DE2725163A1 - Neoviridogriseine, verfahren zu ihrer herstellung, deren verwendung zur bekaempfung bakterieller infektionen und als zusatz zu futtermitteln und diese verbindungen enthaltende mittel - Google Patents

Neoviridogriseine, verfahren zu ihrer herstellung, deren verwendung zur bekaempfung bakterieller infektionen und als zusatz zu futtermitteln und diese verbindungen enthaltende mittel

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DE2725163A1 DE19772725163 DE2725163A DE2725163A1 DE 2725163 A1 DE2725163 A1 DE 2725163A1 DE 19772725163 DE19772725163 DE 19772725163 DE 2725163 A DE2725163 A DE 2725163A DE 2725163 A1 DE2725163 A1 DE 2725163A1
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Description

"Neoviridogriserne, Verfahren zu ihrer Herstellung, deren Verwendung zur Bekämpfung bakterieller Infektionen und als Zusatz zu Futtermitteln und diese Verbindungen enthaltende Mittel"
Die Erfindung betrifft Depsipeptidantibiotika, die als Neoviridogrisein I, II und III bezeichnet werden, ein Verfahren zur Herstellung und Isolierung dieser Verbindungen sowie deren Verwendung als Arzneistoffe und als Futterzusätze.
Die Antibiotika der sogenannten Mikamycin-Vernamycin (oder Streptogramin)-Familie lassen sich in zwei Hauptgruppen einteilen. Eine Hauptgruppe (Gruppe A gemäß D. Vazquez, Antibiotics III, Mechanism of action of antimicrobial and antitumor agents, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, 1975» S. bis 554) besteht aus makrocyclischen Lactonen. Diese Gruppe umfaßt Griseoviridin, Ostreogrycin A (= Mikamycin A =Virginiamycin M β Staphylomycin M » Pristinamycin HA ■ Vernamycin
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A = Streptogramin A = Synergistin A-1 = Verbindung PA-114-A1 β Verbindung E-129 Faktor A und dergl.), Ostreogrycin G (= Virginiamycin Mil = Staphylomycin Mil = Pristinamycin HB = Dihydrostreogrycin A = Verbindung E-129 Faktor B = Verbindung R.P.-13920 und dergl.) und die Verbindungen A-2315 A, B und C.
wirken bakteriostatisch und Die Antibiotika dieser Gruppe/sind aktiv gegen gram-positive Bakterien und Mycoplasmen. Griseoviridin, eines der beim erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Fermentationsprodukte, wird bekanntlich durch Streptomyceten zusammen mit Viridogrisein gebildet. Die Herstellung von Griseoviridin ist aus den US-PSen 3 023 204 und 3 174 902 bekannt. Die andere Hauptgruppe (Gruppe B gemäß D. Vazquez a.a.O.) besteht aus makrocyclischen Depsipeptidverbindungen und läßt sich in zwei Untergruppen einteilen, nämlich die Viridogrisein-Untergruppe und die Vernamycin B-Untergruppe. Die Antibiotika dieser Hauptgruppe eignen sich hauptsächlich zur Unterdrückung des Wachstums von gram-positiven Bakterien, wie Staphylococcus aureus und Bacillus subtilis. Die Vernamycin B-Untergruppe enthält 12 Homologe. Da die Antibiotika in dieser Gruppe mit einer Reihe von Synonymen bezeichnet werden, ist es praktisch unmöglich, sämtliche Namen für die Verbindungen dieser Untergruppe aufzuführen. Einige repräsentative und wissenschaftlich wichtige Verbindungen dieser Untergruppe sind nachstehend aufgeführt :
1. Vernamycin Ba= Ostreogrycin B = Pristinamycin IA « Mika-
mycin B » Streptogramin B m Synergistin B-1"Verbindung
E-129 Faktor Z » Verbindung PA114-B1
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2. Vernamycin Ba= Ostreogrycin B1 = Pristinamycin IC = Verbindung E-129 Faktor Z1
3. Vernamycin Ba= Ostreogrycin B2 = Pristinamycin IB = Verbindung E-129 Faktor Z2 = Verbindung R.P.-I3919
4. Ostreogrycin B3 = Verbindung E-129 Paktor Z3
5. Patricin A
6. Patricin B
7. Vernamycin B<f
8. Vernamycin C = Doricin
9. Virginiamycin (Staphylomycin)S
10. Virginiamycin (Staphylomycin)S2
11. Virginiamycin (Staphylomycin)S3
12. Virginiamycin (Staphylomycin)S4 (oder S1)
Die Verbindungen dieser Untergruppe haben gemeinsam, daß sie aus 7 Bestandteilen mit den gemeinsamen 4 Bestandteilen 3-Hydroxypicolinsäure, L-Threonin, L-Prolin und L-Phenylglycin bestehen. Andererseits ist in der Viridogrisein-Untergrupp-e nur eine Verbindung, nämlich das Viridogrisein, bekannt. Die Identität von Viridogrisein mit Etamycin, Verbindung K-179 und Verbindung F-137OA ist nachgewiesen. Im Gegensatz zur vorgenannten Vernamycin B-Untergruppe besteht Viridogrisein aus 8 Bestandteilen, nämlich 3-Hydroxypicolinsäure, L-Threonin, D-Leucin, 4-Hydroxy-D-prolin, Sarcosin, ß,N-Dimethyl-L-leucin, L-Alanin und L-Phenylsarcosin. Wie nachstehend erläutert, gehören die Neoviridogriseine der Erfindung zu dieser Viridogrisein-Untergruppe.Eine der erfindungsgemäß gebildeten
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Verbindungen, nämlich Neoviridogrisein IV wurde als Viridogrisein identifiziert. Die Herstellung von Viridogrisein ist aus der US-PS 3 023 204 bekannt. Der Synergismus zwischen der Gruppe A und der Gruppe B für verschiedene Mikroorganismen ist bekannt und wird zur Steigerung der therapeutischen Wirkung von Arzneimitteln mit einem Gehalt an Antibiotika dieser Familie als Wirkstoffe ausgenutzt. Dies gilt auch für die erfindungsgemäßen Neoviridogriseine.
Die Depsipeptidantibiotika der Erfindung, nämlich Neovirido-· grisein I, II und III sowie Viridogrisein sind wirksam gegen gram-positive Bakterien und Mycoplasmen und können in verdünnter Form als rohe Konzentrate oder in reiner Form, gegebenenfalls zusammen mit Griseoviridin, verwendet werden. Die vorgenannten Depsipeptidantibiotika lassen sich erfindungsgemäß dadurch herstellen, daß man Streptomyces sp. P8648 (FEWi-PJ562) in einem entsprechenden wäßrigen Medium unter aeroben Bedingungen züchtet, wonach die gebildeten Neoviridogriseine, gegebenenfalls zusammen mit Griseoviridin, aus der Gärbrühe gewonnen werden.
Erfindungsgemäß wird auch ein Verfahren zur selektiven Herstellung der gewünschten Neoviridogrisein-Komponenten zur Verfügung gestellt, indem man eine oder mehrere bestimmte Aminosäuren während oder vor der Züchtung zusetzt, insbesondere Prolin zur Erhöhung der Ausbeute an Neoviridogrisein I und II und a-Amino-n-buttersäure zur Erhöhung der Ausbeute an Neoviridogrisein I und III. Wie bereits erwähnt, sind Neovirido-
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grisein I, II und III wertvolle Antibiotika mit einer starken Wirkung gegen verschiedene pathogene Mikroorganismen, einschließlich gram-positiven Bakterien und Mycoplasmen. Demgemäß finden diese Wirkstoffe Verwendung in der Human- und Veterinärmedizin. Insbesondere eignen sich die erfindungsgemäßen Antibiotika zur Verwendung als Arzneistoffe zur Behandlung von durch gram-positive Bakterien und Mycoplasmen, wie Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Diplococcus pneumoniae, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma fermentans und Mycoplasma agalactiae, hervorgerufene Erkrankungen. Der bloße Ausdruck "Neoviridogrisein" wird zur allgemeinen Bezeichnung der Neoviridogriseine genannten Depsipeptidantibiotika verwendet. Dies bedeutet, daß mit diesem Ausdruck nicht nur die einzelnen Verbindungen der Gruppe Neoviridogrisein I, II und III sowie Viridogrisein (= Neoviridogrisein IV) gemeint sind, sondern auch Gemische aus 2 oder mehr Verbindungen dieser Gruppe.
Wie bereits erwähnt, werden die Depsipeptidantibiotika der Erfindung zusammen mit Viridogrisein und Griseoviridin durch den Stamm Streptomyces sp. P8648 (FEBM-P3562) gebildet. Dieser Mikroorganismus wurde aus einer Bodenprobe nahe dem Kuzuryu-Damm in Pukui-ken , Japan, isoliert.
Der erfindungsgemäß verwendete Mikroorganismus bildet aus einem gut verzweigten (einfache Verzweigung) Substratmycel ein farbloses, kurzes Luftmycel. Sporenketten mit glatter Oberfläche
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werden am Kopf des Luftmycels in einer losen Schleife gebildet. Es lassen sich weder Wirbel noch Askosporen beobachten. Die
Wachstumseigenschaften dieses Mikroorganismus auf verschiedenen
Agarmedien werden nachstehend beschrieben:
(1) Saccharose-Nitrat-Agar Wachstum : gering
Luftmycel : gelegentlich dünnes, weißes Luftmycel
Rückseite : farblos bis gräulich-weiß lösliches Pigment : keines
(2) Glueοse-Asparagin-Agar Wachstum : reichlich
Luftmycel ' : wenig oder keines; falls gebildet,
weiß gefärbt
Rückseite : schwach gelblich bis hellgelb
lösliches Pigment : keines
(3) Glycerin-Asparagin-Agar Wachstum : mäßig
Luftmycel : wenig oder keines; wenn gebildet,
dann weiß
Rückseite : schwach gelb bis gräulich-gelb
lösliches Pigment : keines
Hefeextrakt-Malζextrakt-Agar Wachstum : reichlich
Luftmycel J weiß bis graustichig weiß
Rückseite : schwach gelb, später bräunlich-grau
lösliches Pigment : keines oder selten leicht braun
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(5) Stärke-Agar Wachstum Luftmycel
Rückseite
lösliches Pigment Stärkehydrolyse
mäßig
keines oder wenig; wenn gebildet, dann weiß
schwach gelb bis hell-graubraun in der Kolonienmitte keines gering
(6) Tyrosin-Agar Wachstum Luftmycel
Rückseite lösliches Pigment mäßig
keines oder gelegentlich, wenige Flecken eines weißen Luftmycels
gräulich-gelb bis hell-gelbbraun
zunächst schwach purpurfarben bis leicht rötlich-braun, nach 10 Tagen schwach braun, geringfügige Bildung von Melanoidpigment
(7) Nähragar Wachstum Luftmycel Rückseite lösliches Pigment
dünn, weiß schwach gelb keines
(8) Hafermehl-Agar Wachstum Luftmycel Rückseite
weiß bis graustichig weiß
graustichig gelb bis hell rötlichbraun mit Grausfich
lösliches Pigment : keines
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Die optimale Wachstumstemperatur für den erfindungsgemäßen Mikroorganismus liegt im Bereich von 25 bis 35°C. Ein geringfügiges Wachstum dieses Mikroorganismus ist auch bei Temperaturen außerhalb dieses Temperaturbereichs möglich, beispielsweise bei 1O°C oder 45°C. Oberhalb von 52°C tritt kein Wachstum auf. Die erfindungsgemäßen Actinomyceten verflüssigen Gelatine in Glucose-Peptin-Gelatine-Medium,führen ζυ einer schwachen Hydrolyse von Stärke in Stärke-Agar mit anorganischen Salzen und peptonisieren Magermilch ohne Koagulation.
Die Bildung eines Melanoidpigments wird gelegentlich in Tyrosin-Agar beobachtet, jedoch nicht in Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar und Tyrosin-Hefeextrakt-Brühe.
über die Assimilation von Kohlenstoffquellen (in Pridham-Gottlieb-Medium) lassen sich folgende Aussagen machen:
positiv : D-Xylose, D-Glucose, D-Fructose,
L-Bhamnose, D-Mannit
geringfügig positiv : Saccharose
negativ : L-Arabinose, i-Inosit, Raffinose.
Im Hinblick auf die Bildung von bekannten Peptid- und Nichtpeptid-Makrolidantibiotika, wie Mikamycin A und B, Virginiamycine, Ostreogrycine, Etamycin, Vernamycine, Viridogrisein, Griseoviridin und Pristinamycine sind folgende Mikroorganismen mit Streptomyces sp. P8648 zu vergleichen:
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Streptoinyces griseus MEHL 2426
griseoviridus MERL 2427
ep., (Etamycin-Bildner)
conganensis
ostreogriseus
mitakaensis
loidensis
Die zugänglichen Informationen über die Wachstumseigenschaften und physiologischen Eigenschaften dieser Mikroorganismen lassen klare Unterschiede zwischen dem erfindungsgemäßen Streptomyces-Stamm und den vorgenannten Stämmen erkennen. Beispielsweise unterscheidet sich Streptomyces griseus NRRL 2426 darin, daß er zur Untergruppe Rectiflexibiles mit geraden oder leicht welligen Sporenketten gehört, während der erfindungsgemäße Mikroorganismus zu der Untergruppe Spirales zu rechnen ist. Der erstgenannte Stamm bildet ein graues bis gelbstichig graues Luftmycel auf Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar, während der letztere ein graustichig weißes Luftmycel bildet. Ferner verwertet der erstgenannte Stamm L-Arabinose, was der letztgenannte nicht tut. Der Etamycin-Bildner Streptomyces sp., der in Antibiotics Annual 1954 bis 1955, S. 728 bis 732 beschrieben ist, unterscheidet sich vom erfindungsgemäßen Mikroorganismus in der Assimilation von Kohlenstoff quell en und den Züchtungseigenschaften auf Czapek-Agar, Glucose, Asparagin-Agar und Nähragar. Streptomyces conganensis zeigt in den morphologischen Eigen-
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schäften der Sporen klare Unterschiede. Unter den vorstehend aufgeführten Mikroorganismen zeigt Streptomyces griseoviridus NRRL 2427 die meisten Ähnlichkeiten zu den erfindungsgemäßen Streptomyceten. Die Ergebnisse eines taxonomisehen Vergleichs zwischen diesen beiden Stämmen sind in nachstehender Tabelle zusammengestellt:
Farbe des
Luftmycels
Streptomyces griseoviridus NRRL 2427
schwach orangestichig gelb bis gelbstichig rosa mit einem Grauton auf Hefeextrakt-Malζ extrakt-Agar, Hafermehl-Agar, Stärke-Streptomyces sp. P8648
ein weißes bis graustichig weißes Luftmycel wird in geringen Mengen auf den meisten ISP-
Agar und Glycerin-Asparagin- Medien gebildet.
Agar
Auf Hefeextrakt-Mal ζ extrakt-Agar wird reichlich weißes Luftmycel gebildet.
Farbe des
Substratmycels
graustichig gelb bis olivfarben braun oder schwarzbraun auf Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar, Hafermehl-Agar, Stärke-Agar und Glycerin-Asparagin-Agar blaßgelb oder hellgelb bis graustichig braun auf den meisten ISP-Medien
lösliches
Pigment
keine Bildung von Melanoidpigment. Im allgemeinen wird kein anderes Pigment beobachtet, jedoch wird selten gelbes Pigment in geringem Umfang gebildet.
keine Bildung von Melanoidpigment. Im allgemeinen wird kein anderes Pigment beobachtet, jedoch wird selten in geringem Umfang braunes Pigment gebildet.
Verwertung von Kohlen stoff quell en
L-Arabinose
D-Fructose
Saccharose
L-Arabinose D-Fructose +++ Saccharose +
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Aus der vorstehenden Tabelle ergibt sich, daß zwischen Streptomyces griseoviridus NRRL 2427 und dem erfindungsgemäßen Streptomyces-Stamm deutliche Unterschiede in bezug auf die morphologischen und Züchtungseigenschaften und in bezug auf die Verwertung von Kohlenstoffquellen bestehen. Bei einer Züchtung beider Stämme unter identischen Bedingungen ist der erfindungsgemäße Mikroorganismus zur Bildung von Neoviridogrisein I, II und III sowie von Viridogrisein (Neoviridogrisein IV) und Griseoviridin in der Lage, während Streptomyces griseoviridus NRRL 2427 nur Viridogrisein und Griseoviridin, aber kein Neoviridogrisein I, II und III bildet.
Somit ist der erfindungsgemäß verwendete Mikroorganismenstaimn als eine neue Spezies von Streptomyces anzusehen und wird mit Streptomyces sp. P8648 bezeichnet. Dieser Stamm wurde beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology unter der Nummer FERM-P Nr. 3562 hinterlegt. Die Erfindung ist jedoch nicht auf diesen speziellen Mikroorganismus beschränkt, sondern umfaßt auch die Verwendung aller spontaner und künstlicher Mutanten, die sich vom erfindungsgemäßen Mikroorganismus ableiten und in der Lage sind die neuen Antibiotika Neoviridogrisein I, II und III zu bilden.
Herstellung von Neoviridogrisein I. II und III Die Antibiotika der Erfindung werden hergestellt, indem man Streptomyces sp. P8648 in ein entsprechendes Medium überimpft und unter aeroben Bedingungen bei Temperaturen im Bereich von
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18 bis 37°C 2 bis 14 Tage züchtet und die dabei angereicherten Antibiotika aus der Gärbrühe nach an sich üblichen Verfahren gewinnt und reinigt.
Nachstehend sind bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens näher erläutert:
Zur Züchtung des erfindungsgemäßen Mikroorganismus können alle Arten von Medien verwendet werden, von denen bekannt ist, daß sie sich zur Züchtung von Streptomyceten eignen. Bevorzugte Kohlenstoffquellen für diese Medien sind beispielsweise Glucose, Glycerin, Stärke, Dextrin, Hafermehl, Melassen, Fette und Öle. Beispiele für entsprechende Stickstoffquellen sind Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Fleischextrakt, Pepton, Trockenhefe, Maisquellflüssigkeit, Hefeextrakt, Casein und dessen Hydrolysate und anorganische Salze, wie Ammoniumsulfat und Ammoniumnitrat. Gegebenenfalls kann das Medium mit untergeordneten Mengen an Wachstumsfaktoren versetzt werden. Beispiele dafür sind Vitamine, Aminosäuren, organische und anorganische Salze, wie Calciumcarbonat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Natriumphosphat, Kaliumphosphat und Magnesiumsulfat.
Die Antibiotika der Erfindung können durch Züchtung in herkömmlichen Gefäßen, wie Schüttelkolben, Glasfermentern und Tankfermentera, hergestellt werden. Aus wirtschaftlichen Gründen wird die Züchtung in großtechnischem Maßstab vorzugsweise in Submerskultur unter künstlicher Belüftung durchgeführt. Die Züchtung wird vorzugsweise unter aeroben Bedingungen in einem
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Temperaturbereich von 25 bis 35°C durchgeführt. Bei Verwendung von Schüttelkolben oder Tankfermentern erreicht die Bildung der Neoviridogriseine im allgemeinen innerhalb von 2 bis 10 Tagen ihr Maximum.Der pH-Wert kann sich während der Züchtung je nach Art des verwendeten Mediums auf einen Wert außerhalb des physio logischen Bereichs verändern. Vorzugsweise wird der pH-Wert während der Züchtung im Bereich von 6 bis 9 gehalten. Im allgemeinen wird der pH-Wert des Mediums vor der Überimpfurig auf einen Wert von 6,5 ^>is 8,5 eingestellt.
Kontrolle der Neoviridogrisein-Komponenten in der Gärbrühe Wie vorstehend erläutert, bildet der erfindungsgemäße Mikroorganismus ein Gemisch aus'Neoviridogrisein I, II, III und IV und Griseoviridin. Durch eine geeignete Kombination von Kohlenstoff und Stickstoffquellen im Medium ist es möglich, die Zusammensetzung der Neoviridogriseine in der Gärbrühe ohne spezifische Zugabe einer freien Aminosäure oder einer organischen Säure zu verändern. Bei der großtechnischen Herstellung wird jedoch vorteilhafterweise der Gehalt an Neoviridogrisein I, II und/oder III in der Gärbrühe eingestellt, indem man das Medium während der Züchtung je nach den Umständen und den Bedürfnissen mit den entsprechenden Aminosäurebestandteilen in freier Form versetzt. Selbstverständlich kann die Zusammensetzung der Neoviridogriseine in der Gärbrühe durch entsprechende Wahl von spontanen oder künstlichen Mutanten, die aus dem erfindungsgemäßen Streptomycetenstamm erhalten worden sind, variiert werden. Ferner kann
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diese Zusammensetzung auch durch Einstellung der Züchtungsbedingungen, wie Temperatur, pH-Wert und Belüftung, und/oder durch Zusatz von physiologisch aktiven Mitteln, wie Enzyminhibitoren und -promotoren beeinflußt werden. Eine bevorzugte Ausführungsform zur selektiven Bildung von bestimmten Neoviridogri sein-Komponent en besteht darin, die entsprechenden Aminosäurebestandteile, oc-Amino-n-buttersäure und/oder Prolin, während der Züchtung zuzuführen. Insbesondere wird durch einen Zusatz von Prolin während der Züchtung der prozentuale Anteil an Neoviridogrisein I und II in der Gesamtmenge der Neoviridogriseine I, II, III und IV erhöht. Die Neoviridogriseine I und II weisen eine stärkere antimikrobielle Aktivität als die Neoviridogriseine III und IV auf. Entsprechendes gilt auch für ct-Amino-n-buttersäure. Die Menge an Neoviridogrisein I und III kann selektiv durch Zusatz von a-Amino-n-buttersäure zum Medium vor der Überimpfung oder während der Züchtung erhöht werden. Da der erfindungsgemäße Mikroorganismus während der Züchtung Proteasen bildet, kann auch proteinhaltiges Material, das die entsprechenden Aminosäurebestandteile enthält, anstelle von freien Aminosäuren zugegeben werden. Beispielsweise kann Prolin durch Casein oder entsprechende durch saure Hydrolyse hergestellte Hydrolysate, beispielsweise durch Casaminsäuren, ersetzt werden.
Isolierung und Reinigung
Die erfindungsgemäßen Antibiotika Neoviridogrisein I, II und III sowie Viridogrisein können nach an sich üblichen Verfahren aus der Gärbrühe aufgrund ihrer physiko-chemisehen Eigenschaften als
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Depsipeptidantibiotika isoliert werden. Gegebenenfalls können die Neoviridogriseine aus der Gärbrühe zusammen mit Griseoviridin in Form eines Gemisches von Neoviridogriseinen und Griseoviridin gewonnen werden. Bei der Verwendung als Futterzusatz oder in veterinärmedizinischen Arzneimitteln ist die
rohen
Verwendung eines/Gemisches von Neoviridogriseinen und Griseoviridin aus wirtschaftlichen Gründen besonders vorteilhaft.
Neoviridogriseine und Griseoviridin können aus der Gärbrühe mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert werden. Beispiele für entsprechende Lösungsmittel für die gleichzeitige Extraktion von Neoviridogriseinen und Griseoviridin sind Essigsäureäthylester, Essigsäurebutylester, n-Butanol, Methylenchlorid und Chloroform. Ist eine selektive Extraktion von Neoviridogriseinen ohne Griseoviridin erwünscht, werden organische Lösungsmittel,wie Methylisobutylketon, Benzol, Toluol und andere aromatische Kohlenwasserstoffe, bevorzugt. Da das Mycel im wesentlichen keine Neoviridogriseine enthält und die extrahierbaren Lipide in den Zellen häufig die nachfolgenden Reinigungsschritte stören, werden die Antibiotika zweckmäßigerweise mit einem organischen Lösungsmittel aus der filtrierten oder zentrifugierten Gärbrühe zusammen mit der Waschflüssigkeit extrahiert.
Das Lösungsmittelextrakt mit den Neoviridogriseinen und/oder dem Griseoviridin kann auf verschiedene Weise weiter isoliert und gereinigt werden. Beispiele dafür sind Adsorptions- und
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EIutionsverfahren mit Aktivkohle, Amberlite XAD-4 und 7 (Rohm & Haas Co.), Ionenaustauschharzen, wie Amberlite IR-120 (Rohm & Haas Co.) und Dowex 5OW-X2 (The Dow Chemicals Co.); Gelfiltration mit Sephadex LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals AB) und deren Äquivalenten; Adsorptionschromatographie an Aluminiumoxid und Kieselgel. Die vorgenannten Verfahren können zweckmäßigerweise zur Isolation und Reinigung der gewünschten Antibiotika kombiniert werden. Ferner kann eine Gegenstromverteilung mit einem entsprechenden Lösungsmittelsystem für die Isolierung und Reinigung zu einem guten Erfolg führen.
Physiko-chemische Eigenschaften von Neoviridopyisein I, II und III Neoviridogrisein I,. II und III sowie Viridogrisein sind amorphe weiße Feststoffe und lösen sich in Methanol, Äthanol, n-Propanol, Isopropanol, n-Butanol, Dioxan, Essigsäureäthylester, Essigsäurebutylester, Aceton, Methyläthylketon, Methylisobutylketon, Benzol, Toluol, Methylenchlorid, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, N,N-Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid. Sie sind kaum löslich in Wasser und Diäthyläther und praktisch unlöslich in Petroläther und Hexan.
Die Antibiotika der Erfindung sind in wäßriger Lösung bei Temperaturen von 25 bis 37°C mindestens 1 Monat und bei 600C und einem pH-Wert von 2 bis 9 30 Minuten stabil. Die Schmelzpunkte, bestimmt in einer Kofler-Schmelzpunktsapparatur, sind nachstehend angegeben:
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Neoviridogrisein I : nicht bestimmt
II : 93°C
III : 115°C
Viridogrisein : 140°C
Die UV-Absorptionsspektren von Neoviridogrisein I, II, III und Viridogrisein sind in den Figuren 1 bis 8 wiedergegeben, wobei die Figuren 1 bis 4 die UV-Spektren von Neoviridogrisein I,
II, III und Viridogrisein in Methanol und die Figuren 5 bis Q die entsprechenden Spektren in 0,1 η NaOH-Methanol zeigen.
Die E/iCL-Werte der Neoviridogriseine an ihren Maxima sind nachstehend angegeben:
In neutralem Methanol
Neoviridogrisein I : 305 nm (65)
II : 305 nm (88)
III : 305 nm (90) Viridogrisein : 305 nm (90)
In 0,1 η NaOH-Methanol
Neoviridogrisein I : 340 nm (70)
II : 340 nm (84)
III : 340 nm (90) Viridogrisein : 340 nm (96)
Spektren
Die Iß-/in KBr-Preßlingen sind in den Figuren 9 bis 12 wiedergegeben. Die charakteristischen Peaks und Schultern sind nachstehend angegeben (Sch ■ Schulter).
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Neoviridogrisein I (KBr-Preßling)
3370, 2910, 2850, 1735, 1670 (Sch.), 1635, 1590 (Sch.), 1515, 1460 (Sch.), 1445, 1405, 1375, 1290, 1280, 1250 (Sch.), 1200, 1190, 1160, 1125, 1100 und 1080 cm"1.
Neoviridogrisein II (KBr-Preßling)
332Ο, 295Ο, 2920, 2820, 2800, 1745, 1670 (Sch.), 1630, 1600 (Sch.), 1575, 1515, 1460 (Sch.), 1445, 1405, 1390, 1365,1330 (Sch.), 1295, 1275, 1240, 1200, 1195, 1160, 1130, 1095 und 1065 cm"1.
Neoviridogrisein III (KBr-Preßling)
3335, 2960, 2940, 2870, 1750, 1670 (Sch.), 1660 (Sch.), 1635, 1590 (Sch.), 1515, I45O, 1405, 1390 (Sch.), 1370, 1340 (Sch.), 1300, 1245, 1200, 1160 (Sch.), 1130, 1100 und 1065 cm"1.
In den nachstehend aufgeführten dünnschichtchromatographisehen Systemen haben die Neoviridogriseine I, II und III sowie Viridogrisein und Griseoviridin die folgenden R~-Werte: (1) dünnschichtchromatographisehe Platte: vorbeschichtete dünn-
schichtchromatographische Platte mit Kieselgel 60F-254, E. Merck, Darmstadt Benzol : Methanol =5:1 0,66 0,62 0,59 0,55 0,20
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Laufmittel I : Be
Neoviridogrisein II Rf
III
Viridogrisein
Griseoviridin
(2) dünnschichtchromatographische Platte: wie in (1)
Laufmittel I : Chloroform : Methanol = 30 : 1 = 0,39
Neoviridogrisein II Rf 0,32
III 0,19
0,18
Viridogrisein 0,02
Gri seoviridin
Zur Analyse der Aminosäurebestandteile werden die einzelnen Neoviridogrisein-Komponenten über Nacht bei 1100C in 6 η HCl hydrolysiert. Das erhaltene Hydrolysat wird zur Trockne eingedampft. Durch wiederholtes Eindampfen werden auch Spuren von Salzsäure entfernt. Die Aminosäuren im Hydrolysat werden dünnschichtchromatographisch (Eastman Chromogram-Cellulosefolien 13254 mit fluoreszierendem Indikator, Eastman Kodak Co.; Laufmittelsystem: n-Butanol/Essigsäure/Wasser = 4/1/1), durch Hochspannungselektrophorese (Toyo-Filterpapier Nr. 51A, Toyo Roshi Kaisha, Ltd.; Puffersystem: Ameisensäure/Essigsäure/Wasser = 25/75/9ΟΟ, pH-Wert = 1,8; 60 V/cm bei 00C, 30 min) und durch automatisierte Aminosäureanalyse (Hitachi-Aminosäureautoanalysator KLA-5, Hitachi, Ltd.) bestimmt. Folgende Aminosäuren lassen sich nachweisen:
Neoviridogrisein I : Threonin} Leucin, Prolin, a-Amino-n-
buttersäure, Sarcosin, Phenylsarcοsin
und ß ,N-Dimethylleucin
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Neoviridogrisein II : Threonin, Leucin, Prolin, Alanin,
Sarcosin, Phenylsarcosin und ß,N-Dime thyl1euc i η
Neoviridogrisein III : Threonin, Leucin, Hydroxyprolin,
α-Amino-n-buttersäure, Sarcosin, Phenylsarcosin und β,Ν-Dimethylleucin
Viridogrisein : Threonin, Leucin, Hydroxyprolin,
Alanin, Sarcosin, Phenylsarcosin und β,Ν-Dimethylleucin.
Die Gegenwart von 3-Hydroxypicolinsäure läßt sich auf folgende Weise massenspektrometrxsch und dunnschichtchromatographisch feststellen:
Eine authentische Probe von Viridogrisein und der Neoviridogriseine I, II, III und IV werden über Nacht bei 1100C in 6 η HCl hydrolysiert. Die Hydrolysate zeigen unter den angegebenen Bedingungen nur einen UV-absorbierenden Flecken mit dem gleichen Rf-Wert.
(1) Dünnschichtchromatographie an Kieselgel
Dünnschichtplatte : mit Kieselgel 60 F-254 vorbeschichtete Kieselgelplatte, E. Merck, Darmstadt
Laufmittel : Chloroform : Methanol =2:1
Bf-Wert : 0,46
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(2) Diinnschichtchromatographie an Cellulose
Dünnschichtplatte : Eastman Chromagram Cellulosefolien
13254- mit fluoreszierendem Indikator Eastman Kodak Co.
Laufmittel : n-Butanol : Essigsäure : Wasser =
4:1 : 1
Rf-Wert : 0,62
Das Molekulargewicht dieser Antibiotika wird direkt im Massenspektrometer bestimmt:
Neoviridogrisein I : 876
II : 862
III : 892 Viridogrisein : 878
Zur Untersuchung der chemischen Struktur der Neoviridogriseine I, II und III werden diese 3 Antibiotika sowie Viridogrisein über Nacht bei Raumtemperatur in 0,1 η NaOH hydrolysiert und anschließend vor der massenspektrometrisehen Untersuchung gemäß dem Verfahren von Compernolle u. Mitarb., Organic Mass Spectrometry, Bd. 6 (1972), S. 151 bis 166, mit Diazomethan methyliert. Pur Neoviridogrisein I, II und III ergeben sich folgende Strukturformeln:
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Neoviridogrisein I
CH
OH
II ?H2
"N< ^CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-N-
CH-N-CO-CH-NH-CO-CH
Neoviridogriseiη II
0 I
co
CH-N-CO-CH-NH-CO-CH I I I
CH, CH3 CH-CH
5 I
CH-CH CHx
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CH5 CH0 CH
I 2 I
CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-N CH-CO (H)
CH-CH,
Neoviridogrisein III
)H
χ/ * ι
.0H
OH · / \
α CH2 CH2 \η?
,2 ,2 ,2
ι " r ι
CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-N CH-CO
I I (HI)
CH-CH N-CHx
k '
0 CH0
I I 2
co co
I I
CH-N-CO-CH-NH-CO-CH N-CH,
' Jl I 5
CH-CH,
I ■ 3 ■
CH-CH3
CH,
Aus den vorstehenden Strukturformeln für Neoviridogrisein I, II und III ergibt sich, daß die Antibiotika der Erfindung eine Gruppe von neuen Depsipeptidantibiotika darstellen, die Homologe von Viridogrisein sind. Die Identität von Neoviridogrisein IV mit Viridogrisein wird durch Massenspektrometrie, Dünnschichtchromatographie, UV- und IR-Spektrometrie und Aminosäureanalyse unter Verwendung von authentischen Proben von Viridogrisein und Etamycin bestätigt.
Antimikrobiell Aktivität
Neoviridogrisein I, II und III weisen in Laboratoriumsversuchen ein breites antimikrobielles Wirkungsspektrum gegen Bakterien, Mycoplasmen, Actinomyceten und Rickettsien,auf. Insbesondere zeigen sie eine beachtliche in vitro-Aktivität gegen übliche
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und resistente Stämme von Staphylococcus aureus sowie gegen Stämme von Streptococcus pyogenes, Diplococcus pneumoniae, Sarcina lutea, Bacillus subtilis, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma pulmonis, Mycoplasma fermentans und Mycoplasma agalactiae. Die Mindesthemmkonzentrationen der erfindungsgemäßen Depsipeptidantibiotika werden separat und zusammen mit Viridogrisein und Griseoviridin an verschiedenen Mikroorganismen mit dem Röhrchenverdünnungstest bestimmt. Die Ergebnisse sind in den nachstehenden Tabellen aufgeführt.
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Tabelle I Mindesthemmkonzentrationen von Neoviridogrisein I, II und III
Mikroorganismus (a) Medium NV*I NV* II NVIII VG** NV*Misch. NV*+GV**Miscli.
0,1 0,2 0,8 3,2 3,2 3,2
°>2
0,4 J
0,2 ^
0,4
0,2
0,2
0,2
0,2
0,4
0,4 ro -α ro cn
Staphylococcus aureus 209? BHIX 0,2 0,1 0,2 0,2 0,2
(EM)r BHIX 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4
(STH)1" BHIX 0,8 0,8 1,6 1,6 1,6
(PC, TC, EM, LTl )r1 BHIX 6,25 6,25 6,25 6,25 6,25
O (PC,TC,EM,LM)r2 BHIX 6,25 6,25 6,25 6,25 6,25
to
OO 		(TC,EM,LM,CP)r BHIX 6,25 6,25 6,25 6,25 6,25
Vt (SM,STH)r BHIX 0,4 0,2 0,2 0,4 0,4
">.
ο		 (PC,KM,NM)r BHIX 0,8 0,4 0,4 0,8 0,8
OO (EM,CM,SM,PC,TC)r BHIX 0,4 0,2 0,4 0,4 0,4
-•J (EM,OM)r BHIX 0,8 0,4 0,8 0,8 0,8
(TC,CP,PC)r BHIX 0,2 0,2 0,4 0,4 0,4
(BX-1633)(PC)r BHIX 0,4 0,2 0,4 0,4 0,4
Russell(PC)r BHIX 0,2 0,2 0,4 0,4 0,4
Smith BHIX 0,2 0,2 0,2 0,4 0,4
Staphylococcus sp. (PC)r BHIX 0,8 0,4 0,8 0,4 0,8
sp. BHIX 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8
Tabelle I (Forts.)
Mikroorganismus
Medium NV*I NV* II 2JVIII VG** NVKisch. NV'+GV*"1 Misch.
I'iplococcus pneumoniae Typ 1 BHI+HB"" Streptococcus pyogenes BHI+HB"· Sarcina lutea
Bacillus subtilis ATCC 6633 Salmomella gallinarum Escherichia coli
Pseudomonas aeruginosa Proteus vulgaris
Candida a.lbicans
BHIX BHIX BHIX BHIX BHIX BHIX
; 0,2
! 0,4 0,2 0,4
>25
^
0,4 0,2 0,4
0,4
>25
0,2 0,4 > 0,4
0,4 0,4 > 0,4
0,4 0,2 0,4
0,8 0,8 0,8
25 >25 25
25 >25 25
25 >25 25
> 25 ^>25 25
> 25 > 25 25
0,1 0,1 0,1 0,4
>25 >25
* = Neoviridogrisein; (a) EM = Erythromycin; ***GV = Griseoviridin
PC = Penicillin;
SM = Streptomycin
·* VG = Viridogrisein;
STH = Streptothricin;
LM = Leucomycin C? - Chloramphenicol IiT-I = Neomycin OM = Oleandomycin
( }* = rosistent gegen die in Klammern angegebenen Antibiotika
BHI = Hirn-Herz-Infusionsbrühe
BHI + HB = Hirn-Herz-Infusionsbrühe mit einem Gehalt an 10 % Pferdeblu1 ^ MY = Malzextrakt-Hefeextrakt-Medium
TC = Tetracyclin KM = Kanamycin
Aus den vorstehenden Werten für die Mindesthemmkonzentrationen geht hervor, daß Neoviridogrisein II wirksamer ist als Neoviridogrisein IV, d.h. Viridogrisein. Bei diesen Untersuchungen wird jeweils auf das doppelte Volumen verdünnt. Um Neoviridogrisein II und Viridogrisein in bezug auf ihre antibiotische Aktivität zu unterscheiden, wird die Bestimmung der Mindesthemmkonzentration mit einem wesentlich niedrigeren Verdünnungsgrad wiederholt.
Die nachstehende Tabelle zeigt, daß Neoviridogrisein II etwa
die 2- bis 3-fache Aktivität von Viridogrisein aufweist.
Tabelle II Vergleich von Neoviridogrisein II mit Viridogrisein
Mikro or gani smu s
Staphylococcus aureus 209 P
(EM,CM,SM,PC,TC)r 0,125
(TC,CP,PC)r
Bx-1633(PC)r
Russell(PC)r
Smith
Medium: Hirn-Herz-Infusionsbrühe
Abkürzungen: vgl. Tabelle I
Bei der Untersuchung der minimalen Hemmkonzentrationen von Neoviridogrisein I, II und III in Gegenwart von Griseoviridin läßt
Mindesthemmkonzentration
(μκ/ml)		 VG**
NV*II 0,133
0,078 0,334
0,125 0,334-
0,094 0,267
0,125 0,267
0,125 0,267
0,125
7098R1 /ΠΠ7 4
14
sich ein Synergismus zwischen Neoviridogrisein und Griseoviridin feststellen, wie es auch bei Viridogrisein und Griseoviridin der Fall ist. Der Synergismus der Antibiotika der Erfindung mit Griseoviridin wurde mit unterschiedlichen Verhältnissen von Neoviridogriseingemisch zu Griseoviridin näher untersucht. Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle zusammengestellt .
Tabelle III
Synergismus eines Neoviridogriseingemisches mit Griseoviridin Neoviridogriseingemisch : Griseoviridin Mindesthemmkcnzentration*
100 0,313 * untersuchter Mikroorganismus: Sarcina lutea
90 0,156 Röhrchenverdünnungstest mit Hirn-Herz-Infusionsbrühe.
80 0,125
70 0,125
60 0,094
50 0,078
40 0,094
30 0,125
20 : 0,250
10 : 0,250
0 : 0,250
: 0
: 10
: 20
: 30
: 40
50
60
70
80
90
100
Aus der vorstehenden Tabelle ergibt sich, daß der Synergicmur,
7 0 9 8 F* 1 / Π Π 7 /,
cine« Neoviridogriseingemisches mit Griseoviridin am signifikantesten bei einem Verhältnis von 50 : 50 ist, d.h. ein 1 :1-Geminch von Neoviridogriseinen und Griseoviridin weist die 3-4-faehe Aktivität von Neoviridogrisein oder Griseoviridin al]ein auf.
Auπ Tabelle IV ergibt sich die hohe in vitro-Aktivität von Neoviridogri sein 31 gegen vernein edene Mycoplasmastämine sowie der überlegene ilynorgi r;nmn eines Gemisches aus Neovi ridogri sein Ij und Griseoviridin im Vergleich mit einem Gemisch aus Viridogrisein und Gi^i seoviridin. Die Mindesthemmkonzentration v/ird nach dem Verdünnungstest bestimmt.
Tabelle JV Mikroorganismus Medium NV II VG GV- NV II+GV» VG+GV*
y])I a sma gal 1 i sop ti cum
KP13 (1) 0,025 0,10 0,10 0,0063 0,025
M.yco])]asmn pulraonis TG 22 (2) 0,?8 1,56 6,25 0,20 0,39
Mycoplasma fermentans (2) <0,05 <O,O5<O,O5 <0,05 <0,05
Mycoplasma agalactiae PG 2 (2) 0,39 0,78 3,13 <0,05 0,39
Medium (1): VVl1O angereicherte Brühe (Elken, Japan)
(2): PPJjO-Brühe (Chanock-Medium, Difco) * Mi schungsverhältni 55: 50/50 NV 13, VG, GV: vgl. Tabelle I
Wie vorstehend erläutert, weisen die Neovi ri dogiü seine 1, 13 und 11] eine beacht] i eh·- /.1: tivität gegen gram-ro:-.i ti ve Bakterien und Mycoplasmen aui", und zwar allein odrr in (iojjii seilen mit Virido-
7 0 9HM/ Π :*. 7 A
grisein (Neoviridogrisein IV) und Griseoviridin. Es wurde festgestellt, daß die Gewichtsverhältnisse von Neoviridogrisein I, II und III sowie von Viridogrisein (Neoviridogrisein IV) und Griseoviridin in einem Gemisch innerhalb weiter Grenzen variieren können, wobei die überraschenden antimikrobiellen und antimycoplasmatisehen Aktivitäten erhalten bleiben. Beispielsweise wird ein Gemisch der folgenden Zusammensetzung auf seine in vitro-Aktivität gegen Streptococcus mutans, einem Mikroorganismus, der bei Zahnkaries und bei peridentalen Erkrankungen auftritt, untersucht:
Neoviridogrisein II 27 Gewichtsprozent
Neoviridogrisein IV (Viridogrisein) 23 Gewichtsprozent Griseoviridin 50 Gewichtsprozent
Diese Untersuchung wird in einer Todd-Hewitt-Brühe (Difco) mit 0,5 Prozent TC-Lactalbuminhydrolysat (Difco) durchgeführt. Die ursprüngliche Organismenzahl beträgt etwa 3 χ 10 Organismen pro ml. Die Kulturröhrchen werden 48 Stunden bei 37°C anaerob inkubiert. Als Mindesthemmkonzentration und minimale baktericide Konzentration wird für Neoviridogrisein eine Konzentration von 1,0 ppm festgestellt.
Ferner wird das gleiche Gemisch in vitro gegen Treponema hyodysenteriae, einem Schweinedysenterieorganismus untersucht. Das Gemisch wird in Blut-Agar bei Konzentrationen von 100, 50, 10, 5, 1, 0,5 und 0,1 ppm untersucht. Die Platten werden mit einem !Tupfer beimpft und 4- Tage bei 42°C inkubiert. Die Mindesthemmkonzentration wird zu 0,5 ppm bestimmt.
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i r·
Ferner wird ein Gemisch der folgenden Zusammensetzung auf seine in vitro-Aktivität gegen verschiedene Mycoplasmastämme untersucht :
Neoviridogrisein II 25 Gewichtsprozent
Neoviridogrisein IV (Viridogrisein) 25 Gewichtsprozent Griseoviridin 50 Gewichtsprozent
Folgende Mindesthemmkonzentrationen werden festgestellt: Stamm Mindesthemmkonzentration
Mycoplasma gallisepticum KPI3 0,07
Mycoplasma pulmonis 0,20
Mycoplasma fermentans 0,05
Mycoplasma agalactiae 0,05
Die geschilderten Neoviridogrisein-Griseoviridin-Gemische eignen sich auch zur Behandlung von Tieren, die an infektiösen Erkrankungen leiden, die durch die vorgenannten pathogenen Bakterien hervorgerufen worden sind.
Da Mikamycin A und B als sehr wirksame Futterzusätze bekannt sind, werden die Antibiotika der Erfindung einem Fütterungstest unterzogen. Ein Neoviridogriseingemisch wird in einer Menge von 2 bis 20 ppm einem Geflügelfutter zugesetzt und 10 Wochen an männliche Küken verfüttert. Verglichen mit der Kontrollgruppe, die das gleiche Futter ohne Zusatz von Neoviridogrisein erhält, zeigen die unter Zusatz von Neoviridogrisein gefütterten Küken eine stärkere Zunahme des Körpergewichts und eine bessere Futterver-
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wertung. Somit sind die Neoviridogriseine der Erfindung wertvolle Futterzusätze.
Auch Präparate, die eines oder mehrere der Neoviridogriseine I, II und III gegebenenfalls im Gemisch mit Viridogrisein (Neoviridogrisein IV) und Griseoviridin enthalten, erweisen sich als wertvolle Futterzusätze, wobei die Gewichtsverhältnisse der einzelnen Bestandteile innerhalb sehr weiter Grenzen variieren können.
Beispielsweise wird ein Gemisch der nachstehenden Zusammensetzung in vivo als Futterzusatz für Küken untersucht: Neoviridogrisein II . 27 Gewichtsprozent
Neoviridogrisein IV (Viridogrisein) 23 Gewichtsprozent Griseoviridin 50 Gewichtsprozent
Pro Behandlungsgruppe werden 15 eintägige Hähnchen verwendet. Die Tiere erhalten 11 Tage ein Futter mit einem Gehalt an etwa 55 Prozent Roggenkörner, versetzt mit Vitaminen, Minueralstoffen, Fett und Proteinen. Der hohe Gehalt an Roggenkörnern ergibt in der Regel ein geringes bis mäßiges Wachstum. Diese Diät dient als Standarddiät zur Ermittlung von wachstumsfördernden Stoffen und äntibiotisch wirkenden Futterzusätzen. Als positive Kontrolle wird 100 ppm Penicillin verwendet. Die erhaltenen Werte sind in nachstehender Tabelle zusammengestellt. Das Verhältnis von Gramm verbrauchtem Futter pro Gramm Gewichtszunahme wird als Futter/Zunahme-Verhältnis bezeichnet. Das Verhältnis des Körper-
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gewichts der Hähnchen am Ende der 11-tägigen Untersuchung zum ursprünglichen Körpergewicht wird als Körpergewichtsverhältnis "bezeichnet. In der letzten Spalte ist die durchschnittliche Gewichtszunahme (g pro Tier) angegeben.
durchschnitt-
ppm im Putter-Zunahme- Körpergewichts- liehe Gewichts-Behandlung Futter Verhältnis verhältnis zunähme ()
Roggen-
Kontrolle		 100 1,334 4,696 156,47
Penicillin 100 1,197 5,012 163,20
untersuchtes
Gemisch		 50 1,256 " 4,739 161,66
η 25 1,283 4,892 163,47
Il 1,204 5,226 174,67
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
In einem 250 ml-Erlenmeyer-Kolben werden 50 ml eines Anzuchtmediums mit einem Gehalt an 0,5 Prozent Sojabohnenmehl, 0,5 Prozent Pharmamedia (Traders Oil Mill Co.), 0,5 Prozent Hafermehl, 0,5 Prozent Trockenhefe und 0,5 Prozent Rübenmelassen gegeben und auf den pH-Wert 6,5 eingestellt. Nach einer 15-minütigen Autoklavenbehandlung bei 1200C wird eine öse voll Streptomyces sp. P8648 auf eine ISP-2-Agar-Schrägkultur überimpft. Der Kolben wird sodann 48 Stunden bei 280C auf einem rotierenden Schüttelgerät inkubiert. 2 ml dieser Anzuchtkultur werden auf 100 ml in einem 500 ml-Erlenmeyer-Kolben befindliches Medium der nachstehenden Zusammensetzung übertragen:
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0,5 Prozent Sojabohnenmehl, 0,5 Prozent Erdnußmehl, 0,5 Prozent Hafermehl, 0,5 Prozent Trockenhefe und
0,5 Prozent Rübenmelassen (pH-Wert vor dem Atoklavisieren 6,5)· Die Züchtung wird 96 Stunden bei 28°C auf einem rotierenden Schüttelgerät bei 200 U/min (Kreisradius 3»5 cm) vorgenommen. Die Gärbrühe von 12 Kolben wird gesammelt und zu einem klaren Gärfiltrat filtriert. Der erhaltene Filterkuchen wird mit 100 ml Wasser gewaschen. Die Waschflüssigkeit und das Gärfiltrat werden vereinigt. Die antibiotische Aktivität dieser Lösung (pH-Wert 8,3) wird zu 23,0 mm auf einer Sarcina lutea-Nähragar-Testplatte bestimmt, wobei der .standardisierte Scheibentest mit einer 8 mm Papierscheibe durchgeführt wird. 800 ml der vorgenannten wäßrigen Lösung werden 2 mal mit je 200 ml n-Butanol extrahiert. Die Butanolextrakte werden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Man erhält 90 mg eines rohen Pulvers aus Neoviridogriseinen und Griseoviridin. Dieses rohe Pulver wird mit einer geringen Menge an Kieselgel vermischt und auf eine mit Kieselgel gepackte Säule (Wako-Gel C-100, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.; 1,5 x 25 cm) aufgesetzt. Die Kieselgelsäule wird zunächst mit 300 ml eines Gemisches aus Benzol und Aceton (5 · 1) und anschließend mit einem Gemisch aus Benzol und Aceton (2:1) eluiert. Mit einem automatischen Fraktionssammler werden Fraktionen mit einem Gewicht von 10 g gewonnen. Die aktiven Fraktionen Nr. 25 bis 35 werden vereinigt und zur Trockne eingedampft. Man erhält 30 nlg eines Neovirido-
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griseingemisches, das aus Neoviridogrisein I, II und III und Viridogrisein besteht. Nach dem Eindampfen der aktiven Fraktionen Nr. 45 bis 54· zur Trockne erhält man ein rohes Pulver, dessen antibiotische Aktivität dunnschichtchromatographisch Griseoviridin zugeordnet wird. Diese beiden Präparate werden unter den angegebenen Bedingungen dünnschichtchromatographisch behandelt. Die antimikrobielle Aktivität wird an einer Sarcina lutea-Nähragar-Testplatte bestimmt.
Dünnschichtplatte: mit Kieselgel 60 F-254 vorbeschichtete Dünnschichtplatte, E. Merck, Darmstadt,
(1) Laufmittel : Chloroform : Methanol = 20 : 1 Neoviridogriseine: R~-Wert = 0,45 Griseoviridin 0,05
(2) Laufmittel : Benzol : Aceton =1:1 Neoviridogriseine : R„-Wert =0,55 Griseoviridin 0,13
Beispiel 2
200 ml einer 48-stündigen Kultur von Streptomyces sp. P8648 im gleichen Medium wie in Beispiel 1 werden auf einen 15 Liter fassenden Fermenter aus korrosionsbeständigem Stahl mit einem Gehalt an 10 Liter des Anzuchtmediums von Beispiel 1 überimpft. Die Züchtung wird 96 Stunden bei 27 bis 28°C unter Belüftung mit steriler Luft in einer Geschwindigkeit von 5 Liter/min durchgeführt. Während der Züchtung wird mit einem Kreiselrührer mit einer Frequenz von 200 U/min gerührt. Der Durchmesser des Rührers beträgt etwa 1/4 des Fermenterdurchmessers. Nach der
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Züchtring werden Mycel und Feststoffe abfiltriert. Das erhaltene Gärfiltrat wird auf den pH-Wert 6,0 eingestellt und 2 mal mit je 2 Liter Essigsäureathylester extrahiert. Die Essigsäureäthylesterextrakte werden vereinigt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Man erhält 700 mg rohe Neoviridogriseine und Griseoviridin. Das erhaltene rohe Pulver aus Neoviridogriseinen und Griseoviridin wird in einer geringen Menge Methanol gelöst und auf eine mit Sephadex LH-20 gepackte Säule der Abmessungen 3 x 50 cm aufgesetzt. Bei der Elution mit Methanol werden Fraktionen von jeweils 10 ml gesammelt. Die Neoviridogriseine finden sich in den Fraktionen Nr. 22 bis 29. Diese Fraktionen werden gewonnen, zur Trockne eingedampft und säulenchromatographisch an Kieselgel (Silicar CC-7 Special; Mallinckrodt Chemical Works; 1,5 χ 20 cm) weiter gereinigt. Die Elution wird mit einem Gemisch aus Chloroform und Methanol (30 : 1) durchgeführt. Die 8 Fraktionen Nr. 5 bis Nr. 12 mit einem Gewicht von jeweils 5 g werden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Ma_n erhält 25 g eines weißen Neoviridogriseinpulvers. Dieses Pulver weist folgende Zusammensetzung auf:
Neoviridogrisein I : 15 Prozent
II : 20 Prozent
III : 20 Prozent Viridogrisein : 45 Prozent
Dünnschichtchromat ographi sch läßt sich in den Fraktionen Nr. 30 bis 34 der vorerwähnten Chromatographie an Sephadex LH-20 Griseo-
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viridin nachweisen. Diese aktiven Fraktionen werden vereinigt, unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft und aus warmem Methanol kristallisiert. Man erhält 30 mg nadeiförmige Kristalle von Griseoviridin. Die Identität dieser Kristalle mit Griseoviridin wird dünnschichtchromatographisch und durch andere physikochemische Verfahren bestätigt.
Beispiel 3
Es wird die gleiche Fermentation wie in Beispiel 1 96 Stunden durchgeführt, mit der Ausnahme, daß das Fermentationsmedium folgendermaßen zusammengesetzt ist: Sojabohnenmehl 0,5 Prozent, Pharmamedia 0,5 Prozent, Hafermehl 0,5 Prozent, Trockenhefe 0,5 Prozent, Eübenmelassen 0,5 Prozent und DL-a-Amino-n-buttersäure 0,1 Prozent (pH-Wert 6,5)· Die Gärbrühe von 13 Flaschen wird gesammelt und filtriert. Das FiItrat wird 2 mal mit jeweils 300 ml n-Butanol extrahiert. Nach dem Entfernen des n-Butanols
etwa
aus den Extrakten hinterbleiben/70 mg rohes Pulver aus Neoviridogriseinen und Griseoviridin. Dieses rohe Pulver wird dünnschichtchromatographisch an Kieselgel und anschließend durch Bioautographie an Sarcina lutea als TestOrganismus analysiert. Bei diesem Test wird eine Dünnschichtplatte der Firma E. Merck, Darmstadt (mit Silica Gel 60 F-254- vorbeschichtete Dünnschichtplatte) verwendet. Die erhaltenen Rf-Werte und die Lösungsmittel sind nachstehend angegeben: .
Chloroform:Methanol 20:1 30:1 40:1
Neoviridogrisein I Rf-Wert 0,60
II 0,56
III 0,50
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0 ,39 0 ,20
0 ',32 0 ,16
0 ,19 0 ,13
0 --8V 0 ,18 2725163
Viridogri sein 0 0 ,02 0,10
Griseoviridin ,05 0,00
Beispiel 4
50 ml eines Anzuchtmediums mit einem Gehalt an 0,3 Prozent Rindfleischextrakt, 0,5 Prozent Tryptone (Difco Laboratories), 0,1 Prozent Glucose, 2,4- Prozent lösliche Stärke, 0,5 Prozent Hefeextrakt, 0,4 Prozent Calciumcarbonat und 0,5 Prozent Sojabohnenmehl (pH-Wert 7»0) werden in einen 250 ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben und I5 Minuten bei 1200C autoklavisiert. Sporen von Streptomyces sp. P8648 auf einem Schrägagar werden in diesen Kolben überimpft und 3 Tage bei 25°C unter Schütteln zur Herstellung einer Anzuchtkultur gezüchtet. Das Fermentationsmedium besteht aus 0,5 Prozent löslicher Starke, 2,0 Prozent Glucose, 1,0 Prozent Pharmamedia, 0,5 Prozent Hafermehl, 0,5 Prozent Haisquellwasser, 0,05 Prozent Dikaliumphosphat und 0,05 Prozent Magnesiumsulfat (pH-Wert 6,5)· 50 ml dieses Fermentationsmediums werden in einen 250 ml'-Erlenmeyer-Kolben gegeben und 15 Minuten bei 1200C autoklavisiert. Der Anteil des Inokulums beträgt 2 Prozent (Volumen/Volumen). Der Fermentationskolben wird mit der vorgenannten Anzuchtkultur angeimpft und bei 25°C auf einem rotierenden Schüttelgerät inkubiert. 24 oder 48 Stunden nach dem Beimpfen wird eine sterile Lösung von Casaminsäure (Difco Laboratories) oder Prolin (pH-Wert 7>0) bis zu einer Endkonzentration von 0,4 Prozent zugegeben. Anschließend wird die Züchtung fortgesetzt. 4 Tage nach dem Beimpfen wird die Gärbrühe abfiltriert und das Gärfiltrat 2 mal mit einem gleichen
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Volumen an Essigsäureäthylester extrahiert. Die Essigsäureäthylesterextrakte werden vereinigt und unter vermindertem Druck zu einem Pulver eingedampft. Dieses rohe Pulver wird in Essigsäureäthylester aufgenommen. Eine Aliquotmenge dieser Lösung wird quantitativ auf eine Kieselgel-Dünnschichtplatte aufgebracht. Die Platte wird in einem Laufmittelsystem aus Chloroform und Methanol (50 :1) entwickelt. Das Lösungsmittel wird an der Luft abgedampft. Sodann wird die Diinnschichtplatte wieder in dem Laufmittelsystem aus Chloroform und Methanol (50 :1) entwickelt. Die einzelnen NeoviridogriSeinkomponenten werden
unter ultraviolettem Licht (3650 A) ermittelt, von der Dünnschichtplatte abgekratzt und in einem bekannten Volumen an Methanol suspendiert. Nach dem Dekantieren des Kieselgels wird die Menge der Antibiotika in den Extrakten durch UV-Spektroskopie bestimmt. Der Extinktionskoeffizient bei 305 nin beträgt 8000. Die Ergebnisse sind nachstehend zusammengestellt:
zugesetzte Aminosäuren
I keine Casaminsäure Prolin
Neoviridogri sein II 2% 2% 2%
III 9 40 60
3 3
Viridogrisein 85 55 35
Beispiel 5
Etwa 1O Liter einer 23 Stunden alten Anzuchtkultur werden gemäß Beispiel 2 in einem Fermenter hergestellt. Das Fermentationsmedium (600 Liter) enthält 0,5 Prozent Sojabonnenmehl, 0,5 Pro-
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zent Pharmamedia, 0,5 Prozent Hafermehl, 0,5 Prozent Trockenhefe, 0,5 Prozent Rübenmelasse und 0,1 Prozent DL-oc-Amino-nbuttersäure (pH-Wert vor dem Autoklavisieren auf 6,5 eingestellt). Das Medium wird 15 Minuten bei 1200C in einem 1400 Liter fassenden Tankfermenter aus korrosionsbeständigem Stahl mit Dampf sterilisiert und sodann auf 280C abgekühlt. In diesen Tankfermenter wird die vorerwähnte Anzuchtkultur (10 Liter) zugegeben und 75 Stunden bei 28°C unter einer Rührgeschwindigkeit von 180 U/min (Doppelkreiselrührer; Kreisradius 1/4 des Tankdurchmessers) belüftet, wobei vom Tankboden 300 Liter/min sterile Luft mittels eines Sprenggeräts zugeführt werden. Nach beendeter Züchtung wird die Brühe durch eine Filterpresse filtriert. Das Filtrat wird 2 mal mit je 150 Liter n-Butanol extrahiert. Die n-Butanol Extrakte werden vereinigt, mit einem geringen Volumen an gesättigter NaCl-Lösung gewaschen und in einem Rotationsverdampfer auf 2 Liter eingeengt. Sodann werden 20 g Kieselgel (Wakogel G-10 , Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) zugegeben und das Einengen auf dem Rotationsverdampfer wird bis zur vollständigen Trockne fortgesetzt. Das erhaltene Gemisch aus Antibiotika und Kieselgel wird in einer geringen Menge Chloroform suspendiert und oben auf eine Kieselgelsäule (Wakogel C-100; 6,5 x 75 cm) aufgesetzt. Die Elution der aktiven Antibiotika wird stufenweise zunächst mit 7 Liter Chloroform, sodann mit 10 Liter eines Gemisches aus Chloroform und Methanol (50:1) und schließlich mit Methanol durchgeführt. Die Fraktionen Nr. 16 bis 29 (300 g/Fraktion) die sich gegenüber Sarcina lutea
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als bioaktiv erweisen (Neoviridogriseine) werden gesammelt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Man erhält ein rohes Pulver an Neoviridogriseinen. Dieses rohe Pulver wird in einer geringen Menge Methanol gelöst und über eine mit Sephadex LH-20 gepackte Säule der Abmessungen 7,0 χ 45 cm gegeben. Es werden Fraktionen von jeweils 100 g mit Methanol eluiert. Aus den Fraktionen Nr. 6 bis 15 erhält man nach dem Abdampfen des Lösungsmittels etwa 15 g rohes Pulver eines Neoviridogri seingemi sehe s. Die Fraktionen Nr. 50 bis 60 der vorerwähnten Kieselgelsäule enthalten Griseoviridin. Nach einem ähnlichen Reinigungsverfahren mit Sephadex LH-20 (Säulengröße 7,0 χ 45 cm), wie es für das Neoviridogriseingemisch verwendet worden ist, wird wiederholt. Man erhält 4 g rohes Griseoviridin.
Beispiel 6
Zur endgültigen Reinigung wird eine präparative Dünnschichtchromatographie an Kieselgel-Dünnschichtplatten angewendet. 1 g rohes Neoviridogriseingemisch von Beispiel 5 wird in 2 ml Essigsäureäthylester gelöst und streifenweise auf 10 Kieselgel-Dünnschichtplatten (mit Silica Gel 60 F-254 vorbeschichtete Dünnschichtplatten) aufgesetzt. Diese Dünnschichtplatten werden zuerst mit einem Lösungsmittelsystem aus Chloroform und Methanol (50:1) entwickelt. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels an der Luft werden diese Dünnschichtplatten einer zweiten Entwicklung mit einem Laufmittelsystem aus Chloroform und Methanol (25:1) unterworfen. Neoviridogrisein I, II und III-sowie
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Viridogrisein werden auf den Dünnschichtplatten unter ultraviolettem Licht (3650 A; Blak-Ray UVL-22, Ultra-Violet Products Inc.) markiert und abgekratzt. Die einzelnen Neoviridogriseinkomponenten werden mit einer geringen Menge an Methanol eluiert und zur Trockne eingedampft. Man erhält folgende Mengen an reinen Neoviridogriseinen:
Neoviridogrisein I : 16,7 mS (weniger rein, ölig)
II : 11,1 mg (weißes Pulver)
III : 15,2 mg (weißes Pulver) Viridogrisein : 30,0 mg (weißes Pulver)
Jeweils etwa 5 mg der Neoviridogriseine werden in 6 η HCl 36 Stunden bei 1100C in einem verschlossenen Röhrchen hydrolysiert und anschließend der Dünnschichtchromatographie, Fapierchromatog'aphie, Hochspannungs-Papierelektrophorese und automatischen Aminosäureanalyse unterworfen. Die einzelnen Komponenten weisen folgende Bestandteile auf:
Neoviridogrisein I : 3-Hydroxypicölinsäure,
Threonin,
Leucin,
Prolin,
Sarcosin,
β,Ν-Dimethylleucin, α-Amino-n-buttersäure und Phenylsarcosin.
Neoviridogrisein II : 3-Hydroxypicolinsäure,
Threonin,
Leucin,
Prolin,
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Neoviridogrisein II
Sarcosin,
β,Ν-Dimethylleucin, Alanin und
Phenylsarcοsiη.
Neoviridogrisein III
3-Hydroxypicolinsäure, Threonin, Leucin, Hydroxyprolin, Sarcosin, ß,N-Dimethylleucin, α-Amino-n-buttersäure und Phenylsarcosin.
Viridogrisein
3-Hydroxypicolinsäure, Threonin, Leucin, Hydr oxyp rο1iη, Sarcosin, ß,N-Dimethylleucin, Alanin und Phenyls arc ο sin.
Die Identität von Neoviridogrisein IV mit Viridogrisein wird ferner durch IR -, UV-, IJMR- und Massenspektrometrie, Dünnschichtchromatographie, Hydrolysatanalyse und Feststellung des antimikrobiellen Wirkungsspektrums bestätigt.
Das gemäß Beispiel 5 erhaltene Griseoviridinpräparat wird aus warmem Methanol zu nadeiförmigen Kristallen kristallisiert.
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Sodann wird ein Teil der nadeiförmigen Kristalle mit einer authentischen Griseoviridinprobe durch IR-, UV-, NMR- und Massenspektrometrie, Dünnschichtchromatographie, Elementaranalyse und andere physikochemische Verfahren verglichen und dabei identifiziert.
Bedeutung der Zeichnungen
Fig. 1: UV-Spektrum von Neoviridogrisein I (NVG i) in Methanol Fig. 2: UV-Spektrum von Neoviridogrisein II (NVGII) in Methanol Fig. 3: UV-Spektrum von Neoviridogrisein III (IJVG III) in Methanol Fig. M-: UV-Spektrum von Neoviridogrisein IV (NVG IV,VG) in Methanol
Fig. 5: UV-Spektrum von Neoviridogrisein I (NVG I) in Methanol/ 0,1 η NaOH
Fig. 6: UV-Spektrum von Neoviridogrisein II (NVG II) in Methanol/ 0,1 η NaOH
Fig. 7: UV-Spektrum von Neoviridogrisein III (NVG III) in Methanol/0,1 η NaOH
Fig. 8: UV-Spektrum von Neoviridogrisein IV (NVG IV,VG) in Methanol/0,1 η NaOH
Fig. 9: IR-Spektrum von Neoviridogrisein I (NVG I)-KBr-Preßling Fig.10: IR-Spektrum von Neoviridogrisein II (NVG H)-KBx---Preßling Fig.11: IR-Spektrum von Neoviridogrisein III (NVG III)-KBr~Preßling
Fig.12: IR-Spektrura von Neoviridogrisein IV (NVG IV,VG)-KBr-Preßling
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Leerseite

Claims (10)

  1. DIPL.-CHEM. DR. VOLKER VOSSIUS PATENTANWALT
    MONCHENbB,
    SlEBtHTSTRASSE *
    P.O. BOX 8847 67 PHONE: (O 89) 47 40
    CABLE ADDRESS: BENZOLPATENT MÖNCHEN
    TELEX 5-29453 VOPAT D
    13. Juni 1377
    u.Z.: M 210 Case: P/S-1
    PANLABS INC., FAYETTEVILLE, NY., V.St.A.
    Sanraku Ocean Co., Ltd. Tokyo, Japan
    "Neoviridogriseine, Verfahren zu ihrer Herstellung, deren Verwendung zur Bekämpfung bakterieller Infektionen und als Zusatz zu Futtermitteln und diese Verbindungen enthaltende Mittel"
    Priorität: 10. Juni 1976, Japan, Nr. 68306/1976
    Patentansprüche
    1J Neoviridogriseine der Formeln I, II und III
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    CH0
    2
    CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-N
    CH-CH,
    3 0
    co
    CH-N-CO-CH-NH-CO-CH
    I CH-CH,
    I 5
    CH-CHx
    I 5
    CH,
    CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-N
    CH-N-CO-CH-NH-CO-CH N-CH,
    ι ι ι *
    CH3 CH-CH5
    CH-CH, I
    CH,
    709851/0874
    _ 5 —
    \/ CH
    CH5 CH9 CHD
    I 2 I 2 I 2
    CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-N CH-CO
    I I (III)
    CH-CH, N-CH,
    I 3 I 5
    0 CH0
    1 I 2
    co co
    I I
    CH-N-CO-CH-NH-CO-CH N-CH,
    Il I 3
    CH-CH,
    I 5
    CH-CH,
    I 3
    CH5,
  2. 2. Verfahren zur Herstellung der Neoviridogriseine nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces sp. P8648 (FERM-P3562) unter aeroben Bedingungen bei Temperaturen von 18 bis 37°C in einem wäßrigen, assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und essentielle Mineralsalze enthaltenden Nährmedium in einem pH-Bereich von etwa 6 bis etwa 9 so lange züchtet, bis eine wesentliche antibiotische Aktivität im Medium auftritt, das Fermentationsprodukt aus dem Medium gewinnt und gegebenenfalls Neoviridogrisein I, II und III als einzelne Bestandteile isoliert.
  3. 3· Verfahren nach Anspruch 2,dadurch gekennzeichnet, daß man neben Neoviridogrisein I, II und III auch Viridogrisein und Griseoviridin erzeugt.
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  4. 4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung in Gegenwart von a-Amino-η-buttersäure und/oder natürlichen Quellen mit einem Gehalt an ot-Amino-n-butt er säure durchführt.
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung in Gegenwart von Prolin und/oder natürliche^Prolin enthaltenden Quellen durchführt.
  6. 6. Antibiotisches Präparat, enthaltend Neoviridogrisein I, II und III, Viridogrisein und Griseoviridin, hergestellt durch Züchtung von Ströptomyces sp. P8648 (FERM-P3562).
  7. 7. Arzneimittel zur Behandlung von durch gram-positive Bakterien und Mycoplasmen verursachte Infektionen, enthaltend als Wirkstoff die Depsipeptidantibiotika Neoviridogrisein I, II und III sowie Viridogrisein.
  8. 8. Arzneimittel nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß sie als Wirkstoff Neoviridogrisein I enthalten.
  9. 9. Arzneimittel nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Wirkstoff Neoviridogrisein II enthalten.
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  10. 10. Arzneimittel nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß sie als Wirkstoff Neoviridogrisein III enthalten.
    11. Arzneimittel nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Wirkstoffe Neoviridogrisein I,
    II und III sowie Viridogrisein im Gemisch mit Griseoviridin enthalten.
    12. Futterzusatz, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Neoviridogrisein I, II und III sowie Viridogrisein und Griseoviridin als Wirkstoffe.
    13. Futterzusatz mit einem Gehalt an Neoviridogrisein I, II oder
    III oder einem Gemisch dieser Verbindungen.
    14. Futterzusatz nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß er als Wirkstoff Neoviridogrisein II enthält.
    15. Futterzusatz, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Neoviridogrisein I, II oder III im Gemisch mit Viridogrisein und Griseoviridin.
    16. Futterzusatz nach Anspruch 15» dadurch gekennzeichnet, daß er als Wirkstoff Neoviridogrisein II enthält.
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    17. Streptomyces sp. P8648 (FERM-P3562).
    18. Verwendung der Antibiotika nach Anspruch 1 zur Bekämpfung bakterieller Infektionen.
    19. Verwendung der Antibiotika nach Anspruch 1 als Zusatz zu Futtermitteln.
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