, <SEP> 60% <SEP> Protein <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> 
<tb> Sojabohnenölmehl, <SEP> 44% <SEP> Protein <SEP> 30, <SEP> 0 <SEP> 
<tb> gemahlener, <SEP> gelber <SEP> Mais, <SEP> fein,

   <SEP> zum <SEP> Auffüllen <SEP> auf <SEP> 100
<tb> Das <SEP> in <SEP> der <SEP> obigen <SEP> Futterzusammenstzung <SEP> verwendete <SEP> Vitamin-Aminosäure-Prämix <SEP> ist <SEP> aus <SEP> der <SEP> folgenden
<tb> Formulierung <SEP> hergestellt. <SEP> Die <SEP> Quantitätsangaben <SEP> beziehen <SEP> sich <SEP> dabei <SEP> auf <SEP> Einheiten/kg <SEP> der <SEP> fertigen
<tb> Futterzusammensetzung.
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 5> 

 
 EMI5.1 
 
<tb> 
<tb> 



  Butyhcrtes <SEP> Hydroxytoluol <SEP> 125,0 <SEP> mg
<tb> dl-Methionin <SEP> 500,0 <SEP> mg
<tb> Vitamin <SEP> A <SEP> 3300, <SEP> 0 <SEP> IE
<tb> Vitamin <SEP> D3 <SEP> 1100, <SEP> 0 <SEP> ICE <SEP> 
<tb> Riboflavin <SEP> 4, <SEP> 4 <SEP> mg <SEP> 
<tb> Vitamin <SEP> E <SEP> 2, <SEP> 2 <SEP> IE <SEP> 
<tb> Niacin <SEP> 27, <SEP> 5 <SEP> mg <SEP> 
<tb> Panthothensäure <SEP> 8, <SEP> 8 <SEP> mg <SEP> 
<tb> Cholinchlorid <SEP> 500, <SEP> 0 <SEP> mg
<tb> Folsäure <SEP> 1, <SEP> 43 <SEP> mg <SEP> 
<tb> Menadion-natriumbisulfat <SEP> 1, <SEP> 1 <SEP> mg <SEP> 
<tb> Vitamin <SEP> B12 <SEP> 11,0 <SEP>  m
<tb> gemahlener, <SEP> gelber <SEP> Mais, <SEP> fein, <SEP> zum <SEP> Auffüllen <SEP> auf <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> g <SEP> 
<tb> 
 Die   Testkücken   werden dann inokuliert,

   und zwar durch direkte Inokulation in den Kropf jedes Kükens unter Verwendung eines gemischten Inokulums von 5000 sporenbildenden Oocyten von Eimeria acervulina und einer ausreichenden Anzahl Oocyten von Eimeria tenella zur Erzeugung einer 85 bis 100% Mortalität bei   nichtbehandelten Kontrolltieren.   Die Küken haben während der gesamten Tesidauer freien Zugang zu Futter und Wasser. 7 Tage nach der Inokulation werden die Tests abgebrochen.

   Die   Vögel   werden gewogen, getötet und ihr 
 EMI5.2 
 
 EMI5.3 
 
<tb> 
<tb> Verbindung <SEP> Konz. <SEP> im <SEP> Futter <SEP> Anz. <SEP> d. <SEP> Vögel <SEP> % <SEP> Überle-% <SEP> Vögel <SEP> mit <SEP> verringerten
<tb> TpM <SEP> bei <SEP> Beginn <SEP> bcnde <SEP> Läsionen <SEP> 
<tb> E.

   <SEP> tenella <SEP> E.acervulina
<tb> LL-C23024 <SEP> ss <SEP> 15 <SEP> 3 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 
<tb> LL-C23024 <SEP> ss <SEP> 10 <SEP> 5 <SEP> 100 <SEP> 60 <SEP> 100
<tb> LL-C23024 <SEP> ss <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 80 <SEP> 0 <SEP> 100
<tb> NNC' <SEP> 15 <SEP> 4 <SEP> 0Q
<tb> LL-C23024 <SEP> ss <SEP> 120 <SEP> 15 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> 60 <SEP> 15 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> 30 <SEP> 15 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> 0 <SEP> 15 <SEP> 20 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> NNC <SEP> 15 <SEP> 100 <SEP> ---- <SEP> -----LL-C23024 <SEP> ss <SEP> 20 <SEP> 15 <SEP> 100 <SEP> 87 <SEP> 100
<tb> 15 <SEP> 15 <SEP> ! <SEP> ? <SEP> M <SEP> IM <SEP> 
<tb> 10 <SEP> 15 <SEP> 60 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 5 <SEP> 15 <SEP> 47 <SEP> 7 <SEP> 0
<tb> 0 <SEP> 15 <SEP> 27 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> NNC <SEP> 15 <SEP> IM-NNC <SEP> = <SEP> nicht <SEP> behandelte,

   <SEP> nichtinfizierte <SEP> Kontrolltiere
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 6> 

 
 EMI6.1 
 
 EMI6.2 
 
<tb> 
<tb> VIKonzentration <SEP> im <SEP> Futter <SEP> Anz. <SEP> d. <SEP> Vögel <SEP> % <SEP> Überlebende <SEP> % <SEP> Vögel <SEP> mit <SEP> verringerten <SEP> Läsionen
<tb> (TpM) <SEP> zu <SEP> Beginn <SEP> E. <SEP> tenella <SEP> e. <SEP> acervulina
<tb> 15 <SEP> 5 <SEP> 100 <SEP> IM <SEP> 100
<tb> 10 <SEP> 5 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> 5 <SEP> 5 <SEP> 60 <SEP> 20 <SEP> 60
<tb> 0 <SEP> 15 <SEP> 20 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 15 <SEP> 10 <SEP> IM <SEP> IM <SEP> IM
<tb> 7, <SEP> 10 <SEP> IM <SEP> 70 <SEP> IM
<tb> 
 
 EMI6.3 
 



  Beispiel A
Bewertung von Testzusammensetzungen hinsichtlich der nematociden Aktivität unter Verwendung der freilebenden, hermaphroditischen, mikrobivorösen Nematode Caenorhabditis elegans   II   Bei den folgenden Tests werden C. elegans zur Bestimmung der nematociden Aktivität der   Fermentationsbrühe   und   der gemetsten   Maische, die nach dem Verfahren gemäss der Erfindung hergestellt wurden,   verwendet.   Dieser Organismus wird ebenfalls zur Bewertung von LL-C23024 alpha und LL-C23024 B verwendet, um deren nematocide Aktivität zu bestimmen. 



   Bei diesen Tests handelt es sich bei der Fermentationsbrühe um die bei der Fermentation erhaltene Mischung von Flüssigkeit und Feststoffen, die entnommen wird, bevor die Feststoffe,   d. h.   die geerntet Maische, von der Flüssigkeit abgetrennt wird. Bei der geamteten Maische handelt es sich um die Feststoffe, die nach der Abtrennung zurückbleiben. 



   Zur Bewertung der geernteten Maische werden die Feststoffe der geernteten Maische in destilliertem Wasser im Verhältnis 1 : 1 dispergiert Die Fermentationsbrühe wird so, wie sie ist, verwendet und enthält sowohl Flüssigkeit als auch Feststoffe. 



   Bei den vorliegenden Bewertungen wird C. elegans in einem C. briggsae Maintenance Medium aufbewahrt. Das Maintenance-Medium ist im Handel erhältlich von Grant Island Biological Company, Grant Island, New York, und weist die folgende Zusammensetzung auf. 



   C. briggsae Maintenance Medium 
 EMI6.4 
 
<tb> 
<tb> Komponente <SEP> mg/l
<tb> Anorganische <SEP> Sake <SEP> 
<tb> CaC12. <SEP> 2H20 <SEP> 220, <SEP> 50 <SEP> 
<tb> CuC12. <SEP> 2H20 <SEP> 6, <SEP> 50 <SEP> 
<tb> Fe <SEP> (NH4) <SEP> 2 <SEP> (S04) <SEP> 2. <SEP> 6H20 <SEP> 58. <SEP> 80 <SEP> 
<tb> KH2P04 <SEP> 1225, <SEP> 50 <SEP> 
<tb> KOH <SEP> (a)
<tb> MnCl2. <SEP> 4H2O <SEP> 22,20
<tb> ZnC12 <SEP> 10, <SEP> 20 <SEP> 
<tb> Andere <SEP> Komponenten <SEP> 
<tb> N-Acetylenglucosamin <SEP> 15, <SEP> 00 <SEP> 
<tb> Adenosin-3'- <SEP> (2*}-phosphorsaure. <SEP> H20 <SEP> 365. <SEP> 00 <SEP> 
<tb> Cytidin-3'- <SEP> (2')-phosphorsäure <SEP> 323,00
<tb> D-Glucose <SEP> 1315, <SEP> 00 <SEP> 
<tb> Glutalhion, <SEP> reduziert <SEP> 204, <SEP> 00 <SEP> 
<tb> Guanosin-3'- <SEP> (2')-PO4Na2.H2O <SEP> 363,00
<tb> Magnesiumcitral.5H2O <SEP> (dibasisch) <SEP> 915,00
<tb> Kaliumcitrat.

   <SEP> H20 <SEP> 486, <SEP> 00 <SEP> 
<tb> DL-Thioktsäure <SEP> 3, <SEP> 75
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 7> 

 
 EMI7.1 
 
<tb> 
<tb> Thymin <SEP> 126, <SEP> 00 <SEP> 
<tb> Uridin-3'- <SEP> (2')-phosphorsäure <SEP> 324,00
<tb> Aminosäuren
<tb> L-Alanin <SEP> 1395, <SEP> 00 <SEP> 
<tb> L-Arginin <SEP> 975, <SEP> 00 <SEP> 
<tb> L-Asparaginsäure <SEP> 1620,00
<tb> LCystcin-HCl. <SEP> H20 <SEP> 28, <SEP> 00 <SEP> 
<tb> Gl-Glutamat <SEP> (Na).

   <SEP> H20 <SEP> 550, <SEP> 00 <SEP> 
<tb> L-Glutamin <SEP> 1463, <SEP> 00 <SEP> 
<tb> Glycin <SEP> 722, <SEP> 00 <SEP> 
<tb> L-Histidin <SEP> 283, <SEP> 00 <SEP> 
<tb> L-Isoleucin <SEP> 861,00 <SEP> 
<tb> L-Leucin <SEP> 1439,00
<tb> L-Lysin-HCl <SEP> 1283, <SEP> 00 <SEP> 
<tb> L-Methionin <SEP> 389, <SEP> 00 <SEP> 
<tb> L-Phenylalanin <SEP> 803, <SEP> 00 <SEP> 
<tb> L-Prolin <SEP> 653, <SEP> 00 <SEP> 
<tb> L-Serin <SEP> 788, <SEP> 00 <SEP> 
<tb> L- <SEP> Threonin <SEP> 717, <SEP> 00 <SEP> 
<tb> L-Tryptophan <SEP> 184, <SEP> 00 <SEP> 
<tb> L- <SEP> Tyrosin <SEP> 272, <SEP> 00 <SEP> 
<tb> L- <SEP> Valin <SEP> 1020, <SEP> 00 <SEP> 
<tb> Vitamine
<tb> p-Aminobenzoesäure <SEP> 7, <SEP> 50 <SEP> 
<tb> Biotin <SEP> 3, <SEP> 75
<tb> Cholindihydrogenocitrat <SEP> 88, <SEP> 50 <SEP> 
<tb> Cyanocobalamin <SEP> (B) <SEP> --3, <SEP> 75 <SEP> 
<tb> Folinat <SEP> (Ca) <SEP> 3,

   <SEP> 75 <SEP> 
<tb> Myo-inosit <SEP> 64, <SEP> 50 <SEP> 
<tb> Niacin <SEP> 7, <SEP> 50 <SEP> 
<tb> Pantethein <SEP> (Pantethine) <SEP> 3, <SEP> 75 <SEP> 
<tb> Pantothenat <SEP> (Ca) <SEP> 7, <SEP> 50 <SEP> 
<tb> Pterolyglutaminsäure <SEP> 7, <SEP> 50 <SEP> 
<tb> Pyridoxalphosphat <SEP> 3, <SEP> 75 <SEP> 
<tb> Pyridoxamin <SEP> 2HCI <SEP> 3, <SEP> 75 <SEP> 
<tb> Pyridoxin <SEP> HCl <SEP> 7,50
<tb> Riboflavin-5'-PO4 <SEP> (Na)2H2O <SEP> 7,50
<tb> Thiamin <SEP> HCI <SEP> 7, <SEP> 50 <SEP> 
<tb> 
 
 EMI7.2 
 :. (i) EJLHansen,Bemerkungen : (a) So viel, wie nötig, um den pH auf 5, 9 0, 1 einzustellen. 



   Für die Bewegungen wird eine Lochplatte mit einer Reihe von kleinen Löchern verwendet. 25 ml der Fermentationsbrühe, der 1:1 Wasser/geerntete Maische-Suspension oder einer wässrigen Acetonlösung von LLC23024 alpha oder LL-C23024   ss,   enthaltend   3 I, 25   bis 500 TpM der Testverbindung, werden unter aseptischen Bedingungen in gesonderten Schächten deponiert. Jedem Schacht werden dann 25 ml des C. elegans Maintenance 
 EMI7.3 
 werden anschliessend in einen Abzug placiert und 48 h nach der Inokulation untersucht, um die Geschwindigkeit und den Grad der nematociden Aktivität der Testzusammensctzungen zu beurteilen. Die erhaltenen Daten sind im folgenden aufgeführt.

   In den Fällen. in denen bei der Fermentationsbrühe eine Aktivität beobachtet wird, wird die Brühe weiter verdünnt, um ein 1:4 Brühe/C.elegans-Verhältnis zu schaffen. 

 <Desc/Clms Page number 8> 

 
 EMI8.1 
 
 EMI8.2 
 
<tb> 
<tb> 



  Zusammensetzung <SEP> Konzentration <SEP> (TpM) <SEP> Nematocide <SEP> Aktivität <SEP> 
<tb> oder <SEP> Verdunnung <SEP> während48h <SEP> 
<tb> Fermentationsbrühe <SEP> D= <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> 8 <SEP> (keine <SEP> Bewe- <SEP> 
<tb> D=1 <SEP> :4 <SEP> gungsfähigkeit)
<tb> geerntete <SEP> Maische
<tb> LL-23024 <SEP> alpha <SEP> 500 <SEP> TpM <SEP> 7
<tb> 250 <SEP> " <SEP> 7 <SEP> 
<tb> 125 <SEP> " <SEP> 7 <SEP> 
<tb> 62, <SEP> 5" <SEP> 6 <SEP> 
<tb> 31, <SEP> 25" <SEP> 0
<tb> LL-23024 <SEP> beta <SEP> 500 <SEP> " <SEP> 7
<tb> 250 <SEP> " <SEP> 0
<tb> 
 
Die bei diesen Bewertungen verwendete   Aktivitatseinteilung   ist wie folgt:

   Aktivitätslegende 8 = keine Bewegungsfähigkeit (scheinbar tot) 
 EMI8.3 
 reduzierte Bewegungsfähigkeit0 = normale Bewegungsfähigkeit der Spezies Beispiel B
Bewertung von LL-C23024 alpha als nematocides Mittel gegen infektiöse Larfen++ von Wiederkäuernematoden. 



  Nach dem oben beschriebenen Verfahren wird die Bewertung von LL-C23024 alpha als nematocides Mittel gegen infektiöse Larven von   Wiederkäuernematoden   durchgeführt, wobei folgende Nematodenspecies anstelle von C. 
 EMI8.4 
 verwendet wurden :zusammengestellt ++ Larven im dritten Häutungsstadium. 



  In den folgenden Tabellen bezieht sich die Aktivitätseinteilung auf die zuvor aufgeführte   #ktivitätslegende.   



    Tabelle vrn    
 EMI8.5 
 
<tb> 
<tb> in <SEP> vitro <SEP> (a) <SEP> -Konzentr. <SEP> Aktivität <SEP> gegen <SEP> (bei <SEP> 48 <SEP> Stunden)
<tb> von <SEP> LL-C23024 <SEP> alpha
<tb> TpM <SEP> H. <SEP> controt. <SEP> o. <SEP> circum. <SEP> T. <SEP> axei <SEP> T. <SEP> colub. <SEP> T.

   <SEP> aceti
<tb> 500 <SEP> 8 <SEP> 8b <SEP> 8b <SEP> 8 <SEP> 6
<tb> 250 <SEP> 7 <SEP> 8b <SEP> 8b <SEP> 7 <SEP> 6
<tb> 125 <SEP> 7 <SEP> 7 <SEP> 7 <SEP> 6 <SEP> 6
<tb> 62, <SEP> 5 <SEP> 7 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 6 <SEP> 6
<tb> 31, <SEP> 25 <SEP> 6 <SEP> 6 <SEP> 0 <SEP> 6 <SEP> 6
<tb> 0 <SEP> (Vergl.) <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 
 (a) durchgeführt in Gewebekulturplatten mit 96 Schächten, X 14868A, hergestellt in   doppeldesûlliertem   Wasser 25   il   LL-C23024 alpha-Lösung und   25 gl der Nematodenkultur   werden pro Schacht zugesetzt (b) innerhalb von 24 h 

 <Desc/Clms Page number 9> 

   ssejspie) C   
Bewertung der nematociden Aktivität des Antibiotikums LL-C23024 alpha gegen Nematospiroides dubius und Aspicularis tetraptera bei Mäusen 
Bei den folgenden Tests werden weibliche,

   weisse   Swiss-Webstennäuse   mit Nematospiroides dubius und Aspicularis tetraptera infiziert und 3 Wochen gehalten, um die Infektionen sich entwickeln zu lassen. 



   Nach diesem Zeitraum des Haltens werden die Mäuse nach dem Zufallsprinzip in Gruppen von vier aufgeteilt. Die Gruppen werden in getrennte Käfige placiert. Anschliessend wird ein mit Medikamenten behandeltes Futter angeboten, welches von etwa 31, 25 TpM bis 4000 TpM der Testverbindung enthält. Das Futter wird den Mäusen eine Woche lang ad libitum angeboten. Wasser wird ebenfalls ad libitum während der Testperiode zur Verfügung gestellt Während der Behandlungsperiode werden die Ausscheidungen der Mäuse 
 EMI9.1 
 mit infizierten,   nicht-medikamentierten     Kontrolltieren,     ausgedrückt  
Bei diesen Tests wurden rohe Fermentationsbrühen bewertet, welche vor der Ernte der Maische erhalten wurden und welche 1000 bis 4000 TpM des nematociden Antibiotikums enthielten.

   Das Mäusefutter, welches mit 31, 25 bis 500 TpM LL-C23024 alpha, gelöst in einem   Aceton/Wasser-Gemisch   (1 : 1), behandelt war, wurde ebenfalls bewertet 
 EMI9.2 
 
<tb> 
<tb> Testzusammen- <SEP> Nahrung <SEP> Aktivität <SEP> (% <SEP> Reduktion) <SEP> +++ <SEP> gegen
<tb> setzung <SEP> Konz. <SEP> TpM <SEP> N. <SEP> Dubius <SEP> A. <SEP> Tetraptera
<tb> + <SEP> Fermentationsbrühe <SEP> 4000 <SEP> 73mit <SEP> LL-C23024 <SEP> alpha <SEP> 2000 <SEP> 44 <SEP> 53
<tb> LL-C23024 <SEP> alpha <SEP> 1000 <SEP> 65 <SEP> 33
<tb> 500 <SEP> 70 <SEP> SA++
<tb> 250 <SEP> 63 <SEP> SA
<tb> 125 <SEP> 61 <SEP> SA
<tb> 62, <SEP> 5 <SEP> 29 <SEP> SA
<tb> 31, <SEP> 25 <SEP> 32 <SEP> SA
<tb> 
 + Menge an LL-C23024 alpha nicht bestimmt ++ geringfügige   Aktivität :

   gesteigerte Zäh !   von   Pinwürmem   bei der fäkalen Untersuchung entdeckt +++ verglichen mit infizierten, nichtmcdikamenticrten   Kontrollieren.   



   Die neuen antibakteriellen und gegen Coccidia wirkenden Mittel werden bei der Kultivierung von Actinomadura yumaense sp. nov. unter kontrollierten Bedingungen gebildet. 



   Ein repräsentativer Stamm dieses Mikroorganismus wurde von einer Bodenprobe isoliert, die in Yuma County, Arizona, gesammelt wurde. Der Stamm wird in der Culture Collection der Lederle Laboratories 
 EMI9.3 
 



   S. DepartmentTaxonomische Charakterisierung von NRRL 12515
Der Stamm NRRL   12515 ist   taxonomisch charakterisiert und identifiziert worden als Stamm einer neuen Species der Art Actinomadura, welcher als Actinomadura yumaense sp. nov. bezeichnet wird. 



   Die kulturellen, physiologischen und morphologischen Merkmale des repräsentativen Stamms NRRL 12515 wurden untersucht, und zwar unter Verwendung von Verfahren, welche beschrieben wurden von   E. B.   
 EMI9.4 
 "Methodsstudy of   Streptomycetes\ Antibiotics Ann.. Seiten   947-953 (1956/1957) ; G. F.

   Gauze et al., "Problems in the classification of antagonistic   actinomycetes",   State Publishing House for Medical Literature, Medgiz, Moskau 
 EMI9.5 
 

 <Desc/Clms Page number 10> 

 
 EMI10.1 
    ;al., "Key   for identification of the species of the genus Actinomadura", The Biology of Actinomycetes and Related Organisms   12 : 30-38 (1977)].   Die Kultur NRRL 12515 hat eine geringe Ähnlichkeit mit Actinomadura pelletier, weist jedoch keine Ähnlichkeit mit irgendeiner anderen beschriebenen Species auf und unterscheidet sich von A. pelletier. in einer Vielzahl von Eigenschaften.

   Der Stamm NRRL 12515 wurde daher als der Typenstamm einer neuen Species bezeichnet und Actinomadura yumaense   sp. nov.   benannt, wobei die Benennung nach dem Ort der Sammlung der Bodenprobe erfolgte, aus der der Typenstamm isoliert wurde. 



    Mikromol1Jholoie   
 EMI10.2 
 



    6Zel1wandzusammensetzung  
Gesamtzellenhydrolysate dieser Kultur enthalten Madurose (3-0-Methyl-D-galactose) und das Mesoisomere der   Diaminopimelinsaure   (DAP). Die Kultur weist auch ein Typ P-l Phospholipid-Muster auf und 
 EMI10.3 
 typisch für Mitglieder der Gattung Actinomadura. 



    Wachstumseienschaften  
Ein gutes Wachstum wird beobachtet auf Bennett's Agar, Gauze Nr. 2 Agar,   NZ-Amin-Stärke-Glucose-   Agar (ATCC Medium 172), Tomatenpaste-Hafcrmchl-Agar und Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar; mässiges 
 EMI10.4 
 Agar und anorganische Salze-Stärke-Agar. 



   Vegetatives Myzel
Auf Media, bei denen gutes Wachstum auftrat, wurde beobachtet, dass sich das vegetative Myzel entwickelte und zusammenrollte und allmählich gelblich-graue Farbschattierungen annahm. 



     Luftmvzet   und Sporenfarbc
Das Luftmyzel und/oder die Sporenmassen waren weiss bis 264. light gray gefärbt. Die Luftmyzelbildung ist auf den meisten Media leicht. 



   Lösliche Pigmente 
 EMI10.5 
 



   ;Physiologische Reaktionen
Keine Melamin-Pigmente   a"fPepton-Eisen-Agar   und Tyrosin-Agar   (ISO-7) ;   starke Peptonisierung von   Lpckmusmilch ; starke Protcolyse   von Nährgelatine; mässige Reduktion von Nitrat ; keine Hydrolyse von Adenin oder Guanin ; starke Hydrolyse von Hypoxanthin, Tyrosin und Xanthin ; schwache Hydrolyse von Stärke ; 
 EMI10.6 
 

 <Desc/Clms Page number 11> 

    ;Lactat.   Mucat und Oxalat. 



    Tabelle vs   
Kulturcharakteristika von Actinomadura yumaense NRRL 12515 
 EMI11.1 
 
<tb> 
<tb> Inkubation <SEP> : <SEP> 14 <SEP> Tage <SEP> Temperatur <SEP> ; <SEP> 28"C <SEP> 
<tb> Medium <SEP> Wachstum <SEP> Luftmyzel <SEP> und/oder <SEP> Sporen <SEP> Lösl. <SEP> Pigment <SEP> Rückseitenfarbe
<tb> Benedict's <SEP> mässig <SEP> bis <SEP> flach, <SEP> pulvrige <SEP> Kolonien; <SEP> Luftmyzel <SEP> gelblich <SEP> 89 <SEP> pale <SEP> yellow
<tb> Agar <SEP> schlecht <SEP> weiss <SEP> bis <SEP> 264. <SEP> light <SEP> pray
<tb> Bennett's <SEP> gut <SEP> kein <SEP> Luftmyzel; <SEP> gerolltes, <SEP> vegetatives <SEP> orangefarben <SEP> S <SEP> darkaavish <SEP> 
<tb> Agar <SEP> Wachstum <SEP> 93.yellowish <SEP> gray <SEP> bis <SEP> 80. <SEP> yellowish
<tb> rayish <SEP> vellowish <SEP> brown <SEP> brown
<tb> Calciumma- <SEP> gut <SEP> flaches <SEP> Wachstum;

   <SEP> spärliches, <SEP> weisses <SEP> gelb-grün <SEP> 90. <SEP> greenish
<tb> lat- <SEP> Agar <SEP> Luftmyzel <SEP> yellow
<tb> Czapek's <SEP> Sac- <SEP> mässig <SEP> bis <SEP> flaches <SEP> Wachstum; <SEP> mässiges <SEP> Luftmyzel <SEP> keines <SEP> 89. <SEP> gale <SEP> yellow <SEP> 
<tb> charose-Agar <SEP> schlecht <SEP> vegetatives <SEP> Wachstum <SEP> 90. <SEP> grayish <SEP> yellow
<tb> Gauze <SEP> Nr. <SEP> 1 <SEP> schlecht <SEP> farbloses, <SEP> flaches <SEP> Wachstum <SEP> ; <SEP> spärliches, <SEP> keines <SEP> farblos
<tb> Agar <SEP> weisses <SEP> Luftmyzel
<tb> Gauze <SEP> Nr. <SEP> 2 <SEP> gut <SEP> erhabene, <SEP> gerollte <SEP> Kolonien <SEP> ; <SEP> vegetatives <SEP> keines <SEP> 72. <SEP> dark <SEP> orange
<tb> Agar <SEP> Myzel <SEP> 93. <SEP> Yellowish <SEP> gray;

   <SEP> mässiges
<tb> Luftmyzel. <SEP> 92. <SEP> yerllowish <SEP> white <SEP> yellow
<tb> Glycerin- <SEP> schlecht <SEP> bis <SEP> flache, <SEP> pulvrige <SEP> Kolonien <SEP> ; <SEP> weisses <SEP> gelb <SEP> 89.pale <SEP> yellow
<tb> Asparagin <SEP> Agar <SEP> mässig <SEP> Luftmyzel
<tb> Hickey- <SEP> mässig <SEP> flache, <SEP> wachsartige <SEP> Kolonien. <SEP> 90. <SEP> grayish <SEP> keines <SEP> 90. <SEP> grayish
<tb> Tresner <SEP> Agar <SEP> yellow <SEP> spärliches <SEP> Luftmyzel, <SEP> weiss <SEP> bis <SEP> 264. <SEP> yellow
<tb> lightgrav
<tb> anorgan. <SEP> Salze-schlecht <SEP> flache, <SEP> farblose, <SEP> pulvrige <SEP> Kolonien <SEP> ;

   <SEP> keines <SEP> farblos
<tb> Stärke-Agar <SEP> weisses <SEP> Luftmyzel
<tb> NZ-Amin-Stärke- <SEP> gut <SEP> stark <SEP> gerolltes <SEP> Wachstum, <SEP> 61. <SEP> grayish <SEP> grünlich-braun <SEP> 78. <SEP> m
<tb> Glucose-Agar <SEP> brown <SEP> bis <SEP> 65. <SEP> brownish <SEP> black; <SEP> mässiges <SEP> yellowish
<tb> Luftmyzel, <SEP> weiss <SEP> bis <SEP> 264. <SEP> light <SEP> gray <SEP> brown
<tb> Hafermehl- <SEP> mässig <SEP> flaches, <SEP> wachsartiges <SEP> Wachstum, <SEP> 90. <SEP> keines <SEP> 90. <SEP> greyish <SEP> 
<tb> Agar <SEP> grayish <SEP> yellow; <SEP> mässiges <SEP> Luftmyzel, <SEP> weiss <SEP> yellow
<tb> Tomatenpaste- <SEP> gut <SEP> flaches, <SEP> wachsartiges <SEP> Wachstum, <SEP> 91. <SEP> dark <SEP> keines
<tb> Hafermehl- <SEP> grayish <SEP> yellow;

   <SEP> Spur <SEP> eines <SEP> weissen
<tb> Agar <SEP> Luftmyzel
<tb> Hefeextrakt- <SEP> gut <SEP> erhabene, <SEP> wachsartige, <SEP> gerollte <SEP> Kolonien, <SEP> orangefarben <SEP> 78. <SEP> dark
<tb> Malzextrakt- <SEP> 93. <SEP> yellowish <SEP> gray <SEP> bis <SEP> 80. <SEP> grayish <SEP> vellowish
<tb> Agar <SEP> yellowish <SEP> brown <SEP> : <SEP> kein <SEP> Luftmyzel <SEP> brown <SEP> 
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 12> 

 
 EMI12.1 
 
 EMI12.2 
 
<tb> 
<tb> vizMedium <SEP> Luftmyzel <SEP> und/oder <SEP> sporifere <SEP> Strukturen <SEP> Sporenform <SEP> Sporengrösse <SEP> Sporenoberfläche
<tb> Czapek's <SEP> Luftsporophoren <SEP> ; <SEP> verzweigt, <SEP> fast <SEP> kreisförmig <SEP> ovoid <SEP> 0,6-0,8un <SEP> glatt
<tb> Sacharose <SEP> angeordnet <SEP> ;

   <SEP> relativ <SEP> kurze, <SEP> spirale <SEP> Kettenx <SEP> 
<tb> Agar <SEP> von <SEP> reifen <SEP> Sporen <SEP> tragend <SEP> 1,0-1,4 <SEP> Sun <SEP> 
<tb> 
 
Tabelle IX   PhvsioioEische Reaktionen   von Actinomadura   vumaense   NRRL 12515 
 EMI12.3 
 
<tb> 
<tb> Medium <SEP> Inkbationsdauer <SEP> Wachstum <SEP> Physiologische <SEP> Reaktion
<tb> (Tage)

  
<tb> Pepton-Eisen-Agar <SEP> 7 <SEP> gut <SEP> leichte <SEP> Braunfärbung
<tb> 14 <SEP> gut <SEP> leichte <SEP> Braunfärbung
<tb> Tyrosin-Agar <SEP> 7 <SEP> mässig <SEP> kein <SEP> Pigment
<tb> 14 <SEP> gut <SEP> gelbliches <SEP> Pigment
<tb> Lackmusmilch <SEP> 14 <SEP> gut <SEP> gute <SEP> Peptonisierung <SEP> 
<tb> 28 <SEP> gut <SEP> starke <SEP> Peptonisierung
<tb> Nährgelatine <SEP> 14 <SEP> gut <SEP> geringfügige <SEP> Proteolyse
<tb> 28 <SEP> gut <SEP> totale <SEP> Proteolyse
<tb> Nitratbrühe <SEP> 14 <SEP> gut <SEP> sehr <SEP> schwache <SEP> Reduktion"
<tb> 28 <SEP> gut <SEP> mässige <SEP> Reduktion
<tb> Adenin-Agar <SEP> 14 <SEP> gut <SEP> keine <SEP> Hydrolyse
<tb> 21 <SEP> gut <SEP> keine <SEP> Hydrolyse
<tb> Guanin-Agar <SEP> 14 <SEP> gut <SEP> keine <SEP> Hydrolyse
<tb> 21 <SEP> gut <SEP> keine <SEP> Hydrolyse
<tb> Hypoxanthin-Agar <SEP> 14 <SEP> gut <SEP> 

  totale <SEP> Hydrolyse
<tb> 21 <SEP> gut <SEP> totale <SEP> Hydrolyse
<tb> Tyrosin-Agar <SEP> 14 <SEP> gut <SEP> starke <SEP> Hydrolyse <SEP> 
<tb> 21 <SEP> gut <SEP> starke <SEP> Hydrolyse
<tb> Xanthin-Agar <SEP> 14 <SEP> gut <SEP> mässige <SEP> Hydrolyse
<tb> 21 <SEP> gut <SEP> starke <SEP> Hydrolyse
<tb> NZ-Amin <SEP> mit <SEP> lösl. <SEP> Stärke <SEP> und <SEP> 5 <SEP> schlechtes <SEP> oder <SEP> kein <SEP> Wachstum <SEP> bei <SEP> 4 , <SEP> 10  <SEP> und <SEP> 55 C; <SEP> mässiges
<tb> Glucose-Agar <SEP> (ATCC <SEP> Med. <SEP> Wachstum <SEP> bei <SEP> 25 , <SEP> 28  <SEP> und <SEP> 45 C <SEP> ; <SEP> gutes <SEP> Wachstum <SEP> bei
<tb> Nr. <SEP> 172) <SEP> 32  <SEP> und <SEP> 37  <SEP> C.
<tb> 



  Harnstoff-Brühe <SEP> 28 <SEP> gut <SEP> Zersetzung <SEP> variabel
<tb> masculin-brühe <SEP> 14 <SEP> gut <SEP> Hydrolyse
<tb> 28 <SEP> gut <SEP> Hydrolyse
<tb> Stärke-Agar <SEP> 5 <SEP> gut <SEP> keine <SEP> Hydrolyse
<tb> 10 <SEP> gut <SEP> keine <SEP> Hydrolyse
<tb> 
   Tabelle X    Kohlenstoffquellennutzung von Actinomadura yumaense 
 EMI12.4 
 
 EMI12.5 
 
<tb> 
<tb> ! <SEP> 5 <SEP> auf <SEP> ISP-9 <SEP> KohJenhvdratnutzunpsmediumInkubation <SEP> ;

   <SEP> 28 <SEP> Tage <SEP> Temperatur <SEP> 28 C <SEP> 
<tb> Kohlenstoffquelle <SEP> Nutzung
<tb> Adonit
<tb> !-Arabinose
<tb> Du <SEP> ! <SEP> cit <SEP> - <SEP> 
<tb> Fructose <SEP> schlecht
<tb> d-Galactose
<tb> d-Glucose <SEP> gut
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 13> 

 
 EMI13.1 
 
<tb> 
<tb> Glycerin
<tb> i-Inosit <SEP> schlecht
<tb> Lactose
<tb> Maltose <SEP> mässig
<tb> d-Mannit
<tb> d-Mannose <SEP> schlecht
<tb> d-Melezitose
<tb> d-Malibiose
<tb> d-Raffinose
<tb> 1-Rhamnose
<tb> Salicin
<tb> Sorbit
<tb> Saccharose <SEP> mässig
<tb> d-Trehalose <SEP> gut
<tb> d-Xylose
<tb> negative <SEP> Kontrolle
<tb> 
 
Tabelle XI Säurebildung aus verschiedenen Kohlehydraten mittels Actinomadura yumaense NRRL 12515 auf Gordon's basalem anorganischem Stickstoffmedium 
 EMI13.2 
 
<tb> 
<tb> Inkubation <SEP> : <SEP> 28 <SEP> Tage <SEP> Temperatur:

   <SEP> 28 C
<tb> Kohlenstoffquelle <SEP> Säurebildmg
<tb> 7 <SEP> Tage <SEP> 28Tage <SEP> 
<tb> Adonit
<tb> i-Arabinose
<tb> Dulcit
<tb> Fructose
<tb> d-Galctose-+
<tb> d-Glucose <SEP> +++ <SEP> +++
<tb> Glycerin <SEP> ++ <SEP> +++
<tb> i-Inosit-+
<tb> Lactose <SEP> - <SEP> Maltose
<tb> d-Mannit
<tb> d-Mannose-+
<tb> d-Melezitose
<tb> d-Melibiose
<tb> d-Raffinose
<tb> !-Rhamnose
<tb> Salicin
<tb> Sorbit
<tb> Saccharose <SEP> - <SEP> +++
<tb> d-Trehalose-+++
<tb> d-Xylose
<tb> negative <SEP> Kontrolle
<tb> 
 +++ = starke, positive Reaktion ++ = mässige, positive Reaktion + = geringe, positive Reaktion = negative Reaktion 

 <Desc/Clms Page number 14> 

   Tabelle XII    Nutzung organischer Säuren mittels Actinomadura yumaense NRRL 12515 auf   Gordon's Modifizierung   von Koser's Basal Agar (Koser's Citrat-Agar)

   
 EMI14.1 
 
 EMI14.2 
 
<tb> 
<tb> Inkubation <SEP> : <SEP> 28 <SEP> Tage <SEP> Temperatur: <SEP> 28  <SEP> C
<tb> Kohlenstoffquelle <SEP> Nutzung
<tb> Tacets
<tb> Bcnzoat
<tb> Citrat
<tb> Lactat
<tb> Malat <SEP> +
<tb> Mucinsaure
<tb> Oxalat
<tb> Propionat <SEP> +
<tb> Pyruvat <SEP> +
<tb> Succinat <SEP> +
<tb> Tartrat <SEP> +
<tb> + <SEP> = <SEP> positive <SEP> Reaktion <SEP> ;--= <SEP> negative <SEP> Reaktion <SEP> 
<tb> 
 bs ist   darauf¯   ninzuweisen,   dass   aer   Ausaructc"ACtmomaaura yumaense mcnt aut oen atamm   Actinomadura yumaense NRRL 12515 oder auf Stämme beschränkt ist, die in vollem Umfang den obigen Wachstums- und mikroskopischen Charakteristika entsprechen, welche lediglich zur Illustration angegeben sind. 



  Das hier beschriebene Actinomadura yumaense umfasst alle Stämme von Actinomadura yumaense, welche die Antibiotika LL-C23024 alpha, beta und jota bilden und welche nicht eindeutig von Actinomadura yumaense NRRL 12515 und dessen subkulturen einschliesslich der Mutanten und Varianten derselben unterschieden werden können. Der Begriff "Mutanten" umfasst die natürlichen (spontanen) Mutanten dieses Organsimus sowie die induzierten Mutanten, die, ausgehend von diesem Organismus, mittels verschiedener, mutagener Mittel, welche dem Fachmann geläufig sind, hergestellt werden können. Derartige Mittel sind beispielsweise das Bestrahlen mit Röntgenstrahlung, Ultraviolettstrahlung, das Behandeln mit Stickstofflost, Actinophagen, Nitrosaminen und dgl..

   Ebenfalls sollen die   inter-und intraspezifischen, genetischen Rekombinanten,   die mittels bekannter genetischer techniken hergestellt werden können, umfasst sein. Solche genetischen Techniken sind beispielsweise Konjugation, Transduktion und Techniken der genetic engineering. 



   Die Kultivierung von Actinomadura yumaense kann mit einer weiten Vielzahl von festen oder flüssigen Kulturmedia durchgeführt werden. Brauchbare media zur Bildung der Antibiotica   LL-c23024 alpha,   beta und   jota-..   umfassen eine assimilierbare Stickstoffquelle, wie Protein, Proteinhydrolysat, Polypeptide, Aminosäuren, Maiswasser, etc., sowie anorganische Anionen und Kationen, wie Kalium, natrium, Ammonium, Calcium, Sulfat, Carbonat, Phaosphat, Chlorid,   etc..   Spurenelemente, wie Bor, Molybdän, Kupfer,   etc.,   werden als Verunreinigungen anderer bestandteile der Media zur Verfügung gestellt.

   Die Belüftung in Tanks oder Flaschen erfolgt, indem man sterile Luft durch oder auf die Oberfläche des Fermentiermediums   drückt.   Eine weitergehende Bewegung in den Tanks wird durch einen mechanischen Propeller gewährleistet Ein Antischäummittel, wie   Schmalzöl   oder Silikon-Entschäumer, kann erforderlichenfalls zugesetzt werden. 



   Actinomadura yumaense wird auf geneigten Agarplatten (agar slants) aufgezogen und am Leben gehalten,   z. B.   auf Bennett's Agar, Hefe-Malz-Agar oder ATCC Medium Nr. 172. Das ATCC Medium Nr. 172 ist bevorzugt. Die geneigte Platte wird mit einer Kultur von Actinomadura yumaense inokuliert und etwa 7 Tage bei 28 bis   370 C,   vorzugsweise bei etwa   320 C, inkubiert.   Diese Basiskulturen können durch serienweise Übertragung auf frische Agar slants am Leben erhalten werden, oder es kann auch ein Pfropfen des Agars mit einem Gehalt an Myzel von dem gut entwickelten agar slant verwendet werden, um flüssige Media zu inokulieren. 



   Durch Inokulation von 100 ml sterilem, flüssigen Medium in 500 ml-Flaschen mit den von einem Agar slant der Kultur abgekratzten oder abgewaschenen Sporenmaterial werden   Schüttelflaschen-lmpfzubereitungen   von Actinomadura yumaense   hergestellt.   Beispiele geeigneter Saatmedia sind die folgenden. 
 EMI14.3 
 
<tb> 
<tb> 



  Medium <SEP> A <SEP> S <SEP> : <SEP> 
<tb> Rinderextrakt <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> 
<tb> Bacto <SEP> (R) <SEP> Trypton <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 
<tb> Glucose <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 
<tb> Hefeextrakt <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 
<tb> Wasser <SEP> qs. <SEP> 100
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 15> 

 
 EMI15.1 
 
 EMI15.2 
 
<tb> 
<tb> Medium <SEP> B <SEP> %
<tb> Glucose <SEP> 1 <SEP> 
<tb> Starke <SEP> 2
<tb> Hefeextrakt <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 
<tb> NZ-Amin <SEP> A <SEP> (R) <SEP> 2 <SEP> 0. <SEP> 5 <SEP> 
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 0. <SEP> 1 <SEP> 
<tb> Wasser <SEP> qs. <SEP> tOO <SEP> 
<tb> 
 
 EMI15.3 
 Corp., Norwich,   NY) :   Medium B wird bevorzugt. 
 EMI15.4 
 4 Tage auf einer rotierenden   Schüttelmaschine   heftig geschüttelt. Dieses Saatinokulum wird anschliessend verwendet, um die Fermentationskultur zu inokulieren.

   Die Saatkultur kann auch gefroren und gelagert werden, um für anschliessende   Saatkulturen   ein Inokulum bereitzustellen. 



   Die im folgenden angegebenen Media sind Beispiele für brauchbare Media zur Fermentierung von Actionomadura yumaense, um Antibiotika LL-C23024 alpha, beta und jota herzustellen. 
 EMI15.5 
 
<tb> 
<tb> 



  Medium <SEP> C <SEP> %
<tb> Glucose <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> 
<tb> Glycerin <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> 
<tb> Sojamehl <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> 
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 
<tb> Natriumchlorid <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> 
<tb> Wasser <SEP> qs. <SEP> 100
<tb> 
 (3 kann durch Baumwollsamenöl oder lösliche Fleischbestandteile mit gleichem Effekt ersetzt werden). 
 EMI15.6 
 
<tb> 
<tb> 



  Medium <SEP> D <SEP> %
<tb> Glucose <SEP> 3, <SEP> 0 <SEP> 
<tb> Sojamehl <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> 
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 
<tb> Natriumchlorid <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> 
<tb> Wasser <SEP> qs. <SEP> IM
<tb> Medium <SEP> E <SEP> YA <SEP> 
<tb> Stärke <SEP> 1 <SEP> 
<tb> Melassen <SEP> 2
<tb> Sojamehl <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> 
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 
<tb> Wasser <SEP> qs. <SEP> IM
<tb> Medium <SEP> F <SEP> i <SEP> 
<tb> Glucose <SEP> 3
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 16> 

 
 EMI16.1 
 
<tb> 
<tb> lösliche <SEP> Fleischbestandtcile <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> 
<tb> Natriumchlorid <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 
<tb> Wasser <SEP> qs.

   <SEP> 100
<tb> Médium <SEP> go <SEP> 
<tb> Glucose <SEP> 3
<tb> Sojamehl <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 
<tb> Ammoniumsulfat <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> 
<tb> Natriumchlorid <SEP> - <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 
<tb> Wasser <SEP> qs. <SEP> 100
<tb> Medium <SEP> H. <SEP> 2 & <SEP> 
<tb> Glucose <SEP> 3
<tb> Ammoniumsulfat <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> 
<tb> dibasisches <SEP> Kaliumphosphat <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 
<tb> Natriumchlorid <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 
<tb> Wasser <SEP> qs. <SEP> 100
<tb> 
 Medium D ist bevorzugt 
 EMI16.2 
 verwenden. 



   Alternativ kann die Fermentation auch in grösseren Fermentationstanks durchgeführt werden, welche mit einer Belüftungseinrichtung und einer Rühreinrichtung ausgerüstet sind. Jeder Tank wird mit 3 bis 10% (Vol/Vol) des auf die oben beschriebene Weise hergestellten Inokulums inokuliert. Die Belüftung wird mit einer 
 EMI16.3 
 Propellers, der mit 200 bis 400 U/min angetrieben wird, gerührt. Die Temperatur wird bei 25 bis 35"C, vorzugsweise bei   32 C,   gehalten. Die Fermentation wird solange fortgeführt, bis sich Antibiotika in dem Fermentationsmedium anreichern, gewöhnlich nach 100 bis 150 h. Zu diesem Zeitpunkt wird das Antibiotikum geerntet
Das Antibiotikum kann gemäss den in der US-PS 4 278 663 beschriebenen Verfahren geerntet und gereinigt werden oder gemäss der folgenden Verfahrensweise. 



   Die rohe Fermentationsbrühe mit einem Gehalt der gesamten Zellen und hergestellt auf die oben beschriebene Weise wird mit einem gleichen Volumen eines beliebigen Nicht- Kohlenwasserstoff- wasserunmischbaren, organischen Lösungsmittels vermischt Methylenchlorid oder Äthyllacetat ist bevorzugt die organische Phase wird abgetrennt und im Vakuum zu einem öligen Sirup konzentriert. 



   Der ölige Sirup wird in Methylenclorid aufgelöst und auf eine Säule aus Silikagel, Aluminiumoxid, durch Vernetzen von Dextran hergestelltem, hydrophilem, unlöslichem Molekularsieb für chromatographische Zwecke (Sephadex LH-20 (R) der FA. Pharmacia Fine Chemicals Div. of Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ. ) oder Magnesiumaluminiumsilikat gegeben. Beispiele geeigneter Lösungsmittel zur Entwicklung der Säule sind   Diäthyläther,   Äthylacetat, eine   1 : 1- bis 1 : 7- (VolNol) Mischung von Methylenchlorid : Äthyläther,   10 bis 40 % Aceton in Methylenchlorid, 2 bis 10 % niederer Alkohol 

 <Desc/Clms Page number 17> 

 
 EMI17.1 
 beliebigen, mässig siedenden Kohlenwasserstoff, wie Hexan oder Heptan, gewaschen, vorzugsweise bei etwa 40 C, und an der Luft getrocknet.

   Man erhält so als Endprodukt das Antibiotikum X-14868A in Form der freien Säure. 



   Falls das Produkt in Form eines Salzes erwünscht ist, kann die freie Säure durch eine Behandlung mit einem zweckentsprechenden Kation, vorzugsweise in Form einer verdünnten, mineralischen Base. umgewandelt werden, und zwar nach Verfahrensweisen, die dem Fachmann geläufig sind. 



   Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen näher   erläutert.   Bei den Media A, B, C, etc. handelt es sich um die oben definierten. Falls nichts anderes angegeben ist, werden alle Verfahren bei Zimmertemperatur (ungefähr 22 C) und bei 1 at Druck   durchgeführt.   
 EMI17.2 
 eine 500 ml Flasche, enthaltend 100 ml steriles Medium B, zu inokulieren. Die Flasche wird 2 Tage auf einem   Rotaùonsschüttler   bei   28 C   inkubiert. 



   Ein 5% Inokulum dieser Kultur wird anschliessend zu 100 ml sterilem Medium C in einer 500 ml Flasche transferiert und 5 Tage bei 28 C auf einem   Rotationsschiiltler   inkubiert. 
 EMI17.3 
 mittels eines Bioassays gegen die freilebende Nematode Caenorhabditis elegans beobachlet. 



    B e i s p i e l 2  
Es werden   sieben 500 m ! Flaschen vorbereitet,   jede enthaltend 100 ml eines der folgenden sterilen Media : 
 EMI17.4 
 
<tb> 
<tb> Plasene <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 1W <SEP> ml <SEP> MealUm <SEP> L <SEP> ; <SEP> 
<tb> Flasche <SEP> 2 <SEP> : <SEP> 100 <SEP> mit <SEP> Medium <SEP> C <SEP> mit <SEP> 1,5% <SEP> Baumwollsamenöl <SEP> anstelle <SEP> des <SEP> Sojamehls
<tb> Flasche <SEP> 3 <SEP> : <SEP> 100 <SEP> ml <SEP> Medium <SEP> C <SEP> mit <SEP> 1, <SEP> 5% <SEP> lösliche <SEP> FleischbestandLeile <SEP> anstelle <SEP> des <SEP> Sojamehls
<tb> Flasche <SEP> 4 <SEP> : <SEP> 100 <SEP> ml <SEP> Medium <SEP> D
<tb> Flasche <SEP> 5 <SEP> : <SEP> 100 <SEP> ml <SEP> Medium <SEP> E
<tb> Flasche <SEP> 6 <SEP> : <SEP> 100 <SEP> ml <SEP> Medium <SEP> F
<tb> Flasche <SEP> 7 <SEP> :

   <SEP> 100 <SEP> ml <SEP> Medium <SEP> G.
<tb> 
 
 EMI17.5 
 



    1 hinsichlich ihrerBeispiel 3   
Gefrorene   Ferrnentationskulturzellen   von Actinomadua yumaense NRRL 12515 werden verwendet, um eine 100 ml steriles Medium B enthaltende 500 ml-Flasche zu inokulieren. Die Flasche wird anschliessend 4 Tage bei   32 C   auf einem Rotationsschüttler inkubiert. Ein 5% Inokulum dieser Kultur wird anschliessend zu 100 ml sterilem Medium H in einer 500 ml-Flasche transferiert und 5 Tage auf einem Rotationsschüttler bei   280C   inkubiert. 

 <Desc/Clms Page number 18> 

 



   Die antibakterielle Aktivität wird gemäss Beispiel 1 festgestellt und die Anticoccidienaktivität gemäss Beispiel 2. Das Vorliegen der antibiotischen Aktivität wird ebenfalls mittels Dünnschichtchromatographie auf   Silikagelplatlcn,   entwickelt in Äthylacetat:Chloroform 70:30 (Vol/Vol), untersucht. 



   Beispiel 4 
100 ml steriles Medium A in einer 500 ml-Flasche werden mit gewaschenen Sporen eines Agar slants von Actinomadura yumaense NRRL 12515 inokuliert. Die Flasche wird 2 Tage auf einem   Rotationsschüttlerbei     32 C   inkubiert. Ein 5% Inokulum dieser Kultur wird dann zu 100 ml sterilem Medium H in einer 500 ml- 
 EMI18.1 
 wird anschliessend zu einer 500 ml-Flasche, enthaltend 100 ml frisches, steriles Medium H, transferiert und 6 Tage bei   28 C   auf einem Rotationsschüttler inkubiert. Die antibakterielle Aktivität wird gemäss Beispiel 1   festgestellt.   



   Beispiel 5 
Zwei 500 ml-Flaschen, jede enthaltend 100 ml steriles Medium A, werden mit einer gefrorenen Saatkultur von Actinomadura yumaense NRRL 12515 inokuliert und 2 Tage bei   32 C   auf einem Rotationsschüttler inkubiert. Die Inhalte der beiden Flaschen werden anschliessend kombiniert und zu   12 1 frischen,   sterilem Medium 
 EMI18.2 
 bei 280C unter Belüftung und Rühren inkubiert. Die Fermentationsbrühe wird hinsichlich ihrer antibiotischen Aktivität mittels Dünnschichtchromatographie auf Silikagelplatten, entwickelt in Äthylacetat:Chloroform 70:30 (Vol/Vol),   untersucht.   Alternativ werden mehrere der entwickelten Platten einem Bioassay gegen Bacillus subtilis unterworfen, wobei sich das Vorliegen von antibiotischer Aktivität ebenfalls   zeigt.   



   Beispiel 6 
Ein typisches Medium, welches verwendet wird, um das primäre Inokulum wachsen zu lassen, wird gemäss der folgenden Formulierung hergestellt. 
 EMI18.3 
 
 EMI18.4 
 
<tb> 
<tb> .. <SEP> LIla <SEP> 
<tb> Rinderextrakt <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> 
<tb> Trypton <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 
<tb> (mittels <SEP> Trypsin <SEP> hergestelltes <SEP> Peptid)
<tb> Glucose <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 
<tb> Hefeextrakt <SEP> 0, <SEP> 5
<tb> Agar <SEP> 0, <SEP> 15 <SEP> 
<tb> Wasser <SEP> qs. <SEP> 100
<tb> 
 
Gewaschene oder abgekratzte Sporen und Myzel von einem Agar slant von Actinomadura yumaense NRRL 12515 werden verwendet, um eine 500 ml-Flasche, enthaltend 100 ml des obigen sterilisierten Mediums, zu inokulieren.

   Die Flasche wird auf einen   Rotationsschüttler   gestellt und 48 h bei   320C   heftig   geschüttelt   Das 
 EMI18.5 
 Flasche zu inokulieren. Dieses Inokulum wird mit steriler Luft belüftet, während das Wachstum 48 h bei   28 C   fortgesetzt wird. Diese 1 l-Kultur wird dann verwendet, um einen 30   i   Fermentortank, enthaltend das gleiche sterile Medium, zu inokulieren ; dieser Tank wird mit steriler Luft belüftet und 42 h bei   280C   inkubiert. 



    Beispiel 7   
Ein   Fermentationsmedium   wird gemäss folgender Formulierung   hergestellt.   
 EMI18.6 
 
<tb> 
<tb> 



   & 
<tb> Dextrose <SEP> 1, <SEP> 5
<tb> Glycerin <SEP> 1. <SEP> 5
<tb> Sojamchl <SEP> 5
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 0. <SEP> 1 <SEP> 
<tb> Natriumchlorid <SEP> 0, <SEP> 3
<tb> Wasser <SEP> qs. <SEP> IM
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 19> 

 
 EMI19.1 
 
0 eingestelltMaische   geemteL   Beispiel 8
Ein Fennentationsmedium wird gemäss folgender Formulierung hergestellt. 
 EMI19.2 
 
<tb> 
<tb> 
<tb> 



  Dextrose <SEP> 3, <SEP> 0
<tb> Sojamehl <SEP> 1,5
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 0,1
<tb> Natriumchlorid <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> 
<tb> Wasser <SEP> qs. <SEP> 100
<tb> 
 
Der pH wird mit 6N Natriumhydroxid auf 7, 0 eingestellt und das Medium sterilisiert. Eine 3001-Portion des gemäss Beispiel 1 hergestellten Inokulums wird verwendet, um 3000   l   des obigen Mediums in einem Fennentor 
 EMI19.3 
   geerntet.   



  Beispiel 9 (1) Die Fermentationsmaische (100 ml) wird mit 6N   HCI   auf pH 4, 0 eingestellt. Die saure Maische wird dann 1 bis 2 h mit einem gleichen Volumen Methylenchlorid gerührt. Das Gemisch aus Maische und Methylenchlorid wird anschliessend filtriert, und zwar unter Verwendung von Diatomeenerde als Filterhilfe. Der   Mcthylenchloridextrakt   wird abgezogen und im Vakuum auf etwa 2   l   konzentriert, wobei man die teilweise gereinigten Antibiotika erhält. 



   2) Chromatographie der teilweise gereinigten Antibiotika auf Silikagel
Eine Glassäule mit einem Durchmesser von 7 cm wird bis zu einer Höhe von 91 cm mit Silika Gel bepackt. 
 EMI19.4 
 Gemisch von 600 ml Diäthyläther und 600 ml Hexan aufgelöst. Die resultierende Suspension wird filtriert, wobei man ein klares Filtrat erhält. Das klare Filtrat wird im Vakuum so weit konzentriert, bis die Kristallbildung beginnt. Diese Suspension wird über Nacht stehengelassen. Das kristalline C23024A1pha wird auf einem Trichter gesammelt, mit kaltem Äther gewaschen und an der Luft getrocknet. Man erhält    33"l g--   kristallines C23024Alpha. Weitere 12, 4 g C23024Alpha werden durch weitere Verringerung des Volumens der vereinigten Waschlösungen und Filtrate erhalten. 



   Die Fraktionen 177 bis 203 aus der Eluierung mit   Äthylacetat : Äthanol,   welche mit C23024 beta angereichert sind, werden kombiniert und im Vakuum konzentriert. Man   erhält   6, 7 g teilweise gereinigtes C23024ss, das, wie oben beschrieben behandelt wird. 



   Die Fraktion 204 bis 213 aus der Eluierung mit   Äthylacetat Äthanol,   welche mit LL-C23024 jota 
 EMI19.5 
 mit Heptan extrahiert. Der letzte Heptanextrakt wird 48 h auf   OOC   gekühlt und die Kristalle werden durch Filtration von der Mutterlauge   entfernt.   



   Diese Mutterlauge wird anschliessend in Methylenchlorid und in eine mit Woelm Silikagel bepackte   Glassäule   einsickern lassen. Die Säule wird dann aufeinanderfolgend mit 21 Methylen, 8   l   Methylenchlorid : Äthylacetat (1 : 1) und 4 1 Athylacetat:Methanol (9:1) cluiert. Das Eluat wird in Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen werden   hieichflic.   ihrer antibiotischen Zusammensetzung untersucht. Die aktiven Fraktionen werden kombiniert und im Vakuum konzentriert, wobei man einen Rückstand erhält, der LL-C23024 jota   enthält.   

 <Desc/Clms Page number 20> 

 



   Beispiel 10 (3) Weitere Reinigung von LL-C23024ss aus der Chromatographie auf Silikagel. 



   Man lässt durch Vernetzen von Dextran hergestelltes, hydrophiles, unlösliches Molekularsieb für chromatographische Zwecke (Sephadex (R) LH20) in einem Gemisch von Hexan-Methylenchlorid-Methanol   (10 : 5 : 1) qucllen.   Eine Glassäule mit einem Durchmesser von 5 cm wird bis zu einer Höhe von 86 cm mit dem Gel bepackt. Die Charge, 3 g gereinigtes   LL-C23024ss,   wird in 10 ml Methylenchlorid, 1 ml Methanol und 10 ml Hexan aufgelöst und in die Säule des Gels einsickern lassen. Die Säule 3 wird anschliessend mit einem Lösungsmittel der gleichen Zusammensetzung entwickelt, wie das, welches zum Aufbringen des Antibiotikums auf die Säule verwendet wurde. Es werden Fraktionen unter Verwendung eines Sammlers aufgefangen. Die ersten 23 Fraktionen haben jeweils ein Volumen von 17 ml.

   Die Fraktionen 17 bis 26 enthielten C23024ss gemäss Dünnschichtchromatographie   (TLC).   Diese Fraktionen werden vereinigt und im Vakuum konzentriert, wobei man reines, amorphes LL-C23024ss (1269 mg) erhält. 



   Beispiel 11 Kristallisation von   LL-C23024S als Natriumsalz  
Gereinigtes LL-C23024ss (2, 4 g), hergestellt wird in den Abschnitten B und C beschrieben, wird in einem Gemisch von Diäthyläther (500   ml),   Hexan (160 ml) und Methylenchlorid (25 ml) aufgelöst. Die resultierende Lösung wird in einen Trenntrichter überführt, der 300 ml destilliertes Wasser enthält. Verdünnte   HCI   (IN) wird 
 EMI20.1 
 wird verworfen und die mit Säure behandelte, organische Phase dreimal nacheinander mit 400 ml-Volumen Wasser gewaschen. Die gewaschene, organische Schicht wird mit einem Teelöffel von Darco G-60 Pulver 15 min gerührt und durch Colite filtriert.

   Die entfärbt, organische Schicht wird über 500 ml destilliertes Wasser placiert 
 EMI20.2 
 alkalische, wässrige Phase wird verworfen und die zurückbleibende, organische Schicht wird zweimal mit 400 mlPortionen Wasser gewaschen. Die gewaschene, organische Schicht wird über Natriumsulfat getrocknet und anschliessend im Vakuum zu einem Volumen von 150 ml konzentriert. Dieses Konzentrat wird mehrere Stunden in einem Abzug stehengelassen. Das kristalline LL-C23024ss wird auf einem Trichter gesammelt, mit kaltem Hexan gewaschen und an der Luft getrocknet. Man erhält 402 mg des kristallinen Salzes von LL-C23024ss. An dieser Probe wurden die mikroanalytischen und ausgewählten spektralen Messungen durchgeführt. 



  Analyse : berechnet für C46H77017Na C   59, 70% ;   H   8. 33% ; 0 29. 46% ;   Asche 2, 49%. C   61. 55 ;   H   8, 79 ;   Asche 3, 31 ; N 0 ; Schmelzpunkt [Fisher-Johns Apparat = 174   (FD-Massenspektrum)   = 924 [a]D26 = +3, 2 in Methanol]. 



  Beispiel 12 Reinigung von LL-C23024 jota
Ein Waters Prep. 500A high performance liquid chromatography instrument   (Flüssigkeitschromatograph)   wird unter einem Druck von 34, 48 bar mit einer Silikagelpatrone beladen. Die Charge, bei welcher es sich um 5, 0 g des Rohmaterials von Beispiel 3 handelt, wird in 50 ml   Heptan : Äthylacetat (45 : 55)   aufgelöst und auf die Säule von Silikagel injiziert. Die Säule wird anschliessend mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch bei einer Flussrate von 200   ml/min   entwickelt, wobei vierzig 200 mI-Fraktionen aufgefangen werden. Die Fraktionen 21 bis 32 werden kombiniert, zu einem Rückstand konzentriert, mit Hexan verrieben und   eingedampft.   Man erhält reines LL-C23024 jota.

   Das obige Verfahren wird viermal wiederholt, wobei man eine kombinierte Gesamtmenge von 280 mg amophes LL-C23024 jota   erhält.   



    Eine 90 mg-Portion des amorphen LLC23024 jota wird in 10 ml Diäthyläther aufgelöst, mit 10 ml Wasser vermischt und mit 0, IN Chlorwasserstoffsäure auf pH 2, 5 eingestellt. Die Ätherschicht wird mit Wasser   gewaschen, mit   O, IN Natriumhydroxid   auf etwa pH 11 eingestellt, abgetrennt und wiederum mit Wasser gewaschen. Die   Ätherphace wird   über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und zu einem Rückstand konzentriert. 



  Eine Lösung dieses   Rückstands   in Äther-Hexan wird langsam eindampfen gelassen, wobei man einen amorphen, weissen Feststoff erhält Dieser amorphe, weisse Feststoff hat folgende Eigenschaften. 



  Elementaranalyse : C   61, 79% ;   H 8, 84% ; Asche   0, 32% ; [Alpha]D26   = +27 (C   0, 724, Methanol) ;     Felddesorpúonsmassenspektroskopie : (M+Na) +   = m/e 953, das berechnete Molekulargewicht beträgt daher 930.

Claims (1)

  1. PATENTANSPRÜCHE 1. Biologisch reine Kultur von Actinomadura yumaense sp. nov. NRRL 12515, welche fähig ist, Fermentation in einem flüssigen Nährmedium, enthaltend assimilierbare Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganischen Salzen, die Antibiotika LL-C23024A] pha, ss und jota in isolierbaren Mengen zu bilden.
    2. Biologisch reine Kultur des Mikroorganismus Actinomadura yumaense sp. nov. NRRL 12515 nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus spontan in der Weise mutiert ist, dass der EMI21.1 C23024A1pha, ss und jota behalten hat.
    3. Biologisch reine Kultur des Mikroorganismus Actinomadura yuaense sp. nov. NRRL 12515 nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus mutagenen Mitteln ausgesetzt worden ist, so dass der Mikroorganismus genetisch verändert ist, jedoch nach wie vor die Fähigkeit behalten hat die Antibiotika LL- C23024A1pha, ss und jota zu synthetisieren.
    4. Verfahren zur Herstellung der neuen Antibiotika LL-C23024A1plha, ss und jota, dadurch gekennzeichnet, dass man Actinomadura yumaense sp. nov. NRRL 12515 oder eine Mutante desselben in einem flüssigen Medium, enthaltend assimilierbare Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze, aerob fermentiert, bis die Fermentationsbrühe eine wesentliche antibiotische Aktivität aufweist, und anschliessend das Antibiotikum von derselben isoliert.
    5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur der Fermentationskultur während eines Zeitraumes von 24 bis 150 Stunden bei 25 bis 35 C gehalten wird.
    6. Verfahren zur Bekämpfung von Nematoden bei warmblütigen Tieren und im Erdboden, enthaltend die Nematoden, dadurch gekennzeichnet, dass man eine nematocid wirksame Menge einer Verbindung LL- C23024AIpha oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes der Verbindung oder Salze oder Fermentationsbrühen oder Festkörper der geernteten Maische, aus der das nematocide Antibiotikum erhalten wird, den Tieren oral verabreicht oder auf den mit Nematoden verseuchten Erdboden aufbringt.
    7. Verfahren zur Bekämpfung von Coccidiosis-Infektionen bei Geflügel, dadurch gekennzeichnet, dass man dem Geflügel einen essbaren Träger und 0, 000025 bis 0, 06 Gew.-% des Antibiotikums LL-C23024Alpha oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz desselben, insbesondere ein nach dem Verfahren des Anspruchs 4 hergestelltes Antibiotikum oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz desselben, verabreicht
AT0386982A 1981-10-22 1982-10-21 Biologisch reine kultur von actinomadura yumaense sp. nov. nrrl 12515 sowie verfahren zur herstellung der neuen antibiotika ll-c23024alpha, beta und jota, zur bekaempfung von nematoden und zur bekaempfung von coccidiosis-infektionen AT388564B (de)

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