HU193087B

HU193087B - Process for preparing new ll-d 42067 alpha and ll-d 42067 beta antibiotics and veterinary compositions containing thereof as active substances

Info

Publication number: HU193087B
Application number: HU85995A
Authority: HU
Inventors: Robert L Kennett; Michael T Lee; Donald B Borders; Joseph J Goodman; Raymond T Testa; William M Maiese; David P Labeda; Sidney Kantor; Guy T Carter
Original assignee: American Cyanamid Co
Priority date: 1984-03-26
Filing date: 1985-03-18
Publication date: 1987-08-28
Also published as: JP2540292B2; EP0156193B1; ES541375A0; EP0156193A3; HUT40170A; DK122185A; DE3509949C2; JPH06263764A; JPH0798750B2; ES8602945A1; EP0156193A2; PT80123A; PT80123B; AU584073B2; JPH08112091A; IE850656L; IE58238B1; NZ211376A; DK122185D0; AU4031885A

Description

A találmány szerinti eljárással két új, LL-D 42067 a és LL-D 42067 β jelzésű antibiotikumot állítunk elő Actinomadura madurae simaoensis NRRL 15734 deponálási számú törzzsel vagy ennek valamely mutánsával vagy variánsával olymódon, hogy aerób körülmények között, asszimilálható szén- és nitrogénforrást és szervetlen anion- és kationsókat tartalmazó, steril folyékony táptalajon fermentálást végzünk a táptalajban jelentős antibiotikus aktivitás eléréséig, majd az antibiotikumot a táptalajból kinyerjük.

A coccidiosis a hústermelő iparágban előforduló járványok egyik legsúlyosabbika. Ez a járvány különösen a baromfitenyésztésben okoz nagyon nagy károkat.

A coccidiosist protozoa paraziták okozzák. A kórokozót hordozó állatok szervezete a táplálékot nem tudja feldolgozni, így testtömegük csökken és legtöbbször el is pusztulnak. A baromfiféléknél általában az Eimeria nemzetségbe tartozó protozoa paraziták okozzák az állatok megbetegedését. Különösen az Eimeria nemzetségbe tartozó hat faj, úgymint Eimeria tenella, Eimeria necatrix, Eimeria mivati, Eimeria maxim-a, Eimeria brunetti ésEimeria acervulina okoznak súlyos járványokat a baromfitenyésztő iparágban.

Bár a coccidiosist már évekkel ezelőtt felismerték, a mai napig nem sikerült megfelelő védekezést kidolgozni a betegség ellen.

Célul tűztük ki, hogy megfelelő módszert dolgozzunk ki melegvérű állatok, különösen a hústermelés céljából tenyésztett állatok, mint például baromfi, sertés, marha, nyúl és juh, protozoon-fertőzése ellen.

Célul tűztük ki továbbá, hogy olyan új készítményt dolgozzunk ki, amely hatásosan alkalmazható a hústermelő iparban az állatok protozoon-fertőzése elleni védelemben.

Célkitűzésünket új védelmi módszer és készítmény kidolgozásával értük el, amelyek hatásosan alkalmazhatók az állattenyésztésben, különösen a baromfi-, marha-, sertés-, juh- és nyúltenyésztésben, de egyéb háziállatok, mint például kutya, macska protozoon-fertőzések elleni védelmében, kezelésében, a fertőzés csökkentésében, a fertőzés megakadályozásában és gyógyításában is.

Fenti készítményekben és módszerekben a találmány szerinti eljárással előállított két új antibiotikumot alkalmazunk, amelyek a következők:

LL-D-42067 a, NRRL 15734 (I) képletű vegyület és

LL-D 42067 β,- NRRL 15734 (II) képletű vegyület.

Fenti vegyűleteket ultraibolya-abszorpciós, infravörös-abszorpciós, proton magmágneses rezonancia-, szén-13 magmágneses rezonanciaspektrum, és proton és szén-13 kémiai eltolódásainak összefüggése alapján azonosítottuk. Ezeket a spektrumokat a következő ábrákon mutatjuk be.

1. ábra - LL-D 42067 a .vegyület ultraibolya-abszorpciós spektruma,

2. ábra - LL-D 42067 α vegyület infravörös abszorpciós spektruma,

3. ábra - LL-D 42067 α vegyület proton magmágneses rezonancia spektruma, kloroformban,

4. ábra - LL-D 42067 α vegyület szén-13 magmágneses rezonancia spektruma, dimetil - szulfoxid bán,

5. ábra - LL-D 42067 a proton és széti-13 kémiai eltolódásainak összefüggése;

6. ábra - LL-D 42067 β vegyület ultraibolya

-abszorpciós spektruma,

7. ábra - LL-D 42067 β vegyület infravörös abszorpciós spektruma,

8. ábra - LL-D 42067 β vegyület proton magmágneses rezonancia spektruma, kloroformban,

9. ábra - LL-D 42067 β vegyület szén-13 magmágneses rezonancia spektruma.

Ügy találtuk, hogy a találmány szerinti eljárással előállított antibiotikumok hatásosan alkalmazhatók állatok — különösen baromfifélék, mint például csirke, kacsa, pulyka, liba, fürj és fácán, valamint marha, juh, sertés és nyúl — coccidiosis fertőzése ellen.

A fenti antibiotikumokat tartalmazó készítmények melegvérű állatok egyéb protozoon-fertőzéses megbetegedése ellen is, így például malária, toxoplasmosis és sarcosporidiosis ellen is alkalmazhatók.

A találmány szerinti eljárással előállított vegyűletek alkalmasak melegvérű állatok protozoon-fertőzésének, mint például coccidiosisnak a megelőzésére/gátlására, gyógyítására, kezelésére, melynek során az állatoknak profilaktikusan, gyógyászatilag vagy terápiásán hatásos mennyiségben a találmány szerinti eljárással előállított LL-D 42067 a vagy LL-D 42067 β antibiotikumot adagoljuk.'

A találmány szerinti eljárással előállított vegyűleteket vagy gyógyszerészetileg elfogadható sóikat a legegyszerűbb, módon az állatok táplálékába vagy ivóvízébe, illetve ezekkel egyidejűleg adagolhatjuk be, de egyedenként is beadagolhatjuk tabletták, folyékony orvosság, gélek, kapszulák, injekció, stb. formájában.

Ez utóbbi módszer egyes állatok esetében alkalmazható, míg az előbbi tömegesen tenyésztett állatok esetében.

Abban az esetben, ha a találmány szerinti eljárással előállított LL-D 42067 α vagy LL-D 42067 β antibiotikumokat baromfifélék «A

-2193087 coccidiosis fertőzöttsége esetében profilaktikusan vagy terápiás kezelésre alkalmazzuk, akkor a megfelelő hatás elérésére 0,1 — —10,0 ppm, előnyösen 0,5 — 3,0 ppm menynyiségben adagoljuk az állatok táplálékába vagy ivóvízébe.

A találmány szerinti eljárással előállított LL-D 42067 a vagy LL-D 42067 β antibiotikumokat egyéb melegvérű állatok, mint például marha, juh vagy sertés protoonfertőzéses megbetegedésének gátlására, gyógyítására, kezelésére is alkalmazhatjuk.

Ezeknél a nagyobbtestű állatoknál a protozoön-fertőzések, mint például a coccidiosis ellen, a találmány szerinti eljárással előállított antibiotikumokat 1,0 — 100 ppm, előnyösen 5 — 50 ppm mennyiségben alkalmazzuk.

A baromfifélék gyógyításánál a találmány szerinti eljárással előállított LL-D 42067 a vagy LL-D 42067 β antibiotikumot 0,0001 — —0,0005 tömeg% koncentrációban baromfitáppal keverjük össze.

Marha-, juh-, vagy sertésfélék gyógyításánál az antibiotikumot 0,0001 - 0,01 tömeg% koncentrációban keverjük az állatok táplálékába.

Abban az esetben, ha a találmány szerinti eljárással előállított antibiotikumokat a coccidiosis megelőzésére vagy gyógyítására alkalmazzuk, akkor az aktív anyagot a premixekbe keverjük bele. A premix szokásosan viszonylag nagy koncentrációban tartalmazza a coccidiosis elleni szert. A premixet közvetlenül az etetés előtt keverjük az állatok tápjába. Szükség szerint a premixet alkalmazhatjuk a napi tápadagra rászórva is.

A prémixek vagy koncentrátumok az antibiotikumot vagy gyógyászatilag megfelelő sóját 0,1 — 5,0 tömeg%-ban, míg a megfelelő hordozó vagy hígítóanyagokat 99,9 — 95 tömeg%-ban tartalmazzák. Hordozóanyagként használhatunk lucernalisztet, szójalisztet, gyapotmag-lisztet, lenmaglisztet, nátrium-kloridot, kálcium-karbonátot, kálcium-szulfátot, kukoricalisztet, melaszt, karbamidot, csontlisztet, kukoricacsőlisztet, rizslisztet, stb. A hordozóanyag biztosítja az aktív anyag egyenletes szétoszlását a tápkeverékben. Ily módon a hatóanyag a tápban egyenletesen 0,1 — 100 ppm koncentrációban fordul elő. Ez 0,00001 — 0,01 tömeg% koncentrációnak felel meg. A gyakorlatban néhány kg premixet adagolunk a táp minden tonnájához, hogy abban az antibigtikum megfelelő koncentrációját biztosítsuk.

A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek vízben nem oldódnak, ezért ha az állatok ivóvízébe téve kívánjuk adagolni, szükséges, hogy előtte valamilyen szerves oldószerben feloldjuk őket. Oldószerként alkalmazhatunk például metanolt, etanolt, acetont, dimetil-szulfoxidot, olajsavat, propilén-glikolt, linolénsavat, stb. Az oldatba célszerű kis men'ynyiségben felületaktív anyagokat és/vagy diszpergálószereket is adagolni, amely szerek elősegítik a hatóanyagot tartalmazó oldat oldódását vagy diszperzióját az ivóvízben.

Abban az esetben, ha egy állattenyésztő telepen csak néhány állat betegedett meg, célszerű ezeknek az állatoknak szájon át, gyógyászati gél formájában beadagolni az LL-D 42067 a vagy LL-D 42067 β antibiotikumot.

A gélkészítésnél egy gyógyászatilag megfelelő gélképző-fázist 3-10³ - 6-10³ Pa csökkentett nyomáson, 20 · 60°C hőmérsékleten, egy vizes puffer-oldattal keverünk össze. A gélképző-fázist úgy állítjuk elő, hogy 0,004 ^: 4,5 tömeg% végkoncentrációnak megfelelő mennyiségben LL-D 42067 a vagy LL-D 42067 β antibiotikumot feloldunk vagy diszpergálunk 14-31 tömeg% végkoncentrációnak megfelelő mennyiségű propilén-glikolban és 15-50 tömeg% végkoncentrációnak megfelelő mennyiségű gél képzőben 60-80°C hőmérsékleten.

A gélképző-fázist úgy is előállíthatjuk, hogy 0,004 — 4,5 tömeg% végkoncentrációnak megfelelő mennyiségű LL-D 42067 a vagy LL-D 42067 β antibiotikumot vagy gyógyászatilag megfelelő sóját és 15- 50 tömeg%, előnyösen 15 — 35 tömeg% végkoncentrációnak megfelelő mennyiségű gélképzőt 14— 30 tömeg% propilén-glikolban szuszpendálunk, 15 perc és 1 óra közötti időtartamig, 3-10³- 6 10³ Pa nyomáson, szobahőmérsékleten. Gélképzőként alkalmazhatunk a-hidro-Q-hidroxi-poli (oxi-etilén) - poli (oxi-propil én) - poli· (οχ -etilén) blokk kopolimert, ami egy nemionos felületaktív anyag, átlagos molekulatömege 12 500; olvadáspontja 56°C; Brookfield-féle viszkozitása 77°C-on 3100; 0,1 %-os vizes oldatának felületi feszültsége 40,6 din/cm (du Nouy tensiometerrel mérve).

A vizes pufferoldatot úgy készíthetjük, hogy 1,5 tömeg % végkoncentrációnak megfelelő mennyiségű citromsavat és 0,1 tömeg% végkoncentrációnak megfelelő mennyiségű trinátrium-citrátot feloldunk 3 — 25 tömeg%, előnyösen 6—12 tömeg%, végkoncentrációnak megfelelő mennyiségű ionmentesített vagy desztillált vízben. A vizes pufferoldatot a végső gélforma 15—50 tömeg%, előnyösen 35—45 tömeg% koncentrációban tartalmazza; A fenti összetételű gél pH. értéke 3-3,5; benne a komponensek hosszú időn át megőrzik kémiai stabilitásukat.

A vizes pufferoldátba adagolhatunk, még:

a) 0,5 - 1,5 tömeg%-ban, előnyösen 1,5 tömeg%-ban baktériumellenes konzerválószert;

b) 0,01-0,03 tömeg%-ban, előnyösen 0,01 tömeg%-ban színezőanyagot, mint pél dául Acid yellow No. 23; („tartrazine,

F.D. és C yellow No. 5; 4,5 dihidro-5-oxo-1-(4-szulfofenil) -4 - [ (szulfofenil) azo] -lH-pirazol-3-karbonsav-trinátriumsó);

c) 0,001-0,02 tömeg%-ban, előnyösen 0,02 tő· meg%-ban egy habzásgátlószert, amely (1) képletű dimetil-polisziloxánok és szilikagél keveréke, a képletben m értéke

-3193087

200-350, a keverék víztiszta viszkózus olaj, amelynek sűrűsége: 0,965-0,970 g/ /cm³, és törésmutatója Πρ⁵=1,404; viszkozitása 6-10'² m²/s.

A gyógyászati gélt úgy állítjuk elő, hogy a fenti módon elkészített gél- és vizes-fázist 1,33· 10³-1,33-10⁴ Pa, előnyösen 3-10³-6-10³ Pa nyomáson 20-60°C hőmérsékleten összekeverjük.

Ezzel az eljárással egy légmentes gélt kapunk, ami a hatóanyagot a kívánt dózisban tartalmazza. Abban az esetben, ha nem szükséges a hatóanyag dózisát pontosan beállítani, vagy ha nem kívánunk légmentes gélt előállítani, akkor az összekeverést végezhetjük atmoszférikus nyomáson is.

Az alábbi példában a gélkészítést mutatjuk be.

4,5 g LL-D 42067 a (vagy 4,5 g LL-D 42067 β) antibiotikumot, 1,5 g citromsav-monohidrátot, 1,0 g nátrium-citrát-dihidrátot, 1,5 g benzil-alkoholt és 0,01 g C.I. Acid Yellow No. 23-at feloldunk 42 g vízben.

A fent említett gélképző anyagból 28 g-ot 21,99 g propilén-glikolban, 60°C hőmérsékleten feloldunk. A kapott oldatokat ezután

3-10³ - 6·10³ Pa nyomáson, 20 - 60°C hőmérsékleten addig kevertetjük, míg homogén keveréket nem kapunk. A keverék -15°C—18°C hőmérsékleten gélesedik; viszkozitása 0,51Ί0⁶; víz/gélfázis aránya 1,5/1,0.

Szájon át történő adagolásnál, például egy 90,8 kg testtömegű hízómarhának 6,3 g fenti módon elkészített gélt adagolhatunk be naponta, ami 3 mg/kg testtömeg/nap dózisnak felel meg.

A gyakorlatban marha-, sertés és juhfélék protozoon-fertőzésének kezelésére 0,03 mg/ /kg testtömeg/nap - 3,0 mg/kg testtömeg/nap hatóanyag-dózis szükséges. Kisebb állatoknál 0,003 mg/kg testtömeg/nap dózis elegendő.

A találmány szerinti eljárással előállított LL-D 42067 a és LL-D 42067 β antibiotikumok szerkezetét röntgensugár krisztallográfiás vizsgálattal határozzuk meg.

A találmány szerinti eljárással előállított LL-D 42067 α fiziko-kémiai tulajdonságait az alábbiakban adjuk meg:

1/ Molekulatömeg: 535 (FAB-MS)

2/ összegképlet: É28H25NO1Q;

3/ Fajlagos optikai forgatóképesség:

[a]“ = +836± 40° (C 0,3; DMF)

4/ Ultraibolya-abszorpciós spektrum 1. ábra

alapján UV^’^OH	jellemző maximumok: = 215 nm (ε 13,200) 254 nm (ε 15,000) 320 nm (ε 5,100)
395 nm	(ε 11,400)
i t\z HCB ^{u v} MA3C	— 213 nm	(ε 27,100)
253 nm	(ε 34,500)

* U1V

321	nm	(ε	12,200)
374	nm	(ε	21,100)
389	nm	(ε	22,900)
= 217	nm	(ε	42,100)
253	nm	(ε	13,900)
312	nm	(ε	5,700)
395	nm	(ε	10,700)

5/ Infravörös-abszorpciós spektrum 2. ábra alapján jellemző csúcsok (KBr pasztil- *

Iában felvéve):

1650, 1598, 1543, 1470, 1440, 1260, 1195, ’⁵ 1020 cm; _w

6/ Proton magmágneses rezonancia spektrum 3. ábra alapján a jelentős csúcsok kémiai eltolódását az 1. táblázatban ad20 juk meg (CDCl₃-ban).

7/ Szén-13 magmágneses rezonancia spektrum 4. ábra alapján a jelentős csúcsok kémiai eltolódását a 2. táblázatban adjuk meg (DMSO-ban).

8/ Proton és szén-13 kémiai eltolódásainak összefüggése 5. ábra alapján (DMSOban).

A találmány szerinti eljárással előállított LL D 42067 β fiziko-kémiai tulajdonságait az alábbiakban adjuk meg:

1/ Molekulatömeg: 521 (FAB-MS)

2/ összegképlet: 0₂₇Η₂₃ΝΟ|θ 3/ Fajlagos optikai forgatóképesség: [a]» = = +770±10° (C 0,165; DMF)

4/ Ultraibolya-abszorpciós spektrum 6. ábra alapján jellemző maximumok:

CHjOH U ’ ΜΑΧ	= 212	nm	(ε	28,200)
	253	nm	(ε	33,200)
	318	nm	(ε	13,200)
	378	nm	(ε	19,700)
	393	nm	(ε	21,700)
, _τν ο,ι-η HCF ^{υ ν} ΜΑΧ	= 211	nm	(ε	13,900)
	253	nm	(ε	18,200)
	318	nm	(ε	7,140)
	372	nm	(ε	9,950)
	388	nm	(ε	10,500)
UV°'^^Wa0H	= 216	nm	(ε	31,200)
251	nm	(ε	11,700)

5/ Infravörös-abszorpciós spektrum 7. ábra alapján a jellemző csúcsok (KBr pasztillában felvéve);

3400, 1646, 1620, 1545, 1463, 1252, 1195, 1020 cm;

6/ Proton magmágneses rezonancia spektrum 8. ábra alapján a jelentős csúcsok kémiai eltolódását a 3. táblázatban adjuk meg (CDCIj-ban);

7/ Szén-13 magmágneses rezonancia spektrum 9. ábra alapján a jelentős c_>úcsok kémiai eltolódását a 4. táblázatban adjuk meg (CD₃OD/CDCI₃).

-4193087 !_±_táblázat

LL-42067 oc proton magmágneses rezonancia spektruma alapján a jelentős csúcsok kémiai eltolódása

Hidrogénatomok*’ Multipliő¹ száma citás'^<’^l,	J	(H)
1,88	2	m
2,34	2	m
2,45	3	s
2,58	1	m
3,62	3	5
3,72	1	d,d	4,64;	14,22
3,88	3	s
4,80	2	m
5,08	1	m
5,32	1	d	5,81
5,55	1	d	5,81
6,70	1	s
12,76	1	s
13,58	1	s

Jelölések: x = CDClj ppm értékek TMS-ben mérttől lefelé xx = DMSO-d_e-ban felvéve spektrumban további két abszorpciós csúcs 4,55 (s) és 5,91 (d) ppm-nél xxx = s - szinglett, d - dublett, t - triplett, m - multiplett.

2i_£áblázat_

LL-D 42067 c< szén-1 3 magmágneses rezonancia spektruma alapján a jelentős csúcsok xémiai eltolódása

Szén Kémiai elto- A szénkötés lódás ppm* típusa

1 2	20.4 25.4	CHj CHj
3	25,8	CHj
4	29,0	CHj
5	30,4	CHj
6	58,5	CH
7	61,6	CHj
8	63,3	CH
9	71,7	CH
10	90,4	CHj
11	100,0	CH
12	109,2	q*^x
13	109,7	9
14	111,0	9
15	113,7	9
16	119,0	9
17	125,8	9
18	126,6	9
19	134,9	9
20	135,3	9
21	136,1	9
22	141,3	9
23	147,9	9
24	151,1	9
25	152,5	9
26	165,4	9
27	165,6	9
28	182,3	9

x = DMSP-d_e, ppm értékek TMS-ben mérttől lefelé xx = kvaterner

-5193087

3. táblázat

LL-D 42067 f> proton magmágneses rezonancia spektruma alapján a jelentős csúcsok kémiai eltolódása

X <r	Hidrogénatomok Multipli-	J (H)
száma	citás**
1,88	2	m
2,30	2	m
2,38	3	s
2,57	2	m
3,69	1	d,d	4,5; 14,3
3,87	3	s
4,79	1	m
4,81	1	d,d	4,5; 12,7
5,06	1	m
5,32	1	d	5,8
5,53	1	a	5,8
6,54	1	s
10,10	1	s
12,80	1	s
12,90	1	s
x = CDC1	3 ppm értékek	TMS-ben mérttől lefelé
XX = s -	szinglett, d ·	- dublett, m	- multiplett.
	4. táblázat

LL-D 42067 β szén-13 magmágneses rezonancia spektruma alapján a jelen· tős csúcsok kémiai eltolódása
Szén	Kémiai eltolódás ppm
1	19,1
2	25,9
3	26,9
4	29,7
5	62,00
6	62,2
7	65,0
8	72,8
9	91,1
10	100,1
11	110,5
12	110,6
13	111,7
14	114,7
15	119,2
16	127,2
17	128,8
18	136,1
19	136,3
20	137,0
21	138,1
22	148,9
23	151,9
24	153,0
25	165,3
26	167,2
27	183,6

x - C1'₃OD /CDClj ppm értékek TMS-ben mérttől lefelé

-6193087

Az LL-D 42067 α és LL-D 42067 β antibiotikumokat egy új Actinomadure madurae mikroorganizmus törzs termeli, ellenőrzött körülmények között végzett tenyésztés során. Az új törzset a Medical Research Division, American Cyanamid Company, New York törzsgyűjtéményében tartjuk fenn, LL-D 42067 a és LL-D 42067 β szám alatt. Az új mikroorganizmus csíraképes tenyészetét letétbe helyeztük a Patent Culture Cpllection Laboratory, Northern Régiónál Research Center, U.S.Department of Agriculture, Peoria, Illinois 61604 és ott NRRL 15734 katalógusszámon vették fel az állandó gyűjteménybe.

Az új antibiotikum-termelő mikroorganizmus törzset egy San Simao, Brazíliában gyűjtött talajmintából izoláltuk. Az új törzset osztályoztuk és „Actinomadure madurae simaoensis-nak neveztük el,

A mikroorganizmus tenyésztési, fiziológiai és morfológiai jellemzőinek megfigyelését Shirling and Gottlieb [Intern. J. Systerm. Bacteriol., 16: 313-340 (1966)], és Gordon, et al. [Intern. J. Systerm. Bacteriol., 24: 54-63 (1974)] módszere szerint végeztük. A sejtfalak összetételét Lechevalier, et al. [Adv. Appl. Microbiol., 14: 47-72 (1971)] határoztuk meg. A vizsgálatok eredményeit az 5-7. táblázatokban foglaljuk össze. A táblázatokban az aláhúzott jellemző színeket Kelly and Judd [Nat. Búr. Stand., Spec. Publ., 440 (1976)] és Intersociety Color Council, National Bureau of Standards Centroid Colos Charts.] meghatározásai szerint adtuk meg.

A szaporodás mértéke

Az LL-D 42067 termelésére alkalmas tenyészeteket az International Streptomyces Project Committee (ISP) által ajánlott különféle agar táptalajokon tenyésztettük, amelyek jellemzőit az 5. táblázatban adjuk meg.

Mikromorfológia

Mikroszkópos vizsgálattal megállapítottuk, hogy a tenyészetben rövid spóraláncok alakulnak ki és a gombafonalak rövid spirálokká (háromfordulatú) hurkolódnak. A spórák felülete elektronmikroszkópos vizsgálattal simának látszik, ami megkülönbözteti az A.verrucosporátót.

Sejtfalösszetétel

A teljes sejt analízis szerint a törzs mezo-diamino-pimelinsavat (DAP) és 3-o-metil-d-galaktózt tartalmaz; a teljes sejtfal B típusú.

A sejtfal összetétele III. típusú (mező DAP, glutaminsav, alanin, muraninsav és glükózamin) és a foszfolipid PIV típusú (foszfatidil-etanol-amin és/vagy metil-etánol-amin és egy ismeretlen glükózamin tartalmú fosz¹θ folipid). Ezen jellemzők alapján nyilvánvaló, hogy a törzs az Actinomadura nemzetségbe tartozik. A PIV típusú foszfolipid nem tipikus az A. madurea-ra, ami szokásosan Pl típusú.

Fiziológiai reakciók

Az LL-D 42067 α és LL-D 42067 β törzsek fiziológiai reakcióit Shirling és Gottlieb [Inter J. Syst. Bacteriol., 16: 313-340 (1966)] és a Gordon tests, Gordon et al. [Intern. J. Syst. Bacteriol., 24: 54-63 (1974)] módszere szerint végezzük.

A szénhidrát hasznosítás adatait a nemzetségbe tartozó hasonlóképpen reagáló más törzsekkel együtt a 6. táblázatban foglaljuk össze.

Az LL-D 42067 az Actinomadura madurae és Actinomadure verrucosopora csoportokhoz hasonlóan viselkedik, bár amint a fentiekben jeleztük, különbözik az Actinomadura verrucosoporától, mivel sima spórafalakkal rendel30 kezik. Az LL-D 42067-et és az Actinomadura maduraet Gordon szerinti vizsgálati sorozatban összehasonlítottuk. (Gordon adatai a fent idézett közleményben találhatók). Az eredményeket a 7. táblázatban foglaljuk ösz35 sze. Különbséget csak az amiláz és a glicerinből és raffinózból termelt savtermelésben találtunk.

M vei az amiláz-termelés és a raffinóz-hasznosítás az Actinomadura madurae esetében is változó lehet, amint azt Goodfellow és társai a J. Fen. Microbiol., 112: 95-111 (1979) irodalmi helyen kifejtik, csak a glicerin reakcióban van különbség.

Mivei az LL-D 42067 törzs a glicerin reak45 ciót és a foszfolipid PIV típusát kivéve ugyanolyan fiziológiai tulajdonságú, mint az Actinomadura madurae, ennek alfajába, Actinomadura madurae simaoensis-ba sorolható be.

tablazat

Actinomadura madurae síntaoensís—ba tartozó LL^-D 42067 tenyésztési jellemzői ISP morfológiai táptalajokban

Agar táptalaj	Légmicélium	Vegetatív micélium	Oldható festék
élesztő ki-	fehér	közép na-	nincs
vonat, ma-		rarcs,
láta kivonat (ISP 2)	színtelen	barna 153	nincs
Szervetlen sók, kémé-	színtelen

nyitó (ISP 4) Glükóz-aszpa-	színtelen	színtelen	nincs
ragin (ISP 5) Zabliszt	halvány ró-	világos	nincs
(ISP 3)	zsaszines	narancs, barna 152*

x = ISCC színmeghatározás szerint

-7193087

6. táblázat

LL-D 42056 és Actinomadure spp. szénhidrát hasznosításának összehasonlítása

Szénhidrát- LL-D 42067 A. madurae A. verrucosopora forrás (a) (a) (b)

1-arabinóz	+	+	+
d-fruktóz	+	+	+
i-inozit	-	változó	változó
d-mannit	+	+	+
raffinóz	-	-	-
ramnóz	+	+	+
szacharóz	+	+	+
d-xilóz	+	+	+
(a) Goodfellow,	Μ., et	al. J. Gén.	Microbiol.,
112: 95-111	(1979)
(b) Nomomura, H	. and 0*	Hara, Y., J	., Ferm. Technoi.

49: 904-912 (1971).

/^táblázat

Az LL-D 42067 Gordon szerinti reakciói

LL-D 42067 A. madurae (Gordon féle adatok)*

Bontás / Átalakítás
Kazein	+	+ (98)
Xantin	-	-
Hipoxantin	+	+ (98)
Tirozin	+	+ (91)
Adenin	-	—
Termelés
Ami láz		+
Zselatin	+	+
Foszfatáz	-	nincs adat
Nitrát-reduktáz	+	+ (98)
Ureáz	-
Eszkulináz	+	+ (98)
Szaporodás
5Z Nátrium-kloridban	-	nincs adat
Szalicilátban	-	nincs adat
Lizozim táptalajban	-	-(91)
Hasznosítás
Acetát	+	+
Benzoát	-	-(94)'
Citrát	-	+ (83)
Laktát	+	nincs adat
Malát	+	+ (84)
Mukát	-	—
Oxalát	-	nincs adat
Propionát	-	nincs adat
Piruvát	+	nincs adat
Szukcinát	+	+ (83)
Tartarát	—

-8193087

7.	táblázat folytatása
Az LL-D 42067	Gordon szerinti reakciói
Szaporodás	LL-D 42067	A. madurae (Gordon féle adatok)*
10°C	--	-
45° C		-(66)
53° C Sav-képzés
Adonitból	+	+ (91)
Arabinózból	+	+
Cellobiózból	+	+
Dextrinből	+	nincs	adat
Dulcitból	-	-
Eritritbó'l	-	-
Fruktózból	+	nincs	adat
Galaktózból	+	+ (84)
Glükózból	+	+
Glicerinből	-	+
Inozitből	-	+ (60)
Laktózból	-	+ (55)
Maltózból	-	+ (53)
Mannitból	+	+
Mannózból	+	+ (94)
Melibiózból	-	-
«X-Metil-d-glükozidból -	-
Raffinózból	változó	-
Ramnózból	+	+
Szalicinből	+	nincs	adat
Szorbitból	-	-
Szacharózból	+	nincs	adat
Trehalózból	+	+ (96)
Xilózból	+	+
ji-Metil-d-xilozidból +	nincs	adat

χ = A zárójelben megadott értékek a savtermelést %-ban jelzik abban az esetben, ha az nem 100%-os.

A találmány szerinti eljárás nem korlátozódik csupán a fenti jellemzőkkel rendelkező organizmusokra, hanem magába foglalja ezek természetben előforduló mutánsait és indukált mutánsait is. Mesterséges úton elő,állított mutánsok alatt a technika állásából ismert, szokásos, jnódon, mint például nitrogén-mustárral röntgen-, ultraibolya-besugárzással, N'-metil-N'-nitro-N-nitrozóguanidinnel, vagy aktinofágokkal történő kezeléssel előállított mutánsokat értjük.

Az LL-D 42067 β in vitro antibakteriális spektrumát agar lemez hígításos módszerrel,

Mueller-Hinton agart használva határoztuk meg. Inokulumként megközelítőleg 10⁴ telep50 képző egységet használunk.

A minimális inhibitor koncentráció (MIC)— mcg/ml-ben kifejezve — alatt azt a legkisebb LL-D 42067 β koncentrációt értjük, amely 35°C hőmérsékleten 18 órán át tartó inkubálás után gátolja a szaporodást.

Az eredményeket a 8. táblázatban foglaljuk össze. Az eredményekből jól látszik, hogy az LL-D 42067 β hatásos Gram-pozitív baktériu60 mok ellen és mérsékelten élesztők ellen.

-9193087

8«._.tábl ázat

LL-D 42067 β antibakteriális hatás-spektruma Vizsgált MIC (mcg/ml)

CA 300 512,00

Candida albicans

Saccharomyces cerevisiae

Mycobacterlum smegmatis

Bacillus subtilis

Bacillus cereus

Enterococcus

Streptococcus faecalis

Streptococcus mutáns Streptococcus mutáns Streptococcus sanguis Staphylococcus epidermidis

Staphylococcus epidermidis Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus

Staphylococcus' aureus

Micrococcus luteus Escherichia coli Escherichia coli AcineLobacter calcoaceticus

Y 15	512,00
ATCC 607 ATCC 6633 LL No. 4. OSI 75-1 SM 77-15	512,00 4,00 S 0,06 1,00 2,00
ATCC 29212 ATCC 27352-, Blil (b) G9I (a)	1,00 0,25 0,25 0,50
CMC 83-56	0,50
ATCC 12228	0,25
Smi th	0,50
LL No. 14	0,50
LL No. 27	*0,06
LL No. 45	0,12
ATCC 25923 PC 1001 No. 311 ATCC 25922	0,25 «0,06 512,00 512,00
STPD 79-17	512,00

Az LL-D 42067 β antibiotikum antibakte riális és antiparazita hatása következtében különböző területeken használható. így például antibakteriális szerként vagy a Gram-pozitiv baktériumok elleni antiszeptikus hatása ⁴θ következtében a bél bakteriális flórájának rendellenességei elfojtására vagy mint általános fertőtlenítőszer, például műszerek fertőtlenítésére. Használható ezen túlmenően malária kezelésében, mint protozoon-ellenes szer. 45 Fentieken kívül coccidiosis-ellenes-szerként alkalmazható a baromfitenyésztésben.

Terápiás célokra, a találmány szerinti eljárással előállított vegyűleteket szokásos gyógyszerészeti készítmények formájában 50 adagolhatjuk. Készíthetünk orális adagolású vagy helyileg alkalmazható készítményeket.

Az aktív hatóanyagot nem mérgező gyógyszerészeti hordozóanyagokkal keverhetjük össze. Ezek típusa az adagolás módjától függ. ⁵⁵

Fermentációs eljárás

Az Actinomadura madurae simaoensis NRRL 15734 törzsnek a tenyésztését igen sokféle folyékony táptalajban végezhetjük. Az új qq LL-D 42067 α antibiotikum termelésére alkalmas táptalajok asszimilálható szénforrást — például dextrint, cukrot, melaszt, glicerint és hasonló anyagokat — hasznosítható nitrogénforrást — például fehérjét, fehérje-hidrolizátumot, polipeptideket, aminosavakat, kukoricalekvárt és hasonlókat — valamint szervetlen anionokat és kationokat, például kálium-, nátrium-, ammónium-, kalcium-, szulfát-, karbonát-, foszfát- és kloridion — tartalmaznak. A nyomelemek—például bór, molibdén, réz, stb. — az egyéb alkotórészek szennyeződéseiként kerülnek a táptalajba. A tartályok, palackok és üvegek levegőztetését steril levegő átbuborékoltatásával vagy a fermentációs közeg felületére való levegöbefúvással biztosítjuk. További keverést mechanikus keverőkkel biztosítunk a fermentorokban. A táptalajhoz szükség esetén habképződést gátló anyagot, mint például olajat vagy szilikont is adhatunk.

Az LL-D 42067 α és LL-D 42067 β izolálása Az LL-D 42067 α antibiotikum izolálásánál á fermentlevet diatomaföldön átszűrjük, majd szerves oldószerbe, mint például metilén-kloridba átextraháljuk. Ezután szilikagéllel töltött oszlopon kromatográfiás módszerrel tisztítjuk. A nemkívánatos zsírokat hexán-etil-acetát 80:20 arányú elegyével távolítjuk el. A termék eluálását metilén-klorid és 1 % ecetsavat tartalmazó metanol elegyével végezzük. Az így kapott nyersterméket fordított fázisú folyadékkromatográfiás módszerrel tisztítjuk tovább, mozgó fázisként acetonitril-víz-ecetsav 600:400:0,28 arányú oldószerelegyet alkalmazva.

-10193087

Az LL-D 42067 β antibiotikum izolálásánál a fermentlevet diatomaföldön átszűrjük, majd szerves oldószerbe, mint például etil-acetátba átextraháljuk. Az extraktumot bepároljuk, majd heptán-metanol elegyben megosztjuk. A metanolos fázist bepároljuk. A kapott maradékot hexánnal trituráljuk, majd bepároljuk. A maradékot 1:1 térfogatarányú acetonitril-víz elegyében feloldjuk és bekoncentráljuk. Csapadék válik ki, amit fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás módszerrel tisztítunk, eluálószerként acetonitril-víz-ecetsav 3000:6000:5 arányú oldószerelegyet használva. Az aktív hatóanyagot tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, majd bepároljuk. A kapott vizes szuszpenziót etil-acetáttal extraháljuk. Az oldószer eltávolítása után tiszta LL-D 42067 β antibiotikumot nyerünk.

t. példa

Inokulum készítés

A tenyésztéshez használható táptalaj öszszetétele például a következő:

1,0%

2,0%

0,5%

0,1%

100,0%-ra feltöltve

Glükóz:

Dextrin:

Élesztő kivonat: N-Z Amin A¹: Kálcium-karbonát Víz = Hasnyálmirigy kivonat, gyártócég: Sheffield Chemical, Norwich, New York.

A fenti összetételű táptalaj pH-ját 7,2-re állítjuk be, majd sterilizáljuk. 100 ml steril táptalajt 500 ml-es edényekbe mérünk be, és a táptalajt oltókaccsal beoltjuk az Actinomadura madurae simaoensis NRRL 15734 mikroorganizmus ferde agaron fenntartott tenyészetéből. Az edényeket ezután forgó keverőre helyezzük és 20 fordulat/perc sebességgel kevertetjük 48 órán át,28°C hőmérsékleten. Ezt az inokulum tenyészetet használjuk 12 liter fenti összetétellel megegyező összetételű táptalajt tartalmazó fermentorok beoltásához. A tenyésztést itt 28°C hőmérsékleten 48 órán át végezzük. Az így kapott másodlagos inokulumot oltóanyagként használjuk.

2. példa Fermentálás

A következő táptalaj megfelelő a tartályfer mentorokban a tenyésztésre:

Szacharóz: 3,0 tömeg%

Szójaliszt: 1,5 tömeg%

Kukoricalekvár: 0,5 tömeg%

Kálcium-karbonát: 0,5 tömeg%

Víz: . 100,0 tömeg%-ra feltöltve

300 1 steril táptalajt az 1. példában ismertetett módon előállított 12 1 másodlagos inokulummal beoltunk. A fermentálást 28°C hőmérsékleten, 200 1/perc sebességű levegő-befúvatás, valamint egy 230 fordulat/perc sebességgel működő keverővei történő kevertetés mellett 135 — 159 órán át végezzük. Ezután a fermentlevet diatomaföldön átszűrjük.

3. példa

LL-D 42067 a izolálása a fermentléből

A 2- példában ismertetett módszer szerint végzett 5 fermentációs eljárás szörletét egye20 sítjük. Az így kapott 900 1 egyesített fermentlé pH-ját 7,5-re állítjuk be és 900 1 metilén-kloriddal extraháljuk. A szerves fázist vákuum alkalmazásával bepároljuk, 84,1 g maradékot ₅ kapunk. A bepárolt maradékból 75,2 g-ot 300 ml hexán-etil-acetát 80:20 arányú elegyében elszuszpendáljuk, majd szilikagéllel töltött oszlopon kromatografáljuk. Eluálásra öszszesen 4 I fentiekben ismertetett oldószerele10 gyet használunk, abból a célból, hogy a zsírokat és a szilikonolajat eltávolítsuk, majd ezután 4 1 metilén-klorid: 1 %-os ecetsav metanolban 9:1 arányú elegyét használjuk, 15 ml-es frakciókat gyűjtünk. A frakciókat vékonyrétegig -kromatográfiás módszerrel analizáljuk. Az LL-D 42067 a antibiotikum egy látható sárga foltot ad (Rf érték = 0,5) a fentiekben ismertetett oldószerrendszert használva futtatószerként. A 31-60 frakciókat, amik az antibioti20 kim többségét tartalmazzák, összeöntjük, vákuum alkalmazásával bepároljuk. 11,1 g vörös színű anyagot kapunk. Az így kapott anyagból

5,5 g-ot nagynyomású folyadékkromatográfiás módszerrel [Prep LC Systen-500, Prep·

PAK-500/C18 töltet, mozgófázisként acetonitril :víz:ecetsav 600:400:0,28 arányú elegyét használva, 100 ml/perc sebességnél 5,5 g/ /30 ml beadagolás] tisztítjuk. Harminc 200 ml-es frakciót gyűjtünk össze. Nagynyomású

3θ folyadékkromatográfiás analízissel megállapítottuk, hogy az LL-D 42067 α főtömegében az

5. frakcióban található. Az 5. frakciót egy éjszakán át állni hagyjuk. Sárga kristályok válnak ki, amit összegyűjtünk oly módon, hogy az anyalugot dekantáljuk, a kristályokat mossuk, szárítjuk. 11 mg LL-D 42067 a-át kapunk, sárga, kristályos formában. Az anyalugot bepároljuk. Az anyalúgból kiváló csapadékot centrifugáljuk. 377 mg LL-D 42067 a40 -át kapunk, sárga amorf, szilárd anyag formájában. A nagynyomású folyadékkromatográfiás analízis körülményei a következők: Kolonna: jj Bondapak C18, 3,9 mm x x 30 cm, Waters Assoc.

Mozgó fázis: acetonitril:víz:ecetsav (400:600:

:0,28)

Detektor: UV 254 nm és UV 365 nm, 0,2

AUFS

Áramlási sebesség: 1,0 ml/perc

LL-D 42067 a retenciős térfogata: 11,5 ml. A kapott anyag fizikai jellemzőit a leírás első része ismerteti.

⁵⁵ 4 példa

Inokulum hígítást sor készítése

A hígítási sor elkészítésénél például a következő összetételű táptalajon végezhetjük a tenyésztést:

⁶⁰ Dextróz: 1,0%

Dextrin: 2,0%

Élesztő kivonat: 0,5%

NZ Amin A’: 0,5%

Kálcium-karbonát: 0,1%

Víz: 100,0%-ra feltöltve

-11193087

Szacharóz:

Szójaliszt:

Kukoricalekvár

Kálcium-karbonát

Víz:

= Hasnyálmirigy kivonat, gyártócég: Sheffield Chemical, Norwich, New York.

A fenti összetétélű táptalajt sterilizáljuk, majd e táptalaj 100 mi ét oltókaccsal beoltjuk az Actinomadura madurae simaoensis NRRL 15734 deponálási számú mikroorganizmus ferde agaron fenntartott tenyészetéből. A tenyészetet ezután forgó keverővei kevertetjük és 48 — 72 órán át, 28°C hőmérsékleten tartjuk. Az elsődleges inokulumot ezután 10 1 fentivel megegyező összetétélű steril táptalajba oltjuk be, ahol 48 órán át, 28°C hőmérsékleten tartjuk. A másodlagos inokulumot egy 250 1 fenti összetétellel megegyező összetételű táptalajt tartalmazó fermentor tartályba oltjuk, ahol a levegőztetést 200 1 /perc sebességű steril levegő befúvásával biztosítjuk. A fermentálást 58 órán keresztül, 28°C hőmérsékleten végezzük. Az így kapott harmadlagos inokulumot oltóanyagként használjuk.

5. példa Fermentálás

A következő táptalajt használjuk a tartály fermentorokban:

3,0 tömeg%

1,5 tömeg%

0,5 tömeg%

0,5 tömeg %

100,0 tömeg%-ra feltöltve

A táptalajt sterilizáljuk, majd 300 1 steril táptalajt 125 1 az 1. példában ismertetett eljárással előállított harmadlagos inokulummal beoltunk. A fermentálást 28°C hőmérsékleten, 6,6 1/1 fermentlé levegőbefúvással és 110 fordulat/perc sebességgel működő keverővei történő kevertetés mellett 137 órán át végezzük. A táptalajhoz a habzás megakadályozására szilikon habzásgátlószert adagolunk be.

6. példa

LL-D 42067 β izolálása fermentléből

A 2. példában ismertetett fermentációs módszerrel 4500 1 fermentlét gyűjtünk össze, majd hozzáadunk 1 térfogat% diatomaföldet. Az elegyet 1 órán keresztül kevertetjük, majd pH-ját 3,0 — 0,3 értékre állítjuk be, koncentrált sósavat alkalmazva. Az elegyhez az össztérfogat felével megegyező térfogatú etil-acetátot adunk és az így kapott elegyet 3 órán át kevertetjük. Ezután a keverékhez 5 térfogat% diatomaföldet adunk, majd az elegyet leszűrjük. Az etil-acetátos fázist elkülönítjük, 5%-os vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal mossuk, majd bepáröljuk. Szirupszerű anyagot kapunk, amit heptán-metanol.2:l arányú elegyében megosztunk.

A 4,5 1 metanolos fázist bepároljuk és a maradékot hexánnal trituráljuk. A hexánt dekantáljuk,a maradékot szárazra pároljuk. Az így kapott anyagot fordított fázisú preparativ nagynyomású folyadékkromatográfiás módszerrel tisztítjuk tovább. A tisztítás körülményei:

Kolonna: PrepPAK*-500/C₁₈ töltet

Mozgó fázis: 1. Acetonitril:viz:ecetsav (8000: :12000:10)

2. Acetonitril:víz:ecetsav (3000: :6000:5)

Áramlási sebesség: 50 ml/perc

Frakciók: 200 ml/frakció

Minta adag: 2-3 g/30 ml adag.

Az 1. mozgófázist használva az LL-D 42067 β-át a 7-10. frakciókban kapjuk. A frakciókat egyesítjük és vákuum alkalmazásával bepároljuk abból a célból, hogy az aceto-nitrilt eltávolitsuk. A maradék vizes szuszpenziót térfogatával megegyező térfogatú etil-acetáttal kezeljük. Az etil-acetátos fázist elválasztjuk, majd egymás után egyenlő térfogatnyi 5%-os vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, és 0,1 n sósavval, majd kétszer vízzel mossuk. A szerves fázist vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk, majd szilárd termékig bepároljuk. A kapott szilárd anyagot ismét kromatográfiás módszerrel tisztítjuk, mozgófázisként a 2. fázist alkalmazva. Az LL-D 42067 β-át a 15-21 frakciókban kapjuk. Ezeket a frakciókat egyesítjük, a fenti módon ismertetett eljárással kezeljük. Tiszta LL-D 42067 β-át kapunk, sárga, szilárd anyag formájában. A kapott anyag fizikai tulajdonságai azonosak a leírás elején összefoglalt adatokkal.

7. példa

Coccidiosis-ellenes hatás vizsgálata Az LL-D 42067 α és LL-D 42067 β antibiotikumok coccidiosis-ellenes hatását csirkék fertőzöttsége esetében a következő vizsgálattal határozzuk meg:

Az állatok tápjának összetétele: Vitamin-aminosav premix 0,5 tömeg% Nyomelemek 0,1 tömeg%

Nátrium-klorid 0,3 tömegje

Dikalcium-foszfát 1,2 tömeg%

Őrölt mészkő 0,5 tömeg%

Stabilizált zsír 4,0 tömeg%

Hidrolizált lucerna, fehérje 17% 2,0 tömeg%

Kukoricacső liszt 5,0 tömeg%

Menhaden halliszt, fehérje 60% 5,0 tömeg%

Szójaolaj liszt, fehérje 44% 30,0 tömeg%

Őrölt sárga kukoricával kiegészítve 100,0 tömeg% A vitamin-aminosav premix összetétele a vetkező:

Hidroxi-toluol-butil-éter dl-Metionin A vitamin D₃ vitamin Riboflavin E vitamin Niacin Pantoténsav Kolin-klorid Polsav

Menadion-nátrium-hidrogén-szuifát kö125,0 mg 500,0 mg 3300,0 I.U. 1100,0 I.C.U

4,4 mg

2,2 I.U

27,5 mg

8,8 mg 500,0 mg L43 mg

1,10 mg

-12193087

Β,2 vitamin 11,00 meg

Őrölt sárga kukoricával kiegészítve: 5,00 g

5000 Eimeria acervulina spórás oociszta és a kezeletlen állatok 60-75%-os elhullásához elegendő számú Eimeria tenellat tartalmazó kevert inokulumot bőrön át egynapos csirkébe beoltunk. A vizsgálandó állatoknak a teljes vizsgálat alatt szabad táplálékot és ivóvizet biztosítunk. Két nappal a beoltás előtt az állatok különböző csoportjainak különböző dózis24 bán hatóanyagot tartalmazó tápot adunk. Hét nappal az oltás után az állatok testtömegét meghatározzuk, maid boncolás után a belső szervek károsodását is megvizsgáljuk. A vizs₅ gálát eredményeit a 9. és 10. táblázatban foglaljuk össze. A táblázat eredményeiből jól látszik, hogy a fertőzött állatok túlélése 0,2 - 5,0 ppm hatóanyagdózisnál jelentős mértékben javul. Ennél a dózisnál az Eimeria tenella és Eimeria acervulina által okozott károsodások jelentős mértékű csökkenése is megfigyelhető.

táblázat

A vizsgált vegyület	LL-D 42067 coccidiosis-ellenes hatása fertőzött csirkék esetében
A vegyület koncentrációja a tápban ppm	A vizsgált csirkék száma	2-os tói- A csökkent károsodásó csirkék részaránya 2
élés	E. tenella	E. acervulina
LL-D 42067 ok	5,0	5	60	100	100
LL-D 42067 ol	2,5	5	100	100	100
LL-D h2067 λ	',25	5	100	80	80
LL-D 42067 J,	0,75	5	100	40	60
LL-D 42067 Λ	0,40	5	100	0	0
LL-D 42067 c*.	0,20	5	80	0	0
Fertőzött,
kezeletlen
kontroll	0,00	20	25	0	0
LL-D 42067 -i	1,00	4	100	100	100
LL-D 42067 Λ	0,75	5	100	100	100
LL-D.42067 ot	0,50	5	100	100	100
LL-D 42067 ot	0,25	5	80	20	60
Fertőzött,
kezeletlen
kontroll	0,00	20	40	0	0

10. táblázat

LL-D 42067 £ coccidiosis-ellenes hatása fertőzött csirkék esetében.

A vizsgált vegyület	A vegyület koncentrációja a tápban ppm	A vizsgált csirkék száma	Z-os túl- élés	A csökkent károsodási
cs E.	írkék részaránya Z
tenella	E. acervulina
LL-D 42067/	5,0	5	80		100
LL-D 42067 /	2,5	5	100		100
LL-D 42067 Λ	1 ,00	5	80		80
LL-D 42067/	0,75	5	60		40
LL-D 42067 f>	0,50	5	40		0
Fertőzött,
kezeletlen
kontroll	0,00	20	35		0

8. példa

Coccidiosis-ellenes hatás fertőzött csirkék ⁵⁰esetében

Az LL-D 42067 a antibiotikum coccidiosis-ellenes hatását különféle coccidiosist előidéző organizmusokkal fertőzött csirkék esetében vizsgáltuk az alábbi módszer szerint. 55

Tíz-napos csirkék bőrébe nyolcszor, kereskedelmi coccidiosis-ellenes vakcinát — amely Eimeria fajták keveréke — oltottunk be az ajánlott koncentrációban. Az oltás előtt két nappal az állatok csoportjait különböző ható- ⁶⁰anyagdózisú táppal etettük. A beoltás után hat nappal az állatok belső szerveinek károsodását megvizsgáltuk. Minden egyes állatot egy 0-4 közé eső számmal jelöltünk, attól függően, hogy károsodtak-e, vagy sem, és milyen mér- ⁶⁵ tékben károsodtak; ezt a számot a csoportba tartozó állatok számával megszoroztuk. A károsodás százalékos csökkenését az alábbi összefüggés alapján számítjuk ki:

kezelt állatok pontszámainak összege

100- - χ 100 kontroll állatok pontszámainak összege

A vizsgálat eredményeit a 11. táblázatban foglaljuk össze. A vizsgálati eredményekből jól látszik, hogy a vizsgált ötféle Eimeria faj által okozott károsodás meggátolható, illetve jelentős mértékben csökkenthető már 0,2 ppm hatóanyagot tartalmazó táp adagolásával is.

-13193087

11. táblázat

LL-D 42067οι hatása csirkék coccidiosisa ellen

A vizsgált vegyület	A vegyület koncentrációja a tápban	A vizsgált csirkék száma	A károsodás százalékos csökkenése	E. maxima
E. tenella	E. acervulia	E. brunetti	E. necatrix
LL-D 42067 λ	1,25	15	100	95	100	100	100
LL-D 42067(/	1,00	15	100	91	100	,00	100
LL-D 42067¼	0,75	15	74	86	100	100	100
LL-D 42067*	0,40	15	52	62	89	100	72
LL-D 42067(/	0,20	15	31	24	64	82	0
Fertőzött, kezeletlen kontroll	0,00	15	7,7’	14*	9,3’	1,7*	11,

x ’ Átlagos károsodási pontszám összege/kontroll

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1/ Eljárás az (I) képletű LL-D 42067 a és a (II) képletű LL-D 42067 β jelzésű antibiotikumok előállítására, azzal jellemezve, hogy Actinomadura madurea simaoensis NRRL 15734 mikroorganizmus törzzsel vagy ennek valamely mutánsával vagy variánsával aerób körülmények között', asszimilálható szén- és nitrogénforrást, valamint szervetlen tápsókat tartalmazó, steril, folyékony táptalajon ferállatok csoportja roentálást végzünk, majd az antibiotikumot a táptalajból kinyerjük.

²⁰ 2/ Eljárás állatgyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, az 1. igénypont szerinti eljárással előállított vegyületet a gyógyszerkészítésben szokásosan használt hordozó és/vagy egyéb se²θ gédar.yagokkal összekeverve állatgyógyászati készítménnyé alakítunk.