DE3509949C2 - Verbindungen und deren Verwendung zur Behandlung von Protozoeninfektionen - Google Patents
Verbindungen und deren Verwendung zur Behandlung von ProtozoeninfektionenInfo
- Publication number
- DE3509949C2 DE3509949C2 DE3509949A DE3509949A DE3509949C2 DE 3509949 C2 DE3509949 C2 DE 3509949C2 DE 3509949 A DE3509949 A DE 3509949A DE 3509949 A DE3509949 A DE 3509949A DE 3509949 C2 DE3509949 C2 DE 3509949C2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- antibiotic
- animals
- compounds
- nrrl
- compound
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D491/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00
- C07D491/12—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00 in which the condensed system contains three hetero rings
- C07D491/16—Peri-condensed systems
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
- A23K20/10—Organic substances
- A23K20/195—Antibiotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
- A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
- C12P17/188—Heterocyclic compound containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen atoms and oxygen atoms as the only ring heteroatoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/03—Actinomadura
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Obesity (AREA)
- Hematology (AREA)
- Virology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Fodder In General (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
- Feed For Specific Animals (AREA)
Description
Die Erfindung betrifft den Gegenstand der Patentansprüche.
Für die fleischerzeugende Industrie stellt die Kokzidiose
als eine durch Protozoen ausgelösten, parasitären Erkrankungen
eine bedeutende Plage dar. Bei der Geflügelindustrie
ist die Kokzidiose für bedeutend größere Verluste
verantwortlich als irgendeine andere durch Protozoen ausgelöste
Erkrankung. Die Kokzidiose ist gleichfalls verantwortlich
für wesentliche wirtschaftliche Verluste bei
einer großen Vielzahl von landwirtschaftlichen Nutzieren,
Haustieren und wildlebenden Tieren.
Die Erkrankung wird verursacht durch Protozoenparasiten,
welche die Wirt-Tiere infizieren. Die infizierten Tiere
verlieren an Gewicht, vermindern ihre Futterverwertung
und in vielen Fällen führt die Krankheit zum Tod. Beim
Geflügel sind diese Protozoenparasiten im allgemeinen von
der Gattung Eimeria. Bisher hat man sechs Species als
Hauptverursacher für die Erkrankung bei Geflügel festgestellt.
Bei diesen sechs Species handelt es sich um
Eimeria tenella, Eimeria necatrix, Eimeria mivati,
Eimeria maxima, Eimeria brunetti und Eimeria acervulina.
Kokzidiose ist zwar bereits seit vielen Jahren als eine
der wichtigsten Erkrankungen bekannt, mit denen die
fleischerzeugende Industrie konfrontiert ist. Dennoch
steht bisher kein vollständig zufriedenstellendes Verfahren
zur Bekämpfung der Erkrankung zur Verfügung.
Es ist somit Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Verbindungen
für die Bekämpfung von Protozoeninfektionen bei warmblütigen
Tieren, insbesondere fleischerzeugenden Tieren, wie Geflügel,
Schweinen, Rindern, Kaninchen und Schafen, zur Verfügung zu
stellen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch die in den
Patenansprüchen gekennzeichneten Verbindungen LL-D42067α und
LL-D42067β, NRRL 15734.
Die Verbindungen eignen sich für die wirksame Bekämpfung, Behandlung,
Verminderung, Verhinderung, Besserung oder Heilung von Protozoeninfektionen
bei landwirtschaftlichen Nutztieren,
Haus- oder Streicheltieren sowie jagdbaren Wildtieren,
insbesondere bei fleischerzeugenden Tieren, wie Geflügel,
Rindern, Schafen, Schweinen und Kaninchen, sowie Haustieren,
wie Kaninchen, Hunden und Katzen.
Das mit LL-D42067α, NRRL 15734, bezeichnete Antibiotikum
hat folgende Strukturformel:
Das mit LL-D42067β, NRRL 15734, bezeichnete Antibiotikum
hat folgende Strukturformel:
Im folgenden werden die Zeichnungen kurz erläutert; es
zeigen:
Fig. I charakteristische UV-Absorptionsspektren
der mit LL-D42067α, NRRL 15734, bezeichneten Verbindung;
Fig. II ein charakteristisches IR-Absorptionsspektrum
der mit LL-D42067α, NRRL 15734, bezeichneten
Verbindung;
Fig. III ein charakteristisches ¹H-NMR-Spektrum
der mit LL-D42067α, NRRL 15734, bezeichneten Verbindung
in CDCl₃-Lösung;
Fig. IV ein charakteristisches ¹³C-NMR-Spektrum
der mit LL-D42067α, NRRL 15734, bezeichneten Verbindung
in DMSO-Lösung;
Fig. V eine charakteristische Zuordnung der chemischen
Verschiebung von ¹H zu ¹³C bei der mit LL-D42067α,
NRRL 15734, bezeichneten Verbindung in DMSO-Lösung;
Fig. VI charakteristische UV-Absorptionsspektren
der mit LL-D42067β, NRRL 15734, bezeichneten Verbindung;
Fig. VII ein charakteristisches IR-Absorptionsspektrum
der mit LL-D42067β, NRRL 15734, bezeichneten
Verbindung;
Fig. VIII ein charakteristisches ¹H-NMR-Spektrum
der mit LL-D42067β, NRRL 15743, bezeichneten Verbindung
in CDCl₃-Lösung;
Fig. IX ein charakteristisches ¹³C-NMR-Spektrum
der mit LL-D42067β, NRRL 15734, bezeichneten Verbindung
in CD₃OD/CDCl₃-Lösung.
Es wurde festgestellt, daß die oben erwähnten Antibiotika
besonders wirksam sind bei der Bekämpfung von Kokzidiose,
verursacht durch Eimeria-Species bei fleischerzeugenden
Tieren, und zwar insbesondere bei Geflügel, wie Hühnchen,
Truthähnen, Enten, Gänsen, Wachteln und Fasanen,
sowie bei Rindern, Schafen, Schweinen und Kaninchen.
Man kann ferner davon ausgehen, daß die erfindungsgemäßen
antibiotischen Mittel wirksam sind bei der Bekämpfung
von Malaria, Toxoplasmose und Sarcosporidiosis bei warmblütigen
Tieren, da die Verursacher dieser Erkrankungen
ebenfalls Protozoeninfektionen sind und mit Eimeria biologisch
verwandt sind.
Die praktische Durchführung der vorliegenden Erfindung
umfaßt das Verfahren der Verhinderung, Bekämpfung oder
Behandlung von Protozoeninfektionen, wie Kokzidiose, bei
warmblütigen Tieren durch die Verabreichung einer prophylaktisch,
pharmazeutisch oder therapeutisch wirksamen
Menge der mit LL-D42067α oder LL-D42067β, NRRL 15734,
bezeichneten antibiotischen Verbindung oder eines pharmazeutisch
und pharmakologisch akzeptablen Salzes derselben.
Die Verabreichung der Verbindung zur Behandlung von
Kokzidiose erfolgt im allgemeinen aus Praktikabilitätsgründen
im oder zusammen mit dem Futter oder im Trinkwasser.
Die oben erwähnte Verbindung oder ein pharmazeutisch
und pharmakologisch akzeptables Salz derselben
kann jedoch auch den einzelnen zu behandelnden Tieren
in Form von Tabletten, Mitteln zum Einflößen, Gelen,
Kapseln oder dergl. oder durch Injektion in Form einer
Paste, eines Gels, einer Kapsel oder Lösung verabreicht
werden. Selbstverständlich sind die zuletzt genannten
Verfahren der Verabreichung für die Behandlung großer
Gruppen von Tieren weniger praktikabel. Sie sind jedoch
für die Anwendung bei einer geringen Anzahl oder bei einzelnen
Tieren durchaus praktisch anwendbar.
Falls die Antibiotika LL-D42067α oder LL-D42067β als
prophylaktische oder therapeutische Behandlungsmittel
gegen Kokzidiose bei Geflügel angewendet werden, so sind
im allgemeinen Mengen von etwa 0,1 TpM bis 10,0 TpM, vorzugsweise
0,5 bis 3,0 TpM, der Antibiotika LL-D42067α
oder LL-D42067β, verabreicht in der Nahrung oder im
Trinkwasser des Geflügels, wirksam zur Verhinderung, Bekämpfung
oder Inhibierung von Kokzidiose bei den Tieren.
Wie bereits zuvor angedeutet, können die Antibiotika
LL-D42067α oder LL-D42067β oder ein pharmazeutisch und
pharmakologisch akzeptables Salz derselben auch als ein
prophylaktisches, pharmazeutisches oder therapeutisches
Behandlungsmittel verwendet werden zur Bekämpfung, Verhinderung
oder Inhibierung von Protozoeninfektionen bei
anderen warmblütigen Tieren, wie Rindern, Schafen und
Schweinen. Im allgemeinen sind Mengen von etwa 1,0 bis
100 TpM und vorzugsweise 5 bis 50 TpM des Antibiotikums
wirksam zur Bekämpfung von Protozoeninfektionen, wie
Kokzidiose, bei diesen größeren Tieren.
Mit Medikamenten versehene Geflügelfuttermittel, die für
das erfindungsgemäße Verfahren brauchbar sind, werden im
allgemeinen hergestellt, indem man etwa 0,0001 Gew.-% bis
etwa 0,0005 Gew.-% des Antibiotikums LL-D42067α oder LL-
D42067β zusammen mit einem nährstoffmäßig ausgewogenen
Geflügelfutter vermischt, z. B. mit dem in den nachfolgenden
Beispielen beschriebenen Kükenfutter.
Mit Medikamenten versetzte Futtermittel für Rinder, Schafe
oder Schweine können auf die gleiche Weise hergestellt
werden, wie es oben für das Geflügelfutter beschrieben
wurde. In diesem Falle werden jedoch 0,0001 bis 0,01 Gew.-%
der antibiotischen Substanz mit dem Rinder-, Schaf- oder
Schweinefutter vermischt.
Falls man die erfindungsgemäße Verbindung zur Verhinderung
oder Bekämpfung von Kokzidiose verwendet, wird das wirksame
Anti-Kokzidiosemittel im allgemeinen zunächst als
Tierfutter-Premix hergestellt. Das Premix enthält im allgemeinen
das Anti-Kokzidiosemittel in einem relativ hohen
Prozentanteil und wird im allgemeinen mit dem Tierfutter
erst unmittelbar vor der Verabreichung vermischt. Das
Futter-Premix kann gewünschtenfalls auch als Lockfutterüberzug
auf die Tagesration der Tiere aufgestreut werden.
Futter-Premixe oder -Konzentrate, die bei der praktischen
Durchführung der vorliegenden Erfindung brauchbar sind,
können hergestellt werden, indem man etwa 0,1 bis 5,0 Gew.-%
des oben identifizierten Antibiotikums oder eines pharmazeutisch
und pharmakologisch akzeptablen Salzes desselben
mit etwa 99,9 bis 95 Gew.-% eines geeigneten Trägermaterials
oder Verdünnungsmittels vermischt. Geeignete Trägermaterialien,
die zur Herstellung von Futterzusatzmitteln
Anwendung finden, umfassen beispielsweise die folgenden:
Alfalmehl, Sojabohnenöl, Baumwollsaatölmehl, Leinsaatölmehl, Natriumchlorid, Calciumcarbonat, Calciumsulfat, Maismehl, Zuckerrohrmelasse, Harnstoff, Knochenmehl, Maiskolbenmehl, Reisspelzenmehl und dergl. Das Trägermaterial fördert eine im wesentlichen einheitliche Verteilung des Wirkstoffs in dem fertigen Futter, dem das Zusatzmittel zugemischt wird. Es übt somit eine wichtige Funktion aus, indem es eine zweckentsprechende Verteilung des Wirkstoffs, d. h. etwa 0,1 bis 100 TpM desselben, über das gesamte Futter gewährleistet. Diese Menge entspricht 0,00001 bis 0,01 Gew.-% des Wirkstoffs in dem fertigen Futter. In der Praxis werden im allgemeinen ein oder mehrere Pfund Premix/t Futtermittel zugesetzt, um das gewünschte Niveau des Antibiotikums im fertigen Futter zu erhalten.
Alfalmehl, Sojabohnenöl, Baumwollsaatölmehl, Leinsaatölmehl, Natriumchlorid, Calciumcarbonat, Calciumsulfat, Maismehl, Zuckerrohrmelasse, Harnstoff, Knochenmehl, Maiskolbenmehl, Reisspelzenmehl und dergl. Das Trägermaterial fördert eine im wesentlichen einheitliche Verteilung des Wirkstoffs in dem fertigen Futter, dem das Zusatzmittel zugemischt wird. Es übt somit eine wichtige Funktion aus, indem es eine zweckentsprechende Verteilung des Wirkstoffs, d. h. etwa 0,1 bis 100 TpM desselben, über das gesamte Futter gewährleistet. Diese Menge entspricht 0,00001 bis 0,01 Gew.-% des Wirkstoffs in dem fertigen Futter. In der Praxis werden im allgemeinen ein oder mehrere Pfund Premix/t Futtermittel zugesetzt, um das gewünschte Niveau des Antibiotikums im fertigen Futter zu erhalten.
Falls das Zusatzmittel oder Premix als Lockfutter auf das
eigentliche Futter aufgestreut wird, so wird auf diese
Weise gleichfalls eine einförmige Verteilung des Wirkstoffs
über das bestreute Futter gewährleistet.
Da die erfindungsgemäßen Verbindungen und ihre pharmazeutisch
und pharmakologisch akzeptablen Salze in Wasser relativ
schwer löslich sind, ist es im allgemeinen erwünscht,
die Wirkstoffe in einem organischen Lösungsmittel,
wie Methanol, Ethanol, Aceton, DMSO, Ölsäure, Linolsäure,
Propylenglykol oder dergl., aufzulösen, falls die
Verbindungen über das Trinkwasser der Tiere verabreicht
werden sollen. Die Lösung wird zweckentsprechenderweise
mit einer geringen Menge eines oberflächenaktiven Mittels
und/oder eines Dispersionsmittels vermischt, um eine
Auflösung und/oder Dispersion des Wirkstoffs im Trinkwasser
der Tiere zu gewährleisten.
Falls die Behandlung einer kleinen Zahl von größeren
fleischerzeugenden Tieren zur Bekämpfung von Protozoeninfektionen
erforderlich ist, kann man das Antibiotikum
LL-D42067α oder LL-D42067β oder ein pharmazeutisch oder
pharmakologisch akzeptables Salz davon vorteilhafterweise
den Tieren oral verabreichen, z. B. täglich in Form
eines medikamentierten Gels.
Das medikamentierte Gel kann hergestellt werden, indem
man eine medikamentierte Geliermittelphase mit einer
wäßrigen Pufferphase unter vermindertem Druck von 25
bis 50 mmHg bei Umgebungstemperatur von 20 bis 60°C vermischt.
Das Geliermittel wird hergestellt, indem
man etwa 0,004 bis etwa 4,5 Gew.-%, bezogen auf die Endzusammensetzung,
des Antibiotikums LL-D42067α oder LL-
D42067β oder eines pharmazeutisch oder pharmakologisch
akzeptablen Salzes davon in 14 bis 31 Gew.-% Propylenglykol, bezogen
auf die Endzusammensetzung, und etwa 15 bis
50 Gew.-% des Geliermittels bei 60 bis 80°C auflöst oder
dispergiert. Alternativ kann die Geliermittelphase auch
vollständig bei Umgebungstemperatur hergestellt werden,
wie nachfolgend beschrieben.
Die Geliermittelphase kann hergestellt werden, indem man
0,004 bis etwa 4,5 Gew.-% des Antibiotikums LL-D42067α
oder LL-D42067β oder ein pharmazeutisch oder pharmakologisch
akzeptables Salz davon zusammen mit dem Geliermittel
(15 bis 50 Gew.-%, vorzugsweise 15 bis 35 Gew.-% der
Formulierung) in Propylenglykol (14 bis 30 Gew.-% der
Formulierung) während 15 min bis 1 h unter vermindertem
Druck von 25 bis 50 mmHg bei Zimmertemperatur aufschlämmt.
Bei dem gewählten Geliermittel handelt es sich um ein
nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel mit der Struktur
eines α-Hydro-Ω-hydroxy-poly(oxyethylen)-poly(oxypropylen)-
poly-(oxyethylen)-Blockcopolymeren, durchschnittliches
Molekulargewicht 12 500; Fp. 56°C; Brookfield-
Viskosität 3100 bei 77°C; Oberflächenspannung einer
0,1%igen wäßrigen Lösung 40,6 dyn/cm (gemessen mit
einem du Nouy-Tensiometer).
Eine wäßrige Pufferlösung kann hergestellt werden, indem
man 1,5 Gew.-% Citronensäure und 1,0 Gew.-% Trinatriumcitrat
in etwa 3 bis etwa 25 Gew.-%, vorzugsweise 6 bis
12 Gew.-%, bezogen auf die Endzusammensetzung, entsalztem
oder destilliertem Wasser auflöst, das in Mengen von etwa
15 bis etwa 50 Gew.-% und vorzugsweise 35 bis 45 Gew.-% der
Formulierung verwendet wird. Mit dieser gepufferten Lösung
wird ein pH-Bereich geschaffen, in dem die chemische
Stabilität der Komponenten der Gelformulierung während
einer langen Zeit erreicht wird, d. h. ein pH von 3
bis 3,5.
Fakultative Komponenten, die der obigen Lösung in dieser
Stufe einverleibt werden können, umfassen:
- (a) Benzylalkohol, den man in Mengen von etwa 0,5 bis etwa 1,5 Gew.-% und vorzugsweise 1,5 Gew.-%, bezogen auf die Formulierung, als antimikrobiellen Konservierungsstoff zusetzen kann;
- (b) den gelben Farbstoff C. I. Acid yellow Nr. 23 [Tartrazin; F. D und C yellow Nr. 5; 4,5-Dihydro-5-oxo- 1-(4-sulfophenyl)-4-[(sulfophenyl)-azo]-1H-pyrazol-3- carbonsäure-trinatriumsalz], der als Farbstoff in Mengen von etwa 0,01 bis etwa 0,03 Gew.-% und vorzugsweise 0,01 Gew.-% der Formulierung verwendet wird;
- (c) ein Antischäummittel, umfassend ein Gemisch von Dimethylpolysiloxanen der Struktur: und Silikagel, wobei der berechnete Durchschnittswert von m 200 bis 350 beträgt. Bei dem Gemisch handelt es sich um eine wasser-weiße, viskose, ölartige Flüssigkeit; d = 0,965 bis 0,970; nD²⁵ etwa 1,404; Viskosität etwa 60 000 cSt. Das Mittel wird in Mengen von 0,001 bis 0,02 Gew.-% und vorzugsweise 0,2 Gew.-% der Formulierung verwendet.
Das medikamentierte Gel wird hergestellt, indem man eine
der oben erwähnten Geliermittelphasen und die wäßrige
Lösung eine halbe bis zwei Stunden unter vermindertem
Druck von 10 bis 100 mmHg, vorzugsweise 25 bis 50 mmHg,
bei Umgebungstemperaturen von 20 bis 60°C vermischt. Es
ist dabei nicht erforderlich zu erhitzen oder abzukühlen.
Bei dieser Verfahrensweise erhält man ein luftfreies Gel,
mit dem genaue Dosismengen des Antikokzidiums nach dem
Volumen verabreicht werden können. Falls eine genaue
Steuerung der Dosismenge des zu verabreichenden Wirkstoffs
nach Volumen nicht erforderlich ist und falls die
Gegenwart von Luft in dem Gel bei der Endzusammensetzung
akzeptierbar ist, kann man die Herstellung auch bei einem
Druck bis einschließlich atmosphärischem Druck durchführen.
Nach der obigen Verfahrensweise kann ein typisches erfindungsgemäßes
Gel hergestellt werden, indem man 4,5 g des
Antibiotikums LL-D42067α (oder 4,5 g des Antibiotikums
LL-D42067β), 1,5 g Citronensäure-monohydrat, 1,0 g Natriumcitrat-
dihydrat, 1,5 g Benzylakohol und 0,01 g des
gelben Farbstoffs C. I. Acid yellow Nr. 23 in 42 g Wasser
auflöst. Dann wird eine Lösung des obigen Geliermittels
(28 g) in 21,99 g Propylenglykol hergestellt durch Vermischen
bei 60°C. Die Lösungen werden anschließend miteinander
vermischt, und zwar bei 25 bis 50 mmHg, bis eine
homogene Mischung erhalten wird. Das Vermischen erfolgt
bei 20 bis 60°C ohne zusäztliches Erhitzen oder Kühlen.
Das gebildete Gel hat einen Geliertemperaturbereich von
-15 bis -18°C. Die Viskosität des Gels ist 0,51 × 10⁶ cSt.
und das Wasser/Geliermittel-Verhältnis beträgt 1,5/1,0.
Wenn man 6,3 g dieses medikamentierten Gels einem
200 Pfund (90,8 kg)-Maststier täglich verabreicht, so erhält
der Stier ungefähr 3 mg/kg Körpergewicht/Tag des
protozoacidisch-wirksamen Antibiotikums LL-D42067α oder
des Antibiotikums LL-D42067β.
In der Praxis haben sich im allgemeinen etwa 0,03 mg/kg/
Tag bis etwa 3,0 mg/kg/Tag als wirksam erwiesen zur Bekämpfung
von Protozoeninfektionen bei Rindern, Schafen
und Schweinen. Für kleinere Haustiere können Mengen bis
hinab zu 0,003 mg/kg Körpergewicht/Tag angewendet werden.
Die Struktur von LL-D42067α wurde durch Röntgenstrahl-
Kristallographie aufgeklärt. Die relative Stereochemie
dieser Verbindung ist nachstehend dargestellt.
Die Struktur von LL-D42067β wurde ebenfalls durch Röntgenstrahl-
Kristallographie aufgeklärt. Die relative Stereochemie
dieser Verbindung ist folgendermaßen.
Die physico-chemischen Eigenschaften von LL-D42067α werden
nachstehend angegeben.
- (1) Molekulargewicht: 535 (FAB-MS);
- (2) Summenformel: C₂₈H₂₅NO₁₀;
- (3) spezifische optische Drehung; [α] = +836 ± 40° (c = 0,3, DMF);
- (4) UV-Absorptionsspektren: gemäß Fig. I
- (5) IR-Absorptionsspektrum: gemäß Fig. II, (KBr-Scheibe): 1650, 1598, 1543, 1470, 1440, 1260, 1195, 1020 cm-1;
- (6) ¹H-NMR-Spektrum (CDCl₃): wie in Fig. III gezeigt und in Tabelle I beschrieben;
- (7) ¹³C-NMR-Spektrum (DMSO): wie in Fig. IV gezeigt und in Tabelle II beschrieben; und
- (8) Zuordnung der chemischen Verschiebung von ¹H zu ¹³C (DMSO) gemäß Fig. V.
Die physico-chemischen Eigenschaften von LL-42067β sind
wie folgt:
- (1) Molekulargewicht: 521 (FAB-MS);
- (2) Summenformel: C₂₇H₂₃NO₁₀;
- (3) spezifische optische Drehung: [α] = +770 ± 10° (c = 0,165, DMF);
- (4) UV-Absorptionsspektren: gemäß Fig. VI
- (5) IR-Absorptionsspektrum: gemäß Fig. VII, (KBr-Scheibe: 3400, 1646, 1620, 1545, 1463, 1252, 1195, 1020 cm-1;
- (6) ¹H-NMR-Spektrum (CDCl₃): wie in Fig. VIII gezeigt und in Tabelle III beschrieben;
- (7) ¹³C-NMR-Spektrum (CD₃OD/CDCl₃): wie in Fig. IX gezeigt
und in Tabelle IV beschrieben.
Die gegen Protozoen wirksamen Verbindungen der vorliegenden
Erfindung, bezeichnet als LL-D42067α und LL-D42067β,
werden gebildet, wenn man unter kontrollierten Bedingungen
einen neuen Stamm einer neuen Subspecies von Actinomadura
madurae kultiviert. Die neuen Stämme werden in
einer Kultursammlung der Medical Research Division,
American Cyanamid Company, Pearl River, New York, als Kultur
Nr. LL-D42067α und LL-D42067β gehalten. Lebensfähige
Kulturen dieses neuen Mikroorganismus wurden hinterlegt
bei Patent Culture Collection Laboratory, Northern
Regional Research Center, U.S. Department of Agriculture,
Peoria, Illinois 61604, und wurden deren permanenter Sammlung
einverleibt. Die Stämme sind der Öffentlichkeit bei
dieser Hinterlegungsstelle unbeschränkt zugänglich unter
ihrer Hinterlegungsnummer NRRL 15734.
Die Kulturen LL-D42067α und LL-D42067β wurden aus einer
Bodenprobe von San Simao, Brasilien, isoliert. Die Kulturen
wurden taxonomisch charakterisiert und als eine
neue Subspecies von Actinomadura madurae identifiziert.
Sie werden als Actinomadura madurae Subspecies simaoensis
bezeichnet.
Die kulturellen, physiologischen und morphologischen
Merkmale der Kultur wurden nach Standardverfahren untersucht,
wie sie beschrieben sind von Shirling und Gottlieb
[Intern. J. System. Bacteriol., 16, 313-340 (1966)] und
Gordon et al. [Intern J. System. Bacteriol., 24, 54-63
(1974)]. Die chemische Zusammensetzung der Zellwände dieser
Kulturen wurde bestimmt nach einem Verfahren von
Lechevalier et al. [Adv. Appl. Microbiol., 14, 47-72 (1971)].
In den nachfolgenden Tabellen V bis VII sind die Einzelheiten
angegeben. Eine allgemeine Beschreibung der Kulturen
erfolgt nachstehend. Die unterstrichenen, beschreibenden
Farben wurden entnommen aus Kelly und Judd [Nat.
Bur. Stand., Spec. Publ., 440 (1976)] und dem zugehörigen
Intersociety Color Council, National Bureau of Standards
Centroid Color Charts.
Wachstumscharakteristika:
Tabelle V beschreibt die Wachstumscharakteristika von Kulturen LL-D42067 auf verschiedenen Agarmedien. Diese wurden ausgewählt unter solchen, wie sie vom International Streptomyces Project Committee (im folgenden als ISP bezeichnet) empfohlen wurden.
Tabelle V beschreibt die Wachstumscharakteristika von Kulturen LL-D42067 auf verschiedenen Agarmedien. Diese wurden ausgewählt unter solchen, wie sie vom International Streptomyces Project Committee (im folgenden als ISP bezeichnet) empfohlen wurden.
Mikromorphologie:
Die mikroskopische Untersuchung des Stamms ergab, daß er kurze Ketten von Conidien auf Lufthyphen bildet, die geringfügig verhakt sind mit kurzen Spiralen (bis zu drei Windungen). Die Sporenoberflächen sind glatt, wenn sie mit dem Elektronenmikroskop beobachtet werden. Damit unterscheidet sich dieses Isolat von A. verrucosopora.
Die mikroskopische Untersuchung des Stamms ergab, daß er kurze Ketten von Conidien auf Lufthyphen bildet, die geringfügig verhakt sind mit kurzen Spiralen (bis zu drei Windungen). Die Sporenoberflächen sind glatt, wenn sie mit dem Elektronenmikroskop beobachtet werden. Damit unterscheidet sich dieses Isolat von A. verrucosopora.
Zellwandzusammensetzung:
Die Gesamtzellanalysen zeigen, daß der Stamm Mesodiaminopimelinsäure (DAP) sowie den Zucker 3-O-Methyl-D-galactose (Madurose) enthält. Damit gehört der Stamm zum Gesamtzellmuster Typ B. Die Zellwandzusammensetzung ist vom Typ III (meso-DAP, Glutaminsäure, Alanin, Muraminsäure und Glucosamin). Das Phospholipid- Muster ist vom Typ PIV (Phosphatidyl-ethanolamin und/oder Methylethanolamin plus unbekannte, Glucosamin-haltige Phospholipide). Aufgrund dieser Daten rechtfertigt sich die Zuordnung des Stamms zur Gattung Actinomadura. Der PIV-Phospholipid-Typ ist für A. madurae nicht typisch. Gewöhnlich wird PI beobachtet.
Die Gesamtzellanalysen zeigen, daß der Stamm Mesodiaminopimelinsäure (DAP) sowie den Zucker 3-O-Methyl-D-galactose (Madurose) enthält. Damit gehört der Stamm zum Gesamtzellmuster Typ B. Die Zellwandzusammensetzung ist vom Typ III (meso-DAP, Glutaminsäure, Alanin, Muraminsäure und Glucosamin). Das Phospholipid- Muster ist vom Typ PIV (Phosphatidyl-ethanolamin und/oder Methylethanolamin plus unbekannte, Glucosamin-haltige Phospholipide). Aufgrund dieser Daten rechtfertigt sich die Zuordnung des Stamms zur Gattung Actinomadura. Der PIV-Phospholipid-Typ ist für A. madurae nicht typisch. Gewöhnlich wird PI beobachtet.
Physiologische Reaktionen:
Die physiologischen Reaktionen der Stämme LL-D42067α und LL-D42067β wurden untersucht, und zwar sowohl nach dem ISP-System, Shirling und Gottlieb [Intern. J. Syst. Bacteriol., 16, 313-340 (1974)], als auch mit den Gordon-Tests, Gordon et al. [Intern. J. Syst. Bacteriol., 24, 54-63 (1974)]. In der Tabelle VI ist das Nutzungsmuster des Stamms auf ISP- Kohlenhydratmedien angegeben, zusammen mit den Mustern anderer Mitglieder der Gattung, welche ähnlich reagieren. Die Kultur LL-D42067 ähnelt den Actinomadura madurae- und Actinomadura verrucosopora-Gruppen. Wie oben angegeben, unterscheidet sie sich jedoch von Actinomadura verrucosopora darin, daß sie glatte Sporenwände aufweist. Ein Vergleich der Reaktionen bei der Gordon-Testserie von Actinomadura madurae (Gordon's Werte; siehe obige Literaturstelle) und LL-D42067, wie in Tabelle VII zusammengefaßt, zeigt an, daß Unterschiede lediglich hinsichtlich der Amylase-Produktion und der Säure aus Glycerin und Raffinose bestehen. Da man festgestellt hat, daß die Amylase-Produktion und die Raffinose-Nutzung bei Actinomadura madurae variieren [N. Goodfellow et al., J. Gen. Microbiol., 112, 95-111 (1979)], bleibt die Glycerin- Reaktion das einzige physiologische Unterscheidungsmerkmal, mit dem sich LL-D42067 von diesem Taxon unterscheidet.
Die physiologischen Reaktionen der Stämme LL-D42067α und LL-D42067β wurden untersucht, und zwar sowohl nach dem ISP-System, Shirling und Gottlieb [Intern. J. Syst. Bacteriol., 16, 313-340 (1974)], als auch mit den Gordon-Tests, Gordon et al. [Intern. J. Syst. Bacteriol., 24, 54-63 (1974)]. In der Tabelle VI ist das Nutzungsmuster des Stamms auf ISP- Kohlenhydratmedien angegeben, zusammen mit den Mustern anderer Mitglieder der Gattung, welche ähnlich reagieren. Die Kultur LL-D42067 ähnelt den Actinomadura madurae- und Actinomadura verrucosopora-Gruppen. Wie oben angegeben, unterscheidet sie sich jedoch von Actinomadura verrucosopora darin, daß sie glatte Sporenwände aufweist. Ein Vergleich der Reaktionen bei der Gordon-Testserie von Actinomadura madurae (Gordon's Werte; siehe obige Literaturstelle) und LL-D42067, wie in Tabelle VII zusammengefaßt, zeigt an, daß Unterschiede lediglich hinsichtlich der Amylase-Produktion und der Säure aus Glycerin und Raffinose bestehen. Da man festgestellt hat, daß die Amylase-Produktion und die Raffinose-Nutzung bei Actinomadura madurae variieren [N. Goodfellow et al., J. Gen. Microbiol., 112, 95-111 (1979)], bleibt die Glycerin- Reaktion das einzige physiologische Unterscheidungsmerkmal, mit dem sich LL-D42067 von diesem Taxon unterscheidet.
Da der Stamm LL-D42067 hinsichtlich aller untersuchten
Eigenschaften mit Ausnahme seiner Glycerin-Reaktionen
und seines PIV-Phospholipid-Musters Actinomadura madurae
gleicht, wurde der Stamm dem Taxon Actinomadura madurae
als eine Subspecies zugeordnet und als Actinomadura
madurae Subspecies simaoensis bezeichnet.
Hinsichtlich der Herstellung dieses neuen, bakteriellen
und antiparasitären Mittels ist die vorliegende Erfindung
nicht auf die vorstehenden spezifischen Organismen
beschränkt oder auf Organismen, die den oben angegebenen
Wachstumscharakteristika und mikroskopischen Charakteristika
vollständig entsprechen. Diese Eigenschaften sind
lediglich zum Zwecke der Erläuterung angegeben. Von der
Erfindung umfaßt ist die Verwendung von natürlich vorkommenden
Mutanten dieses Organismus sowie von induzierten
Mutanten, die aus diesem Organismus mittels der verschiedenen,
dem Fachmann bekannten mutagenen Mitteln erzeugt
werden können, z. B. durch die Behandlung mit Senfgas
(Stickstoffmustard), Röntgenbestrahlung, UV-Bestrahlung,
N′-Methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidin, Actinophagen
u. dgl. Von der Erfindung umfaßt sind ferner inter-
und intraspezifische, genetische Rekombinanten, die nach
bekannten Gentechniken erzeugt werden können, z. B. durch
Konjugation, Transduktion und Techniken des genetic
engineering.
Das in vitro antimikrobielle Spektrum von LL-D42067β wurde
bestimmt nach dem Agarplatten-Verdünnungsverfahren mit
Mueller-Hinton-Agar. Dabei wurde ein Inokulum des jeweiligen
Testorganismus von etwa 10⁴ koloniebildenden Einheiten
mittels der Steer-Replikationsvorrichtung abgegeben.
Die minimale Hemmkonzentration (MIC) in mcg/ml ist
definiert als die geringste Konzentration an LL-D42067β,
welche das sichtbare Wachstum nach 18stündiger Inkubation
bei 35°C inhibiert.
Die in der nachfolgenden Tabelle VIII zusammengestellten
Ergebnisse zeigen, daß LL-D42067β gegen verschiedene
gram-positive Bakterien wirksam ist und gegenüber Hefen
eine mäßige Wirksamkeit aufweist.
Die Nützlichkeit des Antibiotikums LL-D42067β beruht auf
seiner antibakteriellen und antiparasitären Wirkung. Beispielsweise
kann das Antibiotikum verwendet werden zur
Unterdrückung von intestinaler Bakterienflora, als topisches,
antibakterielles Mittel oder Antiseptikum gegen
gram-positive Bakterien sowie als allgemeines Desinfektionsmittel
für Oberflächen, wie bei Instrumenten. Es
ist ferner brauchbar als Antiprotozoenmittel zur Behandlung
von Malaria. Zusätzlich zu seiner antimikrobiellen
und antiparasitären Wirkung ist LL-D42067β als Antikokzidienmittel
bei Geflügel wirksam.
Bei der therapeutischen Verwendung kann die erfindungsgemäße
Verbindung in Form herkömmlicher, pharmazeutischer
Mittel verabreicht werden, die für den angestrebten Verwendungszweck
geeignet sind. Derartige Mittel können in
der Weise formuliert werden, daß sie sich für orale oder
topische Verabreichung eignen. Der Wirkstoff kann kombiniert
werden mit einem nichttoxischen, pharmazeutisch
akzeptablen Träger und im Gemisch mit diesem vorliegen.
Das Trägermaterial kann je nach der angestrebten Verabreichungsart,
d. h. oral oder topisch, aus einer Vielzahl
verschiedener, bekannter Formen ausgewählt werden.
Die Kultivierung von Actinomadura madurae subsp. simoaensis
NRRL 15734 kann in einer Vielzahl von flüssigen Kulturmedien
durchgeführt werden. Brauchbare Medien für die
Herstellung des neuen Antibiotikums LL-D42067α umfassen
eine assimilierbare Quelle von Kohlenstoff, wie Dextrin,
Saccharose, Melasse, Glycerin, etc.; eine assimilierbare
Quelle von Stickstoff, wie Protein, Proteinhydrolysat,
Polypeptide, Aminosäuren, Maisquellwasser, etc.; sowie
anorganische Anionen und Kationen, wie Kalium, Natrium,
Ammonium, Calcium, Sulfat, Carbonat, Phosphat, Chlorid,
etc. Spurenelemente, wie Bor, Molybdän, Kupfer, etc., werden
in Form von Verunreinigungen anderer Bestandteile des
Mediums zugeführt. Die Belüftung von Tanks und Flaschen
wird bewirkt, indem man sterile Luft durch das fermentierende
Medium durchleitet oder auf dessen Oberfläche
aufträgt. Eine weitere Bewegung in dem Tank erfolgt mittels
eines mechanischen Rührers. Erforderlichenfalls kann
ein Antischäummittel, wie ein Siliconöl, zugesetzt werden.
Das LL-D42067α-Antibiotikum wird aus der Fermentationsbrühe
folgendermaßen isoliert. Zunächst wird durch
Diatomeenerde filtriert. Das Antibiotikum wird in ein
Lösungsmittel, wie Methylenchlorid, extrahiert und durch
Säulenchromatographie an Silikagel gereinigt, wobei das
System Hexan : Ethylacetat (80/20) verwendet wird. Dabei
werden unerwünschte Fette entfernt. Anschließend wird
das System Methylenchlorid : 1% Essigsäure in Methanol
(9 : 1) verwendet, wobei man ein Rohprodukt erhält.
Dieses rohe LL-D42067α wird anschließend mittels einer
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gereinigt, und
zwar an einer Phasenumkehrsäule (reverse phase column)
unter Verwendung des Systems Acetonitril/Wasser/Essigsäure
(600 : 400 : 0,28).
Das Antibiotikum LL-D42067β wird aus der Gesamterntemaische
folgendermaßen gewonnen. Zunächst wird durch ein
Medium, wie Diatomeenerde, filtriert. Dann wird das
Antibiotikum in ein Lösungsmittel, wie Ethylacetat, extrahiert,
zu einem Sirup konzentriert, zwischen Heptan
und Methanol verteilt und die Methanolphase zu einem
Rückstand konzentriert. Dieser Rückstand wird mit
Hexan verrieben, dann zu einem Rückstand konzentriert,
der in einem Gemisch gleicher Teile Acetonitril und
Wasser aufgelöst und nachfolgend eingedampft wird. Dabei
erhält man ein Präzipitat. Dieses wird gereinigt durch
eine präparative Phasenumkehr-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
(HPLC). Dabei wird das System Acetonitril/
Wasser/Essigsäure (3000 : 6000 : 5) verwendet. Die
aktiven Fraktionen werden vereinigt, zu einer wäßrigen
Suspension eingedampft und mit Ethylacetat extrahiert.
Dieses wird abgedampft, wobei man das reine LL-D42067β
erhält.
Ein typisches Medium, das zur Aufzucht des Primär-Inokulums
verwendet wird, wurde gemäß der folgenden Zusammensetzung
hergestellt:
Dieses Medium wird auf pH 7,2 eingestellt und dann sterilisiert.
Eine 100-ml-Portion dieses sterilen Mediums
in einer 500-ml-Flasche wird inokuliert mit abgekratztem
Myzel von einem geneigten Agarmedium (agar slant) von
Actinomadura madurae subsp. simaoensis NRRL 15734. Das Medium
wird dann auf einen Drehschüttler placiert und 48
bis 72 h bei 210 U/min und 28°C heftig geschüttelt. Dieses
Primär-Inokulum wird nachfolgend verwendet, um 12 l
des gleichen sterilen Mediums zu inokulieren, welches
anschließend 48 h bei 28°C gezüchtet wird, um ein Sekundär-
Inokulum zu erhalten.
Es wird ein Fermentationsmedium der folgenden Zusammensetzung
hergestellt:
% | |
Saccharose | |
3,0 | |
Sojamehl | 1,5 |
Maisquellwasser | 0,5 |
Calciumcarbonat | 0,5 |
Wasser q.s. | 100 |
Das Medium wird sterilisiert und in einem Verhältnis von
12 l Sekundär-Inokulum von Beispiel 1 pro 300 l Medium
beimpft. Die Fermentierung wird bei 28°C durchgeführt,
wobei ein steriler Luftstrom von 200 l/l Maische/min
durchgeleitet wird und mittels eines Propellers gerührt
wird, der mit 230 U/min betrieben wird. Nach 135 bis
159 h wird die Maische geerntet und durch Diatomeenerde
filtriert.
Das Fermentationsfiltrat aus drei Fermentierungen, die
gemäß Beispiel 2 durchgeführt wurden, wird vereinigt. Man
erhält auf diese Weise eine Gesamtmenge von 1800 l mit
einem pH von 7,5. Das Filtrat wird mit 900 l Methylenchlorid
extrahiert. Die organische Phase wird im Vakuum
konzentriert, wobei man 84,1 g Rückstand erhält.
Eine 75,2-g-Portion dieses Rückstands wird in 300 ml
Hexan/Ethylacetat (80 : 20) suspendiert. Das Ganze läßt
man in eine Glassäule (2 Zoll × 20 Zoll) einsickern, die
mit Silikagel trocken gepackt ist. Die Säule wird mit
einer Gesamtmenge von 4 l der gleichen Lösungsmittelmischung
eluiert, um Fette und Siliconöl zu entfernen. Anschließend
wird mit 4 l Methylenchlorid/1% Essigsäure in
Methanol (9 : 1) eluiert, wobei man 15-ml-Fraktionen auffängt.
Die Fraktionen werden mittels Dünnschicht-Chromatographie
analysiert. Das Antibiotikum LL-D42067α erscheint
als sichtbarer, gelber Fleck (Rf = 0,5) mit dem
gleichen Lösungsmittelsystem. Die Fraktionen 31 bis 60,
die den größten Teil des Antibiotikums enthalten, werden
zusammengegossen und im Vakuum konzentriert, wobei man
11,1 g eines roten Rückstands erhält.
Eine 5,5-g-Portion des obigen Rückstands wird mittels einer
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie [Prep LC
System-500, Prep PAK-500/C18 Patrone, Acetonitril/Wasser/
Essigsäure (600 : 400 : 0,28), 100 ml/min, 5,5 g/30 ml/Injektion]
fraktioniert. Dreißig 200-ml-Fraktionen werden aufgefangen;
durch Analyse der Fraktionen mittels Hochleistungs-
Flüssigkeitschromatographie-Analyse wird festgestellt,
daß die Hauptmenge an LL-D42067α sich in der
Fraktion 5 befindet. Die Fraktion 5 wird über Nacht stehengelassen.
Die resultierenden, gelben Kristalle werden
gesammelt, indem man die Mutterlauge abdekantiert. Die
Mutterlauge wird aufbewahrt. Die Kristalle werden mit der
mobilen Phase gewaschen und an der Luft getrocknet. Man
erhält 11 mg LL-D42067α in Form gelber Kristalle.
Die Mutterlauge wird durch langsames Eindampfen konzentriert.
Das resultierende Präzipitat wird durch Zentrifugieren
gesammelt, wobei man 377 mg LL-D42067α als gelben,
amorphen Feststoff erhält.
Die analytischen HPLC-Bedingungen sind wie folgt:
Säule: μ Bondapack C18, 3,9 mm × 30 cm, Waters
Associates;
mobile Phase: Acetonitril/Wasser/Essigsäure (400 : 600 : 0,28);
Detektor: UV 254 nm und UV 365 nm, 0,2 AUFS;
Strömungsrate: 1,0 ml/min;
Retentionsvolumen von LL-D42067α: 11,5 ml.
mobile Phase: Acetonitril/Wasser/Essigsäure (400 : 600 : 0,28);
Detektor: UV 254 nm und UV 365 nm, 0,2 AUFS;
Strömungsrate: 1,0 ml/min;
Retentionsvolumen von LL-D42067α: 11,5 ml.
Ein typisches Medium, das zur Aufzucht der verschiedenen
Stufen des Inokulums verwendet wird, wurde gemäß der
folgenden Rezeptur hergestellt:
Dieses Medium wird sterilisiert. Eine 100-ml-Portion des
sterilen Mediums wird in einer Flasche mit abgeschabtem
Myzel von einer geneigten Agarkultur von Actinomadura
madurae subsp. simaoensis NRRL 15734 inokuliert. Das Medium
wird anschließend heftig auf einem Drehschüttler
während 48 bis 72 h bei 28°C geschüttelt, um ein Primär-
Inokulum zu erhalten. Dieses Primär-Inokulum wird dann
verwendet, um 10 l des obigen sterilen Mediums zu beimpfen.
Dieses wird wiederum 48 h bei 28°C kultiviert.
Man erhält ein Sekundär-Inokulum. Dieses Sekundär-
Inokulum wird verwendet, um 250 l des obigen sterilen
Mediums in einem Tank zu beimpfen. Man läßt 48 h
bei 28°C wachsen, wobei ein Strom steriler Luft von
200 l/min eingeleitet wird. Auf diese Weise erhält man
ein Tertiär-Inokulum.
Es wird ein Fermentationsmedium der folgenden Zusammensetzung
hergestellt:
% | |
Saccharose | |
3,0 | |
Sojamehl | 1,5 |
Maisquellwasser | 0,5 |
Calciumcarbonat | 0,5 |
Wasser q.s. | 100 |
Dieses Medium wird sterilisiert und nachfolgend beimpft
mit 125 l des Tertiär-Inokulums, das wie oben beschrieben
hergestellt wurde, pro 3000 l des obigen sterilen
Fermentationsmediums. Die Fermentierung wird bei 28°C
durchgeführt. Dabei wird ein steriler Luftstrom von
6,6 l/l Maische zugeführt, es wird mit einem Propeller
gerührt, der mit 110 U/min betrieben wird, und es wird
ein Silicon-Entschäumungsmittel zugeführt. Nach 137 h
Kultivierung unter den obigen Bedingungen wird die
Maische geerntet.
Eine Gesamtmenge von 4500 l geerntete Maische, die aus
zwei im wesentlichen gemäß Beispiel 2 durchgeführten Fermentierungen
stammt, wird mit 1% ihres Volumens an
Diatomeenerde kombiniert. Das Ganze wird 1 h vermischt
und dann der pH auf 3,0±0,3 unter Verwendung von konz. Chlorwasserstoffsäure
eingestellt. Eine Hälfte des Maischevolumens
an Ethylacetat wird zugesetzt und dieses Gemisch
3 h gerührt. Dann wird Diatomeenerde in einer Menge
von 5% des Maischevolumens zugesetzt und das Gemisch filtriert.
Die Ethylacetat-Phase des Filtrats wird abgetrennt,
mit 5%igem wäßrigem Natriumbicarbonat gewaschen
und dann zu einem Sirup konzentriert. Dieses Material
wird zwischen Heptan/Methanol (2 : 1) verteilt.
Die 4,5 l der Methanol-Phase werden zu einem Rückstand
konzentriert, der mit Hexan verrieben wird. Das Hexan
wird dekantiert und der Rückstand zur Trockene konzentriert.
Dieses Material wird durch präparative Phasenumkehr-
HPCL unter folgenden Bedingungen gereinigt:
[Als Packungsmaterial dienen 300 g einer Octadecyl(C)-
gebundenen Phase auf Kieselsäure-Basis (Dimensionen
5,7 cm × 30 cm), eingetragenes Warenzeichen der Wieley
Associates, Inc., Milford, Mass.]:
Säule: eine einzige PrepPAK®-500/C₁₈-Patrone;
mobile Phase 1: Acetonitril/Wasser/Essigsäure (8000 : 12 000 : 10);
mobile Phase 2: Acetonitril/Wasser/Essigsäure (3000 : 6000 : 5);
Strömungsrate: 50 ml/min;
Fraktionierung: 200 ml/Fraktion;
Probenbeladung: 2 bis g/30/ml Injektion.
mobile Phase 1: Acetonitril/Wasser/Essigsäure (8000 : 12 000 : 10);
mobile Phase 2: Acetonitril/Wasser/Essigsäure (3000 : 6000 : 5);
Strömungsrate: 50 ml/min;
Fraktionierung: 200 ml/Fraktion;
Probenbeladung: 2 bis g/30/ml Injektion.
Unter Verwendung der mobilen Phase 1 findet man LL-
D42067β in den Fraktionen 7 bis 10. Diese Fraktionen werden
vereinigt und im Vakuum eingedampft, um den größten
Teil des Acetonitrils zu entfernen. Die resultierende,
wäßrige Suspension wird mit einem gleichen Volumen an
Ethylacetat behandelt. Die Ethylacetat-Phase wird abgetrennt
und nacheinander mit gleichen Volumina 5%igem
wäßrigem Natriumbicarbonat, 0,1N Chlorwasserstoffsäure
und zweimal mit Wasser gewaschen. Die organische Phase
wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und zu
einem Feststoff eingedampft.
Dieser Feststoff wird wiederum chromatographiert unter
Verwendung der mobilen Phase 2. In dieser mobilen Phase
findet man LL-D42067β in den Fraktionen 15 bis 21. Diese
werden kombiniert und wie oben beschrieben behandelt.
Man erhält reines LL-D42067β als gelben Feststoff.
Die Brauchbarkeit der Antibiotikum LL-D42067α und LL-
D42067β als Antikokzidienmittel bei Küken wird durch
die folgenden Tests demonstriert.
Bei dem Test wird ein Geflügelfutter der folgenden Zusammensetzung
verwendet:
% | |
Vitamin-Aminosäure-Premix | |
0,5 | |
Spurenmineralien | 0,1 |
Natriumchlorid | 0,3 |
Dicalciumphosphat | 1,2 |
gemahlener Kalkstein | 0,5 |
stabilisiertes Fett | 4,0 |
getrocknetes Alfalfa, 17% Protein | 2,0 |
Kornglutenmehl, 41% Protein | 5,0 |
Menhadenfischmehl, 60% Protein | 5,0 |
Sojabohnenölmehl, 44% Protein | 30,0 |
gemahlener, gelber Mais, fein zum Auffüllen auf | 100,0 |
Das Vitamin-Aminosäure-Premix der obigen Futterzusammensetzung
wird gemäß der folgenden Rezeptur hergestellt.
Die Mengenangaben beziehen sich auf Einheiten/kg der fertigen
Futterzusammensetzung:
butyliertes Hydroxytoluol|125,0 mg | |
dl-Methionin | 500,0 mg |
Vitamin A | 3300,0 I.E. |
Vitamin D₃ | 1100,0 I.C.E. |
Riboflavin | 4,4 mg |
Vitamin E | 2,2 I.E. |
Nicotinsäure | 27,5 mg |
Panthothensäure | 8,8 mg |
Cholinchlorid | 500,0 mg |
Folsäure | 1,43 mg |
Menadion-natriumbisulfat | 1,1 mg |
Vitamin B₁₂ | 11,0 mcg |
gemahlener gelber Mais, fein, zum Auffüllen auf | 5,0 g |
Ein gemischtes Inokulum von 5000 sporulierten Oocysten
von Eimeria acervulina und einer ausreichenden Anzahl
von Oocysten von Eimeria tenella zur Erzeugung von 60-
bis 75%iger Mortalität bei unbehandelten Kontrolltieren
wird Eintagsküken verabreicht, und zwar durch direktes
Einimpfen in den Kropf jedes Kükens. Alle Küken erhalten
freien Zugang zum Futter und Wasser während der gesamten
Testperiode. 2 Tage vor der Beimpfung wird den verschiedenen
Kükengruppen mit Medikamenten versetztes
Futter angeboten, wobei der Wirkstoff jeweils in unterschiedlichen
Mengen enthalten ist. 7 Tage nach der Beimpfung
werden die Tests beendet. Die Küken werden gewogen,
getötet und ihr Verdauungstrakt wird auf Läsionen
untersucht. Die Ergebnisse sind in den nachstehenden Tabellen
angegeben. Aus den Ergebnissen geht hervor, daß
die Überlebensrate der infizierten Küken verbessert wird,
falls man 0,2 bis 5,0 TpM des Antibiotikums an die infizierten
Küken zusammen mit ihrem Futter verabreicht. Bei
diesen Wirkstoffniveaus wird ferner eine signifikante
Unterdrückung von Läsionen beobachtet, die durch E. tenella
und E. acervulina hervorgerufen werden.
Die Brauchbarkeit des Antibiotikums LL-D42067α wird anhand
seiner Anti-Kokzidienwirkung gegen eine Vielzahl
von Kokzidienspecies demonstriert, welche bei Küken Erkrankungen
verursachen.
Das 80fache der empfohlenen Konzentration eines im Handel
erhältlichen Anti-Kokzidienimpfstoffs mit einem Gehalt
gemischter Species von Eimeria wird durch direkte
Einimpfung in den Kropf jedes Kükens eingebracht. Die
Küken sind zum Zeitpunkt der Inokulation 10 Tage alt.
2 Tage vor der Inokulation wird mit Medikamenten vermischtes
Futter, das den Wirkstoff mit unterschiedlichen
Dosisniveaus enthält, den verschiedenen Kükengruppen
angeboten. 6 Tage nach der Inokulation wird der
Test beendet und die Verdauungstrakts der Küken werden
auf Läsionen untersucht. Je nach der Anwesenheit oder
Abwesenheit von Läsionen und ihrem Ausmaß wird bei jedem
Küken eine Bewertung vorgenommen, die von 0 bis 4 pro
Vogel reicht. Diese Bewertung wird mit der Anzahl der
Vögel pro Gruppe multipliziert. Die prozentuale Verringerung
der Läsionen wird folgendermaßen berechnet:
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle XI zusammengestellt.
Diese Ergebnisse zeigen, daß bei Küken
die durch fünf Species von Eimeria ausgelösten Läsionen
verhindert oder deutlich verringert werden können, falls
man den Wirkstoff in so geringen Konzentrationen wie
0,2 TpM in der Nahrung verabreicht.
Claims (5)
1. Actinomadura madurae subsp. simaoensis NRRL 15734 oder
dieser Stamm in einer Form, nachdem er mutagenen Behandlungen
unterworfen worden ist, die zu einer genetischen Veränderung des
Mikroorganismus geführt haben, wobei jedoch die Fähigkeit zur
Synthese der Antibiotika LL-D42067α und LL-D42067β erhalten geblieben
ist.
2. Die mit LL-D442067α und LL-D42067β bezeichneten
Verbindungen, gekennzeichnet durch folgende Strukturformel
oder
sowie deren pharmazeutisch und pharmakologisch akzeptablen Salze.
3. Verfahren zur Herstellung der antibiotisch wirksamen
Verbindungen LL-D42067α und LL-D42067β gemäß Anspruch 2, dadurch
gekennzeichnet, daß man unter aeroben Bedingungen den Stamm Actinomadura
madurae subsp. simaoensis NRRL 15734 oder eine die antibiotisch
wirksame Verbindung LL-D42067α oder LL-D42067β produzierende
Mutante desselben in einem sterilen, flüssigen Medium, enthaltend
assimilierbare Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff
und anorganischen Anion- und Kationsalzen, fermentiert,
bis eine wesentliche Menge von LL-D42067α oder LL-
D42067β in dem Medium gebildet worden ist, und danach
die antibiotisch wirksamen Verbindungen daraus isoliert.
4. Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 2 zur Bekämpfung
von Protozoeninfektionen bei warmblütigen, besonders
fleischerzeugenden Tieren, insbesondere Geflügel.
5. Verwendung nach Anspruch 4 in Form einer Tierfutter-
Premixzusammensetzung, umfassend einen festen, eßbaren Träger und
etwa 0,00001 bis etwa 5 Gew.-% der Verbindung gemäß Anspruch 2.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US06/593,162 US4650802A (en) | 1984-03-26 | 1984-03-26 | Methods and compositions for treating protozoal infections with a novel antibiotic |
US06/593,159 US4578468A (en) | 1984-03-26 | 1984-03-26 | Antibiotic LL-D42067β |
US06/593,152 US4649143A (en) | 1984-03-26 | 1984-03-26 | Methods and compositions for treating protozoal infections with a novel antibiotic |
US06/593,160 US4551533A (en) | 1984-03-26 | 1984-03-26 | Antibiotic LL-D42067α |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE3509949A1 DE3509949A1 (de) | 1985-10-17 |
DE3509949C2 true DE3509949C2 (de) | 1994-12-01 |
Family
ID=27505011
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE3509949A Expired - Fee Related DE3509949C2 (de) | 1984-03-26 | 1985-03-19 | Verbindungen und deren Verwendung zur Behandlung von Protozoeninfektionen |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0156193B1 (de) |
JP (2) | JPH0798750B2 (de) |
AU (1) | AU584073B2 (de) |
DE (1) | DE3509949C2 (de) |
DK (1) | DK122185A (de) |
ES (1) | ES541375A0 (de) |
HU (1) | HU193087B (de) |
IE (1) | IE58238B1 (de) |
NZ (1) | NZ211376A (de) |
PT (1) | PT80123B (de) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4845037A (en) * | 1986-07-31 | 1989-07-04 | American Cyanamid Company | Process for producing antibiotic LL-D42067α |
US5298524A (en) * | 1988-06-09 | 1994-03-29 | Pfizer Inc. | Acidic polycyclic ether antibiotic having an anticoccidial and growth promotant activity |
WO1989012105A1 (en) * | 1988-06-09 | 1989-12-14 | Pfizer Inc. | Acidic polycyclic ether antibiotic having anticoccidial and growth promotant activity |
US5126350A (en) * | 1990-06-13 | 1992-06-30 | Schering Corporation | Polycyclic aromatic antifungal compounds |
DE19719522A1 (de) * | 1996-08-17 | 1998-02-19 | Gruenenthal Gmbh | Neue polycyclische Phthalazinderivate, Verfahren zu Ihrer Herstellung und ihre Verwendung |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2621690A1 (de) * | 1975-05-20 | 1976-12-09 | Ciba Geigy Ag | Neues antibiotikum und verfahren zu seiner herstellung |
US4407946A (en) * | 1981-10-22 | 1983-10-04 | American Cyanamid Company | Process for producing antibiotic X-14868A |
-
1985
- 1985-03-04 EP EP85102399A patent/EP0156193B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-11 NZ NZ211376A patent/NZ211376A/en unknown
- 1985-03-14 IE IE65685A patent/IE58238B1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-03-18 PT PT80123A patent/PT80123B/pt not_active IP Right Cessation
- 1985-03-18 HU HU85995A patent/HU193087B/hu not_active IP Right Cessation
- 1985-03-18 ES ES541375A patent/ES541375A0/es active Granted
- 1985-03-18 DK DK122185A patent/DK122185A/da not_active Application Discontinuation
- 1985-03-19 DE DE3509949A patent/DE3509949C2/de not_active Expired - Fee Related
- 1985-03-25 AU AU40318/85A patent/AU584073B2/en not_active Ceased
-
1993
- 1993-07-16 JP JP5199012A patent/JPH0798750B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-04-03 JP JP7099437A patent/JP2540292B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2540292B2 (ja) | 1996-10-02 |
JPH06263764A (ja) | 1994-09-20 |
EP0156193A2 (de) | 1985-10-02 |
AU584073B2 (en) | 1989-05-18 |
IE58238B1 (en) | 1993-08-11 |
DE3509949A1 (de) | 1985-10-17 |
EP0156193B1 (de) | 1990-12-27 |
IE850656L (en) | 1985-09-26 |
JPH08112091A (ja) | 1996-05-07 |
NZ211376A (en) | 1991-05-28 |
DK122185A (da) | 1985-09-27 |
PT80123B (pt) | 1987-06-17 |
EP0156193A3 (en) | 1986-12-10 |
JPH0798750B2 (ja) | 1995-10-25 |
HU193087B (en) | 1987-08-28 |
HUT40170A (en) | 1986-11-28 |
AU4031885A (en) | 1985-10-03 |
ES8602945A1 (es) | 1985-12-16 |
DK122185D0 (da) | 1985-03-18 |
PT80123A (en) | 1985-04-01 |
ES541375A0 (es) | 1985-12-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE3519834C2 (de) | Neue antibiotische Wirkstoffe, Verfahren zu ihrer Gewinnung und ihre Anwendung zur Bekämpfung von Infektionen bei Tieren und Pflanzen | |
EP0035119B1 (de) | Polyätherverbindungen und ihre Herstellung, entsprechende Präparate und die Verwendung dieser Produkte als Heilmittel oder wachstumsfördernde Mittel bei Wiederkäuern | |
DE3509949C2 (de) | Verbindungen und deren Verwendung zur Behandlung von Protozoeninfektionen | |
DD234031A5 (de) | Verfahren zur herstellung von neuen antibiotika ll-d 42067alpha und ll-d 42067beta | |
DE3880845T2 (de) | Durch fermentation hergestellte antibiotika. | |
DE2931082C2 (de) | ||
DE2514215A1 (de) | Antibiotika und verfahren zu deren herstellung | |
EP0133971A1 (de) | Antibiotikum, dessen Herstellung sowie dessen Verwendung | |
DE2431270C2 (de) | Antibiotische Substanz, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung dieser antibiotischen Substanz als wachstumsförderndes Mittel | |
DE3882490T2 (de) | Saurer polyzyklischer Äther, verwendbar als Anticoccidiosemittel und als wachstumsförderndes Mittel. | |
EP0197360B1 (de) | Verwendung von Efomycinen als Leistungsförderer bei Tieren, Efomycine und ihre Herstellung | |
EP0011178B1 (de) | Antibiotikum, seine Herstellung sowie seine Verwendung als Arzneimittel | |
DE2404958C2 (de) | Metabolit A-27106 und Verfahren zu seiner Herstellung | |
DE2708493A1 (de) | Neues antibiotikum am-1042 | |
EP0183214A2 (de) | Organisch-chemische Verbindung, mikrobiologische Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung | |
DE2652677A1 (de) | Antibiotica 890a tief 1 und 890a tief 3 | |
DE1929355C3 (de) | Thiopeptin-Antibiotika und deren Verwendung in Futtermittelzusätzen | |
DE3608175A1 (de) | Efomycin g, seine herstellung und seine verwendung als leistungsfoerderer bei tieren | |
DE69223302T2 (de) | Antibiotikum LL-E19020 Gamma | |
DE3238316C2 (de) | ||
DE3889417T2 (de) | Methode für die Kontrolle von chronischer Atmungskrankheit und nekrotischer Enteritis bei Vögeln. | |
DE3885655T2 (de) | Antibiotikum 6270B, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung als Anticoccidiosemittel und Futterzusatz. | |
DE2140322A1 (de) | Neues Antibiotikum | |
JPH0613520B2 (ja) | 抗生物質LL―D42067αおよびLL―D42067β | |
AT388564B (de) | Biologisch reine kultur von actinomadura yumaense sp. nov. nrrl 12515 sowie verfahren zur herstellung der neuen antibiotika ll-c23024alpha, beta und jota, zur bekaempfung von nematoden und zur bekaempfung von coccidiosis-infektionen |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8110 | Request for examination paragraph 44 | ||
8125 | Change of the main classification |
Ipc: C07D491/16 |
|
D2 | Grant after examination | ||
8364 | No opposition during term of opposition | ||
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |