DK147129B - Fremgangsmaade til fremstilling af depsipeptid-antibiotika neoviridogrisein i, ii og iii samt eventuelt viridogrisein og griseoviridin - Google Patents

Description

147129

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af en række hidtil ukendte depsipeptid-antibiotika der benævnes neoviridogrisein I, II og III, samt eventuelt samtidig viridogrisein og griseoviridin. Disse antibiotika anvendes som lægemidler og som additiver i dyrefoder, idet de i høj grad er effektive med hensyn til at inhibere væksten af forskellige grampositive bakterier og mykoplasmaer.

Den gruppe antibiotika der benævnes med fællesbetegnelsen mikamycin-vernamycin (eller streptogramin) klassificeres i to hovedgrupper. Den ene hovedgruppe (gruppe A ifølge D Vazquez, side 521-534 i Antibiotics III, Mechanism of action of antimicrobial and antitumor agents, Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York 1975) er macrocykliske laktonforbindelser og omfatter griseoviridin, ostreogrycin A(=mikamycin A=virginiamycin M= staphylomycin M= pristinamycin IIA=vernamycin A=streptogramin A=synergistin A-l= Compound PA-114Al=Compound E-129 Factor A etc.), ostreogrycin G (= virginiamycin MII=staphylomycin MII=pristinamycin IIB=dihydrost-reogrycin A=Compound E-129 Factor B=Compound R.P.-13920 etc) og Compounds A-2315 A, B og C. Omend bakterostatiske er denne gruppe antibiotika virksomme mod grampositive bakterier og mykoplasmaer. Griseoviridin, der er et af gæringsprodukterne ved den foreliggende opfindelse, vides at blive frembragt sammen med viridogrisein af streptomyceter, og produktionen af griseoviridin er angivet i USA-patentskrift nr 3.023.204 og 3.174.902.

Den anden hovedgruppe (gruppe B ifølge D. Vazquez) er makrocykliske depsipeptidforbindelser fordelt i to undergrupper, nemlig viridogrisein-undergruppen og vernamycin B-undergruppen.

De antibiotiske stoffer i denne hovedgruppe er hovedsagelig effektive med hensyn til at undertrykke væksten af grampositive bakterier som Staphylococcus aureus og Bacillus subtilis. Vernamycin B-undergruppen indeholder 12 homologe. Da synonymrelationerne mellem de offentliggjorte navne på antibiotika i denne gruppe er så komplicerede, er det praktisk talt umuligt at opregne alle forbindelsesnavnene i denne undergruppe. Nogle repræsentative og videnskabeligt betydningsfulde forbindelser af denne undergruppe er som følger: 147129 2 1. Vernamycin B α =ostreogrycin B=pristinamycin IA=mikamycin B= streptogramin B=synergistin B-l=compound E-129 Factor Z= compound PA114B1 2. Vernamycin B γ =ostreogrycin Bl=pristinamycin IC=compound E-129 Factor Z1 3. Vernamycin B β =ostreogrycin B2=pristinamycin IB=compound E-129 Factor Z2=compound R.P.-13919.

4. Ostreogrycin B3=compound E-129 Factor Z3

5. Patricin A

6. Patricin B

7. Vernamycin Β δ 8. Vernamycin C=doricin

9. Virginiamycin (Staphylomycin)S

10. Virginiamycin (Staphylomycin)S2 11. Virginiamycin (Staphylomycin)S3 12. Virginiamycin (Staphylomycin)S4 (eller SI)

Forbindelser af denne undergruppe har det fælles træk at de er sammensat af syv bestanddele hvoraf de fire er fælles, nemlig 3-hydroxypikolinsyre, L-treonin, L-prolin og L-fenylglycin. På den anden side har der i viridogrisein-undergruppen kun været kendt én forbindelse, viridogrisein, og dennes identitet med etamycin, compound K-179 og compound F-1370A er godt fastslået. I modsætning til den ovennævnte vernamycin B-undergruppe er viridogrisein sammensat af 8 bestanddele, nemlig 3-hydroxypikolinsyre, L-treonin, D-leucin, 4-hydroxy-D-prolin, sarkosin, β-N-dimetyl-L-leucin, L-alanin og L-fenylsarkosin. Som det fremgår af den efterfølgende udførlige beskrivelse af opfindelsen hører de her omhandlede neo-viridogrisein-antibiotika til viridogrisein-undergruppen og en forbindelse der dannes sammen med neoviridogriseinerne og som opringelig betegnedes neoviridogrisein IV er blevet identificeret som viridogrisein. Fremstilling af viridogrisein er beskrevet i DSA-patentskrift nr 3.023.204.

Synergismen mellem gruppe A og gruppe B på forskellige mikroorganismer er velkendt og kan udnyttes med fordel til at 3 147129 potentiere den terapeutiske virkning af farmaceutiske lægemidler indeholdende antibiotika af denne gruppe som virksomme bestanddele. Dette gælder også for neoviridogriseiner.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i krav 1's kendetegnende del anførte. Man forgærer altså et passende vandigt medium under aerobe betingelser med en hidtil ukendt art af slægten Streptomyces benævnt Streptomyces sp.

P8648 (FERM-P3562), hvorefter de dannede neoviridogriseiner udvindes fra gæringsmediet med eller uden griseoviridin.

Ved en fordelagtig udførelsesform for fremgangsmåden kan man ifølge opfindelsen til gæringen tilføre prolin for at forøge mængden af neoviridogriseineme I og II og ifølge en anden tilføre α-amino-n-smørsyre for at forøge mængden af neovi-ridogriseinerne I og III/ hvilke tilførsler sker under eller før gæringsprocessen.

Som nævnt er de ved fremgangsmåden fremstillede forbindelser neoviridogrisein I, II og III værdifulde antibiotika som er i høj grad virksomme mod forskellige patogene mikroorganismer, herunder grampositive bakterier og mykoplasmaer og kan derfor finde nytte i human- og veterinærmedicinen. I praksis kan disse antibiotika bruges som lægemidler til behandling af infektionssygdomme fremkaldt af grampositive bakterier og mykoplasma, fx af Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Diplococcus pneumoniae, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma fermentans,

Mycoplasma agalactiae og lignende organismer.

I nærværende beskrivelse bruges betegnelsen "neoviridogrisein" som sådan som fælles betegnelse for de depsipeptid-antibiotika som kaldes neoviridogriseineme; betegnelsen bruges således ikke blot om de enkelte medlemmer af antibiotikumgruppen neoviridogrisein I, II og III samt viridogrisein (=neoviridogrisein IV), men også om blandinger af to eller flere forbindelser af denne gruppe.

4 147129

Mikroorganismer

De omhandlede depsipeptid-antibiotika frembringes af en hidtil ukendt stamme af Streptomyces,benævnt Streptomyces sp.P8648 (FERM-P 3562) sammen med viridogrisein og griseoviridin. Denne mikroorganisme er blevet isoleret fra en jordprøve opsamlet nær Kuzuryu-dæmningen i Fukui-ken, Japan.

Generelt udsender denne mikroorganisme farveløse, korte luftmycelier fra velforgrenede (enkelt grening) substratmycelier.

Der dannes sporekæder med glat overflade i en løs løkke på boppen af luftmycelierne. Der iagttages hverken hvirvler eller askosporer. Mikroorganismens kulturegenskaber på forskellige agarmedier beskrives som følger: 1) Sakkarose-nitratagar vækst: dårlig luftmycelium: lejlighedsvis dannes tyndt,

Midt luftmycelium bagside: farveløs til gråhvid opløseligt pigment: intet 2) Glukose-asparaginagar vækst: rigelig luftmycelium: svagteller intet; hvidt når det dannes bagside: lyst gullighvid til lysegul opløseligt pigment: intet 3) Glycerin-asparaginagar vækst: moderat luftmycelium: svag eller manglende; hvidt når det dannes bagside: lysegul til gråliggul opløseligt pigment: intet 5 147129 4) Gærekstrakt-maltekstraktagar vækst: rigelig luftmycelium: hvidt til hvidt med gråligt anstrøg bagside: lysegul, bliver senere brunliggrå opløseligt pigment: intet eller sjældent svagt, brunt 5) Stivelsesagar vækst: moderat luftmycelium: intet eller svagt; hvidt når det dannes bagside: lysegul med lyst gråligbrunt i koloniernes midte opløseligt pigment: intet stivelseshydrolyse: svag 6) Tyrosinagar væks t: moderat luftmycelium: intet, dog iagttages lejlig hedsvis nogle få pletrety^uftmycelium bagside: gråliggul til lyst gulligbrun opløseligt pigment: oprindelig lyst purpurfarvet til lyst rødligbrun, bliver 10 dage senere lysebrun; der dannes kun lidt melanoidt pigment 7) Næringsagar vækst: god luftmycelium: tyndt,hvidt bagside: lysegul opløseligt pigment: intet 8) Havremelsagar vækst: god luftmycelium: hvidt til grålighvidt bagside: gråliggul til lyst rødlig brun med gråligt anstrøg opløseligt pigment: intet 6 147129

Den optimale væksttemperatur for den omhandlede mikroorganisme er i området 25-35°C. Skønt væksten er meget svag kan denne mikroorganisme vokse selv ved en temperatur udenfor dette temperaturområde fx ved 10°C eller 45°C. Den kan ikke vokse ved en temperatur på 52°C.

Denne aktinomycet smelter gelatine i et glukose-pepton-gelatinemedium; den hydrolyserer stivelse svagt i stivelsesagar med uorganiske salte; og den peptoniserer skummetmælk uden koagulering.

Dannelse af et melanoidt pigment iagttages lejlighedvis i tyrosinagar, men ikke i pepton-gærekstrakt-jernagar og tyrosin-gærekstraktsuppe.

Denne mikroorganismes assimilationsmønster for forskellige kulstofkilder er som følger (i Pridham-Gottlieb's medium); positiv: D-xylose, D-glukose, D-fruktose L-rhamnose, D-mannitol svagtpositiv: sakkarose negativ; L-arabinose, i-inositol, raffinose I relation til produktion af kendte peptid- og ikke-peptid-makrolidantibiotika såsom mikamycin A og B, virginiamyciner, ostreogrycinerne, etamycin, vernamycinerne, vididogrisein, griseo-viridin og pristinamyciner skal følgende mikroorganismer sammenlignes med Streptomyces sp. P8648: Streptomyces griseus NRRL 2426, S. griseoviridus NRRL 2427; S. sp., etamycin-frembringer; S. conganensis; S. ostreogriseus; S. mitakaensis; S. loidenses.

De tilgængelige oplysninger om kultur- og fysiologiske egenskaber hos disse mikroorganismer udviser klare forskelle mellem den til fremstilling af de her omhandlede antibiotika anvendte streptomycet og de ovennævnte arter. Fx afviger Streptomyces griseus NRRL 2426 ved at den hører til sektionen Rectiflexibiles med lige eller svagt bølgede sporekæder, mens den ifølge nærværende opfindelse anvendte mikroorganisme hører til sektionen Spirales; førstnævnte frembringer grå til gulliggrå luftmycelier på gærekstrakt-maltekstrakt-agar, mens sidstnævnte frembringer hvide til grålighvide luftmycelier; og ved at førstnævnte udnytter L-arabinose mens sidstnævnte ikke gør. Den etamycinproducerende Streptomyces sp., der er beskrevet i Antibiotics Annual 1954-1955, side 728-732, kan skelnes fra den i- 7 147129 følge nærværende opfindelse anvendte mikroorganisme ved assimilationsmønstret for kulstofkilder og ved kulturkaraktererne på Czapek agar, glukose-asparaginagar og næringsagar. Streptomyces conganensis udviser klare forskelle i sporernes morfologiske karakterer. Blandt de ovenfor anførte mikroorganismer ligner Streptomyces griseoviridus NRRL 2427 mest den ved den foreliggende fremgangsmåde anvendte streptomycet. Resultaterne af den taxonomiske sammenligning mellem de nævnte to typekulturer er summarisk anført i nedenstående tabel:

Streptomyces Streptomyces griseoviridus sp. P 8648 NRRL 2427 -

Luftmyceliets Lyst orangeagtigt gul- Hvidt til grålighvidt farve ligt til gulligrødt med luftmycelium dannes i gråt anstrøg på gæreks- svagt omfang på de trakt-maltekstraktagar, fleste ISP-medier.

havremelsagar, stivel- Hvidt luftmycelium sesagar og glycerol- dannes rigeligt på asparaginagar gærekstrakt-malteks- traktagar

Substratmyceliets Gråliggult til oliven- Bleggult eller lysefarve brunt eller sortbrunt gult til gråligbrunt på gærekstrakt-malt- på de fleste ISP-medier ekstraktagar, havremelsagar, stivelsesagar og glycerol-asparaginagar

Opløseligt Der dannes intet melano- Der dannes intet mela- pigment idt pigment. Som regel noidt pigment. Som regel iagttages intet andet iagttages intet andet pigment, men sjældent pigment, men sjældent dannes et gult pigment dannes der i svagt om-i ringe omfang fang et brunt pigment

Udnyttelse af L-arabinose +++ L-tarabinose kulstofkilder D-fruktose + D-fruktose +++ sakkarose _ sakkarose +

Som det fremgår af denne tabel er der konstateret klare forskelle mellem Streptomyces griseoviridus NRRL 2427 og den ved den foreliggende fremgangsmåde anvendte streptomycet med hensyn til morfologiske egenskaber og kulturkarakteristika samt udnyttelsesmønsteret for kulstofkilder. Når de to mikroorganismer gæres under ens betingelser vil den foreliggende mikroorganisme desuden 8 147129 danne neoviridogrisein I, II og III samt viridogrisein (neoviridogrisein IV) og griseoviridin, mens typekulturen af Streptomyces griseoviridus NRRL 2427 kun danner viridogrisein og griseoviridin, men ikke neoviridogrisein I, II og III.

På basis af resultater med den anførte undersøgelser anses den ved den foreliggende fremgangsmåde anvendte mikroorganisme for at være en ny art af Streptomyces og benævnes Streptomyces sp. P 8648. Typekultur af mikroorganismen er deponeret hos Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology med deponeringsnummeret FERM-P nr 3562. Sådanne spontane og kunstige mutanter afledet af nævnte mikroorganisme, som har i det væsentlige de samme egenskaber som denne og evne til at producere de nye antibiotika neoviridogriseinerne I, II og III, kan også anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Produktion af neoviridogrisein I, II og III

Fundamentalt produceres disse antibiotika ved at man poder og opformerer Streptomyces sp. P8648 i et passende medium linder aeorbe betingelser ved en temperatur i området 18-37°C i 2-14 døgn, hvorefter de akkumulerede antibiotika udvindes fra gæringsmediet og renses på konventionel måde. De foretrukne udførelsesformer for fremgangsmåden ifølge opfindelsen vil blive beskrevet mere udførligt i det følgende:

Til gæring med de pågældende mikroorganismer kan man bruge alle slags medier som kendes som medier for streptomyceter. Fx er fortrinsvise kulstofkilder i mediet glukose, glycerol, stivelse, dekstrin, havremel, melasse, fedt, olie og lignende. Som egnet nitrogenkilde ved dyrkningen kan navnlig nævnes sojabønnemel, bomuldsfrømel, kødekstrakt, pepton, tør gær, majsstøbevand, gærekstrakt, casein og hydrolysater deraf samt uorganiske salte såsom ammoniumsulfat og ammoniumnitrat. Evt. kan der sættes mikrovækst-faktorer til mediet. Blandt sådanne nævnes vitaminer, aminosyrer, organiske og uorganiske salte såsom kalciumkarbonat, natriumklorid, kaliumklorid, natriumfosfat, kaliumfosfat og magniumsulfat.

De omhandlede antibiotika kan fremstilles ved gæring i traditionelle beholdere såsom rystekolber, krukkefermentorer og tankfermentorer, men fra et økonomisk synspunkt vil det være mest 9 147129 fordelagtigt at bruge submers dyrkning under forceret luftning i industriel målestok.

Gæringen udføres hensigtsmæssigt under aerobe betingelser ved en temperatur i området 25-35°C. Når der bruges en rystekolbe eller en tankfermentor når produktionen af neoviridogriseinerne sin topværdi som regel på 2-10 døgn. pH-værdien under gæringen kan ændre sig til uden for det fysiologiske område i afhængighed af den anvendte slags medium. Det er mest ønskeligt at regulere og opretholde en pH-værdi under gæringen i området 6-9. Som regel reguleres mediets pH til 6,5-8,5 før podningen.

Kontrol af neoviridogrisein-komponenterne i gæringsmediet

Som beskrevet foran producerer den givne mikroorganisme en blanding af neoviridogriseinerne I, II, III og IV samt griseo-viridin. Det er muligt at ændre den kvantative sammensætning af neoviridogriseinerne i gæringsmediet ved passende kombination af kulstof- og nitrogenkilder i mediet uden specifik tilsætning af enten en fri aminosyre eller en organisk syre. Ud fra synspunktet industriel produktion vil det imidlertid være mere fordelagtigt at regulere indholdet af neoviridogrisein I, II og/eller III i gæringsmediet ved til mediet at sætte den eller de relevante aminosyrer i fri form under gæringen, i afhængighed af omstændighederne og behovet. Det siger sig selv at sammensætningen af neoviridogriseinerne i gæringsmediet kan varieres ved passende valg af spontane eller kunstige mutanter stammende fra typekulturen af den beskrevne art streptomycet; ved regulering af gæringsbetingelserne såsom temperatur, pH-værdi og luftning; og/eller ved til mediet at sætte · fysiologisk virksomme midler såsom enzyminhibitorer og promotorer.

En af de foretrukne udførelsesformer for metoder til selektiv produktion af bestemte neoviridogrisein-komponenter består i at man tilfører den eller de relevante konstituent-aminosyrer, 'ia-amino-n-smørsyre og/eller prolin under gæringen. Specielt vil tilsætning af prolin under gæringen forøge procentdelen af neoviridogriseiner I og II i den samlede mængde neoviridogrisein I, II, III og IV, og disse to stoffer har kraftigere antimikrobiel virkning end neoviridogriseiner III og IV. Tilsætningen af α-amino-n-smørsyre forøger procentdelen af neoviridogrisein I og III. Mængden af neoviridogriseiner I og III kan forøges selektivt ved at 10 147129 man tilfører α-amino-n-smørsyre til mediet før podningen eller under gæringen. Efterhånden som den omhandlede mikroorganisme producerer protease under væksten/ kan der tilsættes proteinholdigt materiale som indeholder nævnte konstituent aminosyre eller -syrer i stedet for den eller de frie aminosyrer. Fx kan prolin erstattes med éasei'n eller tilsvarende hydrolysater fra syrehydrolyse deraf, fx de såkaldte casaminosyrer.

Isolation og rensning

De hidtil ukendte antibiotika neoviridogrisein I, II og III samt viridogrisein kan isoleres fra gæringsmediet ved konventionelle metoder baseret på deres fysisk-kemiske egenskaber som depsipep-tid-antibiotika. Om nødvendigt kan neoviridogriseinerne udvindes fra næringsmediet sammen med griseoviridin som en blanding af neo-viridogriseiner og griseoviridin. Når de fremstilles til brug som foderadditiv eller veterinært lægemiddel vil en rå blanding af neoviridogriseiner og griseoviridin være mest fordelagtig set fra et økonomisk synspunkt.

Neoviridogriseinerne og griseoviridin i gæringsmediet kan ekstraheres med et vandublandbart organisk opløsningsmiddel.

Fx egner ætylacetat, butylacetat, n-butanol, metylenklorid, kloroform og lignende stoffer sig til ekstraktion af neoviridogriseiner og griseoviridin på en gang. Hvis det ønskes selektivt at ekstrahere neoviridogriseiner uden griseoviridin er de foretrukne organiske opløsningsmidler metylisobutylketon, benzen, toluen og andre aromatiske kulbrinter. Da myceliet praktisk talt ikke indeholder neoviridogriseiner og det ekstraherbare lipid i cellerne ofte griber ind i efterfølgende rensningstrin, er det mest fordelagtigt at ekstrahere de nævnte antibiotiske stoffer med et organisk opløsningsmiddel fra det filtrerede eller centrifugerede medium sammen med den vandige vaskevæske.

Opløsningsmiddelekstrakten af neoviridogriseiner og/eller griseoviridin kan isoleres og renses yderligere på flere forskellige måder. Fx kan man til isolation og rensning hensigtsmæssigt kombinere adsorptions- og elueringsprocesser med aktive kul, "Amberlite" (et i Danmark indregistreret varemærke) XAD-4 og 7, ionbytterharpik-ser såsom "Amberlite" IR-120 og "Dowex" (et i Danmark indregistreret varemærke) 50W-X2; gelfiltrering med "Sephadex" LH-20 ("Sepha- 11 147129 dex" er et i Danmark indregistreret varemærke for tværbundet dekstran) og ækvivalenter dertil; adsorptionskromatografering på aluminiumoxyd og silikagel og lignende metoder. Desuden kan modstrømsfordeling med et passende opløsningsmiddelsystem virke godt til disse formål.

Fysisk-kemiske egenskaber af neoviridogriseiner I, II og III

Neoviridogriseiner I, II og III samt viridogrisein er amorfe hvide faste stoffer og er opløselige i metanol, ætanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, dioxan, ætylacetat, butyl-acetat, acetone, metylætylketon, metylisobutylketon, benzen, toluen, metylenklorid, kloroform, kulstoftetraklorid, N,N-dimetyl-formamid og dimetylsulfoxyd; stofferne er tungtopløselige i vand og ætylæter og praktisk talt uopløselige i petroleumsæter og hexan.

Stofferne er stabile i vandig opløsning i mindst en måned ved en temperatur i området 25-37°C; og i 30 min. ved 60°C, ved en pH-værdi på 2-9. De antibiotiske stoffers smeltepunkter bestemtes i et Kofler-apparat og følgende resultater opnåedes:

Neoviridogrisein I: ikke bestemt

II: 93°C

III: 115°C

Viridogrisein: 140°C

De ultraviolette absorptionsspektra og infrarøde absorptionsspektre for neoviridogriseiner I, II, III og viridogrisein er vist på tegningen, hvor figur 1-4 viste UV-spektret for neoviridogrisein I, II, III og viridogrisein ved optagelse i metanol, figur 5-8 viser det ultraviolette spektrum for samme stoffer optaget i 0,1 N NaOH-metanol og figur 9-12 viser det infrarøde spektrum for de samme fire stoffer i en Br-tablet.

1% Værdierne for E^cm for neoviridogriseinerne ved deres maxima er som følger: I neutral metanol neoviridogrisein I: 305 nm(65) II: 305 nm(88) III: 305 nm(90) viridogrisein: 305 nm(90) 12 147129 I ο,Ι N NaOH-metanol neoviridogrisein I: 340 nm(70) II: 340 nm(84) III: 340 nm(90) viridogrisein: 340 nm(96)

De infrarøde spektre for neoviridogriseinerne er som nævnt vist i figur 9-12 og de karakteristiske toppe og skuldre findes ved følgende bølgetal:

Neoviridogrisein I (KBr tablet): 3370, 2910, 2850, 1735, 1670 (skulder), 1635, 1590 (skulder), 1515, 1460 (skulder), 1445, 1405, 1375, 1290, 1280, 1250 (skulder), 1200, 1190, 1160, 1125, 1100 og 1080 cm \

Neoviridogrisein II (KBr tablet): 3320, 2950, 2920, 2820, 2800, 1745, 1670 (skulder), 1630, 1600 (skulder), 1575, 1515, 1460 (skulder), 1445, 1405, 1390, 1365, 1330 (skulder), 1295, 1275, 1240, 1200, 1195, 1160, 1130, 1095 og 1065 cm"1.

Neoviridogrisein III (KBr tablet): 3335, 2960, 2940, 2870, 1750, 1670 (skulder), 1660 (skulder), 1635, 1590 (skulder), 1515, 1450, 1405, 1390 (skulder), 1370, 1340 (skulder), 1300, 1245, 1200, 1160 (skulder), 1130, 1100 og 1065 cm 1.

I de nedenfor angivne tyndlagskromatografisystemer har neoviridogriseinerne I, II og III samt viridogrisein og griseo-vididin følgende Rf-værdier: (1) tic-plade, forovertrukket tic-plade silikagel 60F-254 (fra E. Merck i Darmstadt), opløsningsmiddelsystem: benzen/metanol 5:1 neoviridogrisein I Rf 0,66 II 0,62 III 0,59 viridogrisein 0,55 griseoviridin 0,20 (2) tic-plade: samme som (1), opløsningsmiddel: kloroform/metanol 30:1 neoviridogrisein I Rf 0,39 II 0,32 III 0,19 viridogri sein 0,18 griseoviridin 0,02 13 147129

Til analyse af de indgående aminosyrer hydrolyseredes alle neoviridogrisein-komponenterne i 6N HC1 natten over ved llo°C og det resulterende hydrolysat inddampedes til tørhed. Efter at selv spor af svovlsyre var fjernet ved gentagne inddampninger bestemtes aminosyrerne i hydrolysatet ved tyndlagskromatografi (Eastman Chromatogram ark 13254 cellulose med fluorescerende indikator Eastman Kodak Co.; opløsningsmiddelsystem n-butanol/eddike-syre/vand 4:1:1), højspændingspapirelektroforese (Toyo Filter papir nr. 51 A, Toyo Roshi Kaisha, Ltd., puffersystem: myresyre/ eddikesyre/vand=25/75/900, pH=l,8; 60V/cm ved 0°C i 30 min. og auto-aminosyreanalyse (Hitachi auto-aminosyreanalysator KLA-5,

Hitachi, Ltd.). Tilstedeværelse af følgende aminosyrer bekræftedes: Neoviridogrisein I: treonin, leucin, prolin, a-amino-n-smørsyre, sarkosin, fenylsarkosin, β,N-dimetylleucin.

Neoviridogrisein II: treonin, leucin, prolin, alanin, sarkosin, fenylsarkosin, β,N-dimetylleucin.

Neoviridogrisein III: treonin, leucin, hydroxypyrolin, a-amino-n-smørsyre, sarkosin, fenylsarkosin, β,N-dimetylleucin.

Viridogrisein: treonin, leucin, hydroxyprolin, alanin, sarkosin, fenylsarkosin, β,N-dimetylleucin.

Tilstedeværelse af 3-hydroxypikolinsyre bekræftedes ved massespektrometri og tyndlagskromatografi på følgende måde:

En autentisk prøve af viridogrisein og af hvert af stofferne neoviridogrisein I, II, III og IV hydrolyseredes natten over i 6N HC1 ved 110°C for at give de ovenfor beskrevne hydrolysater.

Hvert hydrolysat udviste kun én UV-absorptionsplet med samme Rf-værdi under de angivne betingelser.

(1) Silikagel tic tic-plade: forovertrukket tic-plade silikagel 60 F-254 fra E. Merck, Darmstadt Opløsningsmiddel: kloroform/metanol 2:1 Rf: 0,46 (2) Cellulose-tic tic-plade: Eastman kromatogram ark 13254, cellulose med fluorésce- rende indikator fra Eastman Kodak Co.

Opløsningsmiddel: n-butanol/eddikesyre/vand 4:1:1

Rf: 0,62

Molekylvægten af disse antibiotika bestemtes ved direkte indsættelse i et massespektrometer. Den var for neoviridogrisein I: 14 147129 876, neoviridogrisein II: 862, for neoviridogrisein III: 892 og for viridogrisein: 878.

Til undersøgelse af den kemiske struktur af neoviridogrise-inerne I, II og III hydrolyseredes disse tre antibiotika samt viridogrisein natten over i 0,1 N NaOH ved stuetemperatur og metyleredes derefter med diazometan før der foretoges masse-spektrometri efter Compernolle et al's metode (Organic Mass Spectrometry, vol. 6, side 151-166, 1972). Strukturen af neoviridogrisein I, II og III findes på basis af de foretagne undersøgelser at være som følger:

Neoviridogrisein I

C\ /CH3 ΓΗ ch0 0H I / \2 I CH„ CH0 CH0 II I 2 I 2 I 2

^.TCO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-N-CH-CO

N | I

CH—CH-, N-CH0 | 3 I 3 0 CH0 1 I 2

CO CO

I I

CH-NCO-CH-NH-CO-CH-N-CHL

Al i i sy >,CH, CH0 CH-CH,

I 3 I 2 I

CH3 CH-CH3 ch3 15 147129

Neoviridogrisein II

CH, /CH, 3 _TI nch ch0 SS' I /\2 I CH, CH, CH, il | 2 | 2 I 2

^CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-N-CH-CO

N I I

CH-CH, N-CH, I 3 I 3 0 CH,

1 I

CO CO

I I

CH-NCO-CH-NH-CO-CH-N-CH, II I I 3 C3 Ίη'™3 ch3

Neoviridogrisein III

CH, /CH, OH

H, / 3 i °h r /\ I CH, CH, CH, il | 2 | 2 I 2

CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-N-CH-CO

N I | CH-CH, N-CH, | 3 | 0 CH, 1 I 2

CO CO

I I

CH-NCO-CH-NH-CO-CH-N-CH,

Al i i 3 C-A 1h3 CH-CH3 ch3 1471.29 16

Som det fremgår af de viste strukturer for neoviridogrisein I, II og III er disse antibiotika en gruppe depsipeptid-antibiotika der er homologe med viridogrisein. Identiteten af neoviridogrisein IV med viridogrisein og etamycin bekræftedes ved massespektrome-tri, tyndlagskormatografi, UV- og IR-spektrometri og aminosyre-analyse under sammenligning med autentiske prøver af viridogrisein og etamycin.

Antimikrobiel virkning

Neoviridogrisein I, II og III har bredt antimikrobielt spektrum mod bakterier, mykoplasmaer, aktinomyceter og rickettsier ved laboratorieforsøg. Nærmere betegnet udviser de bemærkelsesværdig aktivitet in vitro mod de sædvanlige og resistente stammer af Staphylococcus aureus så vel som stammer af Streptococcus pyogenes, Diplococcus pneumoniae, Sarcina lutea, Bacillus subtilis, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma pulmonis, Mycoplasma fermentans og Mycoplasma agalactiae. De mindste inhiberende koncentrationer af de omhandlede depsipeptid-antibiotika bestemtes særskilt og sammen med viridogrisein og griseoviridin på forskellige mikororganismer ved rørfortyndingsmetoden. Resultaterne fremgår af følgende tabel.

17 147129

rH

ύ \ i

H

H

Η X

•M

U> ε o > HNOONNMN'in'fOINNN OO ^ H O - H + OOOfOOOCOOOOOOOOO o o *ϋ g

H

c •iH ·

0) X

ta ·Η in in in

•H g Ol'TlflfSCNlNTCO'TCO'^'^'f'i 00 OO

^ *· O« > OOHlOlOVOOOOOOOOO o o o s Ό

•H

H

h in in in > (Ν^ιΟΠΝΜ^®τί«ι<ί<ί·ί^ -3< 00 O U -------------- Η Q) > OOHIOIOIOOOOOOOOO o o c

<H

H (ti H

h in in w d) fl η N'JlONNNN^flOO'i^'fni 00 00 O - - - - - - - - -.....

O -H [> OOi-llOlOlOOOOOOOOO o o p s (ti (0

H

ti -P

cj h m m m d) h ri'iooNNNM'fni^nniniiN ** co O - - - - - - - ------- c > OOOIOIDVDOOOOOOOO o o o s

X

d) in in in ro H N'iCONNMrl'CD'iCON'tnilN 00 00 0 -------------- - - d) > OOOIOIOIOOOOOOOOO o o h fe (!) Λ

•H

λ ε α 3 •ri ·Η Ό ΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗ Η Η

(1) 0) EG S

+> g mff|pq«pqmmc£irapqcQCQffim CQ ffl tn Ό

•S

S —

H CN O

d) tn . Η Η H ti Η tn in g 2 - — 3 β wo g g ft O UH ου

•HO ^ιβΟΗΛΗΛ-- OH O

CO ·*. κ ·» r—. N. ^ CJ 0 -—*» O

(CO g g g H g g U -* ft 0U0 til 0 Η Η ι4 λ g ω H ft m Oft 0

i—| ^ ** ·* S *» *> -—» s fO ri i—l " i—I

O >i in H UUgtlSgSftlOH >i >i 0Λ3 H ^EHEHHWWOOUrHd)Æ!J! Xi HOr<Dft<'-ii!--------lin+,Oj fft Λ! (DHoigtiUUUgUggUX ΜΗ (ti· (ti- •Η +>2o|x!lflftfttiWftELlWEiffl2 ε +> Οι +> Οι g (Q OHD (0(11 18 147129

rH

g g «Μ«' ·*» •Η ··* W rH fi Η .* Ή Η X Η >Ρ Η - P* >)ϋ •Η *«.«.*. Ο >1 tn S ooootnmininm (Og O CNCMOJOJO) P (0 ►> Λ Λ ΑΛΑ -Ρ β Η Ο Η + +* -¾ - ^ » »

Η Ο S

β Ε>κ •ri · <]) ^ Ρ1 Ρ* Ρ1 00 β ·· U] -Η V V » - ·Ηβ Ό .j g ο o o ο m ιη in ιη κι τΙ ·* -Ρ Ο ρ (Ν ΓΊ Ο) ΓΊ CN ·Ρ β Ο Η trit» ΛΛΛΑΛ Ρ ·Ρ >1 43 η fe -Η Η g (0 Φ rrt > Η Ο 44 -Ρ .ρ Ο ·Ρ -Ρ ·Ρ Φ μ φ Ο & -Ρ Φ .ρ ρ* ρ· γί οο (0 ·Ρ Φ Ο 43 |> - · »- *· ·Ρ β Ρ ·Ρ Ο υ ο oo ο mm ιη m κι Ρ Φ -Ρ 43 <«> cNoitMoiCNj tn ft cn ·Ρ ο c ΑΛΑΛΑ -pr-1

Il 11 II β _ m id ό > Ug Φ H - O ft CQ Φ g

mdH oooommmmm -P

0 IN Ν (Μ N (N »· P g η -Ρ > ΑΛΑΛΑ ·*· β ·· Ό- β ^ +> 23 β ·Ρ Η (Ρ ·Ρ (0(0 -Ρ Ο Ο β β Ό ρ Φ ·Ρ X ·Ρ φ φ Ρη4-> W Ρ ·Ρ 0 g g r*H Ρ1 CP Ρ< Ρ1 ·H+>β>1Wβmg QJH ****· P0ΦgΦ·P£:iβ η ο o o ο m ιη m m m tu -ΡΉ Ο 4 Ο Ο Η c> Μ (Ν Ν (Ν Ν 0 ft β Ό β Φ- -Ρ ΤΙ 023 ΑΛΑΛΑ Γdφ(0βφgwφ X -PPP(0PMPg ρ -ρ ο Φ (0 β m ι (U Ti ΜΡΗ Οι Ο β Ρ

crJH (Ν Ν' Ν ^ > ,ϋ 0 -Η ·Η X

Η -·»*-*.·- |ί ·Ρ CG I (0 m > oooommmmm II 1111 β Φ Ρ ρ 2 (Ν (Ν Μ (Ν (Ν ffi φ Ρ -Ρ +1

Q) Λ'-. Α Λ Λ Λ OE-lftS'dfiPX

η > 01UO Ή Φ 0) Ιρ « ιφ I ·η Ρ rjgmm οφλ(Β β β Κ W ·- · g -Ρ I ίτι

•Ρ ·Ρ + + β ·► Ρ Φ I

-ΰ Η ΗΗ Η Η Η Η Η ·Ηβ·*·-ΡΦβ-Ρ α) Φ Μ EM ffi ffl Ε W Κ >( Φ-Ηβ (! ·η Ρ ^ +) s ffl μμ (¾ fflismmsj Μα-ρ.-φ,βφίο 01 -H >i O β -Ρ I ·γι Ρ te) Ρ g >ι·Η Φ φ 43 -Ρ C tn 0 g Ο -Ρ β « -η r-ι tn ο Ρ ο >ι tn ρ ιι Φ 2 -Η -Ρ W W Ό -P O g Φ Φ -Ρ Φ Η Η ·Ρ β ·Η >ι3 0 Ρ ·Π Β Η 0) & ·Ρ 0 Ρ<0 ΡΡΦΦ 43 Ε (0 g tPtfliO-Ρ Ο (0 Ο ·Η Φ r-Ι β || g ιη -Ρ β Φ. 43 tn -Η > 11 +

-rl W Ο *Ρ β (0 m Η 43 Ο II II II Ρ II

β βΦΟ β W (0 g -Ρ (0 (0 β Η Φ ~ Η Η

(0 0(00 Η ηΗβ,ββιη>(0 β S S £! Μ Κ X

tn ο-ροιη tnmr-ιροοο spå - η η g

ρ oβOΦίΰβιoφ(0·pgβtn(0 II

ο οο+ββΗΐοββΡΟ-ρβ'σ r- ο og ftui ·ρ η ο ·ρ ji ο δ> φ ή >(ΰ ρ ^βΦ&ιϋ-ΡΟ0Η43ββ+Γα Ϊ3 w ΛίΟιΦΡΟΡΟυΗΗΟΦΡΟβ •ρ ·Ρβ·ΡΧ(ΟΟΕ(ΐίΟιι1ί1Ι1)Ρ(0

2 QftmftEfflstJEtnHftiOftO

19 147129

Som det ses af de i tabellen anførte værdier for den mindste inhiberende koncentration (MIC) er neoviridogrisein II mere aktivt end neoviridogrisein IV, altså viridogrisein. Dette forsøg med MIC var baseret på to gange fortyndinger. Por at skelne mellem neoviridogrisein II og viridogrisein med hensyn til den antibiotiske virkning gentoges MlC-bestemmelsen méd en langt lavere fortyndingsgrad. Nedenstående tabel, hvor de forskellige forkortelser har samme betydning som i den foregående, viser at neoviridogrisein II er 2-3 gange så aktiv som viridogrisein.

Tabel 2

Sammenligning af neoviridogrisein II med viridogrisein Mikroorganisme MIC (mg/ml)

NV II VG

Staphylococcus aureus 209 P 0.078 0,133 (EM,CM,SM,PC,TC)r 0,125 0,334 (TC,CP,PC)r 0,094 0,334 BX-1633(PC)Γ 0,125 0,267

Russell(PC)r 0,125 .0,267

Smith 0,125 0,267

Medium: hj erne-hjerte-infusionsmedium Når den mindsteinhiberende koncentration af neoviridogrisein I, II og III undersøgtes i nærværelse af griseoviridin konstateredes der synergisme mellem neoviridogriseinet og griseoviridin ligesom tilfældet er med viridogrisein og griseoviridin. Synergismen mellem de angivne nye antibiotika og griseoviridin blev derfor undersøgt mere udførligt med forskellige mængdeforhold mellem neo-viridogriseinblandingen og griseoviridin. De iagttagne resultater fremgår af nedenstående tabel 3, resultaterne er opnået med Sarcina lutea som testorganisme.

Tabel 3 20 147129

Synergisme af neoviridogriseinblanding med griseoviridin

Neoviridogrisein- griseoviridin MIC, (mg/ml) blanding 100 0 0,313 90 10 0,156 80 20 0,125 70 30 0,125 60 40 0,094 50 50 0,078 40 60 0,094 30 70 0,125 20 80 0,250 10 90 0,250 o 100 0,250

Forsøgene udførtes ved rørfortyndingsmetoden med et hjernehjerte- infusionsmedium. Af ovenstående tabel 3 ses det at den synergistiske virkning mellem neoviridogriseinblandingen på den ene side og griseoviridin på den anden side var mest udtalt ved mægndefor-holdet 50:50; det ses at en blanding af lige dele neoviridogrise-iner og griseoviridin er 3-4 gange så virksom som neoviridogriseinblandingen alene eller griseoviridin alene.

Nedenstående tabel 4 viser den høje aktivitet in vitro af neoviridogrisein II mod forskellige stammer af mycoplasma såvel som den særlig høje synergisme der udvises af en blanding af neoviridogrisein II og griseoviridin i sammenligning med en blanding af viridogrisein og griseoviridin. MIC bestemtes ved fortyndingsmetoden .

21 147129

Tabel 4

Mikroorganisme Medium NVII VG GV NVII+GV VG+GV

lige . lige dele dele

Mycoplasma gallisepticum KP13 (1) 0,025 0,10 0,10 0,0063 0,025

Mycoplasma pulmonis PG 22 (2) 0,78 1,56 6,25 0,20 0,39

Mycoplasma fermentans (2) <0,05 <0,05<0,05 <0,05 <0,05

Mycoplasma agalactiae PG 2 (2) 0,39 0,78 3,13 <0,05 0,39

Medium (1): beriget PPLO-suppe (Eiken, Japan) (2)j PPLO-medium (Chanock's medium; Difco)

Forkortelserne NV II, VG og GV har samme betydning som i tabel 1.

Som det er vist i det foregående udviser de antibiotiske stoffer neoviridogrisein I, II og III bemærkelsesværdig aktivitet mod grampositive bakterier og stammer af mycoplasma, både alene og i forskellige blandinger med viridogrisein (neoviridogrisein IV) og griseoviridin. Det har vist sig at vægtforholdene mellem neoviridogrisein I-III, viridogrisein (neoviridogrisein IV) og griseoviridin i blandingerne kan variere indenfor meget vide grænser, men de overraskende antimikrobielle og antimycoplasma-virk-ninger bevares stadig. Som et repræsentativt eksempel blev en blanding med sammensætningen (vægt%) 27% neoviridogrisein II, 23% neoviridogrisein IV (viridogrisein) og 50% griseoviridin afprøvet in vitro mod Streptococcus mutans, en mikroorganisme der er knyttet til tandcaries og peridontale sygdomme. Prøven udførtes i Todd Hewitt Broth (Difco) med 0,5% TC laktalbuminhydrolysat (Difco). Det oprindelige organismeantal var 4 ca. 3 x 10 organismer pr. ml. Dyrkningsrør inkuberedes anaerobt ved 37°C i 48 timer. Den mindste inhiberende koncentration (MIC) og mindste baktericide koncentration vandtes begge ved en neoviri-dogriseinkoncentration på 1,0 del pr. million (dpm).

Ved et andet repræsentativt eksempel afprøvedes den samme blanding in vitro mod Treponema hyodysenteriae, en organisme som bevirker svinedysenteri. Blandingen afprøvedes som fortyndinger i blodagar ved koncentrationer på 100, 50, 10, 5, 1, 0,5 og 0,1 ppm. Plader podedes ved hjælp af en vatpind og inkuberedes i 4 døgn ved 42°C. MIC viste sig at være 0,5 dpm. Ved et 22 147129 andet repræsentativt eksempel afprøvedes en blanding med sammensætningen (vægt%): 25% neoviridogrisein II, 25% neoviridogrisein IV (viridogrisein) og 50% griseoviridin in vitro mod forskellige stammer af mycoplasma. Den mindste inhiberende koncentration viste sig at være:

Stamme MIC

Mycoplasma gallisepticum KP13 0,07

Mycoplasma pulmonis 0,20

Mycoplasma fermentans 0,05

Mycoplasma agalactiae 0,05

Disse typer blandinger af neoviridogrisein og griseoviridin er også nyttige til behandling af dyr som har infektionssygdomme bevirket af de forannævnte patogene bakterier.

Da det vides at mikamycin A og B er meget effektive som foderadditiv blev de foreliggende antibiotisk virksomme stoffer underkastet en prøve i dyrefoder. Neoviridogriseinerne som en blanding sattes til kyllingefoder i en mængde på 2-20 dpm og blev givet tilhanécyllinger i 10 uger. I sammenligning med en kontrolgruppe af kyllinger som fik samme foder uden neoviridogrisein viste de med neoviridogrisein fodrede kyllinger sig at have forøget hastighed af vægttilvækst og i effektiviteten i foderudnyttelsen. Neoviridogriseinerne har således vist sig at være nyttige som foderadditiv.

Også præparater indeholdende et eller flere af neoviridogriseinerne I—III, evt. i blanding med viridogrisein (neoviridogrisein IV} og griseoviridin, hvor vægtforholdene mellem komponenterne kan variere inden for meget vide grænser, viste sig nyttige som foderadditiver.

Som repræsentativt eksempel afprøvedes en blanding med sammensætningen (vægt%): 27% neoviridogrisein II, 23% neoviridogrisein IV (viridogrisein) og 50% griseoviridin in vivo ved inkorporering i foder for voksende kyllinger. Der brugtes daggamle hanekyllinger, 15 fugle for hver behandling. Kyllingerne holdtes 11 dage på et foder indeholdende ca. 55% rugkorn suppleret med vitaminer, mineraler, fedt og proteinkilder. Det høje indhold af rugkorn giver normalt dårlig til moderat vækst, og dette foder er et standardfoder der anvendes til bedømmelse af foderadditiver 23 147129 i form af vækstfremmende midler og/eller antibiotika. Der brugtes penicillin (100 dpm) som positiv kontrol. De konstaterede data er anført i tabellen nedenfor. Forholdet foder/tilvækst er udtrykt i antal gram foder konsumeret pr. gram vægttilvækst. Legemsvægtforholdet er forholdet mellem kyllingens legemsvægt ved slutningen af de 11 dages undersøgelse og den oprindelige legemsvægt. Sidste kolonne er den gennemsnitlige tilvækst pr. fugl (i gram).

Behandling dpm forhold legemsvægt- gms foder/ forhold tilvækst tilvækst g

Kontrol - 1,334 4,696 156,47

Penicillin 100 1,197 5,012 163,20

Afprøvet blanding 100 1,256 4,789 161,66 50 1,283 4,892 163,47 25 1,204 5,226 174,67

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen skal i det følgende belyses ved nogle eksempler.

Eksempel 1 24 147129

Et udsædsdyrkningsmedium bestående af 0,5% sojabønnemel, 0. 5% "Pharmamedia" (Traders Oil Mili Co.), 0,5% havremel, 0,5% tør gær og 0,5% roemelasse reguleredes til pH 6,5 og fordeltes i en mængde på 50 ml i en 250 ml stor Erlenmeyer kolbe. Efter autoklavering ved 120°C i 15 min. podedes kolben med en løkkefuld Streptomyces sp. P 8648 fra en ISP-2 agar råkultur og kolben inkuberedes ved 28°C i 48 timer på en roterende ryster. To milliliter af den således dannede udsædskultur overførtes til en 500 ml stor Erlenmeyer kolbe indeholdende 100 ml af følgende gæringsmedium: Søj abønnemel 0,5% jordnøddemel 0,5% havremel 0,5% tør gær 0,5% roemelasse 0,5% (mediets pH-værdi 6,5 før autoklavering) og der dyrkedes ved 28°C i 96 timer på en roterende ryster ved 200 opm (cirkelradius 3,5 cm). Dyrkningsmediet opsamledes fra 12 sådanne kolber og filtreredes til et klart mediumfiltrat.Den vundne kage på filteret vaskedes med 100 ml vand. Den vandige vaskevæske og mediefiltratet forenedes. Den antibiotiske aktivitet af denne opløsning (pH 8,3) bestemtes til 23,0 mm på en næringsagar-prøve-plade af Sarcina lutea når den standardiserede skiveprøve udførtes med en 8 mm papirskive. Otte hundrede milliliter af den vandige opløsning ekstraheredes med to gange to hundrede millilter n-butanol og butanolekstrakterne forenedes og inddampedes til tørhed under nedsat tryk; herved vandtes 90 mg råt pulver af neoviridogriseiner og griseoviridin. Dette rå pulver blandedes med en ringe mængde silikagel og påførtes på en silikagelkolonne ("Wako-Gel" C-100,

Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 1,5 x 25 cm). Silikagelkolon-nen elueredes først med 300 ml benzen/acetone blanding 5:1 og derefter med en benzen/acetone blanding 2:1. Der opsamledes fraktioner på 10 g på en automatisk fraktionsopsamler. De aktive fraktioner nr. 25-35 forenedes og inddampedes til tørhed, hvorved der fremkom 30 mg neoviridogriseinblanding (bestående af neoviridogrisein 1, II og III samt viridogrisein). Desforuden gav inddampning af 25 147129 de virksomme fraktioner nr. 45-54 til tørhed et råt pulver hvis antibiotiske aktivitet svarede til griseoviridin på basis af tic.

Disse to præparater underkastedes tyndlagskromatografi under de angivne betingelser. Den antimikrobielle aktivitet konstateredes på denne næringsagar-prøveplade med Sarcina lutea.

Tic-plade: forovertrukket tic-plade med silikagel 60 F-254 fra E. Merck i Darmstadt.

(1) Opløsningsmiddel: Kloroform/metanol 20:1

Neoviridogriseiner Rf = 0,45 Griseoviridin Rf = 0,05 (2) Opløsningsmiddel: Benzen/acetone 1:1 Neovirogriseiner Rf = 0,55 Griseoviridin Rf = 0,13

Eksempel 2

To hundrede milliliter af den 48 timer gamle kultur af Streptomyces sp. P 8648 i samme dyrkningsmedium som i eksempel 1 podedes i en 15 liter stor krukke-fermentor af rustfrit stål og indeholdende 10 liter af samme udsædsdyrkningsmedium som i eksempel 1; der dyrkedes ved 27-28°C i 96 timer under forceret luftning med 5 liter/min. steril luft. Omrøringen under dyrkningen skete med 200 opm med et skovlhjul hvis radius, var ca. 1/4 af krukkefermentorens diameter. Ved gæringens slutning fjernedes mycelier og faststoffer ved filtrering. Det derved vundne mediumfiltrat reguleredes til pH 6,0 og ekstraheredes med 4x2 liter ætylacetat. Ætylacetatekstrakterne forenedes, tørredes over vandfrit natriumsulfat og inddampedes til tørhed under nedsat tryk hvorved der vandtes 700 mg rå neovirogriseiner og griseoviridin. Det udvundne rå pulver af neoviridogriseiner og griseoviridin opløstes i en ringe mængde metanol og anbragtes på en "Sephadex" LH-20 kolonne (3 x 50 cm). Der opsamledes fraktioner på 10 ml med metanol som elueringsmiddel. Neovidogriseinerne fremkom i fraktionerne nr. 22-29. Disse fraktioner opsamledes, koncentreredes til tørhed og rensedes yderligere ved silikagel-søjlekromatografi ("Silicar" CC-7 Special; Mallinckrodt Chemical Works; 1,5 x 20 cm). Elueringen gennemførtes med en blanding af kloroform og metanol 30:1. Otte 5 gram store fraktioner fra fraktionerne nr. 5-12 forenedes og inddampedes til 26 147129 tørhed under nedsat tryk, hvorved der vandtes 25 mg hvidt pulver af neoviridogriseiner. Den procentuelle sammensætning af neoviri-dogriseinerne I, II og III samt viridogrisein i dette pulver var som følger:

Neoviridogrisein 1:15%, neoviridogrisein II: 20%, neoviridogrisein III: 20% og viridogrisein: 45%.

Griseoviridin fandtes ved tic-bestemmelse i fraktionerne nr. 30-34 fra "Sephadex" LH-20. Disse aktive fraktioner kombineredes, inddampedes til tørhed under nedsat tryk og krystalliseredes i varm metanol til 30 mg nåleformede krystaller af griseoviridin. Identiteten af disse krystaller med griseoviridin bevistes ved tic og andre fysisk-kemiske bestemmelser.

Eksempel 3

Samme slags gæring som beskrevet i eksempel 1 udførtes i 96 timer, dog med den forskel at gæringsmediet bestod af 0,5% sojabønnemel, 0,5% "Pharmamedia", 0,5% havremel, 0,5% tør gær, 0,5% rugmelasse og 0,1% DL-a-amino-n-smørsyre (pH 6,5). Gæringssuppen opsamledes fra 13 kolber og filtreredes. Den filtrerede væske ekstraheredes med 2 x 300 ml n-butanol. Fjernelse af n-butanol fra ekstrakterne efterlod ca. 70 mg råt pulver af neoviridogriseiner og griseoviridin. Dette rå pulver analyseredes ved silikagel-tyndlagskromatografi efterfulgt af biologisk bestemmelse med Sarcina lutea som testorganisme. Den ved denne bestemmelse anvendtes tic-plade var forovertrukket tic-plade Silikagel 60 F-254 fra E. Merck, Darmstadt. De opnåede Rf-værdier og opløsningsmiddelsystemet var som følger:

Kloroform/metanol 20:1 30:1 40:1

Neoviridogrisein I Rf=0,60 0,39 0,20 II 0,56 0,32 0,16 III 0,50 0,19 0,13

Viridogrisein 0,43 0,18 0,10

Griseoviridin 0,05 0,02 0,00 .27 147129

Eksempel 4 50 ml udsædskulturmedium indeholdende 0,3% oksekødekstrakt, 0,5% trypton (Difco Laboratories), 0,1% glukose, 2,4% opløselig stivelse, 0,5% gærekstrakt, 0,4% kalciumkarbonat og 0,5% sojabønnemel (pH 7,0) anbragtes i en 250 ml stor Erlenmeyer kolbe og autoklaveredes ved 120°C i 15 min. Sporer af Streptomyces sp P 8648 fra en agar skråkultur podedes i kolben og der dyrkedes under rystning ved 25°C i 3 døgn for at opnå en udsædskultur. Hoved-gæringsmediet indeholdt 0,5% opløselig stivelse, 2,0% glukose, 1,0% "Pharmamedia", 0,5% havremel, 0,5% majsstøbevand, 0,05% dikaliumfosfat og 0,05% magniumsulfat (pH 6,5). Halvtreds milliliter af dette gæringsmedium anbragtes i en 250 ml stor konisk kolbe og autoklaveredes ved 120°C i 15 min. Podemængden var 2 rumfangs%. Gæringskolben podedes med den beskrevne udsædskultur og inkuberedes ved 25°C på en roterende ryster. Fire og tyve timer . eller 48 timer efter podningen tilsattes en steriliseret opløsning af kasaminosyrer (Difco Laboratories) eller prolin (pH 7,0) til en slutkoncentration på 0,4% og gæringen fortsattes. Fire dage efter podningen filtreredes gæringsmediet og mediefiltratet eks-traheredes to gange med et lige så stort rumfang ætylacetat. Ætyl-acetatekstrakterne forenedes og inddampedes til et tørt pulver under nedsat tryk. Dette rå pulver blev optaget i ætylacetat og en prøve af opløsningen påførtes kvantitativt på en silikagel-tlc-plade. Tic-pladen fremkaldtes i et opløsningsmiddelsystem af kloroform og ætanol 50:1 og opløsningsmidlet afdampedes i luften.

Samme tic-plade fremkaldtes igen i opløsningsmiddelsystemet kloroform/metanol 50:1. De forskellige komponenter af neoviri-dogriseiner lokaliseredes under ultraviolet lys(3650Å) blev skrabet væk fra tic-pladen og suspenderedes i et kendt rumfang metanol. Efter at silikagelen var fjernet ved dekantering bestemtes mængden af antibiotika i ekstrakterne ved UV-bestemmelses-metoden,. på basis af det faktum at ε-værdien ved 305 nm er 8000. Resultaterne af UV-bestemmelsen var som følger: 147129 .28

Tilsat amonosyre

Ingen Casaminosyre Prolin

Neoviridogrisein I 2% 2% 2% II 9 40 60 III 433

Viridogrisein 85 55 35

Eksempel 5

Ca. 10 liter af en 23 timer gammel udsædkultur tilberedtes i en krukkefermentor under samme betingelser som beskrevet i eksempel 2. Gæringsmediet (600 liter) indeholdt 0,5% sojabønnemel, 0,5% "Pharmamedia", 0,5% havremel, 0,5% tør gær, 0,5% roeme-lasse og 0,1% DL-a-amino-n-smørsyre (pH reguleret til 6,5 før autoklavering), og mediet dampsteriliseredes ved 120°C i 15 min. i en 1400 liter stor fermentor i form af en rustfri ståltank, hvorefter der afkøledes til 28°C. Til gæringstanken sattes 10 liter af ovennævnte udsædskultur og der dyrkedes ved 28°C i 75 timer under forceret luftning og omrøring ved 180 opm (ved hjælp af et dobbelt skovlhjul cirkelradius 1/4 af gæringstankens diameter), mens steril luft tilførtes i en mængde på 300 liter/min. gennem en sprøjtekrans i bunden af tanken. Efter gæringens slutning filtreredes gennem en filterpresse. Gæringsmediumfiltratet ekstrahere-des med 2 x 150 liter n-butanol. n-Butanolekstrakterne forenedes, vaskedes med et lille rumfang mættet natriumkloridopløsning og koncentreredes til 2 liter i en roterende evaporator. På dette trin tilsattes der 20 g silikagel '{Wakogel" C-100 fra Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) og koncentreringen i en roterende evaporator fortsattes yderligere til tørhed. Den dannede blanding af antibiotika og silikagel suspenderedes i en lille mængde kloroform og anbragtes på toppen af en kolonne af silikagel (samme type som foran, 6,5 x 75 cm). Elueringen af de antibiotiske stoffer udførtes trinvis først med 7 liter kloroform, derefter med 10 liter af en blanding af kloroform og metanol 50:1 og sluttelig med metanol. Fraktionerne nr. 16-29 (hver fraktion på 300 g), der viste sig bioaktive på Sarcina lutea (neoviridogriseiner), opsamledes og koncentreredes til tørhed under nedsat tryk og gav et råt pulver af neo- 29 147129 viridogriseiner. Dette rå pulver opløstes i et lille rumfang metanol og førtes gennem en kolonne på 7,0 x 45 cm af "Sephadex" LH-20, og hver fraktion (100 g) elueredes med metanol. Der udvandtes ca.

15 g råt pulver af neoviridogriseinblandingen for fraktionerne nr.

6-15 efter at opløsningsmidlet var fjernet ved afdampning. Frak-: tionerne nr. 50-60 af den foran beskrevne silikagelkolonne indeholdt griseoviridin. En lignende rensningsproces med "Sephadex" LH-20 (kolonnestørrelse 7,0 x 45 cm) som anvendt til neoviridogriseinblandingen gentoges og gav 4 g råt griseoviridin.

Eksempel 6

Til sluttelig rensning anvendtes der præparativ tyndlagskromatografi med en tic-plade af silikagel. Et gram af den i eksempel 5 fremstillede rå neoviridogriseinblånding opløstes i 2 ml ætylacetat og anbragtes som bånd på ti silikagel-tlc-plader (forovertrukket tic-plade silikagel 60 F-254). Disse tic-plader fremkaldtes først med et opløsningsmiddelsystem af kloroform og metanol 50:1. Efter at opløsningsmidlet var afdampet i luften underkastedes tic-pladerne en anden fremkaldelse med et opløsningsmiddelsystem af kloroform og metanol 25:1. Neoviridogrisein I, II og III og viridogrisein konstateredes på tic-pladerne under ultraviolet lys (3650Å; "Blak-Ray ULV-22", Ultra-violetProducts Inc.) og blev skrabet af. Hver af neoviridogriseinkomponenterne elueredes med en lille mængde metanol og inddampedes til tørhed.

Udvundne mængder af hver af neoviridogriseinerne i ren tilstand var som følger:

Neoviridogrisein I 16,7 mg(mindre rent, olieagtigt) II 11,1 mg (hvidt pulver) III 15,2 mg (hvidt pulver)

Viridogrisein 30,0 mg (hvidt pulver)

Ca. 5 mg af hver af neoviridogriseinerne hydrolyseredes i 6N HC1 ved 110°C i 36 timer i et lukket rør og underkastedes tyndlagskromatografi, papirkromatografi, høj spændings-papirelektro-furese og auto-aminosyreanalyse. Tilstedeværelse af følgende bestanddele konstateredes i de enkelte tilfælde: 30 147129

Neoviridogrisein I 3-hydroxypicolinsyre treonin leucin prolin sarcosin β,N-dimetylleucin a-amino-n-smørsyre fenylsarcosin

Neoviridogrisein II 3-hydroxypicolinsyre treonin leucin prolin sarcosin β/N-dimetylleucin alanin fenylsarcosin

Neoviridogrisein III 3-hydroxypicolinsyre treonin leucin hydroxyprolin sarcosin β,N-dimetylleucin a-amino-n-smørsyre fenylsarcosin

Viridogrisein 3-hydroxypicolinsyre treonin leucin hydroxyprolin sarcosin β,N-dimetylleucin alanin feny1sarcosin 31 147129

Desuden bekræftedes identiteten af neoviridogrisein IV med viridogrisein yderligere ved IR-, UV-, NMR- og massespektrome-tri, tyndlagskromatografi, hydrolysatanalyse og antimikrobiel spektrometri.

Det i eksempel 5 vundne griseoviridinpræparat krystalliseredes i varm metanol og gav nåleformede krystaller. Derefter sammenlignedes en del af de nåleformede krystaller og identificeredes med et autentisk præparat af griseoviridin ved IR-, UV-, NMR- og massespektrometri, tyndlagskromatografi, elementær analyse og andre fysisk- kemiske egenskaber.

Claims (5)

147129

1. Fremgangsmåde til fremstilling af depsipeptid-antibiotiket neoviridogrisein I med formlen =¾ /CH3 cif ,ch, 0H I / \2 i li f2 f2 f2 \:.T y^· CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-N-CH-CO N | | CH-CH.,. N~CH, l 3 i 3

0 CH

1 I CO CO I I CH-NCO-CH-NH-CO-CH-N-CH, II I I 3 CH2 CH-CH3 ώ3 CH-CH3 CH3 depsipeptid-antibiotiket neoviridogrisein II med formlen cih /ch3 CH .CH, i /\2 I li T2 T2 T2 y^- CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-N-CH-CO N I I CH-CH, *?“CH3 I 1 0 ch2 CO 9°

1 I CH-NCO-CH-NH-CO-CH-N-CH3 ^\L3 ch3 CH-CH3 ch3