DE2843702C2

DE2843702C2 - Neue antibiotische Substanz und ihre Herstellung durch Züchtung eines Streptomyces

Info

Publication number: DE2843702C2
Application number: DE2843702A
Authority: DE
Inventors: Jean Boulogne Billancourt Hauts de Seine Florent; Jean Paris Lunel; geb. Courtillet Denise Charenton Val de Marne Mancy
Original assignee: Rhone Poulenc Industries SA
Current assignee: Rhone Poulenc Industries SA
Priority date: 1977-10-07
Filing date: 1978-10-06
Publication date: 1986-07-31
Also published as: DE2843702A1; GB2006198B; GB2006198A; JPS584720B2; JPS5459396A; US4293650A; FR2408619A1; FR2408619B1

Description

Die Erfindung betrifft eine neue antibiotische Substanz, welche im folgenden mit der Nr. 37 454 RP bezeichnet wird und die der Formel:

H₃C-O

CH₃ CH₃

\ CH₃ „„

ol ο^c"³

CH₃ OH

CH₃

10

15

entspricht, sowie ihre Metallsalze und ihre Salze mit Stickstoffbasen, das Verfahren zu ihrer Herstellung und ein sie enthaltendes im Tierfutter verwendbares Mittel mit Anticoccidienwirkung.
Das 37 454 RP besitzt besonderes Interesse aufgrund seiner Anticoccidien-Wirkung.
Das 37 454 RP kann erhalten werden ausgehend von geeigneten Kulturmedien für einen neuen Mikroorganismus, der im folgenden näher identifiziert wird und dem Genus Streptomyces angehört und die Bezeichnung Streptomyces gypseus DS 27 461 (NRRL 11 168) besitzt.

Das 37 454 RP ist eine Substanz mit saurem Charakter, dessen Neutraläquivalent, bestimmt an dem Produkt in Form der Säure, in Lösung in einem Gemisch aus Methanol-Wasser (70-30 in Volumina) durch Bestimmung mit 0,1 N-Natriumhydroxid etwa 960 beträgt. Die folgenden physiko-chemischen Bestimmungen wurden am Natriumsalz durchgeführt, dessen Bruttoformel C₄₈H₈]OIgNa entspricht.
Aussehen:

Weißes mikrokristallines Pulver.
Löslichkeit (nach den Vorschriften der französischen Pharmakopde, IX. Ausgabe, 1972):

Das 37 454 RP (Natriumsalz) ist in Wasser praktisch unlöslich, wenig löslich in Hexan, löslich in chlorierten Lösungsmitteln wie Methylenchlorid und Chloroform, Alkoholen wie Methanol, Ketonen wie Aceton,

Estern wie Äthylacetat und Dimethylformamid. Elementaranalyse:

Das 37 454 RP (Natriumsalz) enthält Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Natrium. Seine prozentuale

Zusammensetzung beträgt etwa:

O 28,32% O 29,72%

Na 2,36% Na 2,37%

C 59,27% H 8,45%

Berechnet <ur C₄₈H₈₁O₁₈Na: C 59,49% H 8,42% Verlust im Vakuum bei 6O⁰C unter 3 mm Hg = 0,3%. Schmelzpunkt (bestimmt im Kapillarröhrchen):

198-199,5°C. Drehwert:

Bestimmt in Lösung zu 0,974% in Methanol. Der Drehwert von 37 454 RP (Natriumsalz) beträgt etwa:

[a)j!>= +2,3 ±0,6°,

= +1,3 ±0,6°

20 25 30 35 40 45

Ultraviolettspekt.rum:

Das 37 454 RP (Natriumsalz) zeigt keine charakteristische Absorption.

Infrarotspektrum (Bestimmung an Preßlingen in Mischung mit KBr):

Dieses Spektrum ist in der Fig. 1 wiedergegeben, worin als Abszisse einerseits die Wellenlängen, ausgedrückt in Mikron (obere Inschrift) und andererseits die Wellenzahlen in cm"' (untere Eintragung) aufgetragen sind und auf der Ordinate sind die optischen Dichten angegeben.

Tabelle 1

3560 3420 3300 3260 3000 2980 2955 2940 2915 2898 2865 2860

»Sch« F(H₂O)

»Sch« »Sch«

»Sch«

»Sch« »Sch« »Sch«

2838 m 2660 tf 2360 tf (CO₂) 2080 tf 1718 tf 1620F 1460F 1450 »Sch« 1438 »Sch« 1428 »Sch« 1410 »Sch« 1405 m

1375 m 1362 F 1345 »Sch« 1335 »Sch« 1320 »Sch« 1310 m 1300 »Sch« 1288 m 1262 tf 1245 m 1230 m 1215 »Sch«

55 60 65

Fortsetzung

1200 »Sch«	995 m	690 »Sch«
1188 F	985 F	665 f
1162 F	970 »Sch«	660 »Sch«
1140 »Sch«	955 F	630 m
1130 »Sch«	950 m	615 f
1120F	945 »Sch«	580f
HOStF	915 m	550 »Sch«
1098 »Sch«	900 m	540 m
1082 F	895 »Sch«	525 tf
1070 tF	880f	518 tf
1060 »Sch«	86Of	500 m
1052 F	858 »Sch«	470 »Sch«
1045 »Sch«	830 tf	452 f
1040 »Sch«	808 f	412 f
1035 »Sch«	780f	400 »Sch«
1020F	720 »Sch«	340 m
1010 »Sch«	710 m
tF = sehr stark
m = mittel
tf = sehr schwach
F = stark
f = schwach
Sch = Schulter

Magnetisches Kernresonanzspektrum des Protons in deuteriertem Chloroform:

Dieses Spektrum, welches in der F i g. 2 dargestellt ist, wurde auf einem Spektrometer CAMECA TNS-250 30 bei einer Frequenz von 250 MHz ausgehend von einer Lösung mit etwa 40 mg/ccm in deuteriertem Chloroform bestimmt. Es weist die folgenden Charakteristika auf (die chemischen Verschiebungen sind positiv in p.p.m. gezählt gegen die schwachen Felder in bezug auf TMS, das als interner Bezug genommen wird.

Chemische Verschiebung	Form des Signals;
in p.p.m.	Kupplungskonstante (J)
1,0	Dublett, J = 6,5 Hz
1,03	Dublett, J = 6,5 Hz
1,06	Dublett, J = 6,5 Hz
1,09	Dublett, J = 6,5 Hz
1,17	Singulett
1,24	Dublett, J = 6,5 Hz
1,30	Singulett
1,2 bis 1,6	Multiple«
1,62	Singulett
1,80	massiv
1,9 bis 2,5	Multiple«
2,8	doppeltes Triplett
3,2 bis 3,7	Multiple«
3,36	Singulett
3,38	Singulett
3,43	Singulett
3,47	Singulett
3,57	Singulett
3,7 bis 4,2	Multiple«
4,3 bis 4,6	Multiple«
5,98	weites Singulett
6,7	weites Singulett

Nach diesem Spektrum enthält das 37 454 RP (Natriumsalz) 5 Methoxygruppen. Kernmagnetisches Resonanzspektrum von C¹³ in deuteriertem Chloroform:

65 Dieses Spektrum, welches in der Fig. 3 dargestellt ist, wurde auf einem WH 90 Brükerspektrometcr bei

einer Frequenz von 22,63 MHz ausgehend von einer Lösung mit etwa 200 mg/ccm in deuteriertem Chloroform aufgezeichnet. Es weist die folgenden Charakteristika auf (die chemischen Verschiebungen sind positiv gegen die schwachen Felder in bezug auf das deuterierte Chloroform gemessen, das als interner Bezug

bei 77,0 p.p.m. des TMS genommen ist und sind in p.p.m., bezogen auf TMS = 0, ausgedrückt:

Chemische Verschiebung Signalform bei dem unter

p.p.m. bezogen auf TMS off-Resonanz aufgenommenen 5
Spektrum

11.1 Quadruple«
11,7 Quadruple«

12.3 Quadruple« ¹⁰
12,7 und 12,7 Quadruple«

13.6 Quadruple«

18.4 Quadruple«

27.0 Quadruple« ₁₅ U

28.5 Quadruple« i

23.2 Triple« ^

24.3 Triple«

25.7 und 25,7 Triple«

29,2 Triple« 20

30.6 Triple«

31,2 Triple« S

32.5 Triple« ξ. 36,9 Dublett ;iv

38.7 Dublett ²⁵ Ii

39.1 Dublett |

46.2 Dublett $ 47,0 Dublett |

50.8 Quadruple« ₃₀ & 56,7 Quadruple« | 59,2 Quadruple« ;|

60.2 Quadruple« $

60.9 Quadruple« ?ΐ

61.3 Dublett 35 %

66.7 Dublett :j

71.8 Dublett . Ii 74,3 und 74,3 Dublett i< 79,3 und 79,3 Dublett ;| 79,7 Dublett ⁴⁰ « 80,3 Dublett ?i

80.7 Dublett Π

82.8 Dublett ;,-

83.6 Dublett ; 85,5 Dublett ji 78,5 Singulett K 83,3 Singulett ^ 94,5 Dublett || 98,2 Singulett 50 i 98,2 Singulett 1ί 102,5 Dublett || 106,8 Singulett U 178,4 Singulett %

Nach diesem Spektrum enthält das 37 454 RP (Natriumsalz) 48 Kohlenstoffatome. |

Massenspektrum: ^j

Das Massenspektrum bei Feiddesorption liefert für das Natriumsalz einen molekularen Peak entsprechend U

einer Masse von 968 (theoretischer Wert: 968). |

Chromatographische Wanderung: 60 p

Das 37 454 RP (Natriumsalz) kann durch aufsteigende Dünnschichtchromatographie mit Siliciumdioxid- |

gel charakterisiert werden; bei Verwendung eines Gemisches Methylenchlorid-Methanol (94-6 in VoIu- |

mina) beträgt der RpWert 0,75. ' |

Bakteriostatische Aktivität in vitro: sj

Die bakteriostatische Aktivität des 37 454 RP (Natriumsalz) wurde gegenüber einer gewissen Anzahl von 65 ψ

Keimen nach einer der üblichen für diesen Zweck verwendeten Verdünnungsmethoden bestimmt. Für 1

jeden Keim wurde die kleinste Konzentration an aktiver Substanz bestimmt, welche unter definierten p

Bedingungen jegliche sichtbare Entwicklung auf einem geeigneten Nährmedium verhindert. Die Ergeb- gj

nisse der verschiedenen Bestimmungen sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt, wo die minimalen bakteriostatischen Konzentrationen in Mikrogramm/Substanz/ccm Versuchsmedium angegeben sind.

Untersuchte bakterielle Organismen Minimale bakteriostatische

Konzentrationen (in μg/ccm)

Staphylococcus aureus, Stamm 209 P - 0,6

ATCC 6538 P

Staphylococcus aureus, Stamm Smith 0,8

Sarcina lutea - ATCC 9341 0,9

Streptococcus faecalis - ATCC 8043 0,3

Streptococcus pyogenes hemolyticus, Stamm Dig 7 0,6

(Institut Pasteur)

Diplococcus pneuminiae, Stamm TiI 0,1

(Institut Pasteur)

Neisseria catarrhalis (A 152, Institut Pasteur) >20

Bacillus subtilis - ATCC 6633 0,8

Bacillus cereus - ATCC 6630 0,3

Mycobacterium species - ATCC 607 10

Escherichia coli - ATCC 9637 >50

Shigella dysenteriae, Shiga L (Institut Pasteur) >50

Salmonella schottmuelleri (paratyphi B), >50

Stamm Fougenc (Institut Pasteur)

Proteus vulgaris >50

Pseudomonas aeruginosa >15

Akute Toxizität:

An der Maus beträgt die 50%ige letale Dosis (DL₅₀) 90 mg/kg p.o. nach einmaliger Verabreichung.
Anticoccidien-Wirksamkeit:

Die Anticoccidien-Wirksamkeit wurde an dem Küken, das insbesondere mit Eimeria tenella und Eimeria acervulina infiziert wurde, bestimmt.

Die anticoccidielle Aktivität von 37 454 RP (Ntriumsalz), wenn es dem Futter für Küken einverleibt wurde, zeigt sich in nicht toxischen Konzentrationen zwischen 0,005 und 0,04 Gewichts-% Produkt, enthalten in dem Futtermittel.

Der Erzeugerorganismus des Antibiotikums 37 454 RP ist ein Streptomyces-Stamm, der aus einer Endprobe, entnommen in Algerien, isoliert wurde und dem man die Nr. DS 27 461 zuordnete. Dieser Organismus wurde im Agriculture Research Service (ARS) des US-Departments of Agriculture in Peoria, 111. (US A) hinterlegt, wo er unter der Nr. NRRL 11 168 registriert wurde. Eine Probe von S. gypseus (NRRL 11 168) kann von dort unter Bezugnahme auf die vorliegende Veröffentlichung bezogen werden.

Dieser Organismus weist Eigenschaften auf, wodurch man ihn nicht einer bereits beschriebenen Spezies zuordnen konnte und ist deshalb als eine neue Spezies anzusehen und wurde mit der Bezeichnung Streptomyces gypseus, DS 27 461 versehen.

Die Isolierung dieses Stammes wurde nach der allgemeinen Methode bewirkt, die darin besteht, daß eine kleine Menge der Erde in destilliertem sterilem Wasser suspendiert wurde; die Suspension wurde auf vcrschiedene Konzentrationen verdünnt, und ein kleines Volumen jeder Verdünnung wurde auf die Oberfläche von Petrischalen gegeben, welche ein Gelose-Nährmedium enthielten. Nach Inkubation von einigen Tagen bei 26°C, wodurch die Mikroorganismen sich entwickeln konnten, wurden die Kolonien, welche man zwecks weiteren Studiums isolieren wollte, entnommen und wieder auf Gelose-Nährmedien piquiert, so daß man davon reichlichere Kulturen erhielt.

Streptomyces gypseus DS 27 461 bildet ovale Sporen der Abmessungen 0,9 bis 1,2 μ/0,5 bis 0,8 μ, deren Wand bei Beobachtung im Elektronenmikroskop glatt erscheint. Seine Sporenkette umfaßt im allgemeinen 10 bis 20 Sporen; sie sind üblicherweise unter Bildung von mehr oder weniger offenen Spiralen mit 1 bis 3 oder4 Windungen aufgerollt und sind meistens entlang eines Fadens unter Bildung von mehr oder weniger langen Trauben gruppiert. Aufgrund seiner Art und Weise derSporulation wird dieser Stamm in die Sektion Spira nach der Klassiflkation von Pridham eingeordnet.

Der Streptomyces gypseus DS 27 461 entwickelt sich gut bei 26 bis 37°C, jedoch nicht bei 50°C. Er weist ein sporuliertes Luftmycel von weißer Farbe auf. Sein vegetatives Mycel ist im allgemeinen von gräulich bis graubräunlich oder schwach gelblich-braun gefärbt; manchmal jedoch auf bestimmten Nährmedien wie Glycerin-

Asparagin-Gelose oder Glucose-Pepton-Gelose vermögen sich manche Zonen rötlich oder violett zu farben. Auf der Mehrzahl der Gelose-Medien, wo er gezüchtet wird, bildet er lösliche Pigmente von bräunlicher bis grau-brauner oder schwach gelb-brauner, manchmal braun-rosa Farbe. In seinen bei 26°C bewirkten Züchtungen weist er folgende biochemische Eigenschaften auf:

Melaninerzeugung: negativ

Erzeugung von H₂S: negativ

Tyrosinase: negativ

Verflüssigung der Gelatine: positiv

Verwertung der Zellulose: negativ

Erzeugung von Nitriten aus Nitraten: negativ auf Nitratnährbouillon; positiv auf synthetischen Bouillons

Hydrolyse der Stärke: positiv

Züchtung auf entrahmter Milch: weder Koagulation noch Peptonisation; pH unverändert in 1 Monat is

Seine Fähigkeit zur Verwertung verschiedener Kohlenstoffquellen zur Sicherung seiner Entwicklung wurde nach dem Prinzip der Methode von Pridham und Gottlieb (J. of Bact. 56,107-114,1948) bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt:

20 Untersuchte Kohlenstoflquellen Verwertung

D-Glucose positiv

D-Xylose positiv

L-Arabinose positiv

L-Rhamnose positiv

D-Fructose positiv

D-Galactose positiv

Raffinose positiv

D-Mannit positiv

Inosit positiv

Salicin negativ

Saccharose positiv

Die Züchtungseigenschaften von Streptomyces gypseus DS 27 461 sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt. Es sind diejenigen von Züchtungen, welche ein gutes Entwicklungsstadium erreichten, d. h. etwa 2-3 Monate bei 26°C, wenn nichts anderes angegeben ist. Seine Eigenschaften wurden auf Nähr-Gelose bzw. Nähr-Agar und Bouillons, die üblicherweise zur Bestimmung der morphologischen Eigenschaften von Streptomyces-Stämmen verwendet werden, beobachtet, wobei die Züchtungen auf den Gelose-Medien auf Schräg-Agar erfolgten. Eine bestimmte Anzahl der angewandten Züchtungsmedien wurde nach den Formulierungen hergestellt, wie sie in dem Buch »The Actinomycetes«, S. A. Waksman, Seite 193-197, Chronica Botanica Company, Waltham, Mass., USA, 1950 angegeben sind; in diesem Fall sind sie durch den Buchstaben W mit anschließender Angabe der Nummer, womit sie in den »The Actinomycetes« bezeichnet sind, gekennzeichnet.

Die Fundstellen oder Zusammensetzung der anderen Züchtungsmedien sind die folgenden:

Ref. A. »Hickey and Tresner's Agar« - T. G. PRIDHAM und Mitarb. - Antibiotics Annual, 1956-1957,

Ref. B. »Bennett's Agar« - S. A. WAKSMAN - The Actinomycetes, Bd. 2, S. 331, Nr. 30 - The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961.

Ref. C. Formulierung W-23, versetzt mit 2% Gelose (Agar).

RcI". D. »Yeast Extract Agar« - T. G. PRIDHAM und Mitarb. - Antibiotics Annual 1956 - 1957, S. 950.

Rer. E. »Tomato Paste Oatmeal Agar« - T. G. PRIDHAM und Mitarb. - Antibiotics Annual, 1956-1957,

S. 950.

Ref. F. »Melanin formation medium« - S. A. WAKSMAN - The Actinomycetes, Bd. 2, S. 333, Nr. 42 - The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961.

Ref. G. GRUNDY und Mitarb. - Antibiotics and Chem. 2, 401, 1952.

Ref. H. »Inorganic Salts-Starch Agar« - T. G. PRIDHAM und Mitarb. - Antibiotics Annual 1956-1957

S. 951.

Ref. I entspricht der Formulierung W-I, wobei 3% Saccharose ersetzt sind durch 1,5% Glucose.

Ref. J. entspricht der Formulierung W-I, wobei 3% Saccharose ersetzt sind durch 1,5% Glycerin.

Ref. K. entspricht der Formulierung W-18, wo 3% Saccharose ersetzt sind durch 1,5% Glucose.

Ref. L. entspricht der Formulierung W-18, wo die Saccharose weggelassen ist und ersetzt ist durch kleine Streifen Filterpapier, die teilweise in die Flüssigkeit eintauchen.

Ref. M. Bacto Nitrate Broth (Difco).

Ref. N. »Plain gelatin« - hergestellt nach den Angaben von »Manual of Methods for Pure Culture Study of

Bacteria« - Society of American Bacteriologists, Genf, N.Y. - II₅,,-18.

Ref. P. Entrahmte Milch als handelsübliches Pulver zubereitet nach den Angaben des Erzeugers. Ref. Q. Milieu, angegeben zur Untersuchung der H₂S-Erzeugung durch: H. D. TRESNER und F. DANGA Journal of Bacteriology, 76, 239-244, 1958.

30

35

45

50

55

60

65

iCulturmilieu	Entwick	Vegetatives	Sich an der Luft	Lösliches	Beobachtungen und bio
	lungsgrad	Mycel (v.M.)	befindliche Organe	Pigment	chemische Eigenschaften
		oder Unterseite	(enthaltend das
		der Kultur	gesamte Luftmycel
			und die Sporulation
Gelose von	ziemlich	v.M. grau	weiß, sehr mäßig	braun-rosa	ovale Sporen mit den Ab
Hickey und	gut	bräunlich	entwickelt		messungen 0,9 bis 1,2
(Ref. A)					μ/0,5 bis 0,8 u, die Spo-

10

15

20

Gelose von Bennett (Ref. B)

Gelose von Emerson (Ref. C)

gut

Hefeextrakt-Gelose von Pridham (Ref. D)

Gelose mit Hafermehl und Tomatenextrakt von Pridham (Ref. E)

Glucose-Pepton-Gelose (W-7)

Nährgelose (W-5)

Hefe-Tyrosinextrakt-Gelose zur Bildung von Melanin (Ref. F)

Calciummalat-Gelose von Krainsky (Ref. G)

Ovalbumin-Gelose (W-12)

Glucose-Asparagin-Gelose (W-2)

sehr gut

gut

ziemlich gut

mäßig mäßig

ziemlich gut

sehr unergiebig

unergiebig renketten sind in Form von Spiralen mit 1 bis oder 4 Windungen aufgerollt, knäuelartige Sphorophoren

v.M. schwach bräunlich

v.M. braungelb-gräulich

v.M. graubraun

v.M. graubraun bis braun-violett weiß, mäßig entwickelt

weißlich, sehr
mäßig entwickelt

weiß, mäßig entwickelt

weiß, sehr mäßig
entwickelt

braun-gelb,

ziemlich

schwach

braun-orange, sehr schwach

braun-gelb,

ziemlich

schwach

bräunlich,

ziemlich

schwach

weiß, sehr mäßig
entwickelt

grau-braunrosa

v.M. graubräunlich, sich stellenweise violett-rötlich verfärbend

Unterseite weiß, sehr mäßig schwach

braun-gelb >. entwickelt braun-gelb

Unterseite weiß, sehr mäßig keines

gelb-bräunlich entwickelt

Unterseite weiß, mäßig ent- schwach

braun-gräulich wickelt gräulich

Bildung von Melanin: Negativ (die Ablesungen wurden gemäß aen Empfehlungen des Autors durchgeführt)

keine Auflösung von Calciummalat

v.M. farblos bis gräulich

v.M. farblos bis gräulich, Unterseite hellgelblich keine

keine

keines

	Entwick lungsgrad	Vegetatives Mycel (v.M.) oder Unterseite der Kultur	28 43 702	Lösliches Pigment	Beobachtungen und bio chemische Eigenschaften	[
Fortsetzung	mäßig	v.M. grau-gelb bräunlich, mit einigen violett rötlichen Zonen		sehr schwach bräunlich		1
Kulturmilicu	ziemlich gut	v.M. bräunlich	Sich an der Luft befindende Organe (enthaltend das gesamte Luftmycel und die Spekulation	schwach grau-bräun lich	ovale Sporen mit den Abmessungen 0,9 bis 1,2 μ/0,5 bis 0,8 μ, die Sporenketten sind in Form von Spiralen mit 1 bis 3 oder 4 Windungen aufgerollt, Stärkehydro lyse: Positiv
Glycerin- Asparagin- Gelose (W-3)	mäßig	Unterseite grau-gelb	weißlich, in Form von Spuren	schwach braun-gelb lich	Stärkehydrolyse: Positiv
Slärke-Mineral- salze-Gelose von Pridham (Ref. II)	ziemlich gut	Unterseite braun-gelb	weiß, mäßig ent wickelt	grau-braun
Stärke-Nitrat- Gelose (W-IO)	ziemlich gut	v.M. grau- bräunlich, Unterseite braun-gelb	weißlich, sehr mäßig entwickelt	grau-braun
Synthetische Saccharose- Gelose von Czapek (W-I)	ziemlich gut	v.M. braun gelblich, Unterseite braun-gelb	weiß, sehr gut entwickelt	schwach braun-gelb		I
Synthetische Glucose-Gelose von Czapek (ReC I)	ziemlich gut	ziemlich gut ausgebildeter Schleier, v.M. weiß-gelblich	weiß, ziemlich gut entwickelt	keines	Bildung von Nitriten: Positiv
Synthetische Glyccrin- Gclose von Czapek (Ref. J)	sehr mäßig	weißliche Kultur an der Oberfläche	weißlich in Form von Spuren	keines	Bildung von Nitriten: Positiv
Stärke-Nitrat- Brühe (W-19)	keine		weißlich, in Form von Spuren	keines	keine Verwertung von Zellulose	I
Synthetische Glucose-Brühe von Czapek (Ref. K)	ziemlich gut	ziemlich gut ausgebildeter Ring, Unter seite hell gelblich	keine	keines	Bildung von Nitriten: Negativ (die Kontrollen wurden nach 24 Stunden, 48 Stunden, 7 Tagen, 15 Tagen bzw. 28 Tagen Inkubation bei 26⁰C durchgeführt	I
Synthetische Zellulose- Brühe von Czapek (Ref. L)	gut	v.M. weiß gräulich		hell-gelb	Gelatineverflüssigung: Gut
Nitrat-Nähr brühe (Ref. M)		weiß, mäßig ent wickelt		ι I ■j] ;»
Reine 12%ige Gelatine (Rcf N)		weiß, in Form von Spuren

	Fortsetzung	Entwick lungsgrad	Vegetatives Mycel (v.M.) oder Unterseite der Kultur	Sich an der Luft befindende Organe (enthaltend das gesamte Luftmycel und die Spekulation	Lösliches Pigment	Beobachtungen und bio chemische Eigenschaften
S	Kulturmilieu	gut	v.M. sehr dicht und sehr ge faltet, schwach bräunlich	weiß, sehr mäßig entwickelt	schwach grau-bräun lich
10	Kultur auf Kartoffeln (W-27)	sehr un ergiebig	v.M. gräulich, sehr unergiebig entwickelt	keine	keines
15	Kultur auf Karotten (W-28)	mäßig	cremefarbener bis braun-rosa farbener Ring	keine	keines	keine Koagulation, keine Peptonisierung pH-unverändert während 1 Monats
20	Entrahmte Milch (Ref. P)	ziemlich gut	v.M. grau bräunlich	weißlich, in Form von Spuren	braun-gelb	Bildung von H₂S: negativ (die Ablesungen wurden gemäß den Empfehlungen des Autors durchgeführt)
25	Gelose von Tresner und Danga (Ref. Q)

Die Gesamtheit der von Streptomyces gypseus DS 27 461 aufgezeigten Eigenschaften fällt nicht exakt mit irgendeiner derjenigen zusammen, die als Spezies in den üblichen Nachschlagewerken beschrieben werden (Bergey's Manual of Determinative Bacteriology - 7. Ausgabe, 1957 und 8. Ausgabe 1974, sowie »The Actinomycetes« - S. A. WAKSMAN, The Williams and Wilkins Company, 1961). Aus diesem Grunde muß er als eine neue Spezies angesehen werden. In der Tat besitzt S. gypseus DS 27 461 ein sporuliertes Luftmycel mit weißer Farbe, ergibt keine Melaninpigmente auf organischen Milieus und bildet Sporenketten, die sich in Form von Spiralen aufrollen und Sporen, deren mit dem Elektronenmikroskop beobachtete Wand glatt erscheint. Die Spczies, der er sich unter den beschriebenen am stärksten annähert, ist Streptomyces albus, der auch die 4 vorstehend beschriebenen Merkmale besitzt und überdies ein vegetatives Mycel bildet, das farblos bis cremefarben oder bräunlich sein kann und, wenn er ein lösliches Pigment bildet, sein Kulturmilieu bräunlich färbt. Im Gegensatz zu S. albus, der im allgemeinen auf sämtlichen seiner Kulturmilieus kein lösliches Pigment bildet oder lediglich gelegentlich ein bräunliches lösliches Pigment ergibt, bildet S. gypseus DS 27 461 weitaus häufiger auf seinen Gelose-Kulturmilieus lösliche Pigmente mit bräunlicher bis grau-brauner oder schwach braun-gelber Farbe, die zuweilen braun-rosa gefärbt sind. Überdies bildet S. gypseus DS 27 461 im Gegensatz zu S. albus auf bestimmten Gelosemilieus insbesondere auf Glucose-Pepton-Gelose und Glycerin-Asparagin-Gelose ebenso wie bei seiner Kultivierung auf entrahmter Milch ein vegetatives Mycel, das dazu neigt, sich teilweise rosa-rötlich bis violettartig oder violett zu farben. Es muß ebenfalls festgestellt werden, daß S. gypseus DS 27 461 ein hellgelbes, lösliches Pigment auf Gelatine bildet, entrahmte Milch, deren pH er während eines Monats nicht nennenswert ändert, weder peptonisiert, noch koaguliert und auf Karotten lediglich eine außerordentlich unergiebige Entwicklung ergibt, während S. albus auf Gelatine kein lösliches Pigment bildet, entrahmte Milch koaguliert und sie rasch unter Alkalinisierung peptonisiert und sich auf Karotten ausgezeichnet entwickelt. Schließlich verwertet S. gypseus DS 27 461 L-Arabinose, L-Rhamnose, Raffinose und Inosit und verwertet nicht

so Salicin, während S. albus keine L-Arabinose, L-Rhamnose, Raffinose und Inosit verwertet und Salicin verwertet. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von 37 454 RP ist dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces gypseus NRRL 11 168 aerob auf einem klassischen Medium und unter üblichen Bedingungen züchtet, die Fermentationsbrühe bei einem pH zwischen 2 und 5 in Anwesenheit eines Filtrationsmittels filtriert, die im Filtrationskuchen zurückgehaltene Aktivität mit Hilfe eines niedrigen Alkoholsodereineschlorierten Lösungsmittels extrahiert, das Rohprodukt daraus durch Kristallisation durch Einengen unter vermindertem Druck isoliert und nach gebräuchlichen klassischen Methoden reinigt.

Die Kultur von Streptomyces gypseus DS 27 461 kann nach jeder aeroben Kulturmethode an der Oberfläche oder in der Tiefe erfolgen, wobei jedoch die letztere aus Gründen der Einfachheit zu bevorzugen ist. Man verwendet zu diesem Zweck verschiedene Vorrichtungstypen, die in der Fermentationsindustrie geläufigerweise verwendet werden.

Man kann insbesondere den folgenden Weg für die Durchführung der Arbeitsgänge anwenden:

Streptomyces gypseus DS 27 461-Stammcharge Kultur auf Gelose

Kultur in einem gerührten Fläschchen Inokulumkultur in einem Fermcntator

Erzeugjngskultur in einem Fermentator

Das Fermentationsmilieu muß im wesentlichen eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und eine assimilierbare Slickstoffquelle, mineralische Elemente, und eventuell Wachstumsfaktoren enthalten, wobei sämtliche dieser Elemente von genau definierten Produkten oder komplexen Gemischen, wie man ihnen bei biologischen Produkten verschiedenartigen Ursprungs begegnet, eingebracht werden können.

Als assimilierbare Kohlenstoffquellen kann man Kohlenhydrate, wie Glucose, Saccharose und andere KohlenstolY-haltige Substanzen wie die Zuckeralkohole (Mannit) verwenden. Bestimmte tierische oder pflanzliche Öle wie Specköl oder Sojaöl können in vorteilhafter Weise diese verschiedenen Kohlenstoffquellen ersetzen oder ihnen beigegeben werden.

Die geeigneten Quellen für assimilierbaren Stickstoff sind außerordentlich verschiedenartig. Sie können sehr einfache chemische Substanzen sein, wie die Mineralsalze oder organischen Ammoniumsalze, Harnstoff und bestimmte Aminosäuren. Sie können aber auch durch komplexe Substanzen eingebracht werden, die hauptsächlich Stickstoff in protidischer Form enthalten, wie: Casein, Lactalbumin, Gluten und deren Hydrolysate, Soja-, Erdnuß- und Fischmehl, Fleischextrakte, Hefe, lösliche Brennereirückstände und Maisquellwasser.

Unter den eventuell beigegebenen mineralischen Elementen können bestimmte eine puffernde oder neutral!- sierendc Wirkung besitzen, wie die Alkali- oder Erdalkaliphosphate oder wie Calcium- oder Magnesiumcarbonale. Andere fuhren zu dem fur die Entwicklung von Streptomyces gypseus DS 27 461 und die Bildung von 37 454 RP erforderlichen ionischen Gleichgewicht, wie die Chloride und Sulfate der Alkali- und Erdalkalimetalle. Schließlich wirken bestimmte in spezieller Weise als Aktivatoren für die metabolischen Reaktionen von Strcplomyces gypseus DS 27 461, nämlich die Zink·, Kobalt-, Eisen-, Kupfer- und Mangansalze.

Die Wachstumsfaktoren sind Produkte von vitaminischer Natur, wie Riboflavin, Folsäure und Pantothensäure.

Der pi I des Fermentationsmilieus zu Beginn der Kultur muß zwischen 6,2 und 7,8 und vorzugsweise zwischen 6,6 und 7,4 liegen. Die für die Fermentation optimale Temperatur liegt zwischen 25 und 30⁰C, jedoch wird eine zufriedenstellende Erzeugung auch bei Temperaturen zwischen 23 und 33°C erhalten. Die Luftzufuhr für die Fermentation kann innerhalb ziemlich breiter Werte variieren. Man hat jedoch gefunden, daß Luftzufuhren von 0,3 bis 3 I Luft je 1 Brühe und je Minute sich besonders gut eignen. Die maximale Ausbeute an 37 454 RP wird nach 4- bis 8tägiger Kultur erhalten, wobei diese Dauer im wesentlichen von dem verwendeten Milieu abhängt.

Aufgrund des Vorstehenden ist es verständlich, daß die allgemeinen Bedingungen für die Kultur von Streptomyces gypseus DS 27 461 zur Erzeugung von 37 454 RP innerhalb eines breiten Bereichs variieren und jeden speziellen Erfordernissen angepaßt werden können.

Das 37 454 RP kann aus Fermentationswürzen in der folgenden Weise isoliert werden:

Die Würze wird bei einem sauren pH im allgemeinen zwischen 2 und 5 und vorzugsweise um 3 in Anwesenheit eines Filtrationsadjuvans filtriert.

Die in dem Filtrationskuchen zurückgehaltene Aktivität wird hieraus mit Hilfe eines geeigneten organischen Lösungsmittels wie eines niedrigen Alkohols wie Methanol oder eines chlorierten Lösungsmittels wie Methylenchlorid extrahiert. Das Rohprodukt kann ausgehend von den vorstehend genannten organischen Lösungen durch Kristallisation nach Einengen seiner Lösungen unter vermindertem Druck, etwaige Zugabe eines schlechten Lösungsmittels oder eines Nichtlösungsmittels und Aufbewahrung in einer Kühlkammer isoliert wurden.

Das 37 454 RP kann, je nachdem, ob es in Form der Säure oder des Salzes vorliegt, nach gebräuchlichen klassischen Methoden, wie die Kristallisation oder die Chromatographie an verschiedenen Absorptionsmitteln oder die Gegenstromverteilung, gereinigt werden. Die Überfuhrung der 37 454 RP-Säure in eines ihrer Saize oder umgekehrt und die Überführung eines Salzes in ein anderes werden unter Anwendung üblicher Methoden bewirkt.

Verwendbare Salze sind z. B. das Natrium- und Kaliumsalz.

Das folgende Beispiel erläutert, wie die Erfindung in die Praxis umgesetzt werden kann.

Beispiel
a) Fermentation
Man beschickt einen 170-1-Fermentator mit

Pepton	1200 g
Hel'eextrakt	600 g
Glucosc-monohydrat	1200 g
Gclosc	240 g
Wasser uuanlum satis für	110 1

Der pH des Milieus wird durch Zugabe von 25 ecm 10 N Natronlauge auf 7,0 eingestellt. Man sterilisiert dann das Milieu durch Hindurchleiten von Dampf mit 122⁰C während 40 Minuten. Nach dem Abkühlen beträgt infolge der Kondensation des Dampfes im Verlauf der Sterilisation das Volumen der Brühe 1201; der pi I beträgt dann 6,85.

Man setzt dann mit 200 ecm einer Kultur von Streptomyces gypseus DS 27 461 in einem gerührten Eirlenmeyer die Kultur an. Die Kultur wird während 27 Stunden bei 30⁰C und unter Rühren und Zufuhr von steriler Luft entwickelt. Sie ist dann geeignet für das Ansetzen der Erzeugerkultur.

Die Erzeugerkultur wird in einem 800 1 Fermentator durchgeführt, der mit den folgenden Substanzen beschickt wird:
IO

Maisquellwasser (»Comsteep« mit 50% Trockenextrakt) 8 kg

Glucose-monohydrat 12 kg

Ammoniumsulfat 0,8 kg

Wasser quantum satis für 370 1

Der pH wird durch Zugabe von 910 ecm 10 N Natronlauge auf 7,20 eingestellt. Man fügt zu:
Calciumcarbonat 3 kg

Der pH des Milieus beträgt dann 7,30. Man sterilisiert das Milieu durch Einleiten von Dampf mit 122°C während 40 Minuten. Nach dem Abkühlen beträgt aufgrund der Kondensation des Dampfes im Verlauf der Sterilisation das Volumen des Milieus 4001. Der pH beträgt 7,10. Man setzt dann mit 401 Inokulum-Kultur in dem vorstehend beschriebenen 170-l-Fermentator die Kultur an.
Die Kultur wird während 116 Stunden bei 27°C unter Rühren mit einer sich mit 205 Umdrehungen/Minute

drehenden Turbine und unter Luftzufuhr von einem Volumen an steriler Luft von 20 m³ pro Stunde entwickelt. Der pH der Kultur beträgt dann 7,90 und das Volumen der Würze 400 I. Die antibiotische Aktivität der Würze, bestimmt durch Verdünnung mit Staphylococcus, beträgt 860 E/ccm.

b) Extraktion

Man rührt 4001 der wie vorstehend angegeben erhaltenen Würze, deren pH durch Zugabe von 6 1 6 N Schwefelsäure auf 3 gebracht wird, während einer halben Stunde. Nach Zugabe von 20 kg Filtrationsadjuvans wird die Würze auf einer Filterpresse filtriert und der Filtrationskuchen auf dem Filter mit 1001 Wasser gewaschen, dessen pH durch Zugabe von 6 N Schwefelsäure auf pH 3 eingestellt worden ist. Das Filtrat und das Waschwasscr werden entfernt.

Der Filtrationskuchen wird in 230 1 Methanol verteilt, der pH der Mischung wird durch Zugabe von 1,15 I6N Natronlauge auf 7,8 eingestellt. Die Mischung wird während einer halben Stunde gerührt.

Die Mischung wird an einer Filterpresse filtriert, und der Filtrationskuchen wird auf dem Filter mit 1001 eines Methanol-Wassergemisches (75 : 25 in Volumina) gewaschen. Das Filtrat und das Waschwasser werden vereinigt und unter vermindertem Druck (5 bis 10 mm Hg) derart konzentriert, daß man 15 1 wäßriges Konzentrat erhält. Dieses Konzentrat ergibt nach 15 Stunden Stehen bei +4⁰C einen Niederschlag.

Der Niederschlag wird nach dem Absaugen durch Zentrifugieren bei 30⁰C unter vermindertem Druck (1 bis 5 mm Hg) 15 Stunden getrocknet.

Man isoliert auf diese Weise 90 g Natriumsalz von 37 454 RP in roher Form.

c) Reinigung

Das vorstehend erhaltene Rohprodukt wird in 2 I Methylenchlorid gelöst. Die Lösung wird eine Stunde gerührt. Man entfernt durch Zentrifugieren eine Unlöslichkeit.

Die überstehende Flüssigkeit wird durch Destillation unter vermindertem Druck (5 bis 10 mm Hg) bis aufein Volumen von 200 ecm eingeengt und dann in 10 1 η-Hexan gegossen. Der erhaltene Niederschlag wird durch Zentrifugieren entfernt.

Die überstehende Flüssigkeit wird unter vermindertem Druck (5 bis 10 mm Hg) bis aufein Volumen von 800 ecm eingeengt und dann belassen. Nach 48stündigem Belassen bei +4⁰C werden die gebildeten Kristalle durch Filtrieren abgetrennt, mit 100 ecm Hexan bei -10⁰C gewaschen und unter vermindertem Druck bei35°C (5 mm Hg) getrocknet.
Man isoliert auf diese Weise 61 g kristallisiertes 37 454 RP in Form des Natriumsalzes.

d) Umkristallisation

Die vorstehend erhaltenen Kristalle werden in 1,2 1 Aceton gelöst und die Lösung 30 Minuten gerührt. Man entfernt durch Zentrifugieren eine Unlöslichkeit. Man fügt 5 g Entfärbungskohle, die mit Salzsäure gewaschen worden war, zu und rührt dann erneut eine halbe Stunde und trennt schließlich die Entfarbungskohle durch Filtrieren ab.

Zu dem langsam gerührten Filtrat fügt man 600 ecm destilliertes Wasser. Das Natriumsalz von 37 454 RP kristallisiert langsam bei +4⁰C.

Man isoliert die Kristalle durch Filtrieren, wäscht sie mit 200 ecm eines Aceton-Wassergemisches (50 : 50 in Volumina) und trocknet sie unter vermindertem Druck bei 35°C.

Mehl mit Getreideursprung	13,41%
Gerstenmehl	13,41%
Maismehl	13,41%
Weizenmehl	31,32%
Fischmehl	9,92%
Sojamehl	8,92%
Dehydratisiertes Viehfuttermehl	4,56%
Hefeextrakt	2,33%
Pulverformige Trockenmilch	2,68%
Natriumchlorid	0,09%
Calciumchlorid	0,89%
Mineralische Elemente	0,06%
Vitaminkomplex:
Vitamin A	4000 IE/kg
Vitamin D₃	1000 IE/kg
Cholinchlorid	11,5 mg/kg
Riboflavin	2,24 mg/kg
in fugt zu diesem Futtermittel 0,02% 37 454 RP und verteilt es g
I
iierzu 3 Blatt Zeichnungen

³⁵ 40 45

55

Man erhält 42 g Natriumsalz von 37 454 RP in reiner Form.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein in Tierfutter verwendbares Mittel mit Anticoccidienwirkung, enthaltend 37 454 RP und/oder seine Metallsalze und Salze mit Stickstoffbasen gemäß Anspruch 1, gegebenenfalls zusammen mit anderen Anticoccidien-Mitteln.

Die zur Herbeiführung einer geeigneten Wirkung erforderliche Dosis kann natürlich innerhalb breiter Bereiche entsprechend dem Wert der Futtermittel selbst variieren.

Im allgemeinen reicht es aus, daß die den Tieren zur Verfügung gestellten Futtermittelrationen 0,005 bis 0,04 Gcwichts-% an 37 454 RP oder seinen Metallsalzen oder Salzen mit Stickstoffbasen enthalten.

Das 37 454 RP oder seine Metallsalze oder Salze mit Stickstoffbasen können als gleichmäßige Dispersion in den fertigen Futtermittelzusammensetzungen in den vorstehenden Dosen verteilt sein.

Es kann in Futtermittelzusätzen meistens mit anderen Additiven, wie Vitaminen und Mineralsalzen verteilt sein. Diese Futtermittelzusätze können entweder der Ration beigemischt werden oder als solche verzehrt werden und stellen üblicherweise 5 bis 20% der Ration dar.

Die zur Herstellung der fertigen Rationen oder der Futtermittelzusätze verwendeten Vormischungen enthalten üblicherweise 0,05 bis 20% an 37 454 RP oder seinen Metallsalzen oder Salzen mit Stickstoffbasen, verdünnt in einer Futiermittelcharge. Sie stellen ein bequemes Zwischenprodukt dar, das die gleichmäßige Verteilung des wirksamen Produkts in den Futtermitteln erleichtert. Die Vormischungen selbst werden im allgemeinen ausgehend von Konzentrationen erhalten, die 99,9 bis 20% an 37 454 RP oder seinen Metallsalzen oder Salzen mit Stickstoffbasen, versetzt mit verzehrbaren Denaturierungsmitteln, wie Futtermittelfarbstoffen, Aromastoffen, Dispergiermitteln oder die Agglomerierung verhindernden Mitteln und Futtermittelchargen enthalten.

Die Konzentrate und Vormischungen sind im allgemeinen pulverförmig. Die Futtermittelzusatzstoffe und die fertigen Futtermittelzusammensetzungen können entweder pulverförmig sein oder in Form von nach üblichen |

Techniken hergestellten Granulaten vorliegen.

Das folgende Beispiel erläutert eine erfindungsgemäße Zusammensetzung.

25

Beispiel
Man stellt ein Grundfuttermittel mit der folgenden Zusammensetzung her:

30

50 I

Claims

Patentansprüche:

1. Neue antibiotische Substanz mit saurem Charakter und der Bezeichnung 37 454 RP, welche der allgemeinen Formel:

H₃C-O

CH₃

O OH

entspricht, sowie ihre Metallsalze und ihre Salze mit Stickstoffbasen, dadurch gekennzeichnet, daß das Natriumsalz folgende Charakteristika besitzt:

Weißes kristallines Pulver, löslich in chlorierten Lösungsmitteln wie Methylenchlorid und Chloroform, Alkoholen wie Methanol, in Dimethylformamid, Aceton und Äthylacetat, wenig löslich in Hexan und praktisch unlöslich in Wasser,
seine Elementarzusammensetzung ist etwa:

59,27% C, 8,45% H, 28,32% O, 2,36% Na

und entspricht der Summenformel C₄₈H₈|O|₈Na,

sein Schmelzpunkt (bestimmt im Kapillarröhrchen) beträgt etwa:

198-199,5°C,

sein Drehvermögen (bestimmt in Methanol einer Konzentration von 0,974% und für verschiedene Wellenlängen) beträgt etwa:

[a]² _D° = +2,3 ± 0,6°,

= +1,3 ± 0,6°,

sein Ultraviolettspektrum weist keine charakteristische Absorption auf, sein Infrarotspektrum (bestimmt ausgehend von Preßlingen in Mischung mit KBr) zeigt folgende charakteristischen Absorptionsbanden:

3560, 3420, 3300, 3260, 3000, 2980, 2955, 2940, 2915, 2898, 2865, 2860, 2838, 2660, 2360, 2080, 1718, 1620, 1460, 1450, 1438, 1428, 1410, 1405, 1375, 1362, 1345, 1335, 1320,1310, 1300, 1288, 1262, 1245, 1230, 1215, 1200, 1188, 1162, 1140, 1130, 1120, 1105, 1098, 1082, 1070, 1060, 1052, 1045, 1040, 1035, 1020,1010,995,985,970,955,950,945,915,900,895,880,860,858,830,808,780,720,710,690,665,660, 630, 615, 580, 550, 540, 525, 518, 500, 470, 452, 412, 400, 340 cnT¹,

sein kernmagnetisches Resonanzspektrum des Protons zeigt an, daß es 5 Methoxygruppen enthält, sein kernmagnetisches Resonanzspektrum von C'³ zeigt, daß es 48 Kohlenstoffatome enthält, sein Massenspektrum durch Feiddesorption liefert einen Molekularpeak entsprechend einer Masse von 968, bei der aufsteigenden Dünnschichtchromatographie an Siliciumdioxidgel mit einem Gemisch aus Methylenchlorid/Methanol (94/6 in Volumina) als Lösungsmittel hat es einen R_rWert von 0,75, seine Anticoccidien-Aktivität zeigt sich beim Küken in Konzentrationen zwischen 0,005 und 0,04 Gewichts-% des Futtermittels.

2. Verfahren zur Herstellung der Substanz 37 454 RP des Anspruchs 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces gypseus NRRL 11 168 aerob auf einem klassischen Medium und unter üblichen Bedingungen züchtet, die Fermentationsbrühe bei einem pH zwischen 2 und 5 in Anwesenheit eines Filtrationsmittels filtriert, die im Filtrationskuchen zurückgehaltene Aktivität mit Hilfe eines niedrigen Alkohols oder eines chlorierten Lösungsmittels extrahiert, das Rohprodukt daraus durch Kristallisation durch Einengen unter vermindertem Druck isoliert und nach gebräuchlichen klassischen Methoden reinigt.

3. Im Tierfutter verwendbares Mittel mit Anticoccidienwirkung, enthaltend 37 454 RP und/oder seine Metallsalze und Salze mit Stickstoffbasen gemäß Anspruch 1, gegebenenfalls zusammen mit anderen Anticoccidien-Mitteln.