DE2843702A1 - Neue antibiotische substanz und ihre herstellung durch zuechtung eines streptomyces - Google Patents

Neue antibiotische substanz und ihre herstellung durch zuechtung eines streptomyces

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DE2843702A1
DE2843702A1 DE19782843702 DE2843702A DE2843702A1 DE 2843702 A1 DE2843702 A1 DE 2843702A1 DE 19782843702 DE19782843702 DE 19782843702 DE 2843702 A DE2843702 A DE 2843702A DE 2843702 A1 DE2843702 A1 DE 2843702A1
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Description

RHÖNE-POULENO INDUSTRIES, PARIS
Neue antibiotische Substanz und ihre Herstellung durch. Züchtung eines Streptomyces
Die Erfindung betrifft eine neue antibiotische Substanz, welche im folgenden mit der Fr. 37454 KP bezeichnet wird und die der
Formel:
CH
entspricht, ihre Metallsalze ond ihre Salze mit Stickstoffbasen, das Verfahren zu ihrer Herstellung und die sie enthaltenden Zusammensetzungen.
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Das 37454 RP besitzt besonderes Interesse aufgrund seiner Anticoccidien-Wirkung.
Das 37454 RP kann erhalten werden ausgehend von geeigneten Kulturmedien für einen neuen Mikroorganismus, der im folgenden näher identifiziert wird und dem Genus Streptomyces angehört und die Bezeichnung Streptomyces gypseus DS 27461 (ITRRL 11168) besitzt.
Das 37454 RP ist eine Substanz mit saurem Charakter, dessen Neutraläquivalent, bestimmt an dem Produkt in Form der Säure, in lösung in einem Gemisch aus Methanol - Wasser (70-30 in Volumina) durch Bestimmung mit 0,1 N-Natriumhydroxid etwa 960 beträgt. Die folgenden physiko-chemischen Bestimmungen wurden am Natriumsalz durchgeführt, dessen Bruttoformel C48H81°18Na eirt~ spricht.
Aussehen: Weißes mikrokristallines Pulver
Löslichkeit (nach den Vorschriften der französischen Pharmakopee, IX. Ausgabe, 1972): Das 37454 RP (Natriumsalz) ist in Wasser praktisch unlöslich, wenig löslich in Hexan, löslich in chlorierten Lösungsmitteln wie Methylenchlorid und Chloroform, Alkoholen wie Methanol, Ketonen wie Aceton, Estern wie Äthylacetat und Dimethylformamid.
Elementaranalyse: ...
Das 37454 RP (Natriumsalz) enthält Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff ,und Natrium. Seine prozentuale Zusammensetzung beträgt etwa: f0 c 59,27 H 8,45 0 28,32 ITa 2,36 Berechnet für C48H81O18ITa: 59,49 8,42 29,72 2,37
488118
Verlust im Vakuum bei 600C unter 3 mm Hg = 0,3 fo Schmelzpunkt (bestimmt im Kapillarröhrchen): 198-199,50C Drehwert: Bestimmt in Lösung zu 0,974 $ in Methanol. Der Drehwert von 37454 RP (Natriumsalz) beträgt etwa:
foü20 = + 2,3 + 0,6° ßKj20 = + 1,3 + 0,6°
D ' - - 436
Ultraviolettspektrum: Das 37454 RP (Natriumsalz) zeigt keine charakteristische Absorption.
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Infrarotspektrum (Bestimmung an Preßlingen in Mischung mit KBr).
Dieses Spektrum ist in eier beigefügten Figur 1 wiedergegeben, worin als Abszisse einerseits die Wellenlängen, ausgedrückt in Mikron (obere Inschrift) und andererseits die Wellenzahlen in cm (untere Eintragung) aufgetragen sind und auf der Ordinate sind die optischen Dichten angegeben.
Tabelle I
3560 "Sch" 1310 m 945 "Sch" tF = sehr stark -
3420 F(H2O) 1300 "5oh" 915 m m = mittel
3300 m 1288 m 900 m tf =. sehr sehwach
3260 »Sch.» 1262 tf 895 "Sch" F — stark
,3000 «Sch.» 1245 m 880 f f= schwach
2980 F 1230 m 860 f Sch= Schulter
2955 «Sch.» - *. 1215 "Sch" 858 "Sch"
2940 m 1200 "Sch" 830 tf
2915 m 1188 F 808 f
2898 »Sch.» 1162 F 780 f
2865 «Sch.» 1140 "Sch" 720 "S-ch" '
2860 "Sch". 1130 »Sch» 710 m
2838 tn 1120 F 690 "Sch"
2660 tf 1105 tF 665 f •
2360 tf (CO,) 1098 "Sch" 660 "Sch"
2080 tf 1082 F 630 m
1718 tf 1070 tF 615 f
1620 F 1060 "Sch" 580 f
1460 F 1052 F 5.50 »Sch»
1450 »Sch.» 1045 "Sch" 540 m
1438 "Sch" 1040 "Sch" 525 tf
1428 »Sch» 1035 "Sch" 518 tf
1410 "Sch" 1020 F 500 m
1405 m 1010 "Sch" 470 "Sch"
1375 m 995 m 452 f
1362 F 985 F 412 f
1345 »Sch» 970 "Sch" 400 "Sch"
1335 »Sch» 955 F 340 m
1320 »Sch» 950 Cl
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ORIGINAL INSPECTED
Magnetisches Kemresonanzspektrum des Protons in deuteri ertem Chloroform: Dieses Spektrum, welches in der Figur 2 dargestellt ist, wurde auf einem Spektrometer GiMECA TFS-25O bei einer Frequenz von 250 MHz ausgehend von einer Lösung mit etwa 40 mg/ccm in deuteriertem Chloroform bestimmt. Es weist die folgenden Charakteristika auf (die chemischen Verschiebungen sind positiv in p.p.m. gezählt gegen die schwachen Felder in Bezug auf TMS, das als interner Bezug genommen wird.
Chemische Verschiebung in Form des Signals;
p.p.m. Kupplungskons tant e (J)
1,0 Düblett, j = 6,5 Hz
1,03 - . Dublett, j = 6,5 Hz
1,06 Dublett j = 6,5 Hz
1,09 Dublett J = 6,5 Hz
1,17 Singulett
1,24 Dublett, j = 6,5 Hz
1,30 Singulett
1,2 bis 1,6 Multiplett
1,62 Singulett
1,80 massiv
1,9 bis 2,5 Multiplett
2,8 doppeltes Triplett
3,2 bis 3,7 Multiplett
3,36 Singulett
3,38 Singulett
3,43 εί^μΐβΐΐ
3,47 Singulett
3,57 Singulett
3,7 bis 4,2 Multiplett
4,3 bis 4,6 Multiplett
5,98 weites Singulett
6,7 weites Singulett
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Nach diesem Spektrum enthält das 57454 EP (Natriumsalz) 5 Methoxygruppen.
Kernmagnetisches Resonanzspektrum von G in deuteriertem GhIoroform: Dieses Spektrum, welches in der Figur 5 dargestellt ist, wurde auf einem WH 90 Brükerspektrometer bei einer Frequenz von 22,65 MHz ausgehend von einer lösung mit etwa 200 mg/ccm in
deuteriertem Chloroform aufgezeichnet. Es weist die folgenden Charakteristika auf (die chemischen .Verschiebungen sind positiv gegen die schwachen Felder in Bezug auf das deuterierte Chloroform gemessen, das als interner Bezug bei 77>O p.p.m. des IMS
genommen ist und sind in p.p.m. bezogen auf TMS = 0 ausgedrückt:
Chemische Verschiebung
p.p.m. bezogen auf TMS		 -Signalform bei dem unter
off-Resonanz aufgenommenen
Spektrum
11,1 Quadruplett
11,7 Quadruplett
12,3 Quadruplett
12,7 und 12,7 Quadruplett
13,6 Quadruplett
18,4 Quadruplett
27,0 Quadruplett
28,5 Quadruplett
23,2 Triplett
24,3 Triplett
25,7 und 25,7 Triplett
29,2' Triplett
30,6 Triplett
31,2 " Triplett
32,5 Triplett
36,9 Dublett
38,7 Dublett
39,1 Dublett
46,2 Dublett
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Chemis ch.e Ters cni ebung p.p.m. Form des Signals bei dem unter off-Resonanz aufge
bezogen auf OMS nommenen Spektrum
Dublett
47,0 Quadruplett
50,8 Quadruplett
56,7 Quadruplett
59,2 Quadruplett
60,2 Quadruplett
60,9 Dublett
61,3 Dublett .
66,7 Dublett .
71. a Dublett
74,3 und 74,3 Dublett
79,3 und 79,3 Dublett
79,7 Dublett
80,3 Dublett.
80,7 Dublett
82,8 Dublett
83,6 Dublett
85,5 Singulett
78,5 Singulett
83,3 Dublett
94,5 Singulett
98,2 Singulett
98,2 ι
I		 Düble tt_
102,5 Singulett
106,8 Singulett
178,4
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Nach diesem Spektrum enthält das 37454- RP.(Natriumsalz) 48 Kohlenstoff atome .
Massenspektrum: Das Massenspektrum bei Feiddesorption liefert für das Natriumsalz einen molekularen ρ eak entsprechend einer Masse von 968 (theoretischer Wert: 968).
Chromatographische Wanderung: Das 37454 EP (Natriumsalz) kann durch aufsteigende DünnschichtChromatographie mit Siliciumdioxidgel charakterisiert werdenjbei Verwendung eines G-emisches Methylenchlorid-Methanol (94-6 in Volumina) beträgt der Rf-Wert 0,75. '
Bakteriostatische Aktivität in vitro; Die bakteriostatische Aktivität des 37454 RP (Natriumsalz) wurde gegenüber einer gewissen Anzahl von Keimen nach einer der üblichen für diesen Zweck verwendeten Verdünnungsmethoden bestimmt. 51Ur jeden Keim wurde die kleinste Konzentration an aktiver Substanz bestimmt, welche unter definierten Bedingungen jegliche sichtbare Entwicklung auf einem geeigneten Nährmedium verhindert. Die Ergebnisse der verschiedenen Bestimmungen sind in der folgenden Iabelle zusammengestellt, wo die minimalen bakteriostatischen Konzentrationen in MikrogrammZSubstanzZccm Versuchsmedium angegeben sind.
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COPY
28437Ü2
Untersuchte bakterielle Organis
men		 Minimale balcteriostatische
Konzentrationen (in jig/ccm)
Staphylococcus aureus, Stamm "209 P-
AICC 6538 P
Staphylococcus aureus, Stamm Smith
Sarcina lutea - ATCC 9341
Streptococcus faecalis - ATCC 8043
Streptococcus pyogenes hemolyticus,
Stamm Dig "η (Institut Pasteur)
Diplococcus pneumoniae, Stamm TiI
, (Institut Pästeur)
Neisseria catarrhalis (A 152,
Institut Pasteur)
Bacillus subtilis - ATCC 6633
Bacillus cereus - ATCC 6630
Mycobacterium species - ATCC 607
Escherichia coli - ATCC 9637
Shigella dysenteriae, Shiga L
(Institut Pasteur)
Salmonella schottmuelleri (paratyphi B),
Stamm Fougenc.(Institut Pasteur)
Proteus vulgaris
Pseudomonas aeruginosa		 0,6
0,8
0,9
0,3
0,6
0,1
> 20
0,8
0,3
ίο .
>50
. >50
. > 5°
>50
Akute Toxizität: An der Maus beträgt die 50 $-ige letale Dosis 0) 90 mg/kg p.o. nach, einmaliger Verabreichung.
Anticoccidien-Wirksamkeit: Die Anticoccidien-Wirksamkeit wurde an dem Küken, das insbesondere mit Eimeria tenella und Eimeria acervulina infiziert wurde, bestimmt.
Die anticoccidielle Aktivität von 37454 RP (Natriumsalz), wenn
es dem Futter für Küken einverleibt wurde,zeigt sich in nicht toxischen Konzentrationen zwischen 0,005 und 0.04 Gewichts-^ Produkt, enthalten in dem Futtermittel.
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COPV
Der Erzeugerorganismus des Antibiotikums 57454 RP ist ein Streptomyces-Stamm, der aus einer Erdprobe, entnommen in Algerien, isoliert wurde und dem man die Ur. DS 27461 zuordnete. Dieser Organismus wurde im Agriculture Research. Service (ARS) des US-Departments of Agriculture in Peoria, 111. (USA) hinterlegt, wo er unter der Hr. URRL 11168 registriert wurde. Eine Probe von S.gypseus (ERR! 11168) kann von dort unter Bezugnahme auf äie vorliegende Veröffentlichung bezogen werden.
Dieser Organismus weist Eigenschaften auf, wodurch man ihn nicht einer bereits beschriebenen Spezies zuordnen konnte und ist deshalb als eine neue Spezies anzusehen und wurde mit der Bezeichnung Streptomyces gypseus, DS 27461 versehen.
Die Isolierung dieses Stammes wurde nach der allgemeinen Methode bewirkt, die darin besteht, daß eine kleine Menge der Erde in destilliertem sterilem Wasser suspendiert wurde, die Suspension wurde auf verschiedene Konzentrationen verdünnt und ein kleines Volumen jeder Verdünnung wurde auf die Oberfläche von Petrischalen gegeben, welche ein G-elose-Nährmedium enthielten. !fach Inkubation von einigen lagen bei 260C, wodurch die Mikroorganismen sich entwickeln konnten, wurden die Kolonien, welche man zwecks weiteren Studiums isolieren wollte, entnommen und wieder auf Gelose-Nährmedien piquiert, so daß man davon reichlichere Kulturen erhielt.
Streptomyces gypseus DS 27461 bildet ovale Sporen der Abmessungen 0,9 bis 1,2 ^i/0,5 bis 0,8 u, deren Wand bei Beobachtung im Elektronenmikroskop glatt (smooth) erscheint. Seine Sporenkette umfaßt im allgemeinen 10 bis 20 Sporen; sie sind üblicherweise unter Bildung von mehr oder weniger offenen Spr.ralen mit 1 bis 5 oder 4 Windungen aufgerollt und sind meietc-.-i.3 entlang eine: Fadens unter Bildung von mehr oder weniger langen Trauben gruppiert. Aufgrund seiner Art und Weise der Sporulation wird dieser Stamm in die Sektion Spira nach der Klassifikation von Pridham
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eiugeordnet.
Der Streptomyces gypseus DS 27461 entwickelt sich gut bei 26 bis 37 C, jedoch nicht bei 5O0C. Er weist ein sporuliertes Luftmycel von weißer Farbe auf. Sein vegetatives My eel ist im allgemeinen von gräulich bis grau-bräunlich oder schwach gelblich-braun gefärbt; manchmal jedoch auf bestimmten Nährmedien wie Glycerin-Asparagin-Gelose oder Gluco-se-Pepton-Gelose
vermögen sich manche Zonen rötlich oder violett zu färben. Auf der Mehrzahl der Gelose-Medien, wo er gezüchtet wird, bildet er lösliche Pigmente von bräunlicher bis grau-brauner oder schwach gelb-brauner, manchmal braun-rosa Farbe.
In seinen bei 260C bewirkten Züchtungen weist er folgende biochemische Eigenschaften auf:
Melaninerzeugung : negativ
Erzeugung von HpS ί negat iv
lyrosinase : negativ
Verflüssigung der Gelatine s positiv
Verwertung der Zellulose : negativ
Erzeugung von Nitriten aus Hitraten : negativ auf Hitratnähr-
bouillon; positiv auf
synthetischen Bouillons
Hydrolyse der Stärke : positiv
Züchtung auf entrahmter Milch : weder Koagulation noch
Peptonisation; pH un
verändert in 1 Monat
Seine Fähigkeit zur Verwertung verschiedener ICohleustoff quellen zur Sicherung seiner Entwicklung wurde nach dem Prinzip der Methode von Pridham und Gottlieb (J. of Bact. 56, 107-114, 1948)
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bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt:
Untersuchte Kohlen Verwertung
stoff quellen
D-Glucose positiv
D-XyIose positiv
L-Arabinose positiv
L-Rhamnose positiv
D-Pructose positiv
D-Galactose positiv
Raffinose positiv
D-Mannit positiv
Inosit positiv
Salicin negativ
Saccharose positiv
Die Züchtungseigenschaf ten von Streptomyces gypseus DS 274-61 sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt. Es sind diejenigen von Züchtungen, welche ein gutes Entwicklungsstadium, erreichten, d.h. etwa 2 - 5 Monate bei 260C, wenn nichts anderes angegeben ist. Seine Eigenschaften wurden auf Hähr-Gelose bzw. Nähr-Agar und Bouillons, die üblicherweise zur Bestimmung der morphologischen Eigenschaften von Streptomyces-Stämmen verwendet werden, beobachtet, wobei die Züchtungen auf den G-elose-Medien auf Schräg-Agar erfolgten. Eine bestimmte Anzahl der angewandten Züchtungsmedien wurde nach den Formulierungen hergestellt, wie sie in dem Buch "The Actinomycetes", S.A. Waksmau, Seite 193-197, Chronica Botanica Company,Waltham,Mass.,USA,1950 angegeben sind; in diesem Fall sind sie durch den Buchstaben ¥ mit anschließender Aagabe der Hummer, womit sie in den "The Actinomycetes" bezeichnet sind, gekennzeichnet.
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Die J1UUdStBlIeTi oder Zusammensetzung der anderen Züchtungsmedien sind die folgenden:
Ref. A. "Hickey and !Dresner's Agar" - T. G. PRIDHAM und Mitarb. Antibiotics Annual, 1956 - 1957, S. 950 Ref. B. »Bennett's Agar» - S.A. WAKSMAN - The Actinomycetes, Bd. 2, S. 531, Fr. 30 - The Williams and Wilkius Company, Baltimore, 1961
Ref. C. Formulierung ¥-23, 'versetzt mit 2 # Gelose. (Agar) Ref. D. »Teast Extract Agar» - T.G. PRIDHAM und Mitarb. - Antibiotics Annual 1956 - 1957, S. 950
Ref. E. "Tomato Paste Oatmeal Agar" - T.G. PRIDHAM und Mitarb. Antibiotics Annual, 1956 - 1957, S. 950 Ref. F. »Melanin formation medium" - S.A. WAKSMAU - The Actinomycetes, Bd. 2, S. 333, Nr. 42 - The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961
Ref. G. GRUUDY und Mitarb.-Antibiotics and Chem. 2j_ 401, 1952 Ref. H. "Inorganic Salts - Starch Agar" - T.G. PRIDHAM und Mitarb. - Antibiotics Annual, 1956 - 1957, S. 951 Ref. I entspricht der Formulierung W-1, wobei 3 $ Saccharose ersetzt sind durch 1,5 # Glucose
Ref. J. entspricht der Formulierung W-1, wobei 3 f° Saccharose ersetzt sind durch 1,5 # Glycerin
Ref. K. entspricht der Formulierung W-18, wo 3 $ Saccharose ersetzt sind durch 1,5 # Glucose
Ref. L. entspricht der Formulierung W-18, wo die Saccharose weggelassen ist und ersetzt ist durch kleine Streifen Filterpapier, die teilweise in die Flüssigkeit eintauchen Ref. M. Bacto Nitrate Broth (Difco)
Ref. IT. "Plain gelatin" - hergestellt nach den Angaben von "Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria" - Society of American Bacteriologists, Genf, N.Y. - IIcq-18 Ref. P. Entrahmte Milch als handelsübliches Pulver zubereitet nach den Angaben des Erzeugers
Ref. Q. Milieu, angegeben zur Untersuchung der HpS - Erzeugung durch: H.D. TRESNER und F. DAHGA - Journal of Bacteriology, 26, 239-244, 1958.
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Kulturmilieu
Entwicklungsgrad
Vegetatives Mycel (v.M.) oder Unterseite der Kultur
Sich an der Luft ■befindliche Organe (enthaltend das gesamte luftmycel und die Sporulation
lösliches
Pigment
Beobachtungen und biochemische Eigenschaften
Gelose von Hickey und Tresner (Ref. A)
ziemlich gut
ca
α
co
G-elose von Bennett (Ref. B)
Gelose von Emerson (Ref. C)
Hefeextrakt-Gelose von Pridham (Ref. D)
Gelose mit Hafermehl und Tomatenextrakt von Pridham (Ref.E)
gut
gut
sehr gut
gut
v.M. graubräunlich
v.M. schwach bräunlich
v.M. braungelb-gräu lich
v.M. graubraun
v.M. graubraun bis braun-violett
weiß, sehr mäßig entwickelt
weiß, mäßig entwickelt
weißlich, sehr
mäßig entwickelt
weiß, mäßig entwickelt
weiß, sehr mäßig entwickelt
braun-rosa
braun-gelb,
ziemlich
schwach
braun-οrange, sehr
schwach
braun-gelb,
ziemlich
schwach
bräunlich,
ziemlich
schwach
ovale Sporen mit den Abmessungen 0,9 bis 1,2 ,μ/0,5 bis 0,8 μ, die 'Sporenketten sind in Form von Spiralen mit 1 bis 3 oder 4 Windungen aufgerollt, knäuelartige Sporo phoren
rs» co
-P-O)
(N)
Kulturmilieu
Entwicklungsgrad
Vegetatives Mycel (v.M.) oder Unterseite der Kultur
Sich an der Luft befindliche Organe (enthaltend das ge samte Luftmycel und die Sporulation
Lösliches
Pigment
Beobachtungen und biochemische Eigenschaften
Glucose-Pep-
ton-Gelose
(W-7)
Nährgelose
(W-5)
Hefe-Tyrosinextrakt-Gelose zur
Bildung von
Melanin
(Ref- P)
malat-Gelose von
Krainsky
(Ref. G)
Ovalbumin
Gelose
(W-12)
Glucose-Yisparagin
Geloüe
(¥-2)
ziemlich
gut
mäßig
mäßig
ziemlich
gut
sehr unergiebig
unergiebig
v.M. graubräunlich, sich stellenweise violett-rötlich verfärbend
Unterseite braun-gelb
Unterseite gelb-bräunlich
Unterseite braun-gräulich
v.M. farblos bis gräulich
v.M. farblos bis gräulich, Unterseite hellgelblich
weiß, sehr mäßig entwickelt
grau-braunrosa
weiß, sehr mäßig entwickelt
weiß, sehr mäßig entwickelt
schwach
braun-gelb
keines
weiß, mäßig entwickelt
keine
keine
schwach
gräulich
keines
keines
Bildung von Melanin: Negativ (die Ablesungen wurden gemäß den Empfehlungen des Autors durchgeführt)
Keine Auflösung von O.alciummalat
-P-CJ
Kulturmilieu
Entwicklungsgrad
Vegetatives Mycel (v.M.) oder Unterseite der Kultur
Sich, an der Luft befindliche Organe (enthaltend das gesamte luftmycel und die Sporulation
Lösliches Pigment
Beobachtungen und biochemische Eigenschaften
Glycerin-Asparagin-Gelose
(W-3)
Stärke-Mineralsalze-Gelose von
Prid.ham
(Ref.H)
Stärke-Nitrat-Gelose
(W-10)
Synthetische
Saccharose-Gelose von
Czapek (YT-I)
Synthetische
Glucose-Gelose von Czapek
(Ref. I)
mäßig
ziemlich gut
mäßig
ziemlich gut
ziemlich gut
v.M. graugelb-bräunlich, mit einigen violett-rötlichen Zonen
v.M. bräunlich
Unterseite graugelb
Unterseite braun-gelb
v.M. graubräunlich, Unterseite braun-gelb
weißlich, in Form von Spuren
weiß, mäßig entwickelt
weißlich, sehr mäßig entwickelt
weiß, sehr gut entwickelt
weiß,ziemlich gut entwickelt
sehr
schwach bräunlich
schwach grau-bräunlich
schwach braun-gelblich
grau-braun
grau-braun
ovale Sporen mit den Abmessungen 0,9 bis 1,2 /Jt/0,5 bis 0,8 u, die Sporenketten J sind in Form von Spiralen mit 1 bis oder 4 Windungen aufgerollt, Stärkehydrolyse: Positiv
Stärkehydrolyse: Posi« tiv
Ts
Kulturmilieu Entwick Vegetatives Sich an der Luft Lösliches f schwach Beobachtungen und
lungsgrad Mycel (v.M.) befindliche Organe Pigment braun-gelb biochemische Eigen
oder Unterseite (enthaltend das ge schaften
der Kultur samte Luftmyeel und
die Sporulation keines
Synthetische ziemlich v.M. braun weißlich in Form
Glycerin-Ge- gut gelblich, von Spuren
lose von Unterseite keines
Czapek (Ref.J) braun-gelb
Stärke-Nrlxrat- ziemlich ziemlic2;i gut aus- weißlich, in Form Bildung von Nitriten:
ίο Brühe (W-19) gut gebild eter.Sghlei -von Spuren Positiv
O er,v.M.weiß-gelbl keines
CO Synthetische sehr mas weißliche Kultur keine Bildung von Nitriten:
GO Glucose-Brühe sig an der Oberflä Positiv
cn von Czapek
(Ref. K)		 che
Synthetische »
Zellulose- keine keines Keine Verwertung von
Brühe von Zellulose
Czapek
(Ref. L)
Nitrat-Nähr
brühe (Ref. M) ziemlich ziemlich gut aus weiß, mäßig ent Bildung von Nitriten:
gut gebildeter Ring, wickelt Negativ (die Kontrol
Unterseite hell len wurden nach
gelblich 24 Stunden, 48 Stun
den, 7 Tagen, 15 Taget]
bzw. 28 Tagen Inkuba
tion bei 26OC durchge
führt)
Kulturmilieu Entwick Vegetatives Sich an der Luft lösliches Beobachtungen und > NJ Keine Koagulation.
lungsgrad Mycel (v.M.) befindliche Organe Pigment v biochemische Eigen ι
'Gelatineverflüssigung:		 OO Keine Peptonisierung
oder Unterseite (enthaltend das ge schaften Gut •P- pH-unverändert wäh
der Kultur samte Luftmycel und CO rend 1 Monats
die Sporulation -J Bildung von HpS: ne
Reine12$-ige gut v.M. weiß- weiß, in Por,m von hell-gelb O gativ (die Ablesungen
Gelatine
(Ref. N)		 gräulich Spuren wurden gemäß den
Kultur auf gut v.M. sehr weiß, sehr mäßig ent schwach Empfehlungen des Autors
co Kartoffeln dicht und sehr wickelt grau-bräun durchgeführt).
en (¥-27) gefaltet, lich
Uv
CO		 schwach bräun
lich
Oi
Kultur auf sehr un v.M. gräulich, keine keines
Karotten ergiebig sehr unergie
Cj
—»		 (W-28) big entwickelt
entrahmte mäßig cremefarbener keine •keines
Milch bis braun-rosa
(Ref. P) farbener Ring
Gelose von ziemlich v.M. grau-bräun- weißlich, in Form braun-gelb
Tresner und gut •'•ΧΟΆ von Spuren
uanga
IRef. Q;
28A3702
Die Gesamtheit der von Streptomyces gypseus DS 27 461 aufgezeigten Eigenschaften fällt nicht exakt mit irgendeiner derjenigen zusammen, die als Spezies in den üblichen Fachschlagewerken beschrieben -werden (Bergey's Manual of Determinative Bacteriology - 7. Ausgabe, 1957 und 8. Ausgabe 1974, sowie "The Actinomycetes" - S.A. WAKSMAlT, Ehe Williams and Wilkins Company, 1961). Aus diesem Grunde muß er als eine neue Spezies angesehen werden. In der Tat besitzt S. gypseus DS 27 461 ein sporuliertes Luftmycel mit weißer Farbe, ergibt keine Melaninpigmente auf organischen Milieus und bildet Sporenketten, die sich in Form von Spiralen aufrollen und Sporen, deren mit dem Elektronenmikroskop beobachtete Wand glatt erscheint. Die Spezies, der er sich unter den beschriebenen am stärksten annähert, ist Streptomyces albus, der auch die 4 vorstehend beschriebenen Merkmale besitzt und überdies ein vegetatives Mycel bildet, das farblos bis cremefarben oder bräunlich sein kann und,wenn er ein lösliches Pigment bildet, sein Kulturmilieu bräunlich färbt. Im Gegensatz zu S. albus, der im allgemeinen auf sämtlichen seiner Kulturmilieus kein lösliches Pigment bildet, ader lediglich gelegentlich ein bräunliches lösliches Pigment ergibt, bildet S.gypseus DS 27 461 weitaus häufiger auf seinen Gelose-Kulturmilieus lösliche Pigmente mit bräunlicher bis grau-brauner oder schwach braun-gelber Farbe, die zuweilen braun-rosa gefärbt sind. Überdies bildet S.gypseus DS 27 461 im Gegensatz zu S. albus auf bestimmten Gelosemilieus insbesondere auf Glucose-Pepton-Gelose und Glycerin-Asparagin-Gelose ebenso wie bei seiner Kultivierung auf entrahmter Milch ein vegetatives Mycel, das dazu neigt, sich teilweise rosa-rötlich bis violettartig oder violett zu färben. Es muß ebenfalls festgestellt werden, daß S.gypseus DS 27 461 ein hellgelbes, lösliches Pigment auf Gelatine bildet, entrahmte Milch, deren pH er während eines Monats nicht nennenswert ändert, weder peptonisiert, noct koaguliert und auf Karotten lediglich eine außerordentlich unergiebige Entwicklung ergibt,während S.albus auf Gelatine kein lösliches Pigment bildet, entrahmte Milch koaguliert und sie rasch unter Alkalinisierung peptonisiert
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und sich, auf Karotten ausgezeichnet entwickelt. Schließlich verwertet S.gypseus DS 27461 L-Arabinose, L-Rhamnose, Raffinose und Inosit und verwertet nicht Salicin, während S.albus keine L-Arabinose, L-Rhamnose, Raffinose und Inosit verwertet und Salicin verwertet.
Das Verfahren zur Herstellung von 37454 RP besteht im wesentlichen darin, Streptomyces gypseus DS 27461 oder seine Erzeugermutanten auf einem Milieu unter geeigneten Bedingungen zu kultivieren und das gebildete Produkt im Verlauf der Kultur absut rennen.
Die Kultur von Streptomyces gypseus DS 27461 kann nach jeder aeroben Kulturmethode an der Oberfläche oder in der Tiefe erfolgen, wobei jedoch die letztere aus Gründen der Einfachheit zu bevorzugen ist. Man verwendet zu diesem Zweck verschiedene Torrichtungstypen, die in der Fermentationsindustrie geläufigerweise verwendet werden.
Man kann insbesondere den folgenden Weg für die Durchführung der Arbeitsgänge anwenden:
Streptomyces gypseus DS 27461-Stammcharge
♦■
Kultur auf Gelose
Kultur in einem gerührten ELäschchen
Inokulumkultur in einem Permentator Erzeugungskultur in einem Permentator
Das Fermentationsmilieu muß im wesentlichen eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und eiuo assimilierbare Stickstoffquelle, mineralische Elemente, und eventuell Wachstumsfaktoren enthalten, wobei sämtliche dieser Elemente von genau definierten Produkten. oder Komplexen Gemischen, wie man ihnen bei biologischen Pro-
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dukten verschiedenartigen Ursprungs begegnet, eingebracht werden können.
Als assimilierbare Kohlenstoffquellen kann man Kohlenhydrate, wie Glucose, Saccharose und andere Kohlenstoff-haltige Substanzen wie die Zuckeralkohole (Mannit) verwenden. Bestimmte tierische oder pflanzliche Öle wie Specköl oder Sojaöl können in vorteilhafter Weise diese verschiedenen Kohlenstoffquellen ersetzen oder ihnen.beigegeben werden.
Die geeigneten Quellen für assimilierbaren Stickstoff sind ausserordentlich verschiedenartig. Sie können sehr einfache chemische Substanzen sein, wie die Mineralsalze oder organischen Ammoniumsalze, Harnstoff und bestimmte Aminosäuren. Sie können aber auch durch komplexe Substanzen eingebracht werden, die hauptsächlich Stickstoff in protidischer Form enthalten, wie: Casein, Lactalbumin, Gluten und deren Hydrolysate, Soja-, Erdnuß- und Fischmehl, Fleischextrakte, Hefe, lösliche Brennereirückstände und Maismaischwasser.
Unter den eventuell beigegegebenen mineralischen ^lementen können bestimmte eine puffernde oder neutralisierende Wirkung besitzen, wie die Alkali- oder Erdalkaliphosphate oder wie Calcium- oder Magnesiumcarbonate. Andere führen zu dem für die Entwicklung von Streptomyces gypseus DS 27461- und die Bildung von 37454 RP erforderlichen ionischen Gleichgewicht, wie die Chloride und Sulfate der Alkali- und Erdalkalimetalle. Schließlich wirken bestimmte in spezieller Weise als Aktivatoren für die metabolischen Reaktionen von Streptomyces gypseus DS 27461, nämlich die Zink-, Kobalt-, Eisen-, Kupfer- und Mangansalze.
Die Wachstumsfaktoren sind !Produkte von vita^-inischer Eaiur, wie Riboflavin, Polsäure und Pantothensäure.
Der pH des Fermentationsmilieus zu Beginn der Kultur muß zwi-
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schen 6,2 und 7,8 und vorzugsweise zwischen 6,6 und 7,4 liegen. Die für die .Fermentation optimale Temperatur liegt zwischen 25 und 3O0C, jedoch wird eine zufriedenstellende Erzeugung auch bei Temperaturen zwischen 23 und 33°C erhalten. Die Luftzufuhr für die Fermentation kann innerhalb ziemlich breiter Werte variieren. Man hat jedoch gefunden, daß Luftzufuhren von 0,3 bis 3 1 Luft je 1 Brühe und je Minute sich besonders gut eignen. Die maximale Ausbeute an 37454 RP wirdnach 4-bis 8-tägiger Kultur erhalten, wobei diese Dauer im wesentlichen von dem verwendeten Milieu abhängt.
Aufgrund des Vorstehenden ist es verständlich, daß die allgemeinen Bedingungen für die Kultur von Streptomyces gypseus DS 27461 zur Erzeugung von 37454 EP innerhalb eines breiten Bereichs variieren und jeden speziellen Erfordernissen angepaßt werden können.
Das 37454 EP kann aus Fermentationswürzen in der folgenden Weise
isoliert werden:
Die Würze wird bei einem sauren pH im allgemeinen zwischen 2 und 5 und vorzugsweise um 3 in Anwesenheit eines Piltrationsadjuvans
filtriert.
Die in dem Filtrationskuchen zurückgehaltene Aktivität wird hieraus mit Hilfe eines geeigneten organischen Lösungsmittels wie eines niedrigen Alkohols wie Methanol oder eines chlorierten Lösungsmittels wie Methylenchlorid extrahiert. Das Eohprodukt kann ausgehend von den vorstehend genannten organischen Lösungen durch Kiistallisation nach Einengen seiner Lösungen unter vermindertem Druck, etwaige Zugabe eines schlechten Lösungsmittels oder eines Nichtlösungsmittels und Aufbewahrung in einer Kühlkammer isoliert werden.
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Das 37454 RP kann ge nachdem, ob es in Form der Säure oder des Salzes vorliegt, nach gebräuchlichen klassischen Methoden, wie die Kristallisation oder die Chromatographie an verschiedenen Absorptionsmitteln oder die Gregenstromvert eilung,gereinigt werden. Die Überführung der 37454 RP-Säure in eines ihrer Salze oder umgekehrt und die Überführung eines Salzes in ein anderes werden unter Anwendung üblicher Methoden bewirkt.
"Verwendbare Salze sind z.B. das natrium-' und Kaliumsalz.
Das folgende Beispiel erläutert, wie die Erfindung in die Praxis umgesetzt werden kann.
Beispiel
a) Fermentation
Man beschickt einen 170 1 Fermentator mit
Pepton .... 1200 g
Hefeextrakt .... 600 g
Grlucose-monohydrat .... 1200 g
Gelose .... 240 g
Wasser quantum satis
für .... 110 1
Der pH des Milieus wird durch Zugabe von 25 ecm 10 IT Natronlauge auf 7,0 eingestellt. Man sterilisiert dann das Milieu durch Hindurchleiten von Dampf mit 1220C während 40 Minuten. Nach dem Abkühlen beträgt infolge der Kondensation des Dampfes im Verlauf der Sterilisation das Volumen der Brühe 120 1? der pH beträgt dann 6,85.
Man betzt dann mit 200 ecm einer Kultur von Streptomyces gypseus DS 27461 in einem gerührten Erlenmeyer die Kultur an. Die Kultur wird während 27Stuüden bei 300C und unter Rühren und Zufuhr von steriler Luft entwickelt. Sie ist dann geeignet für das Ansetzen der Erzeugerkultur. 909816/1017
Die Erzeugerkultur wird in einem 800 1 Fermentator durchgeführt, der mit den folgenden Substanzen beschickt wird:
Maismaischwasser ("Cornsteep" mit 50 $ Trockenextrakt 8 kg
Grlucose-monohydrat 12 kg
Ammoniumsulfat 0,8 kg
Wasser quantum satis für 370 1
Der pH wird durch Zugabe von 910 ecm 10 U Natronlauge auf 7»20 eingestellt. Man fügt zu:
Calciumcarbonat 3 kg
Der pH des'Milieus beträgt dann I1 30.Man sterilisiert das Milieu durch Einleiten von Dampf mit 122 G während 40 Minuten. Bach dem Abkühlen beträgt aufgrund der Kondensation des Dampfes im Verlauf der Sterilisation das Volumen des Milieus 400 1. Der pH beträgt 7,10. Man setzt dann mit 40 1 Inokulum-Kultur in dem vorstehend beschriebenen 170 1 Permentator die Kultur an.
Die Kultur wird während 116 Stunden bei 27°C unter Rühren mit einer sich mit 205 Umdrehungen/Minute drehenden Turbine und unter Luftzufuhr von einem Volumen an steriler Luft von 20 m*3 pro Stunde entwickelt. Der pH der Kultur beträgt dann 7»90 und das Volumen der Würze 400 1. Die antibiotische Aktivität der Würze , bestimmt durch Verdünnung mit Staphylococcus, beträgt C^O E/ccm.
b) Extraktion
Man rührt 400 1 der wie vorstehend angegeben erhaltenen Würze, deren pH durch Zugabe von 6 1 6 IT Schwefelsäure auf 3 gebracht wird, während einer halben Stunde. Nach Zugabe von 20 kg PiI-trationsadjuvans wird die Würze auf einer Filterpresse filtriert und der !Filtrationskuchen auf dem Eilter mit 100 1 Was-
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ser gewaschen, dessen pH durch Zugabe von 6 N Schwefelsäure auf pH 3 eingestellt worden ist. Das Filtrat und das Waschwasser werden entfernt.
Der Filtrationskuchen wird in 230 1 Methanol verteilt, der pH der Mischung wird durch Zugabe von 1,15 1 6 N Natronlauge auf 7,8 eingestellt. Die Mischung wird während einer halben Stunde gerührt.
Die Mischung wird an einer Filterpresse filtriert und der Filtrationskuchen wird auf dem Filter mit 100 1 eines Methanol-Wassergemisches (75:25 in Volumina) gewaschen. Das Filtrat und das Waschwasser werden vereinigt und unter vermindertem Druck (5 bis 10 mm Hg) derart konzentriert, daß man 15 1 wäßriges Konzentrat erhält. Dieses Konzentrat ergibt nach 15 Stunden Stehen bei +4 C einen niederschlag.
Der Niederschlag wird nach dem Absaugen durch Zentrifugieren bei 300C unter vermindertem Druck (1 bis 5 mm Hg) 15 Stunden getrocknet .
Man isoliert auf diese Weise 90gNatriumsalz von 37454 EP in roher Form.
c)Reinigung
Das vorstehend erhaltene Rohprodukt wird in 2 1 Methylenchlorid gelöst. Die Lösung wird eine Stunde gerührt. Man entfernt durch Zentrifugieren eine UnlÖGlichkeit.
Die überstehende Flüssigkeit wird durch Destillation unter vermindertem Druck (5 bis 10 mm Hg) bis auf ein Volumen von 200 ccia eingeengt und dann in 10 1 η-Hexan gegossen. Der erhaltene Niederschlag wird durch Zentrifugieren entfernt.
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Die überstehende Flüssigkeit wird unter vermindertem Druck (5 bis 10 mm Hg) bis auf ein Tolumen von 800 ecm eingeengt und dann belassen. Nach 48-stündigem Belassen "bei +4-0C werden die gebildeten Kristalle durch Filtrieren abgetrennt, mit 100 ecm
350O (5 mm Hg) getrocknet.
Hexan bei -1O0C gewaschen und unter vermindertem Druck bei
Man isoliert auf diese Weise 61 g kristallisiertes 37454 RP in Form des Hatriumsalzes.
d) Umkristallisation
Die vorstehend erhaltenen Kristalle werden in 1,2 1 Aceton gelöst und die lösung 30 Minuten gerührt. Man entfernt durch Zentrifugieren eine Uulöslichkeit. Man fügt 5 g Entfärbungskohle, die mit Salzsäure gewaschen worden war, zu und rührt dann erneut eine halbe Stunde und trennt schließlich die Entfärbungskohle durch Filtrieren ab.
Zu dem langsam gerührten Filtrat fügt man 600 ecm destilliertes Wasser. Das Natriumsalz von 37454 EP kristallisiert langsam bei +40C.
Man isoliert die Kristalle durch Filtrieren,- wäscht sie mit 200 ecm eines Aceton-Wassergemisches (50:50 in Volumina) und trocknet sie unter vermindertem Druck bei 35 C.
Man erhält 42 g ITatriumsalz von 37454 EP in reiner Form.
Die Erfindung betrifft weiterhin Zusammensetzungen mit Anticoccidienwirkung, die 37454 EP oder dessen Metallsalze oder Salze mit Stickstoffbasen (nicht toxisch bei den Yerweuduugsdosen) enthalten und insbesondere lierfuttermischungen oder konzentrierte Mischungen für die tierische Ernährung,die das 37454 RP oder seine Metallsalze oder Salze mit Stickst off basen
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gegebenenfalls in Anwesenheit eines weiteren Mittels mit Anticoccidienwirkung enthalten.
Die zur Herbeiführung einer geeigneten Wirkung erforderliche Dosis kann natürlich innerhalb breiter Bereiche entsprechend. dem Wert der nahrungsmittel selbst variieren.
Im allgemeinen reicht es aus, daß die den Tieren zur Verfügung
gestellten ITahrungsmittelrationen 0,005 bis 0,04 Gewichts-^ an 37454 RP oder seinen Metallsalzen oder Salzen mit Stickstoffbasen enthalten.
Das 37454 EP oder seine Metallsalze oder Salze mit Stickstoffbasen können als gleichmäßige Dispersion in den fertigen ITaIi-"rungsmittelzusammensetzungen in den vorstehenden Dosen verteilt sein.
Es kann in Nahrungsmittelzusatzen meistens mit anderen Additiven, wie Vitaminen und Mineralsalzen verteilt sein. Diese ITahrungsmittelzusätze können entweder der Ration beigemischt werden oder als solche verzehrt werden und stellen üblicherweise 5 bis 20 fo der Ration dar.
Die zur Herstellung der fertigen Rationen oder der ITahrungsmittelzusätze verwendeten Vormischungen enthalten üblicherweise 0,05 bis 20 fo an 37 454 RP oder seinen Metallsalzen oder Salzen mit Stickstoffbasen,verdünnt in einer nahrungsmittelcharge. Sie stellen ein bequemes Zwiechenprodukt dar, das die gleichmäßige Verteilung des wirksamen Produkts in den Nahrungsmitteln erleichtert. Die Vormischungen selbst werden im allgemeinen ausgehend von Konzentraten erhalten, die 99,9 bi3 20 f* an '37454 RP oder seinen Metall1 salzen oder Salzen, mit Sticlcstoffbasen,versetzt mit verzehrbaren Denaturierungsmitteln, wie JTahrungsmittelfarbstoffen, Aromastoffen, Dispergiermitteln oder die
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Aggloiaerierung verhindernden Mitteln und JTahrungsmittelchargen enthalten.
Die Konzentrate und Vormischungen sind im allgemeinen pulverförmig. Die Mahrungsmittelzusatsstoffe und die fertigen ITahrungsmittelzusammensetzungen können entweder pulverförmig sein oder in Form von nach üblichen Techniken hergestellten Granulaten
vorliegen.
Das folgende Beispiel erläutert eine erfindungsgemäße Zusammensetzung.
Beispiel:
Man stellt ein Grundnahrungsmittel mit der folgenden Zusammensetzung her:
Mehl mit Getreideursprung 13,41 $
Gerstenmehl 13,41 i>
Maismehl 13,41 io
Weizenmehl 31,32 $
Fischmehl 8,92 io
Sojamehl 8,92 $ Dehydratisiertes Viehfuttermehl 4,56 $
Hefeextrakt 2,33 $
Pulverförmiger Trockenmilch 2,68 io
Natriumchlorid 0,09 io
Calciumchlorid 0,89 $ '
Mineralische Elemente 0,06 io Vitaminkomplex:
Vitamin A 4000 IE/lcg
Vitamin D3 " 1000 IE/kg
Cholinchlorid 11,5 mg/kg
Riboflavin 2,24 mg/kg
Man fügt zu diesem Nahrungsmittel 0,02 $ 37 454 RP umverteilt es gleichmäßig.
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Claims (4)

Pat entansprüche
1. Heue antibiotische Substanz mit saurem Charakter und der Bezeichnung 37454 EP, welche der allgemeinen Formel:
entspricht, sowie ihre Metallsalze und ihre Salze mit Stickstoffbasen, dadurch gekennzeichnet, daß das Uatriumsalz folgende Charakter ist ika besitzt:
Weißes kristallines Pulver, löslich in chlorierten Lösungsmitteln wie Methylenchlorid und Chloroform, Alkoholen wie Methanol, in Dimethylformamid, Aceton und Äthylacetat, wenig löslich in Hexan und praktisch unlöslich in Wasser;
seine Elementar zusammensetzung ist etwa: 59,27 J6 C, 8,45 $ H, 28,32 '/ 0, 2,36 j6 Na, und entspricht der Summenformel C^gHg^O^
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sein Schmelzpunkt (bestimmt im Kapillarröhrchen) beträgt etwa: 198 - 199,50C,
sein Drehvenaögen (bestimmt in Methanol einer Konzentration von 0,974 % und für verschiedene Wellenlängen)1 beträgt etwa:
&/20 = + 2,3 + 0,6° fr]20 = + 1,3 + 0,6°, D 436 ~
sein UltraTiolettspektrum weist keine charakteristische Absorption auf;
sein Infrarotspektrum (bestimmt ausgehend von Preßlingen in Mischung mit KBr) zeigt folgende charakteristischen Absorptionsbanden:
3560, 3420, 3300, 3260, 3000, 2980, 2955, 2940, 2915, 2898, 2865, 2860, 2838, 2660, 2360, 2080, 1718, 1620, 1460, 1450, 1438, 1428, 1410, 1405, 1375, 1362, 1345, 1335, 1320, 1310, 1300, 1288, 1262, 1245, 1230, 1215, 1200, 1188, 1162, 1140, 1130, 1120, 1105, 1098, 1082, 1070, 1060, lO52, 1045, 1040, 1035. 1020, 1010, 995, 985, 970, 955, 950, 945, 915, 900, 895, 880, 860, 858, 830, 808, 780, 720, 710, 690, 665, 660, 630, 615, 580, 550, 540, 525, 518, 500, 470, 452,412, 400, 340 cm"1 ,
sein kernmagnetisches Resonanzspektrum des Protons zeigt an, daß es 5 Methoxygruppen enthält;
sein kernmagnetisches Resonanzspektrum von C zeigt, daß es 48 Kohlenstoffatome enthält,
sein Massenspektrum durch Felddesorption liefert einen Molekularpeak entsprechend einer Masse von 968, bei der aufsteigenden DünnschichtChromatographie an Siliciumdioxidgel mit einem Gemisch aus Methylenchlorid/Methanol (94/6 in Volumina) als Lösungsmittel hat es einen R~-Wert von 0,75,
seine Anticoccidien-Aktivität zeigt sich beim Küken in Konzentrationen zwischen 0,005 und 0,04 Gewichts-^ das Futtermittels.
2. Verfahren zur Herstellung des Produkts gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces gypseus
DS 27461 (NRRL 11168) oder seine produzierenden Mutanten aerob
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auf einem geeigneten klassischen Milxeu und unter Bedingungen, welche für diese Art Züchtung üblich sind, züchtet und daß man das im Laufe der Züchtung gebildete 37454 KP abtrennt und es reinigt.
3. Zusammensetzungen mit Anticoccidien-Wirkung, welche im Tierfutter verwendbar sind, enthaltend 37454 RP und/oder seine Metallsalze und Salze mit Stickstoffbasen, gegebenenfalls zusammen mit anderen Anticoccidien-Mitteln.
4. Der neue Mikroorganismus Streptomyces gypseus DS 27461 (ITRRIi 11168) zur Durchführung der Erfindung.
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