DD144562A5 - Verfahren zur herstellung neuer antibiotisch wirksamer neoviridogriseine - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer gegen gram-positive Bakterien und Mycoplasmen hochwirksame Depsipeptidantibiotika und zwar die Neoviridogriseine I, II und III, durch Züchtung von Streptomyces sp.P. 8648 (FERM-P 3562).

Description

Anv/erJrLungsgebiet der Erfindung ' .^: ϊ' ν : Die Erfindung betrifft neue gegen gram-positive Bakterien und Mycoplasmen hochwirksame Depsipeptidantibiotica,und zwar die Neoviridogriseine I, Il und III sowie deren Herstellung, Isolierung und Verwendung zu therapeutischen Zwecken und als Zusatz zu Tierfutter. '

Charakteristik der bekannten teeh'n. Lösungen ^:; Die sogenannten Mikamycine/Vernamycine (oder Streptogramine) zerfallen in zwei Gruppen, von; denen die eine große Gruppe (Gruppe A nach D. Vazquez: SS. 521-53^, ANTIBIOTICS ill, Mechanism of action of antimicrobial and antitumor agents, Springer-Verlag Berlin-Heidelberg-New York 1975). ein mäkrocyclisches Lac ton darstellt^ und Griseoviridin, Ostreogrycin A(=Mikainycin A=V irginiamycin M=Staphylomyc in M=Pr ist inamyc in IIA-Vernainycin A=Streptograinin A=Synergi st in A-I Verbindung PA-ll^Al=Verbindung E=I29 Faktor A, usw.), Ostreogrycin G ' C=Virginiämyc in MII=St aphylomy c in FiIi-Pr i st inamyc in I IB^Dihydrostreogrycin A=Verbindung E-I29 Faktor B=Verbindung R.P. . »13920, usw.) und die Verbindungen A-231.5. A, B und C umfaßt. Diese Antibiotica sind bakteriostatisch und gegen gram-positive Bakterien und Mycoplasmen wirksam. Eines der erfindungsgemäßen Zuchtungsprodukte, ist das Griseoviridin, das bekanntlich zusammen mit Viridogrisein bei der Züchtung von Streptomyceten entsteht und dessen Herstellung in den US-PS 3 023 20^ und 3 17^ 902 offenbart worden war.

Die zweite große Gruppe (Gruppe B nach D. Vazquez) ist ein mäkrocyclisches Depslpeptid und zerfällt in zwei Untergruppen, und zviar in die Viridogrisein- und Vernamycin-B-Gruppe. Diese Antibiotica sind hauptsächlich gegen grain-positive Bakterien, wie Staphylococcus aureus und Bacillus subtilis wirksam. Die Vernainycin-B-Gruppe umfaßt 12 Homologen. Infolge der komplizierten Synonymieverhältnisse bei diesen Antibiotica ist es praktisch unmöglich, alle Verbindungen dieser Untergruppe aufzuzählen. Im folgenden seien lediglich einige repräsentative und wissenschaftlich bedeutsame Verbindungen

hi- 199 3fS

dieser Untergruppe genannt: v

. 1.Vernamycin BoC =Ostreogrycin B=Pristinamycin IA=Mikamycin B=Streptogramin B=Synergistin B-1=Verbindung E-129 Faktor Z=Verbindung PA114B1 .: :

2. Vernamycih Boc =Ostreogrycin BI=Pristinamycin IC=Verbindung E-129 Faktor Z1 ;^^^ , ; : ; ' .v

3· Vernamycin Bo<.=Ostreogrycin B2=Pristinamycin IB=Verbindung ..'.V.-.,.BrI29 Faktor Z2=Verbindung R.P.-13919

4. Ostreogrycin B3=Verbindung E-1.29 Faktor Z3 ^ .

5. Patricin A _; "-^;;'-v·: ' -^-V ^r"·"':' ·, '/ :/';: '^:;..'.·.· ; ' , '- ' -ϊ'· ' .

6. Patricin B :',: ]; : ; /.'; ;\ ; _;;.-^;;. ' '.. /,: "¹V^o'-:'.',.'. ^:.' ^:·. '. 7«... Vernamycin'Br / -^. :.'. ^:._: ' ' ^:;^:'"^^:'.^: ;'.;.. ^;.'' ^:' .. / - . . . 8. Vernamycin C=Doricin . :;; ; ;

"9· Virginiamycin (Staphylomycin)S _; ;-

10. Virginiamycin (Staphylomycin) S2

11* Virginiamycin (Staphylomycin)S3

12· Virginiamycin (Staphylomycin)S4.;.'..(oder S1).

Das gemeinsame Merkmal dieser Untergruppe besteht darin, daß sie aus sieben Komponenten zusammengesetzt ist, wobei 4 davon_; und zwar 3-Hydroxypicolinsäure, L-Threonin, L-Prolin und L-Phenylglycin allen Verbindungen gemeinsam sind. Aus der Viridogriseingruppe ist im Gegensatz dazu bisher nur eine einzige Verbindung bekannt geworden, nämlich das Viridogrisein, das mit Etamycin, Verbindung K-179 und Verbindung F-1370A identisch ist. Es besteht aus acht Komponenten, nämlich aus 3-Hydroxypicolinsäure, L-Threonin, D-Leucin, 4-Hydroxy-D-prolin, Sarcosin, β,Ν-Dimethyl-L-leucin, L-Alanin und L-Phenylsarcosin. Die erfindungsgemäßen Neoviridogriseinantibiotica gehören nun zur Viridogr.iseingruppe, wobei das Neoviridogrisein IV dem Viridogrisein entspricht. Die Herstellung von Viridogrisein war in US-PS 3 023 204 offenbart worden.

Der Synergismus zwischen den Gruppen A und B war an verschiedenen Mikroorganismen untersucht "worden und wurde erfolgreich zur Steigerung der therapeutischen Wirkung von Arzneimitteln, welche ^: Antibiotica dieser Familie als Wirkstoffe enthalten, eingesetzt. Dasselbe gilt auch für die Neoviridogriseine. Ziel Wr Erfindung: : ν - , ;' ,J- '. ;,., · Λ . ; :: Die Erfindung bezieht sich somit aufneue "wertvolle Depsipeptidantibiotica, insbesondere auf die Neoviridogriseine I, II und III und Viridogrisein, die gegen gram-positive Bakterien und Mycoplasmen wirksam sind und in verdünnter Form als Rohkonzentrate oder in gereinigter Form zusammen mit Griseoviridin oder ohne dieses verwendet werden können. Darlegung des Wesens der Erfindung ' ,, , .' . Erfindungsgemaß handelt es sich somit um die Depsipeptidantibiotica NeoviridÖgrisein I, II und III, die gegen gram-positive Bakterien und Mycoplasmen hochwirksam sind.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung dieser Antibiotica durch Züchtung einer neuen Art von Streptomyces, und zwar von Streptomyces sp. P8648 (FERM-P3562) in einem geeigneten wässerigen Medium unter aeroben Bedingungen, wobei .man aus der Kulturlösung neben Griseoviridin oder ohne dieses die Neoviridogriseine er-

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Verfahren zur selektiven Gewinnung der gewünschten Neoviridogriseinkomponente(n) durch Zugabe einer geeigneten Aminosäure bzw, mehrerer Aminosäuren, insbesondere von Prolin zur Steigerung der Ausbeute an Neoviridogrisein I und II, und <2C-Amino-nbuttersäure zur Steigerung der Ausbeute an Neoviridogrisein I und III vor der Züchtung bzw. während derselben. Weitere Erfindungsgegenstände gehen aus der nachfolgenden Erfindungsbeschreibung hervor. Die Neoviridogriseine I, II und III sind hochwirksam gegen verschiedene pathogene Mikroorganismen, ein-

schließlich gram-positive Bakterien -und Mycoplasmen, und können dementsprechend in der¹ Human- und Veterinärmedizin Anwendung finden, insbesondere zur Behandlung von durch gram-positive Bakterien und Mycoplasmen, wie Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Dipiococeus pneumoniae, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma agalactiae, usw. hervorgerufene Infektionskrankheiten.

Der Ausdruck "Neoviridogrisein" bezeichnet nicht nur jeweils ein Glied der Gruppe Neoviridogrisein I, II und III und Viridogrisein (=Neoviridogrisein IV), sondern auch eine Mischung aus zwei oder mehreren Gliedern dieser Gruppe. - V

Kennzeichnung; des Mikroorganismus ; ;

Die neuen erfindungsgemäßen Depsipeptidantibiotica werden neben Viridogrisein und Griseoviridin von einer neuen Rasse von Streptomyces j nämlich von Streptomyc.es sp. P 86^-8 (FERM-P 35^2) produziert. Dieser Mikroorganismus vjurde aus einer in der Nähe des Kuzuryu-Staudammes in Pukui-ken (Japan) entnommenen Bodenprobe isoliert. . : :

Der Mikroorganismus wächst in die Länge, ist farblos und zeigt ein von einem ausgeprägt verzweigten (eine einzige Verzweigung) Substratmyzel ausgehendes Luftmyzel. Die eine glatte Oberfläche aufweisenden Sporenketten entstehen in lockeren Schleifen an der Spitze des Luftmyzels. 'Weder Wirbelbildung.noch Ascosporen. Das Verhalten in den verschiedenen Agarmedien ist viie

(1) Saccharose-Nitrat-Agar .·· ' .-

Wachstum : schwach

Luftmyzel :: dünn, gelegentlich weiß

Rückseite : farblos bis gräulich-weiß

Lösliches Pigment ' · ; - —·-

-is- 199 3

(2) Glucose-Asparagin-Agar

Wachstum ί

Luftmyzel :

Rückseite :

Lösliche s Pigment :

(3) G-lycerin-Asparagin-Agar

Wachstum :

Luftmyzel :

Rückseite :

Lösliches: Pigment :

stark,"'"' ; >::·.; " .; .' ; ^;; .' ' ; .. _ "./ /' ' , schwach oder nicht ausgebildet; wenn vorhanden, dann weiß, blaß-gelblichweiß bis hellgelb

mäßig

schwach oder nicht ausgebildet; wenn vorhanden, dann weiß, blaßgelb bis gräulich-gelb

(4) Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar

Wachstum

Luftmyzel

Rückseite

Lösliches Pigment

(5) Stärkeagar

Wachstum Luftmyzel

Rückseite

Lösliches Pigment Stärkehydrolyse

(6) Tyrosin-Agar Wachstum

stark

weiß bis mit Stich ins Graue hellgelb, später sich bräunlichgrau verfärbend

keines oder selten leicht bräunlich

mäßig

schwach oder nicht ausgebildet; wenn vorhanden, dann weiß, blaßgelb, leicht graubraun im Zentrum der Kolonien

gering

mäßig

-6- t$9 395

Luftmyzel Rückseite Lösliches Pigment

(7) Nähr-Agar

Wachstum Luftmyzel Rückseite Lösliches Pigment

'(S) Hafermehl-Agar

Wachstum Luftmyzel Rückseite

Lösliches Pigment

keines oder gelegentlich einige wenige Flecken -weißes Luftmyzel gräulich-gelb bis hellgelblichbraun

zuerst blaßpurpur bis hellrötlich-braun, nach Tagen blaßbraun, etwas melanoides Pigment.

dünn, weiß

blaßgelb

weiß bis gräulich-weiß gräulich-gelb bis hellrötlichbraun mit Stich ins Graue

Die optimale Wachstumstemperatur des erfindungsgemäßen Mikroorganismus liegt im Bereich von 25 bis 35⁰C. Auch Temperaturen unterhalb oder oberhalb dieses Bereiches, wie z.B. 1O⁰C oder 45⁰C kommen noch für die Züchtung in Frage, allerdings 1st dann das Wachstum sehr gering. Bei einer Temperatur von 52⁰C kommt es jedoch zu keinem Wachstum mehr.

Gelatine in Glucose-Pepton-Gelatinemedium wird verflüssigt; Stärke in Stärke-anorganische Salze-Agar wird schwach hydrolysiert und Magermilch ohne Koagulation peptonisiert.

Gelegentlich Produktion von Melanoidpigment in Tyrosin-Agar, jedoch nicht in Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar und Tyrosin-

3§S

Hefeextrakt-Lösung. ,

C-Assimilation (in Pridham-Gottlieb's Medium):

+ : D-Xylose, D-Glucose, D-Fructose,

.;':.;... ,:,; L-Rhamnose, D-Mannit.

schwach + : Saccharose

' — . \: L-Arabinose, i-Inosit, Raffinose

Bezüglich der Produktion der bekannten Peptid- und Nichtpeptid-Macrolid-Antibiotica, wie Mikamycin A und B, Virginia-^ mycine, Ostreogrycine, Etamycin, Yernamycine, Viridogrisein, Griseoviridin und Pristinamycine, werden folgende Mikroorganismen mit Streptomyces sp. P8648 verglichen:

Streptomyces griseus NRRL 2426 /

griseoviridus NRRL 2427

sp., Etamycin-Produzent

conganensis

ostreogriseus ' ν

mitakaensis ' : ;.y^:"'^;·^;;. ·

' '. ^: \' ' ; loidensis.. ^; . . . ''' /': ^; ^:-..:'.-. ,' .·.

Die dem Anmelder zugänglichen Angaben bezüglich der Kultur- und physiologischen Eigenschaften der genannten Mikroorganismen zeigen deutliche Unterschiede zwischen den erfindungsgemäß beanspruchten Streptomyce.ten und den oben genannten Streptomyceten. So etwa gehört Streptomyces griseus NRRL 2426 zur Sektion Reetiflexibiles mit geraden oder leicht welligen Sporenketten, während der erfindungsgemäße Mikroorganismus zur Sektion Spirales gehört; erstere erzeugt auf Hefeexträkt-Malzextrakt-Agar graue bis gelblich-graue Luftmyzelien, letztere weiße bis .gräulich-weiße; erstere verwertet L-Arabinose, letztere jedoch nichtν Etamycinproduzierende Streptomyces-Arten_; dargestellt in Antibiotics Annual 1954-1955, SS.728-732,

-a- 199

können von dem erfindungsgemäßen Organismus durch die C-Assimilation und die Kultureigenschaften auf Czapek-Agar, Glucose-Asparagin-Agar und Nähragar unterschieden werden. Streptomyces conganensis zeigt deutliche Unterschiede in der Morphologie der Sporen. Unter den oben genannten Mikroorganismen zeigt Streptomyces griseoviridus NRRL 2427 die stärkste Ähnlichkeit mit den erfindungsgemäßen Streptomyceten. Der taxonomische Vergleich beider Streptomyceten ergab dabei folgendes: \ ..'-,·. ·' ' >'^:·^:Λ'.:^:'^:' : ' ' ' ' - / . - v/A·, ' ' ' ' ^{νγ :}. . ' · . '^; ''

Streptorayces gris e ο-viridus NRRL 242?

Streptomyces sp. P 8648

Farbe des

Luftmyzels·

Blaßorange-geIb bis geIblich-rosa mit Stich ins Graue" auf Hefe extrakt- ' Malzextrakt-Agar, Hafer-Agar, Stärke-Agar und Glycerin-Asparagin-Agar.

Weißes bis gräulichweißes Luftmyzel', schwach entwickelt auf den meisten ISP-Medien, reichlich weißes Luftmyzel auf Hefeextrakt-· Malzextrakt-Agar.

Farbe des Substratmyzels

Gräulich-gelb bis leicht olivbraun oder schwärzlich-braun auf Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar, Hafer-Agar, Stärke-Agar und Glycerin-Asparagin-Agar.

Blaß- oder hellgelb bis gräulich-braun auf den meisten ISP-Medien

Lösliches Pigment

Kein Melanoidpigment, gewöhnlich auch kein andere s Pigment, nur selten schwaches gelbes Pigment.

Kein Melanoidpigment, gewöhnlich auch kein anderes Pigment, nur selten braunes Pigment.

Verwertung von C-Quellen

L-Aräbinose +++ D-Fructose + Saccharose - '

L-Arabinose D-Fructose +++ Saccharose +

Aus dieser Tabelle geht hervor, daß zwischen Streptomyces

- a- 1

griseovxridus NRRL 2427 und dem erfindungsgemäßen Streptomyceten morphologisch und hinsichtlich der KuItüreigenschaften sowie der C-Assimilation ein klarer Unterschied besteht. Außerdem produziert der erfindungsgemäße Mikroorganismus Neo- Yiridpgri.sein I, II und III sowie Viridogrisein (Neoviridogrisein TV) und Griseoviridin; Streptomyces griseoviridus KRRL 2427 produziert hingegen unter gleichen Bedingungen nur Viridogrisein und Griseoviridin.

Bei dem erfindungsgemäßen Mikroorganismus handelt es sich somit um eine neue Art, und zwar um Streptomyces sp. P 8648. Eine entsprechende Kultur dieses Mikroorganismus wurde beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, unter der Nummer FERM-P Nr. 3562 hinterlegt. Für den Fachmann ist dabei klar, daß sich die Erfindung nicht auf den konkreten oben definierten und unter FERM-P Nr. 3562 beim Fermentation Research Institute hinterlegten Mikroorganismus beschränkt, sondern auch alle spontan und künstlich von diesem Mikroorganismus abgeleiteten Mutanten, welche Neο-viridogrisein I, II und III zu produzieren in der Lage sind, umfaßt.

Herstellung von Neoviridogrisein I, II und III.

Die erfindungsgemäßen Antibiotica werden hergestellt durch Beimpfen mit Streptomyces sp. P 8648 und Züchtung desselben in einem geeigneten Medium unter aeroben Bedingungen bei Temperaturen von 18 bis 37°C während 2 bis 14 Tage ,wobei die angereicherten Antibiotica aus der Kulturflüssigkeit abgetrennt und nach den üblichen Verfahren gereinigt Werden. Vorzugsweise wird wie folgt gearbeitet:

Für die Züchtung des.Mikroorganismus. können alle Arten von Medien, die sonst auch für Streptomyceten in Frage kommen, verwendet werden. Als C-Quellen des Mediums kommen vorzugsweise ia Frage Glucose, Glycerin, Stärke, Dextrin, Hafermehl,

Melasse, Fett und Öl usw., als N-Quellen Sojamehl, Baumwollsamenmehl, Fleischextrakt, Pepton, trockene Hefe, Maiseinv/eichflüssigkeit, Hefeextrakt, Casein und sein Hydrolysat und anorganische Salze davon, v/ie Ämmoniumsulfat und Ammoniumnitrat. Gegebenenfalls können dem Medium in geringen Mengen auch wachstumsfördernde Stoffe zugesetzt werden, wie Vitamine, Aminosäuren, organische und anorganische Salze, z.B. Calciumcarbonat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Natriumphosphat, Kaliumphos phat und Magnesiumsulfat. — :^

Die neuen 'Antibiotics können durch Züchtung in den üblichen Gefäßen, wie Schutt elf la sehe, Rüttelfermenter und Tankfermen- ter hergestellt werden, allerdings ist _;aus wirtschaftlichen Gesichtspunkten die Submerskultür mit forcierter Belüftung _: für industrielle Maßstäbe am geeignetsten. Die Züchtung wird vorzugsweise unter aeroben Bedingungen bei Temperaturen von 25 bis 35°C durchgeführt. Bei Verwendung einer Schüttelflasche bzw. eines Tankfermenters erreicht die Produktion an Neoviridogriseinen ihr Maximum gewöhnlich nach 2 bis 10 Tagen. Der pH-¥ert kann während der Züchtung je nach der Art des Mediums über den ,..'. physiologischen Bereich hinausreichen. Vorzugsweise ist jedoch während der Züchtung ein pH-Wert von 6 bis 9 einzustellen. Vor der Beimpfung wird der pH-¥ert de s Mediums gewöhnlich auf 6,5 bis.8,5 eingestellt. · ',/-... λ .'" ;. V'.,^;;V/ . ' '' ,[ '\-:\ - ' : . /' ..,;

Kontrolle der Neoviridogriseinkomponenten in der Kulturflüssig-

Wie bereits angegeben, produziert der erfindungsgemäße Mikroorganismus eine Mischung aus Neoviridogrisein I, II, III und IV und Griseoviridin. Durch geeignete Kombination der C- und N-Quellen im Medium kann ohne eigenen Zusatz einer freien Aminosäure oder einer organischen Säure die Zusammensetzung der Neoviridogriseine in der Kulturflüssigkeit geändert werden. Aus technischen Gründen ist jedoch günstiger, den Gehalt an Neoviridogrisein I, II und/oder III in der Kulturflüssigkeit

1 99 3?5

durch Zugabe der entsprechenden Aminosäure(η) in freier Form •während der Züchtung, je nach den Umständen und dem Bedarf einzustellen. Es braucht nicht besonders betont zu -werden, daß die Zusammensetzung der Neoviridogriseine in der Kulturflüssigkeit durch geeignete Wahl spontaner oder künstlicher Mutanten der erfindungsgemäßen Kultur variiert werden kann sowie ferner durch entsprechende Einstellung der Züchtungsbedingungen, wie Temperatur, pH und Belüftung und/oder durch Zugabe von physiologisch aktiven Stoffen, wie Enzyminhibitoren und Promotoren. Eine der bevorzugten Verfahrensvarianten zur selektiven Herstellung bestimmter Neoviridogriseine besteht in der Zufuhr der entsprechenden Aminosäure(n), nämlich Oc -Amino-η-buttersäure und/oder Prolin während der Züchtung. Die Zufuhr von Prolin führt insbesondere zur Steigerung des Anteils an Neoviridogrisein T und II an der Gesamtmenge an Neoviridogrisein I, II, III und IV, wobei die ersteren stärker antimikrobiell wirken als die letzteren. Der Gehalt an Neoviridogrisein I und III kann selektiv durch Zufuhr von 0l· -Amino-n-buttersäure zum Medium vor der Beimpfung bzw. während der Züchtung gesteigert werden. Da der erfindungsgemäße Mikroorganismus während des Wachstums Protease produziert, kann anstelle der freien Aminosäure(n) proteinhaltiges Material zugesetzt werden, das die betreffende(n) Aminosäure(n) enthält. So z.B. kann Prolin durch Casein oder entsprechende Hydrolysate aus der sauren Hydrolyse, wie z.B. Casaminosäuren ersetzt werden.

Isolierung und Reinigung.

Die neuen Antibiotica Neoviridogrisein I, II und III und Viridogrisein können aus der Kulturflüssigkeit durch die üblichen Methoden entsprechend ihren physiko-chemisehen Eigenschaf ten als Depsipeptidantibiotica isoliert werden» Gegebenenfalls können die Neoviridogriseine aus der Kulturflüssigkeit im Gemisch mit dem Griseoviridin erhalten werden. Werden

- AX-

199 3

sie für Futterzusätze oder für veterinärmedizinische Zwecke hergestellt, ist ein rohes Gemisch aus Neoviridogriseinen und Griseoviridin aus wirtschaftlichen Gründen vorteilhafter.

Die Neoviridogriseine und das Griseoviridin können aus der , Kulturflüssigkeit mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert werden. Sp sind z.B. Äthylacetat, Butylacetat, n-Butanol, Methylenchlorid, Chloroform usw.. für"die gleichzeitige Extraktion von Neoviridogriseinen und Griseoviridin geeignet. Sollen jedoch selektiv die Neoviridogriseine ohne Griseoviridin extrahiert werden, sind als organische Lösungsmittel Methyl-isobutylketoh, Benzol, Toluol u.a. aromatische Kohlenwasserstoffe zu verwenden. Da das Myzel im wesentliehen keine Neoviridogriseine enthält und das extrahierbare Lipid in den.Zellen oft die nachfolgenden Reinigungsstufen stört,ist es günstiger, die genannten Antibiotika mit einem organischen Lösungsmittel aus der filtrierten oder zentrifugierten Flüssigkeit zusammen mit dem Waschwasser zu extrahieren.

Das Extrakt aus Neoviridogriseinen und/oder Griseoviridin kann dann auf verschiedene Weise weiter isoliert und gereinigt werden, z.B. durch Kombination von Adsorption und Auswaschen mit Aktivkohle, Amberlite-XAD-^· und ? (Rohm & Haas Co.), Ionenaustauscherharzen, wie Amberlite IR-120 (Röhin & Haas Co.) und Dowex 5QW-X2 (Dow Chemical Co.), GeIfiltration mit Sephadex LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals AB) und äquivalenten Stoffen, Adsorptionschrömatographie auf Tonerde und Silicagel usw. Außerdem kann zusätzlich noch mit Gegenstromverteilung mit einem geeigneten Lösungsinittelsystem gearbeitet werden. " . '...^: :. '.. :."' . \. ·.' · . · ·'."· .'. . " ; ' " '

Physiko-chemische Eigenschaften von Neoviridogri se in I₁ II ,'

Neoviridogrisein I, ΙΓ und III sind wie Viridogrisein amorphe

3fS

weiße Festkörper, löslich in Methanol, Äthanol, n-Propanol, iso-Propanol, n-Butanol, Dioxan, Äthylacetat, Bütylacetat, Aceton, Methyl-äthyl-keton, Methyl-isobutyl-keton, Benzol, Toluol, Methylenchlörid, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, N,N-Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid, schwerlöslich in 1^0 und Äthyläthern und praktisch unlöslich in Petroläther und Hexan. . ' .·. :_: · '; ·-;\'· V-'. .-Γ : ·.' . : ;;;.:-; /..

In wässeriger Lösung sind sie zumindest einen Monat lang bei 25 bis 37⁰C und 30 Minuten bei 60⁰C, bei einem pH von 2 bis 9 beständig. Die Schmelzpunkte der Antibiotica wurden nach Kofier ermittelt: ;

Neoviridogrisein I : nicht bestimmt

^:- ',-' -·. ":' ': · ·, <' Ii ....:.' 93⁰C " /-.. / , '' ] " '/'.[ ^:;

III : 115⁰C Viridogrisein : 140⁰C

Die UV-Absorptionsspektra von Neoviridogrisein I, II, III und Viridogrisein sind in Fig. 1bis 8 gezeigt, wobei Figo 1 bis 4 die UV-Spektren von Neoviridogrisein I, II, III und Viridogrisein in Methanol und Fig. 5 bis 8 die entsprechenden UV-Spektren in 0,1 η NaOH von Neoviridogrisein:

. . -ι o/_a

Spektren in 0,1 η NaOH-Methanol zeigen. Maximale.EJ^,„-Werte

ι cm

In neutralem Methanol,

Neoviridogrisein I : 305 nm (-65)

II : 305 nm (88)

III : 305 nm (90) Viridogrisein : 305 nm (90)

In 0,1 η NaOH-Methanol,

Neoviridogrisein I : 340 nm (70)

v- II : 340 nm (84)

III : 340 nm (90)

Viridogrisein : 340 nm (96)

Die IR-Spektren von Neoviridogrisein I, II, III und Viridogrisein in KBr sind in Fig. 9 bis 12 dargestellt. Charakteristische Maximal- und Schulterwerte:

.Neoviridogrisein I (KBr)

i 3370, 2910, 2850, 1735, 1670 (Schulter), 1635, 1590 i(Schulter)V 1515, 1460 (Schulter), 1445, 1405, 1375,1290, 1280, 1250 (Schulter), 1200, 1190, 1160, 1125, 1100 '

-.- , · _1 ^: -: ' . -' ' ' . ..- ·

und 1080 cm .

Neoviridogrisein II (KBr) V^

...Γ. . ;.332O, 2950, 2920, 2820, 2800, 1745, 1670 (Schulter),

1630, 1600 (Schulter),1575, 1515, 1460 (Schulter), - :

1445, 1405, 1390, 1365, 1330 (Schulter), 1295, 1275,

1240, 1200, 1195, 1160, 1130, 1095 und 1065 cm"¹.

/Neoviridogrisein III (KBr) ; ·

3335, 2960, 2940, 2870, 1750, I67O (Schulter),1660 (Schulter), 1635, 1590 (Schulter), 1515, 1450, 1405, 1390 (Schulter), 1370, 1340 (Schulter), 1300, 1245, 1200,1160 (Schulter), II30, 1100 und 1065 cm"¹.

Dünnschichtchromatographisch (DSC) zeigen Neoviridogrisein I, II und III, Viridogrisein und Griseoviridin die folgenden

Rf -Werte: ' :. λ. "^:-·' f , '. ·.' '. .. ' ...';'.'.'. ·; ' ' . : '..' '· ' '

'(1.) DSC-Platte : Vorgängig überzogene DSC-Plat-

teSILICA GEL 60 F-254, E. Merck, Darmstadt.

Lösungsmittel . : Benzol : Methanol = 5:1

Neoviridogrisein I -Rf =0,66

^;·· .- . ., '·-. -Ii". : ' ; " ' ' :. ^ ., -:; :....Ö,-62' .:' :ν^i;r"' .' ' '. ; '' '·. /"

- 1 99 395

Neoviridogrisein III RF = 0,59 Viridogrisein 0,55

Griseoviridin 0,20

(2) DSC-Platte : wie (1)

Lösungsmittel : ''ChloroformMethanol = 30:1

Neoviridogrisein	H	RF =	0,39
	III		0,32
, ". . - . .			0,19
Viridogrisein			0,18
Griseoviridin		0,02

Zwecks Analyse der Aminosäuren wurde jede Neoviridogriseinkomponente in 6 η HCT über Nacht bei HO⁰C hydrolysiert, das Hydrolysat dann bis zur Trockene eingedampft. Nach Entweichen von HGl in Spuren infolge wiederholten Ξindainpf ens werden die Aminosäuren im Hydrolysat durch DSG ermittelt (Eastman Ghroinagram sheet 13-254 Cellulose mit Fluoreszenzindikator, Eastman Kodak Co.; Lösungsinittelsystem: n-Butanol/Essigsäure/Wasser = 4/1/1)» Elektrophoresepapier für hohe Spannungen (Toyo Filter paper Nr. 5IA, Toyo Soshi Kaisha, Ltd.; Puffersystem: Ameisensäure/Essigsäure/Wasser =25/75/900, pH 1,8; 60 V/cm bei O⁰C, 30 Minuten) und Auto-Aminosäure-Analyse (Hitachi auto-amino acid analyser KLA-5, Hitachi, Ltd.). Folgende Aminosäuren wurden ermittelt:

Neoviridogrisein I : Threonin

; ' ·.'" ' · . . ^: , . ^: ·;. ' /' . ; .- -. : . Leucin ' . -' / ' .: .' ..-. : ^; .; . ' ' λ : ' .; ' ; ^ ' < " "Λ ' Prolin ' · . ' .' .'-. "'' / ' " : " ' '

'. : - . Oi-Amino-n-buttersäure

' : -.' ' " ' " -.'. .' .,'" .." ' ',. ' . · Sarcosin -' ' '^; '" ; . ' ".

Phenylsarcosin β,Ν-Dimethylleucin

- -4b-

395

Neoviridogrisein II

Neoviridogrisein III

Threonin

Leucin

Prolin

Alanin

Sarcosin

Phenylsarcosin β,Ν-Dimethylleucin

Threonin Leucin ' · Hydroxyprolin OO -Amino-n-buttersäure

Sarcosin

Phenylsarcosin β,Ν-Dimethylleucin

Threonin

Leucin

Hydroxyprolin

Alanin

Sarcosin

Phenylsarcosin ß,N-Dimethylleucin ·

Die Anwesenheit von 3-Hydroxy-picolinsäure wurde massenspektrometrisch und durch DSC ermittelt:

Viridogrisein

Eine Originalprobe von Viridogrisein und Neoviridogrisein I, II, III und IV wurde über Nacht in 6 η HCl bei 110⁰C hydrolysiert. Jedes der oben beschriebenen Hydrolysate zeigte nur einen UV-Absorptionsfleck mit demselben Rf-Wert unter den nachfolgend angegebenen Bedingungen:

(1) Silicagel-DSC ·

DSC-Platte : Vorgängig überzogene DSC-PIatti

254, E. Merck, Darmstadt.

SILICA GEL.60 F-

- ΊΤ--

Lösungsmittel : Chloroform: Methanol = 2:1

Rf · : 0,^6

(2) Cellulose DSC

DSC-Platte : Eastman Chroinagram sheet

·;· Cellulose mit Fluoreszenzindika

tor, Eastman Kodak Co. ' Lösungsmittel : n-Butanol!EssigsäurerWasser =

7 ·' ; '.- ' ':.;.: . ., ;:,. · , ... 4:i:i ,;;. .: _. . ; ;-. ; . .. ;

et ; ;·.': ';'. ] ' < :': ;) :^:/;>- .-. :,? o,.62 :' · . -^:--. ; ··. : ^; .V,^; :-,:'" :

Das MG dieser Antibiotica wurde unmittelbar mit dem Massenspektrometer ermittelt:

NeoviridGgrisein	I -= · " :.	: .· :. o7d
	II	: 862
	III	: 892
Viridogrisein		: 878

Zwecks Aufklärung der chemischen Struktur wurden Neoviridogrisein I, II und III und Viridogrisein über Nacht in 0,1 η NaOH "bei Raumtemperatur hydrolysiert, mit Diazomethan ine thyliert und dann massenspektroinetrisch nach Compernolle et. al, (Organic Mass Spectrometry, Vol. β, SS. 151-166,Ί972) untersucht. Die Struktur von Neoviridogrisein I, II und III ist demnach folgende:

-is- 199 3f5

Neoviridogrisein I

CH

CH

CH' CH,

CH₂

CH

CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-N

ι* ι

2 CH-CO

CH-CH

:i' :. v^ co

CH-N-CO-CH-NH-CO-CH

CH.

CH

N-CH,

i ..· ?. CH₉

io I

N-CH₃

CH-CH,

CH-CH

CH,

Neoviridogrisein II OH

CH,

CH

CH

?^H

CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-N

CH-CO

CO-CH-NH-CO-CH-

N-CH, CH₅

co

N-CH,

CH,

CH-CH

CH-CH,

. :?.

CH,

- !99 395

Neöviridogrisein III

OH

CH₃

CH,

CH CH,

5 ^0H /CH

CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-N-

CH-CH_x O

CH₂

CH-CO

N-CH_x ι 3

CH₉

CH-N-CO-CH-NH-CO-CH - N-CH-

CH-CH₃

CH-CH, ι 3

CH,

Die erfindungsgemäßen Neoviridogriseine I, II und III sind somit eine Gruppe von neuen dem Viridogrisein homologen Depsipeptidantibiotica. Die Identität von Neöviridogrisein IV mit Viridogrisein und Etamycin wurde massenspektrometrisch, durch DSC, UY- und IR-spektrometrisch undAminosäure-Analyse anhand von Originalproben von Viridogrisein und Etamycin festgestellt,

Antimikrobielle Aktivität.

Neöviridogrisein I, II und III haben ein breites antimikrobielles Spektrum gegen Bakterien, Mycoplasmen, Actinomyceten und Rickettsien im Labortest, insbesondere in vitro gegen die üblichen, resistenten Stämme von Staphylococcus aureus, ebenso gegen die Stämme von Streptococcus pyogenes, Diplococcus pneumoniae, Sarcina lutea, Bacillus subtilis, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma pulmonis, Mycoplasma fermentans und Mycoplasma agalaetiae. Die minimalen Inhibierungskonzentrationen der neuen Depsipeptidantibiotica wurden für diese allein bzw. zusammen mit Viridogrisein und Griseoviridin an verschiedenen Mikroorganismen nach siem Verdünnungsreihentest ermittelt.

V W-" V, Λ . Tabelle 1 ' /Vv-V V , -W. .:. ^:;'· ... MIC-WERTE von Neoviridogrisein I, II und III (mcg/ml)

. ... , . . . .·. - ' Mikroorganismus (a)	Medium	NV*I	NV*II	NV* III.	VG**	NV*· gem.	; gem.
Staphylococcus aureus 209 P V;	.-.'BHIf1	0,2:	0,1	0,2	0,2	0,2	0,1
. ; ν; ;ν / (EM)r ... : .·;	BHI*	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	Q^z V-VV-VV
: (STH)r	BHI^	0,8	0,8	1,6	1,6	1,6	0,8
(PCjTC,EM,LM)r1	BHI^	6,25	6,25	6,25	6,25	6,25	3,2.7 :i-V..;/.
. ; .. (PC,TC,EM,LM)r2	BHI*	6,25.	. 6,25V	6,25	6,25	6,25	3,2 V-- 7-7
	BHI^"	6,25	6,25	6,25; V	6,25	6,25	3,2 V...VVV r
V V ' . (SM,STH)r	BHI^	0,4	0,2	0,2	0,4 :	0,4	0,2
;V . :; V V (Pc,KM,NM)r V	BHI^	0,8-V	0,4	0,4	0,8	0,8	0,4
Vi ·..· ; ; ::' V ; -.j VV-; (EM, CM, SM, PC,TC)	Γ BHl^	0,4	0,2	0,4	0,4 r	0,4	O,2.-:V.--7/;V:-
W- : V ν V . . V (EM,QM)r V :y	BHI^	0,8 V	0,4	0,8	0,8	0,8 :	o,47v/.:v;.;;7
, ' '..' ' ' ... I J^ \^ ^^ Jn* jj^^^ J- ' ' - .' . -' ' -._ '	BHI^	-:V0,2VV:.	". - 0,2	0,4 '	0,4	0,4	f\ O - '
. \ .Ο·Λ· I ^J Jx ~r - J ν ^^ / : ' "	BHI"1.	; 0,4v	0,2	0,4	0,4	0,47	0,2 7 ' ;.-VV-
: Russell(PC)r	.-7,BHI*"'.	0,2	0,2	0,4	0,4	0,4 V	o,2.;;;;V;V;;V
:.V. .; V :'-'-·· ' ' ',) : Smith' V-- ,' V; ..'	BHI'^	0,2	0,2	0,2	0,4	0,4 ;	0,2
Staphylococcus sp. (PC)1V λ · . . _ . · -.	BHIt	0,8;	0,4	0,8	0,4 V	0,8	0,4
- . ." -_..' . V ; : .- ;. '.SP· V-'-. : Ζ; . .; ' -;; ' / : ' ·.	BHI*	0,8·;	0,8	0,8	0,8	0,8	0,4

(Tabelle 1) Fortsetzung

Mikroorganismus

Medium

NV I

NV II NV III

VG

NV-gem.

NV+GV

Diplococcus pneumoniae type 1 Streptococcus pyogenes Sarcinä lutea

Bacillus subtilis ATCG 6653 Salmonella gallinarum Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Proteus vulgaris Candida albicans

BHI+HB' BHI + BHI^ BHI ^' BHI BHI

HB

Ψ-

BHI^ BHI^ MY^&

0,2 0,4 0,2 0,4

>25

>25

>25

>25

>25

' - ".Ο,.2

0,4 >25

>²5

>25

>25

0,2 0,4 0,4 0,8

>25

0,4 0,4 0,2 0,8

>25

>25

>25 : _;

> 25

>25

0,4 0,4 0,4 0,8

25 25

25

25

25

0,1 0,1, 0,1 0,4

^25

>25 >

NV* = Neoviridogrisein; VG^* = Viridogrisein; GV*** = Griseoviridin (a) EM = Erythromycin; STH = Streptothricin; PC - Penicillin; TC = Tetracyclinj .LM = Leucomycin; CP = Chloramphenicol; SM = Streptomycin; KM « Kanamycin; NM = Neomycin; OM = Oleandomycin. ^

()^r =resistent gegenüber dem (den) in ( ) angegebenen Arzneimittel(n) BHrf = Gehirn-Herz- Extrakt. ν

BHI+ HB^ = Gehirn-Herz-Extrakt, enthaltend 10 fo Pierdeblut : _

MY^& = Malzextrakt-Hefeextrakt-Medium ν

- ft9 395

Die entsprechend Tabelle 1 bei 2-facher Verdünnung erhaltenen MIC-¥erte zeigen, daß Neoviridogrisein II aktiver ist als Neoviridogrise in IV, d.h. Viridogrisein. Zur Differenzierung von Neoviridogrisein II und Viridogrisein hinsichtlich ihrer anti-. biotischen Aktivität wurden die MIC-Werte bei weit geringerer Verdünnung wiederholt. Tabelle 2 zeigt, daß Neoviridogrisein II 2 bis 3 malaktiver ist als Viridogrisein.

.; ;.": - ; '.. ;' ;/V.j--.^: Tabelle 2 ^V-/^^: % >> -/ ; ^: ' '" ,

Vergleich von Neoviridogrisein II mit ': : Viridogrisein.

Mikroorganismus	SM,PC,	MIC	(mcg/ml)
. ..-. " Staphylococcus aureüs 209 P		0,078	0,133 ·
: : : ; : ': V:; (EM,CM,	PC)r
TC)r	(PC)r	0,125	0,334
	(PC)r	0,094	0,334
Bx-1633		0,125	0,267
Russell	0,125	0,267
Smith	0,125	0,267

Medium: Gehirn-Herz-Extrakt · ]

Bei Ermittlung der MIC-Werte von Neoviridogrisein I, II und III in Gegenwart von Griseoviridin beobachtet man einen Synergimus zv;ischen den Neoviridogriseinen und Griseoviridin, was auch auf Viridogrisein und Griseoviridin zutrifft. Der Synergismus der neuen Antibiotica mit Griseoviridin wurde bei verschiedenen Verhältnissen des Neoviridogriseingemisches zu Griseoviridin untersucht (s. Tabelle 3):

99

^; - :'?- . ^ Tabelle 3 .; "'A^VV/Vv V'- -

Synergismus des Neoviridogriseingeinisches mit

Griseoviridin

Neoviridogrisein gemisch

100

.:.-." v- \^:: 90 ' . 80 70 60 V

; ·.. 'v-a so;.:"· ' "

20 io

eovii	-idin MIC+ (mcg/ml)
0	AAA. vAv . 0,313
10	0,156
20	;:;;;; ;:; A;..;; 0,125
30	0,125
50	0,078
60
70	0,125
80	: VAv AvA . 0^250- -
90	0,250
100	0,250

Testmikroorganismus : Sarcina lutea Verdünnungsreihentest in vitro· mit· Gehirn-Herz-Extrakt.

Wie aus Tabelle 3 hervorgeht, war der Synergismus zwischen den Neoviridogriseinen und Griseoviridin· bei einem Verhältnis von 50:50 am stärksten, d.h. ein l':l-Gemisch aus Neoviridogriseinen und Griseoviridin ist 3 "bis ^ mal aktiver als die Neoviridogriseine oder das Griseoviridin allein.

Tabelle Λ zeigt die hohe Aktivität von Neoviridogrisein II in vitro gegen verschiedene Mycoplasinaarten und den stärkeren Synergismus eines Neoviridogrisein II-Griseoviridin-Ge-.misehes gegenüber einem Viridogrisein-Griseoviridin-Gemisch. Die KIG-VJerte wurden nach dem Verdünhungsreihentest ermittelt.

- ζ* - 1

Tabelle 4

Mikroorganismus Medium NV II VG GV NV II VG +

.; .;. · ν-'---;- ';:":-..- ; vv--/¹'-^; " ' ^: ' ' ' -+ GV*' GV*

Mycoplasma galli-

septicum KP 13 (1) 0,025 0,10 0,10 0,0063 0,025

Mycoplasma pulmonis ^

PG 22 (2) 0,78 1,56 6,25 0,20 0,39

Mycoplasma fermen- >

tans (2) <0,05 <0,05 /0,05 <0,05 ^.0,05

Mycoplasma agalactiae .

PG 2 ν (2) 0,39 0,78 3,13 <0,05 0,39

Medium (1): PPLO-Anreicherungslösung (Eiken, Japan) . (2): PPLO-Lösung (Chanock's Medium; Difco)

* Mischungsverhältnis 50/50 NV II, VG, GV: s. Tabelle 1

Die neuen Neoviridogriseine I bis III zeigen somit als solche oder im Gemisch mit Viridogrisein'(Neoviridogrisein I¥) und Griseoviridin eine starke Aktivität gegen gram-positive Bakterien und Mycoplasma arten, wobei die Gewichtsverhältnisse der einzelnen Komponenten des Gemisches zueinander ohne Beeinträchtigung der überraschenden antimikrobiellen und antimycoplasmatischen Aktivität sehr stark variieren können. Dies zeigt ein repräsentatives, jedoch nicht einschränkendes Beispiel, bei dem ein Gemisch aus (in Gew.-%):

Neoviridogrisein II 27 ^

Neoviridogrisein IV (Viridogrisein) 23 % Griseoviridin V ' : 50'%

in vitro an Streptococcus mutans, einem mit Karies, und Perldontalerkrankungen in Zusammenhang gebrachten Mikroorganismus

-25- 1

in Todd Hewitt Broth (Difco) mit 0,5 % TC Lactalbuminhydrolysat (Difco) gete stet wurde. Die Aus gangs zahl der Organismen beträgt cav 3 χ 10 Organismen pro ml. Die KuItürgefäße werden anaerob bei 37⁰C für 48 Stunden beimpft. Der MIC-Wert und die minimale bakterizide Konzentration ergaben dabei für Neoviridogrisein eine Konzentration von 1,0 ppm. -

In einem anderen repräsentativen, jedoch ebenfalls nicht einschränkenden Beispiel wurde dasselbe Gemisch in vitro an Treponema hyödysenteriae, das die Schweinedysenterie hervorruft, in BlutrAgar bei Konzentrationen von 100, 50, 10, 5,1, 0,5 und 0,1 ppm getestet. Die Platten wurden mit einem Abstrich beimpft und während 4 Tagen bei 42⁰C gehalten. Der. MIC-Wert·;-. betrug 0,5 ppm. In einem weiteren repräsentativen ,jedoch ebenfalls nicht einschränkenden Beispiel wurde eine'Mischung aus (in Gew.-%):

Neoviridogrisein II 25 %

Neoviridogrisein IV (Viridogrisein) 25 % Griseoviridin 50%

in vitrq an mehreren Mycoplasmaarten getestet. Es wurden folgende MIC-Werte festgestellt:

Mikroorganismus MIC-Wert

Mycoplasma gallisepticum KP 13 0,07

Mycoplasma pulmonis 0,20

Mycoplasma fermentans 0,05

Mycoplasma agalactiae 0,05.

Die genannten Arten von Neoviridogrisein-Griseoviridin-Gemischen sind außerdem geeignet für die Behandlung von durch Bakterien hervorgerufene Infektionskrankheiten bei Tieren.

Da Mikamycin A und B als sehr wirksame Futter zusätze bekannt sind» wurden die erfindungsgemäßen Antibiotica einem Tierfuttertest unterzogen. Die Ueoviridogriseine wurden in Form eines Gemisches in einer Menge von 2 bis 20 ppm dem Hühnerfutter zugesetzt und für 10 Wochen männlichen Küken verfüttert. Die so behandelten Küken zeigten gegenüber der Kontrollgruppe, die keine Neoviridogriseine verabreicht bekam, eine stärkere Zunahme des Körpergewichtes und der Futtereffizienz. Die erfindungsgemäßen Antibiotica sind somit als Futterzusatz sehr geeignet. '.:. ; ; ' .:. - _: y ^:': ;' . ·: -..:..- ;. ^ ; '.:..:. ." .-

Auch Kompositionen mit einem oder mehreren Neoviridogriseinen der Gruppe I bis III, gegebenenfalls im Gemisch mit Viridogrisein (Neoviridogrisein IV) und Griseoviridin, wobei die Gewichtsverhältnisse der einzelnen Komponenten sehr stark ' schwanken können, haben sich als sehr geeignete Futterzusätze erwiesen. -.: . . ' ;-·; . ..' .. .' . ' .''· ":'' / ' -' '' ' · ..

In einem repräsentativen, jedoch nicht eingrenzenden Versuch wurde eine Mischung aus (in Gew.-%)·.

Neoviridogrisein II 27%

Neoviridogrisein IY (Viridogrisein) 23% Griseoviridin 50 %

in vivo durch Zugabe zu Kükenfutter getestet· Einen Tag alte männliche Küken (15 Tiere pro Versuch) wurden während 11 Tagen mit einem Futter, enthaltend ca. 55% Roggenkörner, ange-, reichert mit. "Vitaminen,".Mineralsalzen, Fett und Proteinen, gefüttert. Der hohe Roggengehalt führt normalerweise zu schwachem: bzw.. mäßigem Wachs turn:. Ein derart zusammengesetztes Futter gilt als Standardfutter für die Differenzierung von Wachstumsstimulatoren und Antibiotica als Futterzusätze. Als positive Kontrolle wurde Penicillin (100 ppm) .-verwendet.'Die Ergebnisse des Versuchs sind nachfolgend tabellarisch zusammen-

gefaßt. Der Quotient "Futter/Zuwachs'¹¹ bedeutet verbrauchtes Futter in Gramm pro Gramm Zuwachs an Körpergewicht, der Para-^ meter "Körpergewicht" das Verhältnis des Körpergewichts nach 11 Tagen zum Ausgangsgewicht. Die letzte Spalte bedeutet den durchschnittlichen Gewichtszuwachs pro Küken (in Gramm).

Behandlung

Roggenkontrolle Penicillin ' Testgemisch Testgemisch Testgemisch

Aüsführungsb eispi ele ' ; .."'. .· ': .-· ;

Nachfolgend wird die Erfindung durch weitere bevorzugte Beispiele illustriert, die jedoch keinen einschränkenden Charakter haben.

Futter, Konzentra tion in ppm	Futter/ Zuwachs	Körper- gewicht · . . ' ;	Durchschnitts Zuwachs pro Küken
——— . / '.'-	1,334	Jj-, 696	.156,47
100	1,197	5,012	163,20
100	1,256	4,789	161,66
" 50	1,283	4,892	163,47
: 25	1,204	5,226	174,67

Beispiel 1 . '-

Ein Nährmedium, bestehend aus Sojamehl, Pharmamedia (Traders Oil Mill Co.), Hafermehl, Trockenhefe und Melasse aus roter Rübe (jeweils 0,5 '%) _t wird auf einen pH von 6,5 eingestellt und in einer Menge von 50 ml in einem 250 lnl-Srlenmeyer-Kolben verteilt. Nach Autoklavieren bei 120°C für15 min wird mit einer Drahtschlinge die Kultur Streptomyces sp, P 8648 auf ISP-2-Schrägagar überimpft, wonach bei 28⁰C i\rährend 48 St auf einem Rotationsschüttler bebrütet wird. Danach werden 2 ml dieser Impfkultur in einen 500 ml-Srlenmeyer-Kolben gebracht, enthaltend 100 ml des nachfolgenden Ferinentationsmediuins:

Sojamehl	0	,5	%
Erdnußmehl	; ο	,5	%
Hafermehl	0	,5	%

(pH 6,5 vor dem Autoklavieren)

Trockenhefe . 0,5 % / '^;v..vV''\- ' .. . 'λ.'''V ^; .' Rote-Rübe-Melasse ;^; " 0,5;^ : ; ./ .. ν ;_: ;

und bei 28⁰C während 96 St auf einem Rotationsschüttler (200 U/min, Radius 3,5 cm) bebrütet. Die Kulturflüssigkeit aus 12 Kolben wird gesammelt und filtriert, -wodurch man*'ein klares Kulturfiltrat erhält. Der Filterkuchen wird mit 100 ml H₂O gewaschen, wonach das Waschwasser und das Kulturfiltrat vereinigt werden. Arbeitet man nun nach dem Plattentest mit einer 8 mm-Papierscheibe, beträgt die antibiotische Wirksamkeit dieser Lösung (pH 8,3) 23,0 mm auf einer Nähragar-Testplatte mit Sarcina lutea. 800 ml dieser wässerigen Lösung werden zweimal mit je 200 ml n-Butanol extrahiert. Die Butanolextrakte werden miteinander vereinigt und unter vermindertem Druck bis zur Trockene eingedampft, wodurch man 90 mg eines rohen' Pulvers, bestehend aus Neoviridogriseinen und Griseoviridin erhält. Dieses wird mit einer geringen Menge Silicagel gemischt und auf eine SiIicage!säule (Wako-Gel C-100, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.; 1,5 χ 25 cm) aufgebracht. Danach wird zuerst mit 300 ml eines Benzol-Aceton-Gemisches (5:1) und dann mit einem Benzol-Aceton-Gemisch (2:1) eluiert. Die 10 g-Fraktionen werden mit einem automatischen Fraktionskollektor gesammelt. Die aktiven FraktionenNr. 25 bis 35 werden miteinander vereinigt und bis zur Trockene eingedampft,· wodurch man 30 mg eines Gemisches aus Neoviridogrisein I, II und III und Viridogrisein erhält. Außerdem erhält man durch Eindampfen der Aktivfraktionen Nr. 45 bis 54 bis zur Trockene ein rohes Pulver, dessen antibiotische Aktivität dem Griseoviridin entspricht. In beiden Fällen arbeitet man mit DSC unter den nachfolgend angegebenen Bedingungen. Die antimikrobielle Wirksamkeit wird dabei auf einer Nähragar-Testplatte mit Sarcina lutea ermittelt. , l·'" : : . :

- as- f

DSC-Plätte : Vorgängig überzogene DSC-Platte : : , :.;. .' SILICA-GEL 60 F-254, E. Merck, Darm-

:;' ;/ ;./ "·;. /.:;;. ; Stadt. '.' ... V'/ :\-;^: . . / . ': ' :,. ' ^: .' ' \\ -

(1) Lösungsmittel : Chloroform : Methanol = 20:1

NeoviridogriseineRf = 0,45 · ' Griseoviridin 0,05

(2) Lösungsmittel : Benzol : Aceton =1:1

Neoviridogriseine Rf .= 0,55 Griseoviridin 0,13

Beispiel 2 ' ' ' " . :'../ ''.'V .;"· ' ;, :^:^'::[ ' ' '^; '.:.' / ' : ;--.

200 ml einer 48 Stunden-Kulter von Streptomyces sp. P 8648 werden in demselben Nährmedium wie in Beispiel 1 auf einem 15 1-Schüttelferrnenter aus rostfreiem Stahl, enthaltend 10 1 desselben Impf -.Nährmediums wie in Beispiel 1 üb er impft und bei 27 bis 28°C für 96 Stunden unter forcierter Belüftung mit 5 l/min steriler Luft bebrütet. Für das Rühren (200 U/min) sorgt· ein Flügelrad, dessen Radius ca. ein Viertel des Durchmessers des SchütteIfermenters ausmacht. Nach Beendigung der Bebrütung werden die Myzelien und Feststoffe abfiltriert. Das erhaltene Kulturfiltrat wird auf pH 6,0 eingestellt und zweimal mit je 2 :1 Äthylacetat extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck bis zur Trockene eingedampft, wodurch man 700 mg eines rohen Pulvers aus den Neoviridogriseinen und Griseoviridin erhält, Has man in einer geringen Menge Methanol löst und auf eine Sephadex LH-20-Säule (3 x 50 cm) aufgibt. Die 10 ml-Fraktionen werden gesammelt, wobei Methanol als Eluierungsmittel dient. Die Fraktionen Nr. 22 bis 29, in denen die Neoviridogriseine enthalten sind, werden gesammelt, bis zur Trockene eingeengt und weiter durch eine SiIicagel-Säule (SILICAR CC-7 Special; Mallinckrodt Chemical "Works; 1,5 χ 20 cm) mit Chloroform/Methanol (30:1) als Elutionsmittei

-3O-

gereinigt. Acht 5 g-Fraktionen aus den Fraktionen Nr. 5 bis 12 werden miteinander vereinigt und unter vermindertem Druck bis zur Trockene eingedampft, wodurch man ein weißes Pulver, bestehend aus den Meoviridogriseinen, erhält.

Der Prozentanteil von Heoviridogrisein I, II und III und Viridogrisein ist dabei wie. folgt:

Neoviridogrisein	. ι ·. :.· .	: 15
	II	: 20
' ' "' . "	III	: 20
Viridogrisein		: 45

Griseoviridin wird durch DSC in den Fraktionen Nr. 30 bis 34 der Sephadex LH-20-Säule festgestellt. Diese Aktiv'f raktionen werden vereinigt, unter vermindertem Druck bis zur Trockene eingedampft und aus warmem Methanol umkristallisiert, wodurch man 30 mg nadeiförmige Kristalle von Griseoviridin erhält. (Identifizierung durch DSC bzw. nach einer anderen physikochemischen Methode). ^^^ ^: - / ^: .

Beispiel 3 ""' .- /:^:'"·' . ;·' ...'.-' · . '; '^:^-'/^:. ;: - ' . ' . ..; ' . : ' '' "".- .·:' '; '

Man züchtet wie in Beispiel 1 während 96 St, ausgenommen, daß das Züchtungsmedium aus So-jabohnenrnehl, Pharmamedia, Hafermehl, Trockenhefe, Rote-Rübe-Melasse (jeweils 0,5 %) und 0,1 % DL·- 06-Amino-n-butt er säure (pH 6,5) besteht. Die Kulturlösung wird aus 13 Kolben gesammelt und filtriert, das Filtrat zweimal mit je 300 ml n-Butanol extrahiert. Nach Entfernung des n-Butanols aus den Extrakten erhält man ca. 70mg eines rohen Pulvers, bestehend aus den Neoviridogriseinen und Griseoviridin. Das Pulver wird mit DSG (Silicagel) und nachfol gende Bioautographie an Sarcina lutea als Testorgänismus analysiert. Dabei gelangt man zu folgenden Ergebnissen:

- vif 9 39$

DSG-Platte : .Vorgängig überzogene DSC-Platte

SILICA GEL 60 P-25^, E. Merck, Darmstad Lösungsmittel : Chloroform : Methanol .

": ....... . ...	I	Rf =	20:1	30:1	40	:1
Neoviridogrisein	II		0,60	0,39	°>	20
	III		0,56	0,32	0,	16
			0,50	0,19	0,	13
Viridogrisein			0,43	0,18	o»	10
Griseoviridin . 1. . '.'.'. '. '			0,05	0,02 ' ' ' . '. ''	0,	00.
•1 . ' ' ': I . ' . Beispiel 4			·. .

50 ml Impf medium, mit 0,3 % Hinderextrakt, 0,5 % .Try.pt on (Difco Laboratories), 0,1 % Glucose, 2,k % lösliehe Stärke, 0,5 % Hefeextrakt, 0,^- % Calciumcarbonat und0,5 % Sojaboh- ;..,..nenjnehl- (pH 7>0) werden in. einem 250 ml-Erlenmeyer-Kolben verteilt und bei 120^C für 15 min autoklaviert. Dann wird der Kolben mit Sporen von Streptomyces sp. P 8648 auf Schrägagar beimpft und bei 25°C für 3 Tage zur Ergänzung der Impfkultur geschüttelt. Das Züchtungsinedium besteht dabei aus 0,5 % löslicher Stärke, 2,0 % Glucose, 1,0 % Pharinainedia, 0,5 % Hafermehl, 0,5 % Maiseinvj-eichflüssigkeit, 0,05 % KpHPO^ und 0,05 $ MgSO₂₊ (pH 6,5). 50 ml dieses Mediums werden dann in einen konischen 250 ml-Kolben gegeben und bei 12O⁰C für 15 min autoklaviert. Die Inokulatmenge beträgt 2 % (v/v). Der Fermentationskolben wird mit der beschriebenen Impfkultur beimpft und bei 25°C auf einem Rotationsschüttler bebrütet. 24· bzw. 48 Stunden nach der Bebrütung wird eine sterilisierte Lösung von Casaininosäure (Difco Laboratories) oder Prolin (pH 7,0) bis zu einer Endkonzenträtion von 0,4 % zugesetzt, wonach die Züchtung fortgesetzt wird. Vier Tage nach der Bebrütung wird die Kultur lösung, abfiltriert und das Kulturf iltrat zv/eimal mit der gleichen Menge Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatextrakte werden vereinigt und bei vermindertem Druck zu einem trockenen Pulver eingedampft. Dieses rohe Pulver wird

-»" If9 395

in Äthylacetat aufgenommen, wonach eine entsprechende Menge der Lösung auf eine DSC-Platte (Silicagel) auf getropft wird. Die Platte wird in Chloroform/Methanol (50 :1) entwickelt, wonach das Lösungsmittel an der Luft abgedampft wird. Danach wird dieselbe Platte noch einmal in demselben Lösungsmittelsystem entwickelt. Die einzelnen Neoviridogriseine wurden unter UV-Licht (3650 2.) ermittelt, von der Platte abgekratzt und in einer bekannten Methanolmenge suspendiert. Nach Entfernung des Silicagels durch Dekantieren wird die Antibioticamenge in den Extrakten durch den UV-Test ermittelt ( £ bei 305 nm 8.000: Ov , .. : . ;.;.;.; ^; -.. \_: '. ' - .'^;''.',. ν. '

' ·': Aminosäure zugesetzt

; ; keine Casamino- Prolin

Neoviridogrisein I 2% 2% 2%

' " : ^;'^:/^;· :· '-; : ' H -.-"'O- & 40 60 . ' ^:'^;;

Viridogrisein 85 55 35

In einem HütteIfermenter werden unter denselben Bedingungen wi.e in Beispiel 2 ca. 10 1 einer 23 Stünden alten Impfkultur bereitet . Das Züchtungsmedium (600 1) , bestehend aus Sojabohnenmehl, Pharmamedia, Hafermehl, Trockenhefe, Rote-Rübe-Melasse (jeweils 0,5 %) und 0,1 % DL- öC-Amino-n-buttersäure (pH 6,5 vor dem Autoklavieren) wird bei 120⁰C während 15 min in einem 1400 1-Tankfermenter aus rostfreiem Stahl dampf sterilisiert und dann auf 28⁰C abgekühlt. Dem Fermenter wird die erwähnte Impfkultur (10 1) zugesetzt, wonach bei 28⁰C während 75 St bei forcierter Belüftung unter Rühren bei 180 U/min (Doppelflügelrad, Radius entspricht' einem Viertel des_; Fermenterdurchmessers) bebrütet v/ird, v;obei die sterile Luft, mit 300 l/min durch den Boden des Tanks eingeblasen wird. Nach der Bebrütung wird die Kulturflüssigkeit ;

- 33- 1 99 3*5

mit einer Filterpresse abfiltriert. Das 'Kulturfiltrat -wird dannzweimal mit je 150 1 n-Butanol extrahiert. Die n-Buta-· nolextrakte werden miteinander vereinigt, mit einer geringen _} Menge einer gesättigten NaCl-Lösung gewaschen undin einem Rotationsverdampfer auf 2 1 eingeengt. Nach Zugabe von 20 g Silicagel (Wakogel C-100, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) wird bis zur vollständigen Trockene weiter eingeengt. Das erhaltene Antibiotica-Silicagel-Gemisch wird in einer geringen Menage Chloroform suspendiert und dann auf eine Silicagelsäule (MKOGEL C-100; 6,5 x 75 cm) aufgebracht. Die Antibiotica. werden stufenweise zuerst mit 7 1 Chloroform,· dann mit 10 1 Chloroform/Methanol (50:1) und schließlich mit Methanol elulert. Die gegenüber Sarcina lutea als bioaktiv festgestellten .Fraktionen Nr. 16 bis 29 (300 g-Fraktion) (Neoviridogri-, seine) werden gesammelt und bei vermindertem Druck bis zur Trockene eingeengt, wodurch man ein rohes Pulver,bestehend aus Neoviridogriseinen, erhält. Dieses wird in einer geringen Menge Methanol gelöst und auf eine Sephadex LH-20-Säule (7,0 χ 45 cm) aufgegeben, wobei jede Fraktion (100 g) mit Methanol eluiert wird. Ca. 15 g rohes Pulver, bestehend aus dem Neoviridogriseingemisch, werden aus den Fraktionen Nr. 6 bis 15 nach Abtreiben des Lösungsmittels erhalten. Die Fraktionen Nr.. 50 bis 60 der beschriebenen Silicagelsäule enthalten Griseoviridin. Durch Reinigung mit einer Sephadex LH-20-Säule (7,Ox 45 cm), wie sie oben für das Neoviridogriseingemisch beschrieben wurde, erhält man 4g rohes Griseoviridin.

Beispiel 6 . , ; .-.. . · . ' . :.. : .' ' ":. · ;

Für die Endreinigung wird eine DSC-Silicagel-Platte verv/endet. Ig des rohen Neoviridogriseingemisches nach Beispiel 5 wird in 2 ml Äthylacetat gelöst und schichtweise auf 10 SiIicagel-Platten (vorgängig überzogene DSC-Platte SILICA GEL 60 F-254) aufgebracht. Diese Platten werden zuerst mit einem Losungsmitte!system aus Chloroform und Methanol (50:1) entv/ikkelt. Nach Abtreiben des Lösungsmittels an der Luft werden

-·: 1f9 3

die Platten noch einmal mit Chloroform/Methanol (25:1) entwickelt. Die Neöviridogrise ine I, II und III und Viridögrisein werden auf den BSC-Platt en unter UV-Licht (3650 'S;-; BLAKRAY UVL-22, Ultra-Violet Products, Inc.) markiert und abgekratzt . Jede Neoviridogriseinkoinponente wird mit einer geringen Menge Methanol eluiertund bis zur Trockene eingedampft. Man erhält dabei folgende Mengenverteilung an reinen Produkten: . ν , ^;-¹./;/'. ' . -^-'V^v^ \'^;'/^:··: / '. ^ { ._: \ ' '/' ,' ' ' '..". '

/ Neoviridogrisein I : 16,7 mg (nicht ganz rein, ölig)

: ' ·;:II' .;;,. ' :11,1 mg (weißes Pulver)

:^: :III : 15,2 mg (weißes Pulver)

Viridogrisein : 30,0 mg (weißes Pulver)

Jeweils ca. 5 mg aller Keoviridogriseine werden hydrolysiert. in 6n HCl bei 110⁰C für 36 Stunden in einem luftdicht verschlossenen Rohr und dann der DSC, Papierchromatographie, PapiereIektrophorese bei hohen Spannungen und Autoaminpessigsäure-Analyse unterzogen. Dabei werden folgende Bestandteile festgestellt: ' ";. : ';, ..;. '/· .^;'^:.··;-:·' ; .λ .. . ···

Neoviridogrisein I : 3-Hydroxy-picolinsäure

::-" : . ^:· ' :".^:'·' Threonin · .. .; .; .' , ' :. ' '

\: . . " ·.;.;:^:·"- '. . · v. '; ;. ·. /. ·.:.";., .'.· '.·'-Prolin'.;' ' ;·- ' -J. - :' / ;:.'..' -. ·;^:;·^;".' ^:- '-.; "..''-: ·; ; ; ". ^::"'· ·" ",. ' "^:- .-Sarcosin ' :' "· .;·. ^{; :}"- . ' . '"

ß,N-Dimethylleucin

. ' ^: '..' ' ' :; ö<i--Amino-n-buttersäure ''..

Phenylsarcosin

Neoviridogrisein II : 3-Hydroxypicolinsäure

. -. - .':.'--k'-'- . .' . ":\:. " ; ;. - Thre onxn '. ..·^: '"' ". . , . '

_:.; . ;.; . : :;' .. .>.;^:;;''_;-.' '." ': ' ," .· Prolin ;: " -

^; " ',, '·. ' .;. · . '..-;. .." ·-.. ." .;: /.' ' ' .' - - .·^: Sarcosin :·..-' ;. .-.'. '. :' ' : -.'. '" " ;. ·;.' ·''. ' ^::, ' .' :.'.- ;" , . '..· " Alanin ' ' , ' '" ;-.' ^: :

Neoviridogrisein II Neoviridogrisein III

Viridogrisein

Phenylsarcosin

3-Hydroxy-picolinsäure Threonin Leucin Hydroxyprolin Sarcosin β,Ν-Dimethylleucin Ö6-Amino-n~buttersäure Phenylsarcosin

3-Hydroxyρic ο1ins äur e Threonin Leucin Hydroxyprolin Sarcosin ß,N-Dirne thy !leucin Alanin Phenylsarcosin

Außerdem wurde die Indentität von Neoviridogrisein IV mit Yiridogrisein noch IR-, UV-, NMR- und massenspektrometrisch, durch DSC, Hydrolysatanälyse und antimikrobielle Spektrometrie festgestellt. -

Das nach Beispiel 5 hergestellte Griseoviridin v/urde aus warmem Methanol uinkristallisiert, /wodurch man nadeiförmige Kristalle erhielt. Ein Teil davon wurde mit einer Originalprobe von Griseoviridin IR-, UV-, NM- und massenspektrometrisch, durch DSC, Elementaranalyse und auf andere physiko-chemische Eigenschaften hin verglichen, wodurch völlige Identität festgestellt werden könnte.

Claims (4)

1. Erf indungsanspruoh.

   1. Verfahren zur Herstellung des Depsipeptidantibiotikums Neoviridogrisein I der Formel

   CH,

   CE

   CH

   CH₂ CH,

   Z T¹Z CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-N -CH-CO

   CH-CH

   CO

   Ή-Κ—CO-CH-NH-CO-CH—N-CH Γ I ί

   CH* CH,

   CH

   CH-CH,

   : -CH-CH,

   ferner des Depsipeptidantibiotikums Neoviridogrisein II der

   Formel -γ'- .-.)/: ' Υ-_Λττ ' '; _CH :.: / γ γ;""-- ' ' : ^;.

   CH,

   CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-N

   CH-CH,

   -. ι :' j:. ' - ..-

   : ^r Ο":· ·· ·., .. Ζ" '·. :

   CH₂ CH-CO

   N-CH₃

   > .:

   CH-ψ—CO-CH-NH-CO - CH-N-CH₃

   J OH

   j--CH-CH₃ CH-CH₃ CH₃

   - I $9 395

   sowie des Depsipeptidantibiotikums Neoviridogrisein III der Formel " -. .- ' ; ^;-:.': \ ^:. " '-'V.' . \ " . , ' ' " > \ . .. ''

   CH,

   CH

   y 3

   ^CH2 ;

   CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-N

   : CH-CH₃

   .· .." o " : ·:' -/ ; .- ^:: - T.---.:-. : ·^ co

   OH

   I. : V;

   CH

   CHo ^XCH.

   CH-CO N-CH, CH₉

   ι ' *: : co

   CH-N- CO-CH-NH-CO-CH- N-CH

   "CH-

   CH

   ' CH-CH, I
   CH-CH,

   d ad u r c h ge ken η ζ ei c h net , daß man unter aeroben Bedingungen bei Temperaturen von 18 bis 37°C in einem wässerigen Nährmedium, enthaltend assimilierbare C- und N-Quellen sowie essentielle Mineralsalze bei einem pH von ca.. 6 bis 9 den MilcroOrganismus Streptomyces sp. P 8648 .(FERM-P3562) so lange züchtet, bis das Medium eine erhebliche antibiotische Aktivität aufweist, und das Züchtungsprodukt vom Medium abtrennt und gegebenenfalls in die Einzelkomponenten Neoviridogrisein I, Neoviridogrisein II und Neoviridogrisein III auftrennt.
2. 2. Verfahren nach . Punkt 1, da du roh g e k e η η ze ich η et , daß zusätzlich zu Neoviridogrisein I, Neo-

   viridogrisein II und Neoviridogrisein III noch Viridogrisein und Griseoviridin hergestellt werden.
3. 3. Verfahren nach Punkt 1, d ad ure h g e k e ή η ze i c h net, daß die Züchtung in Gegenwart von 0i>- Amino η-butt er säure und/oder natürlichen ^-Amino-n-buttersäure-Quellen durchgeführt wird. ^; · / : ^:
4. 4. Verfahren nach Punkt;; 1, dadurch "ge k e η η..· ze ich η e t, daß die Züchtung in Gegenwart von Prolin und/oder einer natürlichen Prolin-Quelle durchgeführt wird.

   Hierzu 12 Seiten Tabellen