CH623566A5 - Process for producing the new depsipeptide antibiotics neoviridogrisein I, II, III - Google Patents

Description

La présente invention concerne un procédé pour obtenir de nouveaux antibiotiques, à savoir l'antibiotique depsipeptidique néoviridogriséine I de formule:

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l'antibiotique depsipeptidique néoviridogriséine II de formule:

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et l'antibiotique depsipeptidique néoviridogriséine III de formule:

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Les antibiotiques de ce genre présentent une forte activité contre les bactéries Gram positives et les mycoplasmes.

Les antibiotiques de la famille mikamycinevernamycine, ou streptogramine, sont classés en deux groupes majeurs. Un premier groupe majeur, le groupe A selon D. Vazquez («Antibiotics», III, pp. 521-534, «Mecanism of action of antimicrobial and antitumor agents», Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, 1975), est un composé lactonique macrocyclique qui comprend la griséo-65 viridine, l'ostréogrycine A (=mikamycine A=virginiamycine M=staphylomycine M=pristinamycine IIA=vernamycine A=streptogramine A=synergistine A-l =composé PA-I14A1 =composé E-129 facteur A, etc.), l'ostréogrycine G (=virgini-

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amycine Mil=staphylomycine MII=pristinamycine IIB=dihydrostréogrycine A=composé E-129 facteur B=composé R.P.-'3929, etc.) et les composés A-2315 A, B et C. Bien qu'il soit bactériostatique, ce groupe d'antibiotiques est actif contre des bactéries Gram positives et des mycoplasmes. La griséoviridine, qui est un des produits de fermentation du procédé selon l'invention, est connue pour être produite en même temps que la viridogriséine par des streptomycètes. Des procédés pour la production de la griséoviridine sont décrits dans les mémoires de brevet USA Nos 3023204 et 3174902. L'autre groupe majeur, le groupe B selon D. Vazquez, est un groupe de composés depsipeptidiques macrocycliques divisé en deux sous-groupes, le sous-groupe viridogriséine et le sous-groupe vernamycine B. Les antibiotiques de ce dernier groupe majeur sont efficaces surtout pour arrêter la croissance des bactéries Gram positives telles que le Staphylococcus aureus et le Bacillus subtilis. Le sous-groupe vernamycine B comporte 12 homologues. A cause des nombreux synonymes parmi les noms d'antibiotiques publiés de ce groupe majeur, il est pratiquement impossible de donner ici une liste complète de tous les noms de composés de ce sous-groupe. Des exemples de composés représentatifs et scientifiquement importants de ce groupe sont:

1. Vernamycine Ba=ostéogrycine B=pristinamycine IA=mikamycine B=streptogramine B = synergistine B-l = composé E-129 facteur Z=composé PA114B1.

2. Vernamycine By = ostréogrycine B1 =pristinamycine IC=composé E-129 facteur ZI.

3. Vernamycine Bß=ostréogrycine B2=pristinamycine IB=composé E-129 facteur Z2=composé R.P.-13919.

4. Ostréogrycine B3=composé E-129 facteur Z3.

5. PatricineA.

6. Patricine B.

7. Vernamycine Bs.

8. Vernamycine C=doricine.

9. Virginiamycine (staphylomycine) S.

10. Virginiamycine (staphylomycine) S2.

11. Virginiamycine (staphylomycine) S3.

12. Virginiamycine (staphylomycine) S4 (ou SI).

Chacun des composés de ce sous-groupe comporte sept constituants. Ces composés ont la particularité d'avoir en commun les quatre constituants acides 3-hydroxypicolinique, L-thréonine, L-proline et L-phénylglycine. Le sous-groupe viridogriséine ne comporte qu'un seul composé connu, la viridogriséine, dont l'identité avec l'étamycine, avec le composé K-179 et avec le composé F-1370A est bien établie. Faisant contraste au sous-groupe vernamycine B, la viridogriséine est composée des huit constituants suivants: acide 3-hydroxypicolinique, L-thréonine, D-leucine, 4-hydroxy-D-proline, sarcosine, p,N-diméthyl-L-leucine, L-alanine et L-phénylsarcosine. Les antibiotiques fournis par le procédé décrit appartiennent à ce sous-groupe viridogriséine et un parmi eux, la néoviridogriséine IV, a été identifié comme viridogriséine. Des procédés pour la préparation de la viridogriséine sont décrits dans le mémoire de brevet USA N° 3023204.

Le synergisme des antibiotiques des groupes A et B contre différents micro-organismes est bien connu et utilisé avec avantage pour renforcer l'action thérapeutique de médicaments contenant un antibiotique de cette famille comme composant actif. Cela est également valable pour les néo-viridogriséines.

Le terme néoviridogriséine comprend, par la suite, les antibiotiques appelés néoviridogriséines en général, c'est-à-dire non seulement les néoviridogriséines I, II, III et la viridogriséine (=néoviridogriséine IV), mais aussi un mélange quelconque de deux ou plusieurs antibiotiques de ce groupe.

La présente invention a pour objet un procédé de préparation des nouveaux antibiotiques depsipeptidiques néoviridogriséine I, II, III, caractérisé par les étapes: cultiver le Streptomyces sp. P8648 (FERM-P3562) dans des conditions anaérobies, à une température de 18 à 37° C environ, dans un milieu nourrissant aqueux contenant des sources assimilables de carbone, des sources assimilables d'azote et des sels minéraux essentiels, à pH de 6 à 9 environ, jusqu'à ce qu'une activité antibiotique appréciable soit conférée au milieu, et recueillir le produit de fermentation ou encore isoler les composés particuliers néoviridogriséine I, néoviridogriséine II, néoviridogriséine III.

La souche Streptomyces sp. P8648 a été déposée le 11 mai 1976 sous le N° P3562 auprès du Fermentation Research Institute, Agency of Industriai Science and Technology, 8-1 Inage-Jgashi 5 chôme, Chiba City, Japon, où elle est accessible au public.

La description suivante traite, à titre d'exemple, des modes de réalisation du procédé selon l'invention, partiellement en regard du dessin. Sur ce dessin:

La fig. 1 montre le spectre ultraviolet de la néoviridogriséine I (NVGI) en méthanol.

La fig. 2 montre le spectre ultraviolet de la néoviridogriséine II (NVG II) en méthanol.

La fig. 3 montre le spectre ultraviolet de la néoviridogriséine III (NVG III) en méthanol.

La fig. 4 montre le spectre ultraviolet de la néoviridogriséine IV (NVG IV, VG) en méthanol.

La fig. 5 montre le spectre ultraviolet de la néoviridogriséine I (NVG I) en méthanol/NaOH 0,1N.

La fig. 6 montre le spectre ultraviolet de la néoviridogriséine II (NVG II) en méthanol/NaOH 0,1N.

La fig. 7 montre le spectre ultraviolet de la néoviridogriséine III (NVG III) en méthanol/NaOH 0,1N.

La fig. 8 montre le spectre ultraviolet de la néoviridogriséine IV (NVG IV, VG) en méthanol/NaOH 0,1N.

La fig. 9 montre le spectre infrarouge de la néoviridogriséine I (NVG I) en disque de KBr.

La fig. 10 montre le spectre infrarouge de la néoviridogriséine II (NVG II) en disque KBr.

La fig. 11 montre le spectre infrarouge de la néoviridogriséine III (NVG III) en disque de KBr.

La fig. 12 montre le spectre infrarouge de la néoviridogriséine IV (NVG IV, VG) en disque de KBr.

Micro-organisme

Selon le procédé décrit, les antibiotiques depsipeptidiques néoviridogriséine I, II et III sont avec de la viridogriséine et de la griséoviridine, produits par une nouvelle souche de Streptomyces appelée Streptomyces sp. P8648 (FERM-P 3562). Ce micro-organisme a été isolé d'un échantillon de sol recueilli près du barrage Kuzuryu à Fukui-ken (Japon).

Ce micro-organisme présente des mycéliums aériens courts incolores qui se prolongent à partir de mycéliums de substrat, ou végétatifs, en fourche simple, bien branchus. Des chaînes de spores, qui présentent une surface lisse, forment une boucle lâche au haut des mycéliums aériens. Ni tourbillon ni ascospore n'a été observé.

Ce micro-organisme présente, sur différents milieux de gélose, les caractéristiques d'élevage suivantes:

1 ) Gélose sucrose/nitrate croissance: faible mycélium aérien: mycéliums aériens occasionnels blancs minces revers: incolore à blanc grisâtre pigment soluble: aucun

2 ) Gélose glucose/asparagine croissance: abondante mycélium aérien: peu ou pas; si formés, blancs revers: blanc pâle jaunâtre à jaune clair pigment soluble: néant

3 ) Gélose glycérine!asparagine croissance: modérée mycélium aérien: peu ou pas; si formés, blancs revers: jaune pâle à jaune grisâtre pigment soluble: néant

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4 ) Gélose extrait de levure/extrait de malte croissance: abondante mycélium aérien : blanc à blanc avec coloration grisâtre revers: jaune clair, tournant plus tard à gris brunâtre pigment soluble: néant ou, rarement, brun clair

5 ) Gélose d'amidon croissance: modérée mycélium aérien: peu ou pas; si formés, blancs revers: jaune pâle avec un léger brun grisâtre au milieu des colonies pigment soluble: néant hydrolyse d'amidon : faible

6 ) Gélose de tyrosine croissance: modérée mycélium aérien: néant ou quelques taches de mycéliums aériens blancs observés occasionnellement revers : jaune grisâtre à brun léger jaunâtre pigment soluble: au début pourpre pâle à brun léger rougeâtre tournant, dix jours plus tard, à brun pâle ; formation d'un peu de pigment mélanoïde

7 ) Gélose nourrissante croissance: bonne mycélium aérien: minces, blancs revers: jaune pâle pigment soluble: néant

8 ) Gélose de farine d'avoine croissance: bonne mycélium aérien : blanc ou blanc grisâtre revers : jaune grisâtre à brun léger rougeâtre avec coloration grisâtre pigment soluble: néant.

La température optimale pour la croissance du microorganisme décrit est comprise entre 25 et 35° C. Bien que la croissance soit très faible, ce microbe peut, cependant, se multiplier en dehors de cet intervalle de températures, par exemple à 10° C ou à 45° C, mais il ne peut plus se multiplier à la température de 52° C.

Cette actinomycète liquéfie la gélatine dans un milieu glucose/ peptone/gélatine, hydrolyse faiblement l'amidon dans une gélose amidon/sels inorganiques et peptonise le lait écrémé sans coagulation.

La production de pigment mélanoïde, observée occasionnellement en gélose de tyrosine, ne survient ni en gélose peptone/extrait de levure/fer, ni en bouillon tyrosine/extrait de levure.

Le comportement du micro-organisme décrit, en ce qui concerne l'assimilation de sources de carbone en milieu de Pridham-Gottlieb, est illustré par le schéma suivant:

positive : D-xylose, D-glucose, D-fructose, L-rhamnose, D-mannitol légèrement positive: sucrose négative: L-arabinose, i-inositol, raffinose.

En ce qui concerne la production d'antibiotiques macrolides connus peptidiques et non peptidiques, tels les mikamycines A et B, les virginiamycines, les ostréogrycines, l'étamycine, les verna-mycines, la viridogriséine, la griséoviridine et les pristinamycines, les micro-organismes suivants peuvent être comparés avec les Streptomyces sp. P8648:

Streptomyces griseus NRRL 2426 Streptomyces griseoviridus NRRL 2427 Streptomyces sp., producteur d'étamycine Streptomyces conganensis Streptomyces ostreogriseus Streptomyces mitakaensis Streptomyces loidensis

L'information disponible sur les caractéristiques physiologiques et de culture du micro-organisme décrit montre une différence nette entre ce micro-organisme et les micro-organismes comparables

énumérés ci-dessus. Par exemple, la différence entre le Streptomyces griseus NRRL 2426 et le micro-organisme décrit consiste en ceci: le premier appartient à la section des rectiflexibles qui présente des chaînes de spores droites ou légèrement ondulées, tandis que le présent micro-organisme appartient à la section des spirales ; le premier produit sur une gélose extrait de levure/extrait de malte des mycéliums aériens gris à gris jaunâtre, tandis que le second produit des mycéliums aériens blancs ou blanc grisâtre; la L-arabinose est utilisée par le premier mais pas par le second. Le Streptomyces sp., producteur d'étamycine, spécifié dans «Antibiotics Annual», 1954-1955, pp. 728-732, peut être différencié du micro-organisme décrit en ce qui concerne le comportement de l'assimilation de sources de carbone et les caractéristiques de culture sur la gélose de Czapek, la gélose glucose/asparagine et la gélose nourrissante. Le Streptomyces conganensis présente des différences frappantes en ce qui concerne les caractéristiques morphologiques des spores. Parmi les micro-organismes comparables énumérés ci-dessus, le Streptomyces griseoviridus NRRL 2427 ressemble le plus aux streptomycètes décrits. Les résultats de la comparaison taxono-mique entre ces deux cultures sont résumés dans le tableau suivant:

Streptomyces griseoviridus NRRL 2427

Streptomyces sp. P8648

Couleur du mycélium aérien

Couleur du mycélium de substrat ou végétatif

Pigment soluble

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Utilisation so des sources de carbone

Jaune pâle orangeâtre à rose jaunâtre avec coloration grise sur gélose extrait de levure/extrait de malte, gélose de farine d'avoine, gélose d'amidon et gélose glycérine/ asparagine

Jaune grisâtre à brun olivâtre ou noirâtre sur gélose extrait de levure/ extrait de malte, gélose de farine d'avoine,

gélose d'amidon et gélose glycérine/ asparagine Pas de formation de pigment mélanoïde, habituellement pas d'autre pigment, mais rarement du pigment jaune peu formé

L-arabinose 4- + + D-fructose +

Sucrose —

Blanc à blanc grisâtre et peu formé sur la plupart des milieux ISP; blanc et abondamment formé sur gélose extrait de levure/extrait de malte

Jaune pâle ou jaune clair à brun grisâtre sur la plupart des milieux ISP

Pas de pigment mélanoïde; habituellement pas de pigment, mais rarement du pigment brun légèrement formé

L-arabinose

D-fructose

Sucrose

+ + + +

Comme le tableau précédent le montre, une différence nette existe entre le Streptomyces griseoviridus NRRL 2427 et le strepto-55 mycète décrit en ce qui concerne les caractéristiques morphologiques et de culture ainsi que l'utilisation des sources de carbone. De plus, lorsque les deux sont fermentés dans des conditions identiques, le micro-organisme décrit peut produire des néoviridogriséines I, II et III aussi bien que de la viridogriséine (néoviridogriséine IV) «o et de la griséoviridine, tandis que la culture de Streptomyces griséo-viridus NRRL 2427 ne produit que de la viridogriséine et de la griséoviridine, mais pas de néoviridogriséine I, II, et III.

Comme ce qui précède le montre, le micro-organisme décrit est un Streptomyces d'une nouvelle espèce dénommé Streptomyces 65 sp. P8648. Une culture typique du micro-organisme décrit a été déposée auprès du Fermentation Research Institut, Agency of Industriai Science and Technology, sous le numéro de dépôt FERM-P 3562. Il y a lieu de préciser ici que les micro-organismes

utilisables dans les modes de réalisation du procédé selon l'invention ne se limitent pas au micro-organisme particulier spécifié ci-dessus et classé comme FERM-P 3562 auprès du Fermentation Research Institut, mais ces micro-organismes comprennent tous les mutants spontanés et artificiels dérivés de ce dernier microorganisme et qui sont capables de produire les antibiotiques néoviridogriséine I, II et III.

Production des néoviridogriséines I, II, III

Le procédé décrit pour produire les antibiotiques depsipeptidiques néoviridogriséine I, II, III, qui est un mode de réalisation du procédé selon l'invention, comporte les étapes suivantes : inoculer et laisser se propager le Streptomyces sp. P8648 dans un milieu approprié, dans des conditions aérobies à une température comprise entre 18 et 37° C, pendant 2 à 14 j, de recueillir les antibiotiques accumulés du bouillon de fermentation et de les purifier selon des procédés usuels.

Tous les milieux connus pouvant être utilisés pour les strepto-mycètes peuvent être employés pour la fermentation du microorganisme du procédé décrit. Des exemples pour des sources de carbone préférées du milieu sont: glucose, glycérine, amidon, dextrine, farine d'avoine, mélasses, graisses, huile et autres substances similaires. Des exemples de sources d'azote préférées sont la farine de soja, la farine de graines de coton, la peptone, la levure sèche, le liquide de maïs trempé, l'extrait de levure, la caséine et son hydrolysat ainsi que des sels inorganiques tels le sulfate d'ammonium et le nitrate d'ammoniaque. Des facteurs de croissance mineurs peuvent être ajoutés au milieu. Des exemples de tels facteurs sont les vitamines, les acides aminés, les sels organiques et inorganiques tels le carbonate de calcium, le chlorure de sodium, le chlorure de potassium, les phosphates sodiques, les phosphates potassiques ainsi que le sulfate de magnésium.

Pour obtenir des antibiotiques selon le procédé décrit, la fermentation peut être effectuée dans des récipients usuels tels le vase d'agitation, le récipient de fermentation et la cuve de fermentation mais, au point de vue économique, la culture submergée sous aération forcée offre un maximum d'avantages à l'échelle industrielle. La fermentation est, de préférence, effectuée dans des conditions aérobies à une température comprise entre 25 et 35°C. Lorsqu'un vase d'agitation (ou une cuve de fermentation) est employé, la production de néoviridogriséines atteint habituellement un maximum en 2 à 10 j. La valeur du pH peut changer pendant la fermentation jusqu'au-delà de la plage biologique, en fonction du genre de milieu employé. Il est avantageux que la valeur du pH soit, pendant la fermentation, maintenue entre 6 et 9. Avant l'inoculation, le pH du milieu est, de préférence, compris entre 6,5 et 8,5.

Contrôle des néoviridogriséines dans le bouillon

Comme exposé plus haut, le micro-organisme du procédé décrit produit un mélange de néoviridogriséines I, II, III, IV et de griséoviridine. Les parts des différentes néoviridogriséines dans le bouillon de fermentation peuvent être changées en utilisant une combinaison appropriée des sources de carbone et d'azote dans le milieu, sans ajouter un acide aminé libre ou un acide organique. Au point de vue d'une production à l'échelle industrielle, il est cependant préférable d'ajuster les parts de néoviridogriséines I, II et/ou III dans le bouillon de fermentation en ajoutant au milieu, pendant la fermentation, l'aminoacide constituant pertinent libre ou plusieurs de ces acides, suivant les circonstances et les besoins momentanés. Les parts des différentes néoviridogriséines dans le bouillon de fermentation peuvent être variées de manière appropriée en sélectionnant des mutants spontanés ou artificiels dérivés de la culture du strepto-mycète du procédé décrit et/ou en ajoutant au milieu des agents physiologiquement actifs tels les enzymes inhibiteurs et les enzymes promoteurs. Un procédé préféré pour une production sélective de néoviridogriséines particulières désirées comporte l'étape suivante: ajouter, durant la fermentation, l'aminoacide constituant pertinent ou plusieurs de ces acides tels que l'acide a-amino-n-

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butyrique et/ou de la proline. L'addition de proline, pendant la fermentation, augmente le pourcentage de néoviridogriséines I et II dans la quantité totale de néoviridogriséines I, II, III, IV. Les néoviridogriséines I, II ont une activité antimicrobienne plus forte que celle des néoviridogriséines II, IV. L'addition d'acide a-amino-n-butyrique au médium avant l'inoculation ou pendant la fermentation permet d'augmenter sélectivement les parts des néoviridogriséines I et III. Comme le micro-organisme du procédé décrit produit de la protéase pendant sa croissance, du matériel protéineux comportant l'aminoacide constituant pertinent, ou plusieurs de ces acides, peut être ajouté au lieu d'aminoacide libre. La caséine ou des hydrolysats correspondants provenant d'une hydrolyse acide, par exemple les casaminoacides, peuvent ainsi être substitués à la proline.

Isolation et purification

Les antibiotiques néoviridogriséines I, II, III et viridogriséine peuvent être isolés du bouillon de fermentation selon un procédé usuel basé sur les propriétés physico-chimiques des antibiotiques pepsipeptidiques. Au besoin, les néoviridogriséines peuvent être recueillies du bouillon de fermentation en même temps que la griséoviridine, sous la forme d'un mélange néoviridogriséine/ griséoviridine. Lorsque les antibiotiques décrits sont préparés sous forme d'un additif de nourriture d'animaux ou d'un médicament vétérinaire, un mélange brut de néoviridogriséines et de griséoviridine est économiquement le plus avantageux.

Les néoviridogriséines et la griséoviridine du bouillon de fermentation peuvent être extraits avec un solvant organique non miscible avec l'eau. Les exemples de tels solvants pour l'extraction simultanée des néoviridogriséines et de la griséoviridine sont l'acétate d'éthyle, l'acétate de butyle, le n-butanol, le chlorure de méthylène, le chloroforme et d'autres substances similaires. Des exemples préférés de tels solvants pour l'extraction sélective des néoviridogriséines sont la méthylisobutylcétone, le benzène, le toluène et d'autres hydrocarbures aromatiques. Du fait que le mycélium ne contient pratiquement pas de néoviridogriséines et que le lipide qui peut être extrait dans les cellules peut interférer avec des étapes de purification ultérieures, il est préférable d'extraire ces antibiotiques du bouillon filtré ou centrifugé au moyen d'un solvant organique, en même temps que l'eau de lavage.

L'extrait de solvant de néoviridogriséines et/ou de griséoviridine peut être isolé et purifié selon différents procédés. Les exemples de tels procédés sont l'adsorption et l'élution avec du carbone actif de la marque Amberlite XAD-4 et 7 de Rohm &

Haas Co. avec des résines échangeuses d'ions de la marque Amberlite IR-120 deRohm & Hass Co. et de la marque Dowex 50W-X2 de The Dow Chemical Co., le filtrage par gel avec la Sephadex LH-20 de Pharmacia Fine Chemicals AB ou avec ses équivalents, l'analyse chromatographique par adsorption sur de l'alumine et du gel de silice, etc. Ces procédés peuvent être combinés pour l'isolation et la purification de ces antibiotiques. Il est avantageux d'utiliser une distribution en contre-courant avec un système de solvants approprié.

Propriétés physico-chimiques des néoviridogriséines

Les néoviridogriséines I, II, III ainsi que la viridogriséine sont des solides blancs amorphes et solubles dans du méthanol, de l'éthanol, du n-propanol, de l'isopropanol, du n-butanol, du dioxanne, de l'acétate d'éthyle, de l'acétatebutyle, de l'acétone, de la méthyléthylcétone, de la méthylisobutylcétone, du benzène, du toluène, du chlorure de méthylène, du chloroforme, du tétrachlorure de carbone, du N-N-diméthylformamide et du diméthyl-sulfoxyde, à peine solubles dans l'eau et dans l'éther éthylique et pratiquement insolubles dans le pétrole et dans l'hexane.

Ces antibiotiques sont stables dans une solution aqueuse pendant au moins un mois à une température comprise entre 25 et 37° C et pendant 30 mn environ à 60° C à pH de 2 à 9. La déter-

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mination du point de fusion de ces antibiotiques à l'aide de l'appareil de Kofler a donné les résultats suivants:

Néoviridogriséine I : non-déterminé II : 93°C III: 115°C Viridogriséine : 140° C

Les fig. 1-8 montrent les spectres d'absorption ultraviolets des néoviridogriséines I, II, III et de la viridogriséine. Les fig. 1-4 montrent le spectre ultraviolet des néoviridogriséines I, II, III et de la viridogriséine enregistré en méthanol, et les fig. 5-8 montrent les spectres ultraviolets de ces substances enregistrés en méthanol/NhOH 0,1N. Les maximum des valeurs E J °y°m des néoviridogriséines sont les suivantes:

Dans du méthanol neutre,

Néoviridogriséine I : 305 nm (65)

II : 305 nm (88)

III: 305 nm (90)

Viridogriséine : 305 nm (90)

Dans du méthanol/NaOH 0,1N Néoviridogriséine I : 340 nm (70)

II : 340 nm (84)

III: 340 nm (90)

Viridogriséine : 340 nm (96)

Les fig. 9-13 montrent les spectres d'absorption infrarouges des néoviridogriséines I, II, III et de la viridogriséine en disque de KBr. Les sommets et les épaules caractéristiques sont observés dans les régions suivantes:

Néoviridogriséine I (disque de KBr):

3370,2910,2850,1735,1670(sh.), 1635,1590(sh.), 1515,1460 (sh.), 1445,1405,1375,1290,1280,1250 (sh.), 1200,1190,1160,1125,1100 et 1080 cm-1;

Néoviridogriséine II (disque de KBr):

3320,2950,2920,2820, 2800,1745,1670 (sh.), 1630,1600 (sh.), 1575,1515,1460 (sh.), 1445,1405,1390,1365,1330(sh.), 1295,1275, 1240,1200,1195,1160,1130,1095 et 1065 cm-1;

Néoviridogriséine III (disque KBr):

3335,2960,2940,2870,1750,1670 (sh.), 1660 (sh.), 1635,1590 (sh.), 1515,1450,1405,1390 (sh.), 1370,1340 (sh.), 1300,1245,1200, 1160 (sh.), 1130,1100 et 1065 cm"K

Les néoviridogriséines I, II, III, la viridogriséine et la griséoviridine ont, dans les systèmes de TLC, les valeurs Rf suivantes:

0°C pendant 30 mn, et par analyse d'aminoacides en utilisant l'analyseur du type Hitachi KLA-5, de Hitachi, Ltd. La présence des acides aminés suivants a été confirmée:

1) Plaque de TLC :

Solvant :

Néoviridogriséine I : II : III:

Viridogriséine : Griséoviridine :

2) Plaque de TLC : Solvant : Néoviridogriséine I :

II : III:

Viridogriséine :

Griséoviridine :

plaque préenrobée du type Silicagel

60F-254 de E. Merck, Darmstadt.

benzène/méthanol 5/1

Rf=0,66

0,62

0,59

0,55

0,20

identique à celle de 1)

chloroforme/méthanol 30/1

Rf=0,39

0,32

0,19

0,18

0,02

Néoviridogriséine I

Néoviridogriséine II :

Néoviridogriséine III:

20

35

40

thréonine leucine proline acide a-amino-n-butyrique sarcosine phénylsar cosine P,N-diméthylleucine thréonine leucine proline alanine sarcosine phénylsarcosine P,N-diméthylleucine thréonine leucine hydroxyproline acide a-amino-n-butyrique sarcosine phénylsarcosine P,N-diméthylIeucine thréonine leucine hydroxyproline alanine sarcosine phénylsarcosine

P,N-diméthylleucine

La présence d'acide 3-hydroxypycolinique a été confirmée par spectrométrie de masse et par TLC de la manière suivante:

Un échantillon authentique de viridogriséine et de chacune des néoviridogriséines I, II, III, IV a été hydrolysé une nuit en HCl 6N à 110° C pour produire des hydrolysats qui ne présentaient qu'une seule tache d'absorption UV avec la même valeur Rf, dans les conditions indiquées.

1) TLC de gel de silice

Plaque de TCL : plaque préenrobée du type Silicagel 60 F-254 de E. Merck, Darmstadt chloroforme/méthanol 2/1 0,46

Néoviridogriséine III:

Viridogriséine

Solvant : 45 Rf ;

2) TCL de cellulose Plaque de TCL :

50

Solvant Rf

Eastman Chromagram Sheet 13254 en cellulose avec indicateur fluorescent, Eastman Kodak Co.

n-buthanol/acide acétique/eau 4/1/1 0,62

Pour analyser les aminoacides constituants, chaque néoviridogriséine a été hydrolysée une nuit en HCl 6N à 110° C et l'hydrolysat obtenu a été concentré à siccité. Après avoir éliminé toute trace d'acide chlorhydrique par des évaporations répétées, les aminoacides contenus dans l'hydrolysat ont été déterminés par TLC en utilisant une feuille de chromatogramme du type Eastman 13 254 en cellulose avec indicateur fluorescent, de Eastman Kodak Co. et un système de solvants n-buthanol/acide acétique/eau 4/1/1, par électrophorèse sous haute tension en utilisant du papier du type Toyo Filter N° 51A de Toyo Roshi Kaisha, Ltd., un système tampon acide formique/acide acétique/eau 25/25/900, pH 1,8, à 60 V/cm à

Le poids moléculaire de ces antibiotiques a été déterminé par insertion directe dans un spectromètre de masse.

55

Néoviridogriséine I : 876 II : 862 III: 892

Viridogriséine : 878

60

Pour étudier la structure chimique des néoviridogriséines I, II, III, ces antibiotiques ainsi que la viridogriséine ont été hydrolyses une nuit en NaOH 0,1N à la température ambiante et ensuite méthylés avant la spectrométrie de masse avec du diazométhane, 65 selon le procédé de Compernolle et al. («Organic Mass Spectro-metry», vol. 6, pp. 151-166,1972). Sur la base des informations exposées ci-dessus, les néoviridogriséines I, H, III ont la structure suivante:

Néoviridogriséine I

OH

% ^

\

CH

I

CHj

CO - WH—CH- CO-NH- CH-CO-CK- CH,

4

i co

ÒK-W — CO-CH-NH-

I I

CHi CHt I

CH.

CH2 CH2

-N dH-

CO

h-CHi

I

CK,

ca

CQ-CH—N—CHj

Néoviridogriséine II

OH

CHj CHj

X /

CH I

CHj,

CU— H - CH - CO - fJH- CH- C 0

Ctf-CHa

I

0

1

CO

CK-CH,

I

CH-CH, !

C

/K,

CH. CH,

-N CH-Cû

Ù-CK* I

CH.

CO

Ctt-N - CO -CH -fc'H -CO-CH— N - CH3

>\ch3 CH.

Néoviridogriséine III

CH,

a

OH

I

CK

dit

CO-KH—ÇH —CO—CVH— Oi—CO-

ch-ch3

i

0

co ch-ch5 I

CH-CHj

I

CH,

OH I

/°\ CKf CHj I I -M Ctf-Cö

N-CH,

CHj

I

CO

CH-Kl -CO- Ctf-NH- CO -CH —N— CH.

Il J

O™'

CH. I

ch3

CH-CHi

CH~CHa

I

CH,

623 566

10

Les structures ci-dessus montrent que les néoviridogriséines II, III du procédé décrit sont des antibiotiques depsipeptidiques homologues à la viridogriséine. L'identité de la néoviridogriséine IV avec la viridogriséine et l'étamycine a été confirmée par spectrométrie de masse, par TLC, par spectrométrie IV et IR et par l'analyse d'acides aminés, en utilisant des échantillons authentiques de viridogriséine et d'étamycine.

Activité antimicrobienne

Les néoviridogriséines I, II, III ont un large spectre antimicrobien contre des bactéries, des mycoplasmes, des actino-

mycètes et des rickettsies, dans les tests de laboratoire. Elles déploient une activité remarquable, en particulier contre les variétés usuelles et résistantes de Staphylococcus aureus, aussi bien que contre celles de Straptococcus pyogenes, Diplococcus pneumoniae, 5 Sorcina lutea, Bacillus subtilis, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma pulmonis, Mycoplasma fermentans et Mycoplasma agalactiae.

Les concentrations inhibitrices minimales, désignées par la suite par le symbole MIC, des antibiotiques depsipeptidiques décrits ont été déterminées, aussi bien séparément qu'en combi-îo naison avec la viridogriséine et la griséoviridine, contre différents micro-organismes, au moyen de tests de dilution dont les tableaux suivants montrent les résultats.

Tableau 1 : Valeurs de la MCI des néoviridogriséines I, II, III (mcg/ml)

Micro-organisme

Milieu

NV* I

NV*II

NV* III

VG**

NV* mél.

NV

Staphilococcus aureus

209P

BHI(1)

0,2

0,1

0,2

0,2

0,2

0,1

(EM)r

BHI(1)

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

0,2

(STH)r

BHI(1)

0,8

0,8

1,6

1,6

1,6

0,8

(PC, TC, EM, LM)r 1

BHI(1)

6,25

6,25

6,25

6,25

6,25

3,2

(PC, TC, EM, LM)r 2

BHI(1)

6,25

6,25

6,25

6,25

6,25

3,2

(TC, EM, LM, CP)r

BHI(1)

6,25

6,25

6,25

6,25

6,25

3,2

(SM, STH)r

BHIa)

0,4

0,2

0,2

0,4

0,4

0,2

(PC, KM, EM)r

BHI(1)

0,8

0,4

0,4

0,8

0,8

0,4

(EM, CM, SM, PC, TC)r

BHI(1)

0,4

0,2

0,4

0,4

0,4

0,2

(EM, OM)r

BHI(1)

0,8

0,4

0,8

0,8

0,8

0,4

(TC, CP, PC)r

BHI(1)

0,2

0,2

0,4

0,4

0,4

0,2

(BX-1633) (PC)r

BHI(1)

0,4

0,2

0,4

0,4

0,4

0,2

Russell (PC)r

BHI(1)

0,2

0,2

0,4

0,4

0,4

0,2

Smith

BHI(1)

0,2

0,2

0,2

0,4

0,4

0,2

Staphylococcus sp.

(PC)r

Staphylococcus sp.

Diplococcus pneumoniae type 1 Streptococcus pyogenes Sorcina lutea

Bacillus subtilis ATCC 6633 Salmonella gallinarum Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Proteus vulgaris Candida albicans

BHI(1)

0,8

0,1

0,8

0,4

0,8

0,4

BHI(1)

0,8

0,8

0,8

0,8

0,8

0,4

BHI+HB'2»

0,2

0,4

0,2

0,4

0,4

• 0,1

BHI+HB(2)

0,4

0,2

0,4

0,4

0,4

0,1

BHIU)

0,2

0,4

0,4

0,2

0,4

0,1

BHI(1)

0,4

0,4

0,8

0,8

0,8

04

BHI(1)

>25

>25

>25

>25

>25

>25

BHI(1)

>25

>25

>25

>25

>25

>25

BHI(1)

>25

>25

>25

>25

>25

>25

BHI(1)

>25

>25

>25

>25

>25

>25

my(3)

>25

>25

>25

>25

>25

>25

* N V=néoviridogriséine la) EM = érithromycine LM = leucomycine NM = néomycine

** VG=viridogriséine STH = streptothricine

*** GV=griséoviridine PC = pénicilline TC = tétracycline SM= streptomycine KM= kanamycine

CP = chloramphénicol OM = oléandomycine

( )r=Résistant au(x) médicament(s) dans la parenthèse.

(1) BHI=Bouillon à infusion de cerveau et de cœur.

<2) BHI+HB=Bouillon à infusion de cerveau et de cœur comportant 10% de sang de cheval.

,3) MY=Milieu extrait de malte/extrait de levure.

Comme le tableau précédent des valeurs CIM le montre, la néoviridogriséine II est plus active que la néoviridogriséine IV, c'est-à-dire la viridogriséine. Ce résultat a été obtenu sur la base de deux tests de dilution. Pour différencier la néoviridogriséine II et la viridogriséine en ce qui concerne leurs activités antibiotiques, le test pour déterminer la CIM a été répété avec une dilution sensiblement plus faible. Le tableau 2 indique que la néoviridogriséine II est 2 à 3 fois plus active que la viridogriséine.

( Tableau en tète de la page suivante )

Lors du test des CIM des néoviridogriséines I, II, III en présence de la griséoviridine, un synergisme a été observé entre la néoviridogriséine et la griséoviridine comme dans le cas de la viridogriséine 60 et de la griséoviridine. C'est pourquoi le synergisme des antibiotiques décrits avec la griséoviridine a été étudié plus en détail à des proportions variées du mélange des néoviridogriséines par rapport à la griséoviridine. Le tableau 3 montre les résultats obtenus:

65 ( Tableau en page suivante j

Comme ce tableau le montre, l'activité maximale du groupe des néoviridogriséines en synergisme avec la griséoviridine se situe à

Tableau 2:

Comparaison de la néoviridpgriséine II avec la viridogriséine

11

623 566

Tableau 3:

Synergisme du mélange de néoviridogriséines avec la griséoviridine

Micro-organisme

CIM (mcg/ml) NV* II VG**

Mélange de néoviridogriséine : griséoviridine

CIM * (mcg/kl)

Staphylococcus aureus

100: 0

0,313

209 P

0,078

0,133

90: 10

0,156

(EM, CM, SM, PC, TC)r

0,125

0,334

,n 80: 20

0,125

(TC, CP, PC)r

0,094

0,334

70: 30

0,125

Bx-1633 (PC)r

0,125

0,267

60: 40

0,094

Russel (PC)r

0,125

0,267

50: 50

0,078

Smith

0,125

0,267

40: 60

0,094

15 30: 70

0,125

Milieu: Bouillon à l'infusion de cerveau et de cœur.

20: 80 10: 90 0:100

0,250 0,250 0,250

Abréviations: selon tableau 1.

la proportion de 50:50, c'est-à-dire un mélange néoviridogriséines/ 20 griséoviridine 1/1 et 3 à 4 fois plus actif que le mélange de néoviridogriséines ou la griséoviridine seule.

Le tableau 4 illustre la forte activité in vitro de la néoviridogriséine II contre différentes variétés de mycoplasmes ainsi que la supériorité du synergisme déployé par un mélange néovirido-

* Micro-organisme de test: Sartina lutea.

Test de dilution avec bouillon à l'infusion de cerveau et de cœur.

griséine II/griséoviridine en comparaison avec celui d'un mélange viridogriséine/ griséoviridine. Les CIM ont été déterminés au moyen 25 de tests de dilution.

Tableau 4

Micro-organisme

Milieu

NV II

VG

GV

NV 11+GV*

VG+GV

Mycoplasma gallisepticum KP 13

(1)

0,025

0,10

0,10

0,0063

0,025

Mycoplasma pulmonis PG 22

(2)

0,78

1,56

6,25

0,20

0,39

Mycoplasma fermentons

(2)

<0,05

<0,05

<0,05

<0,05

<0,05

Mycoplasma agalactiae PG 2

(2)

0,39

0,78

3,13

<0,05

0,39

Milieu (1): Bouillon d'enrichissement de PPLO (Eiken, Japon).

Milieu (2): Bouillon PPLO (milieu de Chanock, Difco).

* Proportion du mélange: 50/50.

NV II, VG, GV: voir tableau 1.

En résumé, les néoviridogriséines I-III décrites déploient une activité remarquable contre les bactéries Gram positives et les mycoplasmes, aussi bien seules qu'en différents mélanges avec de la viridogriséine (néoviridogriséine IV) et la griséoviridine. Il s'est avéré que les proportions mutuelles en poids des néoviridogriséines I-III, de la viridogriséine (néoviridogriséine IV) et de la griséoviridine, dans un mélange, peut varier dans de larges mesures tout en conservant l'activité antimicrobienne et antimycoplasme de ces mélanges. A titre d'exemple non limitatif, un mélange comportant, en poids: Néoviridogriséine II 27%

Néoviridogriséine IV (viridogriséine) 23% Griséoviridine 50%

a été testé in vitro contre le Streptococcus mutans, un microorganisme à l'origine des caries dentaires et des maladies péri-dontales. Le test a été effectué dans un bouillon de Todd Hewitt (Difco) avec 0,5% d'hydrolisat TC lactalbumine (Difco). Le compte initial des micro-organismes a donné 3 x 104 d'organismes par millilitre environ. Les tubes de culture ont été incubés dans des conditions anaréobies à une température de 37° C pendant 48 h. Aussi bien la CIM que la concentration bactéricide minimale ont été trouvées à une concentration de néoviridogriséine de 1,0 ppm (part par million).

Toujours à titre d'exemple non limitatif, le même mélange a été testé in vitro contre le Treponema hyodysenteriae, un microorganisme à l'origine de la dysenterie porcine. Le mélange a été testé, dilué dans de la gélose au sang à des concentrations de 100, 50,10,

5,1,0,5 et 0,1 ppm. Une fois inoculées, les plaques ont incubé pendant 4 j à une température de 42° C. La CIM était de 0,5 ppm. A titre 45 d'exemple représentatif non limitatif, un mélange comportant, en poids:

Néoviridoviséine II 25%

Néoviridogriséine IV (viridogriséine) 25% Griséoviridine 50%

50 a été testé in vitro contre plusieurs variétés de mycoplasmes. Les CIM suivantes ont été trouvées:

Espèce CIM

Mycoplasma gallisepticum KP 13 0,07

Mycoplasma pulmonis 0,20

Mycoplasma fermentons 0,05

Mycoplasma agalactiae 0,05

Ces mélanges typiques néoviridogriséines/griséoviridine sont aussi utiles dans le traitement d'animaux souffrant de maladies e» infectieuses provoquées par les bactéries pathogènes précitées.

Les mikamycines A et B étant connues pour être efficaces comme additif de nourriture, les antibiotiques décrits ont été testés en combinaison avec de la nourriture pour animaux. Un mélange de néoviridogriséines a été ajouté à une nourriture de poulets dans 65 une proportion de 2 à 20 ppm et le mélange obtenu a été administré à des poulets mâles pendant dix semaines. Comparés à un groupe de référence de poulets nourris avec la même nourriture dépourvue de néoviridogriséines, les poulets nourris à la néovirido-

623 566

12

griséine étaient supérieurs en ce qui concerne le taux de croissance du poids et le rendement de la nourriture, ce qui prouve que les néoviridogriséines décrites sont très utiles comme additif de nourriture.

Une composition comportant une ou plusieurs des néoviridogriséines I-III mélangées ou non à de la viridogriséine (néoviridogriséine IV) et de la griséoviridine, et dans laquelle les proportions mutuelles en poids des composants peuvent varier dans de très larges mesures, s'est montrée très utile comme additif de nourriture. A titre d'exemple représentatif non limitatif, un mélange comportant, en poids:

Néoviridogriséine II 27%

Néoviridogriséine IV (viridogriséine) 23% Griséoviridine 50%

a été testé in vivo en l'ajoutant à la nourriture de poulets en période de croissance. Quinze poussins de 1 j ont été utilisés pour un test au cours duquel ils ont été soumis à un régime comportant, pendant

11 j, 55% de grains de seigle complétés par des vitamines, des minéraux, de la graisse et des sources de protéines. La teneur élevée en grains de seigle ne provoque habituellement qu'une croissance faible ou modérée. Ce régime standard est couramment utilisé pour tester des agents promoteurs de croissance et des additifs antibiotiques de nourriture. De la pénicilline a été utilisée comme additif de référence, dans une proportion de 100 ppm.

Le procédé décrit permet, en résumé, d'obtenir les antibiotiques depsipeptidiques néoviridéogriséines I, II, III et viridéogriséine qui sont actifs contre les bactéries Gram positives et contre les mycoplasmes et qui peuvent être utilisés dilués, comme concentrats bruts ou sous forme pure, avec ou sans griséoviridine. Le procédé permet, de plus, d'obtenir ces antibiotiques depsipeptidiques par une fermentation simple d'un milieu aqueux dans des conditions aérobies au moyen du Streptomyces sp. P8648 (FERM-P 3562) et de recueillir les néoviridogriséines formées du bouillon de fermentation avec de la griséoviridine ou sans elle. Ce procédé a, d'ailleurs, l'avantage de permettre la production sélective des néoviridogriséines désirées en utilisant, pendant ou avant la fermentation, des aminoacides pertinents, par exemple de la proline pour augmenter la production des néoviridogriséines I et II et de l'acide a-amino-n-butyrique pour augmenter la production des néoviridogriséines I et III. Les antibiotiques obtenus selon le procédé décrit peuvent être utilisés en médecine humaine et vétérinaire, en particulier pour le traitement de maladies infectieuses provoquées par le Staphylococcus aureus, le Streptococcus pyogenes, le Diplicoccus pneumoniae, le Mycoplasma gallisepticum, le Mycoplasma fermentans, le Mycoplasma agalactiae, etc.

Exemple 1

50 ml d'un milieu de culture de germes comportant 0,5% de farine de soja, 0,5% de Pharmamedia de Traders Oil Mill Co., 0,5% de farine d'avoine, 0,5% de levure sèche et 0,5% de mélasse de betterave ont été ajustés à pH 6,5 et distribués dans un Erlen-meyer de 250 ml. Après traitement dans un autoclave à 120° C pendant 15 mn, une petite quantité de Streptomyces sp. P8648, cultivée sur un plan de gélose, a été inoculée dans l'Erlenmeyer qui a incubé sur un agitateur rotatif pendant 48 h à 28° C. 2 ml de la culture de germes ainsi obtenue ont été transférés dans un Erlenmeyer contenant 100 ml d'un milieu de fermentation qui comportait 0,5% de farine de soja, 0,5% de farine de cacahuètes, 0,5% de farine d'avoine, 0,5% de levure sèche et 0,5% de mélasse de betterave, et cultivés à 28° C pendant 96 h sur un agitateur rotatif à 200 t/mn sur un cercle d'un rayon de 3,5 cm. Le filtrage du bouillon de culture recueilli de

12 Erlenmeyers a donné un filtrat de bouillon clair. Le résidu, ou gâteau, obtenu sur le filtre a été lavé avec 100 ml d'eau. L'eau de lavage et le filtrat de bouillon ont été combinés. L'activité antibiotique de la solution aqueuse à pH 8,3 ainsi obtenue s'est révélée être de 23,0 mm sur une plaque d'essai de gélose nourrissante,

en exécutant le test du disque avec un disque en papier de 8 mm. 800 ml de cette solution aqueuse ont été extraits à deux reprises en utilisant chaque fois 200 ml de n-butanol, les extraits de butanol ont été combinés et concentrés à siccité sous une pression réduite pour produire 90 g de poudre brute de néoviridogriséines et de griséoviridine. Cette poudre brute a été mélangée à une petite quantité de gel de silice et appliquée sur une colonne de gel de silice de 1,5 x 23 cm de la marque déposée Vako-Gel C-100 de Vako Pure Chemical Industries, Ltd. La colonne de gel de silice a été éluée d'abord avec 300 ml d'un mélange benzène/acétone 5/1 et ensuite avec un mélange benzène/acétone 2/1. Des fractions de 10 g ont été recueillies sur un collecteur automatique de fractions. Les fractions actives numérotées de 25 à 35 ont été combinées et concentrées à siccité pour fournir, ou produire, 30 g d'un mélange de néoviridogriséines I, II, m et de viridogriséine. La concentration à siccité ces fractions actives numérotées de 45 à 55 a produit une poudre brute dont l'activité antibiotique correspondait à celle de la griséoviridine, déterminée par Chromatographie à couche mince, désignée dans la suite par le symbole TLC. Ces deux préparations ont été analysées par TLC. L'activité antimicrobienne a été déterminée en utilisant une plaque de gélose nourrissante de Sorcina lutea.

Plaque de TLC: plaque préenrobée du type Silicagel 60 F-254, de E. Merck, Darmstadt.

1) Solvant: chloroforme/méthanol 1/1

Néoviridogriséines Rf: 0,45

Griséoviridine: 0,05

2) Solvant: benzène/acétone 1/1

Néoviridogriséines Rf: 0,55

Griséoviridine: 0,13

Exemple 2

200 ml de la culture de Streptomyces sp. P8648 dans un milieu de culture identique à celui de l'exemple 1 ont été inoculés dans un récipient de fermentation en acier inoxydable contenant 101 du milieu de culture de germes de l'exemple 1 et cultivés à 27-28° C en agitant pendant 96 h, sous une aération forcée de 5 1/mn d'air stérile. L'agitation a eu lieu à une vitesse de rotation de 200 t/mn au moyen d'une hélice dont le rayon était égal au quart de celui du récipient de fermentation. Après celle-ci, les mycéliums et les solides ont été éliminés par filtrage. Le filtrat obtenu a été ajusté à pH 6,0 et extrait quatre fois en utilisant chaque fois 21 d'acétate d'éthyle. Les extraits d'acétate d'éthyle ont été combinés, séchés sur du sulfate de sodium anhydre et concentrés à siccité sous pression réduite, pour produire 700 mg de poudre brute de néoviridogriséines et de griséoviridine. Cette poudre a été dissoute dans une petite quantité de méthanol et chargée sur une colonne du type Sephadex LH-20 de 3 x 50 cm. Des fractions de 10 ml ont été recueillies avec du méthanol comme éluant. Des néoviridogriséines ont été trouvées dans les fractions numérotées de 22 à 29 qui ont été recueillies, concentrées à siccité et purifiées par Chromatographie à colonne de gel de silice de 1,5 x 20 cm du type Silicar CC-7 de Mallinckrodt Chemical Works. L'élution a été exécutée en utilisant un mélange chloroforme/méthanol 30/1. Les huit fractions de 5 g numérotées de 5 à 12 ont été combinées et concentrées à siccité sous pression réduite, pour produire 25 mg de poudre blanche de néoviridogriséines qui comprenaient 15% de néoviridogriséine 1,20% de néoviridogriséine II, 20% de néoviridogriséine III et 45% de viridogriséine. De la griséoviridine a été trouvée par TLC dans les fractions numérotées de 30 à 34 de la colonne Sephadex LH-20. Ces fractions actives ont été combinées, concentrées à siccité sous pression réduite et cristallisées dans du méthanol chaud pour produire 30 g de cristaux acidulaires, dont l'identité a été prouvée par TLC ainsi que par d'autres procédés de détermination physico-chimique.

Exemple 3

La même fermentation que celle de l'exemple 1 a été effectuée pendant 96 h, sauf que le milieu de fermentation comportait 0,5% de farine de soja, 0,5% de pharmamédia, 0,5% de farine d'avoine, 0,5% de levure sèche, 0,5% de mélasse de betterave et 0,1 % d'acide DL-a-amino-n-butyrique à pH 6,5. Le bouillon de fermentation a été recueilli de 13 Erlenmeyers et filtré. Le liquide filtré a été extrait deux

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

13

623 566

fois en utilisant chaque fois 300 ml de n-butanol. L'élimination du n-butanol des extraits a fourni environ 70 mg de poudre brute de néoviridogriséines et de griséoviridine. Cette poudre brute a été analysée par TLC de gel de silice suivi d'une graphie avec de la Sorcina lutea comme organisme de test. La plaque TLC employée lors de cet essai était une plaque préenrobée du type Silicagel 60 F-254, de E. Merck, Darmstadt. Les valeurs Rf et les systèmes de solvants étaient les suivants:

Chloroforme/méthanol

20/1

30/1

40/1

Néoviridogriséine I

Rf= 0,60

0,39

0,20

II

0,56

0,32

0,16

III

0,50

0,19

0,13

Viridogriséine

0,43

0,18

0,10

Griséoviridine

0,05

0,02

0,00

Exemple 4

50 ml d'un milieu de culture de germes comportant 0,3% d'extrait de bœuf, 0,5% de tryptone de Difco Laboratories, 0,1% de glucose, 2,4% d'amidon soluble, 0,5% d'extrait de levure, 0,4% de carbonate calcique et 0,5% de farine de soja à pH 7,0 ont été distribués dans un Erlenmeyer de 250 ml et traités à l'autoclave à 120° C pendant 15 mn. Des spores de Streptomyces sp. P8648 élevées sur un plan de gélose ont été introduites dans l'Erlenmeyer et cultivées à 25° C pendant 3 j, pour produire la culture de germes. Le milieu de fermentation comportait 0,5% d'amidon soluble, 2,0% de glucose, 1,0% de pharmamédia, 0,5% de farine d'avoine, 0,5% de liquide de maïs trempé, 0,05% de phosphate bipotassique, 0,05% de sulfate de magnésium (pH 6,5). 50 ml de ce milieu de fermentation ont été placés dans un vase conique de 250 ml et traités à l'autoclave à 120° C pendant 15 mn. La part de l'inoculum était de 2% du volume. Des germes de la culture ci-dessus ont été inoculés dans le vase de fermentation qui a incubé dans un agitateur rotatif à 25° C. 24 ou 48 h après l'inoculation, une solution stérilisée de casamino-acide de Difco Laboratories ou de la proline (pH 7,0) a été ajoutée jusqu'à une concentration finale de 0,4% et la fermentation a été poursuivie. Quatre jours après l'inoculation, le bouillon de fermentation a été filtré et le filtrat de bouillon a été extrait à deux reprises en utilisant chaque fois un volume égal d'acétate d'éthyle. Les extraits d'acétate d'éthyle ont été combinés et concentrés à siccité sous une pression réduite, pour produire une poudre sèche. Cette poudre brute a été dissoute dans de l'acétate d'éthyle et une aliquote de la solution a été répartie sur une plaque TLC de gel de silice, sous forme de taches de grandeur déterminée. La plaque de TLC a été développée dans un système de solvants de chloroforme et de méthanol (50/1) et le solvant a été évaporé dans l'atmosphère. La plaque de TLC a été alors de nouveau développée dans le même système de solvants de chloroforme et de méthanol (50/1). Chaque composante de néoviridogriséine a été localisée sous une lumière ultraviolette (3650 Â), grattée de la surface de la plaque de TLC et suspendue dans un volume connu de méthanol. Après avoir éliminé le gel de silice par décantation, la quantité d'antibiotiques contenue dans les extraits a été déterminée lors d'essais par irradiations aux rayons UV, sachant qu'à 305 nm la valeur de s était de 8000. Les essais aux rayons UV ont donné les résultats suivants:

Aminoacide ajouté

aucun casaminoacide proline

Néoviridogriséine I

2%

2%

2%

Néoviridogriséine II

9%

40%

60%

Néoviridogriséine III

4%

3%

3%

Viridogriséine

85%

55%

35%

Exemple 5

Environ 101 de la culture de germes âgée de 23 h ont été préparés dans un récipient de fermentation, dans des conditions identiques à celles de l'exemple 2. Le milieu de fermentation (6001), qui comprenait 0,5% de farine de soja, 0,5% de pharmamédia, 0,5% de farine d'avoine, 0,5% de levure sèche, 0,5% de mélasse de betterave et 0,1 % d'acide DL-a-amino-n-butyrique, a été stérilisé à la vapeur à 120°C pendant 15 mn dans une cuve de fermentation en acier de 14001, et refroidi à 28 °C. Les 101 de culture de germes ont été ajoutés au milieu de cette cuve et le tout a été cultivé à une température de 28° C pendant 75 h avec une aération forcée en agitant avec une vitesse de rotation de 180 t/mn au moyen d'une double hélice dont le rayon correspondait à un quart du diamètre de la cuve de fermentation. Un débit de 3001/mn d'air stérile circulait à partir d'un dis-perseur du fond de la cuve. Après la fermentation, le bouillon a été filtré par un filtre-presse. Le filtrat de bouillon a été extrait à deux reprises en utilisant chaque fois 1501 de n-butanol. Les extraits de n-butanol ont été combinés, lavés avec un petit volume de solution saturée de NaCl, et concentrés à 21 dans un évaporateur rotatif. A cette étape, 20 g de gel de silice de la marque Wakogel G-100 de Wako Pure Chemical Industries, Ltd., ont été ajoutés et la concentration dans l'évaporateur rotatif a été continuée jusqu'à siccité complète. Le mélange antibiotiques/gel de silice ainsi obtenu a été suspendu dans une petite quantité de chloroforme et chargé au haut d'une colonne de gel de silice du type Wakogel C-100 de 6,5 x 75 cm. L'élution pour déterminer les activités antibiotiques a été effectuée par étapes, d'abord en utilisant 7 1 de chloroforme, ensuite avec 101 d'un mélange chloroforme/méthanol (50/1) et finalement avec du méthanol. Les fractions de 300 g numérotées de 16 à 29 qui présentaient une bioactivité contre la Sorcina lutea (néoviridogriséine) ont été recueillies et concentrées à siccité sous une pression réduite, pour produire une poudre blanche de néoviridogriséines. Cette poudre a été dissoute dans un petit volume de méthanol et passée à travers une colonne Sephadex LH-20 de 7,0 x 45 cm, chacune des fractions de 100 g étant éluée avec du méthanol. Après l'élimination du solvant par évaporation, environ 15 g de poudre brute d'un mélange de néoviridogriséines ont été recueillis des fractions numérotées de 6 à 15. Des fractions numérotées de 50 à 60 de cette colonne de gel de silice contenaient de la griséoviridine. Une purification avec la colonne Sephadex LH-20 de 7,0 x 45 cm, qui a été utilisée pour le mélange de néoviridogriséine, a produit 4 g de griséoviridine brute.

Exemple 6

Pour la purification finale, la TLC a été utilisée, avec une plaque de TLC de gel de silice. 1 g du mélange brut de néoviridogriséines de l'exemple 5 a été dissous dans 2 ml d'acétate d'éthyle et chargé en forme de bandes sur des plaques de TLC de gel de silice du type Silicagel 60 F-254. Ces plaques de TLC ont été d'abord développées avec un système de solvants chloroforme/méthanol (50/1). Ensuite, le solvant a été évaporé dans l'atmosphère et les plaques de TLC ont été à nouveau développées avec un système de solvants chloroforme/méthanol (25/1). Des néoviridogriséines I, II, III et de la viridogriséine ont été trouvées sur les plaques de TLC sous la lumière ultraviolette à 3650 Â, à l'aide de l'instrument du type Blak-Ray UVL-22 de Ultra-Violet Products, Inc., et raclées de l'élution. Chaque composant de néoviridogriséine a été élué avec une petite quantité de méthanol et concentré à siccité, pour produire les quantités suivantes de composantes de néoviridogriséines pures:

Néoviridogriséine I : 16,7 mg, moins pure, huileuse Néoviridogriséine II : 11,1 mg, sous la forme d'une poudre blanche Néoviridogriséine III : 15,2 mg, sous la forme d'une poudre blanche Viridogriséine 30,0 mg sous la forme d'une poudre blanche.

Environ 5 mg de chacune de ces néoviridogriséines ont été hydrolysés dans de l'HCl 6N à une température de 110°C pendant 36 h dans un tube scellé et analysés par TLC, par Chromatographie sur papier, par électrophorèse sous haute tension ainsi que par une

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

623 566

14

analyse des acides aminés. Ces néoviridogriséines comportaient les composés suivants:

Néoviridogriséine I : acide 3-hydroxypicolinique, thréonine, leucine, proline, sarcosine, P-N-diméthylleucine, acide a-amino-n-buty-rique, phénylsarcosine.

Néoviridogriséine II: acide 3-hydroxypicolinique, thréonine, leucine, proline, sarcosine, p,N-diméthylleucine, alanine, phénylsarcosine.

Néoviridogriséine III: acide 3-hydroxypicolinique, thréonine, leucine, hydroxyproline, sarcosine, p,N-diméthylleucine,

acide a-amino-n-butyrique, phénylsarcosine.

Viridogriséine: acide 3-hydroxypicolinique, thréonine, leucine,

hydroxyproline, sarcosine, P,N-diméthylleucine, alanine, phénylsarcosine.

De plus, l'identité de la néoviridogriséine IV avec la viridogriséine a été confirmée par irradiations aux IR, aux UV, par s résonance paramagnétique, par spectrométrie de masse, par TLC, par analyse d'hydrolysats et par spectrométrie antimicrobienne. La préparation de griséoviridine obtenue dans l'exemple 5a, par ailleurs, été cristallisée dans du méthanol chaud, pour fournir des cristaux acidulaires. Une partie de ces cristaux a été ensuite com-io parée avec une préparation authentique de griséoviridine et identifiée avec celle-ci par irradiations aux IR, aux UV, par RNM, par spectrométrie de masse, par TLC, par analyse élémentaire et par d'autres procédés physico-chimiques.

R

12 feuilles dessins

Claims (5)

623 566

1 1

CHt j (ni)

CO )

N -CO — CH— NH— CO— CH N — CH,

CH* CH* CH— CH*

I I

CHj ÇH— CR,

CH3

1. Procédé pour obtenir l'antibiotique depsipeptidique néoviridogriséine I de formule:

GH* ^CH3

X CH / CH*

OH î X \

aCHe CHZ CHz

I II

CO- NH- CH - CO - NH — CH— CO — N CH — CO

cIh n-ch5

I

CH,

I (i)

CO

n — co — ch—nh — co — ch— n - ch.

i i i

CHj CH, CH—CH,

CH, V" CH3

l'antibiotique depsipeptidique néoviridogriséine II de formule:

CHj

CHi .CH,

X

ch chi

OC v i"- i"-

n co—nh — ch — co — nh — ch — co— n ch-co

I

n-ch3

I

chx

I (ii)

CO I

co — ch — nh — co — ch — n — ch.

I I

ch, ch—ch»

i ch ch»

ch;

et l'antibiotique depsipeptidique néoviridogriséine III de formule: (Formule en tête de la page suivante)

comportant les étapes suivantes: cultiver le Streptomyces sp. P8648 (FERM-P3562) dans des conditions aérobies, à une température de 18 à 37°C, dans un milieu nourrissant aqueux contenant des sources assimilables de carbone, des sources assimilables d'azote et des sels minéraux essentiels, à pH de 6 à 9 jusqu'à ce qu'une activité antibiotique appréciable soit conférée au milieu, et recueillir le produit de fermentation, ou encore isoler les composés particuliers néoviridogriséine I, néoviridogriséine II, néoviridogriséine III.

65 2. Procédé selon la revendication 1, comportant les étapes suivantes: produire, en plus de la néoviridogriséine I, de la néoviridogriséine II et de la néoviridogriséine III, de la viridogriséine et de la griséoviridine.

2

REVENDICATIONS

3. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la fermentation séine I, de la néoviridogriséine II, de la néoviridogriséine III ou un est mise à exécution en présence d'acide a-amino-n-butyrique mélange de ces substances.

et/ou de sources naturelles comportant de l'acide a-amino-n- 30 6. Utilisation selon la revendication 5, dans laquelle l'ingrédient butyrique. actif est la néoviridogriséine II.

3

623 566

OH

CH5 y»- CH, I

CH 1

CH ^ \

CH, CH* CH2

i ' '

NH-CH — CO— NH — CH —CO — N CH — CO

CH-CH. N —CHj

4. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la fermentation 7. Utilisation selon la revendication 5, dans laquelle la néo-est mise à exécution en présence de proline et/ou d'une source viridogriséine est mélangée à de la viridogriséine et de la griséo-naturelle comportant de la proline. viridine.

5. Utilisation, comme complément fourrager, d'une compo- 35 8. Utilisation selon la revendication 7, dans laquelle la néo-sition comportant comme ingrédient actif de la néoviridogri- viridogriséine est la néoviridogriséine II.