CH633964A5

CH633964A5 - Verfahren zur herstellung von pepsin-inhibitoren.

Info

Publication number: CH633964A5
Application number: CH1161976A
Authority: CH
Inventors: Shinichi Kojima; Kazuro Nakamura; Ten Koide; Shigeo Ogino
Original assignee: Sumitomo Chemical Co
Priority date: 1975-09-12
Filing date: 1976-09-13
Publication date: 1983-01-14
Also published as: CA1066212A; DE2660964C2; GB1519101A; DE2640420C2; US4091093A; FR2323394B1; SE436137B; NL7610032A; DE2640420A1; CA1159000B; SE7609960L; FR2323394A1; AU1754876A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Pepsin-Inhibitoren, die im nachstehenden auch als Procidine bezeichnet werden, unter Verwendung eines neuen Mikroorganismus, und auf die nach dem Verfahren erhaltenen Pepsin-Inhibitoren, die als aktive Komponente in pharmazeutischen Mitteln gegen Magen-und Zwölffingerdarmgeschwüre geeignet sind.

Als nächstliegender Stand der Technik sind die Artikel «Pepstatin, a New Pepsin Inhibitor Produced by Actinomy-ces» von H. Umezawa in J. Antibiotics, 23, S. 259-262 (1970) und die JP-AS 47-8996 zu nennen. In beiden Vorveröffentlichungen sind jedoch Mikroorganismen beschrieben, die mit dem im erfindungsgemässen Verfahren zum Einsatz gelangenden Mikroorganismus nicht übereinstimmen.

Im Rahmen der Erfindung sind ausgedehnte Untersuchungen über von Mikroorganismen gebildete Produkte auf der Suche nach neuen Pepsin-Inhibitoren durchgeführt worden; dabei ist festgestellt worden, dass ein neuer Stamm eines Mikroorganismus in seinem Züchtungs-Produkt eine Substanz bildet und ansammelt, die fähig ist, die Aktivitäten von Pepsin und verschiedenen sauren Proteasen stark zu inhibieren. Als Ergebnis der verschiedenen Untersuchungen konnten im Rahmen der Erfindung die dabei gebildeten Pepsin-Inhibitoren erfolgreich isoliert und in Form von Kristallen gewonnen werden.

Bei dem im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten Mikroorganismus handelt es sich um einen neuen Stamm, der aus einer Bodenprobe aus Fukuzaki-cho, Hyogo prefecture, Japan, isoliert wurde und der ursprünglich als Streptomyces procidinanus bezeichnet worden ist. Der Mikroorganismus ist beim «Fermentation Research Institute», Abt. für industrielle Forschung und Technologie, Chi-ba, Japan, hinterlegt worden und hat die Hinterlegungs-Nr. Ferm-P No. 3156 erhalten. Der Stamm ist weiterhin am 29. Juli 1976 in der «American Type Culture Collection», 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA, hinterlegt worden und hat die Nr. ATTC 31233 erhalten.

Nachfolgend werden die bakteriologischen Eigenschaften dieses Mikroorganismus im einzelnen beschrieben, der im nachstehenden als «Stamm SC-4708» bezeichnet wird. Bei der Beschreibung der Farben wird auf den «color Standard» des «Japan Color Institute» Bezug genommen.

Bakteriologische Eigenschaften des Stammes SC-4708

I. Charakteristische morphologische Eigenschaften: Unter dem Mikroskop wurden eine Reihe von leicht gewellten

15 Luftmyzeln festgestellt, die aus gut verzweigten Substrat-myzeln wuchsen. Keine Bildung von Spiralen und Wirtein. Die ausgereifte Sporenkette besitzt 10 oder mehr Sporen mit einer Grösse von 1,4 bis 1,8 auf 0,8 bis 1,0 um, mit glatter Oberfläche.

20 II. Wuchs auf verschiedenen Kulturmedien:

1) auf Sucrosenitratagar (gezüchtet bei 27 °C):

der Wuchs ist schlecht, farblos; kein Luftmyzel; kein lösliches Pigment.

2) auf Glycerolasparaginagar (gezüchtet bei 27 °C):

25 der Wuchs ist blassgelblich; ein leuchtend graues Luftmyzel; ein lösliches Pigment, leicht blassgelb;

3) auf Glucoseasparaginagar (gezüchtet bei 27 °C): der Wuchs ist schlecht, blassgelb; kärgliches Luftmyzel, weiss; lösliches Pigment, leicht blassgelb;

30 4) auf Glucose-Czapeck-Agar (gezüchtet bei 27 °C): Wuchs, blassrötlichgelb; kein Luftmyzel; Pigment, leicht rötlichgelb;

5) auf Stärkeagar (gezüchtet bei 27 °C):

Wuchs, blassgelb; Luftmyzel, weiss; lösliches Pigment, leicht

35 blassgelb;

6) auf Nährmittelagar (gezüchtet bei 27 °C):

sehr schlechter Wuchs, farblos; kein Luftmyzel; kein lösliches Pigment;

7) auf Peptonglucoseagar (gezüchtet bei 27 °C):

40 Wuchs, mattrötlichgelb; Luftmyzel, kärglich und weiss; lösliches Pigment, leicht mattrötlichgelb;

8) auf Malzextraktagar (gezüchtet bei 27 °C):

Wuchs, gräulichgelb; Luftmyzel, weiss; lösliches Pigment, leicht gräulichgelb;

45 9) auf Tyrosinagar (gezüchtet bei 27 °C):

Wuchs, blassgelb; Luftmyzel, sehr leicht weiss; kein lösliches Pigment; Tyrosinasereaktion negativ;

10) auf Calciummalatagar (gezüchtet bei 27 °C):

Wuchs schlecht; kein Luftmyzel; kein lösliches Pigment; am so Umfang der Wuchsstelle wurde Calciummalat nicht gelöst;

11) auf Kartoffelscheibe gezüchtet bei 27 °C):

kein Wuchs nach 21 Tagen;

12) auf Rübenscheibe (gezüchtet bei 27 °C):

kein Wuchs nach 21 Tagen;

55 13) auf Pferdeserum (gezüchtet bei 30 °C):

kein Wuchs nach 21 Tagen;

14) auf Cellulose (gezüchtet bei 27 °C):

kein Wuchs nach 21 Tagen;

15) auf Hefemalzagar (gezüchtet bei 27 °C):

60 reichlicher Wuchs, gelblichrosa bis blassrosa; Luftmyzel, leuchtendgrau, kein lösliches Pigment;

16) auf Hafermehlagar (gezüchtet bei 27 °C):

kein Wuchs nach 21 Tagen;

17) auf Ei (gezüchtet bei 27 °C):

65 kein Wuchs nach 21 Tagen;

18) auf Milch (gezüchtet bei 37 °C):

kein Wuchs nach 21 Tagen;

19) auf Gelatine (gezüchtet bei 20 °C):

3

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Wuchs, farblos bis blassgelb; Luftmyzel, weiss; kein lösliches Pigment; keine wesentliche Gelatineverflüssigung;

20) auf Peptonwasser (gezüchtet bei 27 °C):

kein Wuchs nach 21 Tagen.

III. Charakteristische physiologische Eigenschaften:

1) Temperaturbereiche für das Wachstum:

Die Ergebnisse von Versuchen bei 20,24,27, 30 und 37 °C unter Verwendung von Glucoseasparaginagar als Kulturmedium zeigen, dass Wachstum bei jeder Temperatur, ausgenommen 37 °C, gegeben ist; optimale Wachstumstemperaturen scheinen zwischen 27 und 30 °C zu liegen.

2) Verwertung von Kohlenstoffquellen (gezüchtet auf Pridham-Gottrieb-agar bei 27 °C):

Gutes Wachstum mit Verwertung von Glucose und Galaktose. Xylose, Arabinose, Rhamnose, Fructose, Saccharose, Maltose, Lactose, Raffinose, Inulin, Mannit, Sorbit, Dulcit, Inosit und Salicin wurden nicht verwertet.

Die oben aufgeführten charakteristischen Eigenschaften können dahingehend zusammengefasst werden: Das Luftmyzel des Stammes SC-4708 bildet weder Wirtel noch Spiralen; die Sporen weisen eine glatte Oberfläche auf; eine spezifische Eigenschaft des Stammes ist sein schlechtes Wachstum mit Ausnahme von Hefemalzagar; das Wachstum ist insbesondere bei 37 °C ausserordentlich schlecht; trotz seines schlechten Wachstums weist der Stamm ausgeprägte Aktivität zur Hydrolyse von Stärke auf; der Stamm gehört zum nichtchromogenen Typ von Mikroorganismen; der Wuchs ist farblos, blassgelb oder blassbraun; das Luftmyzel ist weiss oder stark grau und wird leicht gebildet; lösliches Pigment wurde nicht in wesentlichem Umfang festgestellt; bei den nachfolgenden Reaktionen, nämlich der Gelatineverflüssigung, der Koagulation und Peptonbildung von entfetteter Milch, der Auflösung von Calciummalat und der Reduktion von Nitrat ist der Stamm stets negativ. Vergleicht man diese Eigenschaften mit denjenigen bekannter Mikroorganismen, welche diese Eigenschaften aufweisen, dann wird kein ähnlicher Stamm gefunden. Als ein Stamm mit relativ ähnlichen Eigenschaften wird Streptomyces omiyaensis gefunden. Nachfolgend werden die Eigenschaften des Stammes SC-4708 mit der Beschreibung des Stammes Streptomyces omiyaensis in der Literatur 1 Bergey's «Manual of Determinative Bacteriology», 8. Auflage, S. 762 (1974) und 2 Waksman «The Actinomycetes», Bd. 2, S. 254, verglichen; die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle aufgeführt:

SC-4708

Streptomyces omiyaensis

SC-4708

Streptomyces omiyaensis

Wirtebildung Spiralbildung Sporenoberfläche Farbe des Luftmyzels

Farbe des Wuchses glatt weiss bis stark-grau farblos bis blass-gelb glatt grau weiss bis blass-gelb

15

20

25

30

35

40

50

Melaninpigment Hydrolyse von Stärke Proteolyse

Gelatineverflüssigung Verwertung von Kohlenstoffquellen D-Glucose D-Galaktose D-Xylose L-Rhamnose D-Fructose Stoffwechselprodukte

+

+ +

+ + +

+ + + + +

Precidine Chloramphenicol

Wie aus obiger Tabelle ohne weiteres zu ersehen ist, erinnert der Stamm SC-4708 an Streptomyces omiyaensis, unterscheidet sich davon jedoch in den proteolytischen Eigenschaften und bei der Verwertung von Kohlenstoffquellen und weiterhin darin, dass er Chloramphenicol nicht bildet. Demzufolge ist der Schluss zutreffend, dass der Stamm 4708 einen neuen Stamm darstellt, dem ursprünglich der Name Streptomyces procidinanus gegeben wird.

Actinomycetes unterliegen gewöhnlich der künstlichen oder natürlichen Mutation. Demzufolge umfasst der ursprünglich als Streptomyces procidinanus benannte Stamm auch alle davon ausgehenden Mutanten.

Der wie vorstehend angegebene unter der Nr. ATCC 31233 hinterlegte, als «Stamm SC-4708» bezeichnete Mikroorganismus wurde aufgrund bakteriologischer Untersuchungen nach Bergeys «Manual of Determinative Bacteriology», 8. Auflage ursprünglich als Streptomyces procidinanus benannt. Aufgrund einer bezweifelnden Anfrage von ATCC wurden jedoch erneut chemische Tests mit dem Zell- und Substrat-Myzel ausgeführt, wobei sich herausstellte, dass der Mikroorganismus nicht zur Gattung Streptomyces, sondern eindeutig als «Actinomadura sp.» zu bezeichnen ist.

Der Diamin-pimelinsäure-(DPA)-Test, der eine der Methoden zur Abtrennung von Streptomyces von anderen Mikroorganismen darstellt, zeigt, dass die Zelle DPA nicht in LL-, sondern meso-Konfiguration enthält. Das Vorhandensein von Menachinon K-9 im Menachinontest sowie das Ausbleiben einer Fragmentierung des Substrat-Myzels in Bennetts-Agar bestätigen, dass der untersuchte Stamm weder Nocardiopsis noch Nocardia ist. Das Zuckermuster der Zellwand ist vom Typ III.

Gegenstand der Erfindung ist somit das im Patentanspruch 1 definierte Verfahren zur Herstellung von Pepsin-In-hibitoren.

Im einzelnen werden von dem beschriebenen Stamm SC-4708 Pepsin-Inhibitoren erzeugt und angesammelt, welche für die Unterbindung von Magengeschwüren und Zwölffin-gerdarmgeschwüren geeignet sind; die Strukturformel dieser Pepsin-Inhibitoren sind beispielsweise nachfolgend aufgeführt:

Stamm S-735

CH, CH, CH, CH,

3 n?/ 3

CH, CH, CH, CH, CH, CH, CH CH

3 n?/ 3 n3/ 3 i , i

CH CH CH CHJOH CH, CH„OH

I I I MI I 3 M|

OHgCOHH-CH-CONH-CH-COigH-OH-CH-CEg-COliSH«- Cil C0ÎÎII OZ-GII CII^

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4

Stamm S-l 14

Dieser Stamm besteht aus einem Gemisch aus den beiden nachfolgenden Verbindungen, nämlich ch* ch, ch- ch,

3 \3/ 3

ch ch ch, ch, ch, ch,

x3 / 3 ^ / 3

ch i

ch,

ch i

ch20h ch,

ch, ch,

5

ch ch2oh ch2c0nh-ch-c0uh-ch-c0im-ch-ch-ch2-c0kh-ch-c0m»ch-.ch-ch2-c00h und ch, ch, ch, ch,

3 3

ch, ch, ch ch, ch, ch

3 L 3

ch,

ch

CHjOH

i Ai ch,

ch ch0conh-ch-conh-ch-conh-ch-ch-ch0-conh-ch-conh~gh-ch-ch0cooh ch, ch,

S*/ 3

ch i i chjoh

/ 2>l

Stamm S-346

OH, CH,

3

ch ch, ch, ch,. ch, ch, ch, \3/ 3 n^/3 3

ch ch

I f ch2 ch2

ch i

chJoh I 2il

CH,

ch, ch,

V 3

ch i ch-oh i 3|

ch2c0hh-ch-c0m-ch-c0nh-ch-ch-ch2c0nh-ch-c0hh-ch-ch-ch2-c00h

Darüber hinaus erzeugt der Stamm SC-4708 das Proci-din (S-735 A), das in der britischen Patentschrift 1 314 231 beschrieben und nachfolgend mit seiner Strukturformel aufgeführt ist; dieses Procidin (S-735 A) und sein Methylesterderivat (S-735-M) sind als Mittel gegen Magengeschwüre oder Zwölffingerdarmgeschwüre brauchbar; der Stamm SC-4708 erzeugt auch dieses Procidin und kann daher zur Herstellung dieser Verbindungen eingesetzt werden.

Stamm S-735 A

ch, ch, ch, ch, ch, ch,

3 3 3

ch, ch,

3

ch ch ch ch I

chJoh •

ch,

ch, ch,

5

ch ! , . chjoh [ 41

chgcohh-ch-cohh-ch-cohh-ch-qh'-chg-cohh-ch-comi-ch-ch-chg-cooh

Die aus dem vorgenannten Stand der Technik bekannten Mikroorganismen erzeugen beispielsweise das aus der GB-PS 1 314231 bekannte Procidin S-735-A ebenfalls, jedoch wird es nach dem erfindungsgemässen Verfahren unter Verwendung des Stammes SC-4708 mit 5- bis 6fach höherer Ausbeute erhalten.

Ausserdem zeigt das nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhältlichen Procidin S-735 eine um das 5- bis 6fach höhere Inhibitionswirkung für Renin, das ein stark blutdruckerhöhendes Enzym darstellt, als das bekannte Procidin S-735-A.

Zur Erläuterung der Erfindung dienen auch 10 Blatt Abbildungen mit den Fig. 1 bis 10; hierbei zeigen die Fig. 1, 3, 5, 7 und 9 die IR-Spektren der Precidine S-735, S-l 14, S-346, S-735-A und S-735-M; die Fig. 2,4, 6, 8 und 10 zeigen die NMR-Spektren der Precidine S-735, S-l 14, S-346, S-735-A und entsprechend S-735-M.

Das im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendete Kulturmedium kann flüssig oder fest sein. Üblicherweise ist bei der Verwendung eines flüssigen Mediums die 55 Schüttelkultivierung oder die Kultivierung unter aeroben Bedingungen geeignet und zweckmässig. Es kann jedes beliebige Medium verwendet werden, solange der beschriebene Mikroorganismus darin wachsen und in diesem Medium Procidin ansammeln kann. Im einzelnen können solche 60 Kohlenstoffquellen wie etwa Glucose, Lactose, Glyzerin, Stärke, Sucrose, Dextrin, Melassen, organische Säuren u.dgl. verwendet werden; als Stickstoffquellen können solche Materialien wie etwa Proteolyseprodukte, beispielsweise von Pepton, Casaaminosäure, oder N-Z-Amine, Fleischextrakt, 65 Hefeextrakt, Sojabohnenkörner, Maiswasser, Aminosäuren, Ammoniumsalze, Nitrate und andere organische oder anorganische Stickstoff enthaltende Verbindungen verwendet werden. Es ist festgestellt worden, dass für die Bildung von

S-l 14 und S-346 der Zusatz von L-Leucin zu dem Medium erforderlich ist. Die zugesetzte Menge an L-Leucin beträgt vorzugsweise 0,5 bis 2 Gew.-%, was jeweils von den Kulturbedingungen abhängt. Als anorganische Salze können verschiedene Phosphate, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid und ähnliche Salze zugesetzt werden. Zur Beschleunigung des Wachstums der Mikroorganismen können auch Vitamine oder mit den Nukleinsäuren verwandte Verbindungen zugesetzt werden. In einigen Fällen kann auch der Zusatz von die Schaumbildung unterdrückenden Mitteln, wie etwa Silikone, Polypropylenglykol-Derivate oder Sojabohnenöl wirksam sein, um die Menge der in dem Medium angesammelten Procidine zu steigern.

Bei der praktischen Durchführung der Kultivierung wird es angestrebt, auf das Medium eine Zucht aufzuimpfen, die durch vorherige Präinkubierung in kleinem Massstab erhalten wurde. Die Bedingungen zur Kultivierung, bzw. zum Züchten, wie etwa die Züchtungstemperatur und die Züchtungsdauer, werden geeignet ausgewählt und kontrolliert, so dass ein max. Gehalt an Procidinen angesammelt wird. In vielen Fällen erfolgt das Züchten vorzugsweise unter aeroben Bedingungen bei 25 bis 35 °C für 2 bis 7 Tage bei pH-Werten im Bereich von 4 bis 9,5.

In dem auf diese Weise gezüchteten Produkt werden Procidine gebildet und angesammelt. Wird die Züchtung in einem flüssigen Medium durchgeführt, so wird das Produkt grundsätzlich in dem flüssigen Anteil angesammelt. Demzufolge kann das Züchtungsprodukt zuerst filtriert oder zen-trifugiert werden, um die Mikroorganismuszellen zu entfernen; anschliessend erfolgt die Abtrennung des Produkts aus dem Filtrat oder der überstehenden Flüssigkeit. Alternativ dazu kann das Produkt direkt aus dem Züchtungsprodukt ohne die Entfernung der Mikroorganismuszellen abgetrennt werden. Die Abtrennung und Reinigung des angestrebten Produkts aus dem Züchtungsprodukt kann leicht mittels verschiedener Kombinationen von Verfahren erfolgen, die auf den chemischen Eigenschaften der Procidine beruhen. Zum Beispiel kann die Ausfällung durch Zusatz eines Fällmittels, wie etwa Ammoniumsulfat, durchgeführt werden; es kann die Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, wie etwa n-Butanol durchgeführt werden, das nicht frei mit Wasser mischbar ist, jedoch die Procidine zu lösen vermag; es kann die Auflösung in einem polaren Lösungsmittel, wie etwa Methanol oder Äthanol erfolgen; die Entfernung von Verunreinigungen kann durch Behandlung mit Hexan od.dgl. erfolgen; es kann die Gelfiltration mit «Sephadex» durchgeführt werden; die Ionen-Austausch-Chromato-graphie mit verschiedenen Ionenaustauschern, wie etwa Io-nen-Austausch-Harzen, -Cellulose, -«Sephadex» u.dgl.,

kann durchgeführt werden; schliesslich kann die Adsorptions-Chromatographie mit Adsorptionsmitteln, wie etwa aktivierter Holzkohle, Aluminiumoxid, Siliciumdioxidgel, «Amberlite» XAD-1, 2 u.dgl., wirksam angewandt werden. Zusätzlich können natürlich geeignete andere Reinigungsverfahren, die auf den Eigenschaften der Procidine beruhen, benutzt werden, soweit diese verfügbar sind. Durch eine geeignete Kombination dieser Verfahren können die Procidine aus dem Züchtungsprodukt in Form von Kristallen isoliert werden.

In der nachfolgenden Tabelle 1 sind die Rf-Werte von S-735, S-l 14, S-346, S-735-A und S-735-M aufgeführt, die mittels Dünn-Schicht-Chromatographie in verschiedenen Lösungsmittelsystemen bestimmt wurden. Als Dünnschicht wurde eine dünne Schicht aus Siliciumdioxidgel verwendet (hergestellt von Merck & Co., Handelsbez. 5715, Schichtdik-ke 0,25 mm) und die Entwicklung erfolgte bei Zimmertemperatur.

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Tabelle 1:

Procidin Rf-Werte

Lösungsmittel- Lösungsmittel- Lösungsmittelsystem A system B system C

S-735 0,30 0,84 0,61

S-l 14 0,15 0,58 0,57

S-346 0,16 0,62 0,63

S-735-A 0,14 0,54 0,49

S-735-M 0,42 0,88 0,65

Bemerkungen

Lösungsmittelsystem A; Chloroform/Methanol/Essigsäure (92,5: 6 : 1,2)

Lösungsmittelsystem B: Chloroform/Methanol/Essigsäure (86 :12 : 2)

Lösungsmittelsystem C: Butanol/Butylacetat/Essigsäure/ Wasser (10 : 20 : 1 :1)

Die Bestimmung der Pepsin inhibierenden Aktivität wurde entsprechend dem nachfolgenden Verfahren durchgeführt.

Die nachstehenden prozentualen Konzentrationsangaben sind gewichtsmässig. 1,9 ml eines Reaktionsgemisches aus 1,0 ml 0,6%iger Caseinlösung, wobei das Caseinsubstrat in 0,08m Milchsäure-Pufferlösung (pH-Wert 2,2) gelöst wurde; 0,7 ml 0,02n Salzsäure/0,02m Kaliumchlorid-Pufferlösung (pH-Wert 2,2); 0,2 ml procidinhaltiger Probelösung wurden mit 0,1 ml einer Lösung versetzt, die kristallines Pepsin in einer Konzentration von 40 ng/ml enthält. Nach Durchführung der Reaktion im Verlauf von 30 Minuten bei 37 °C wird die Reaktion durch Zugabe von 2,0 ml einer l,7m-Perchlorsäure-Lösung beendet. Nachdem das Reaktionsgemisch 1 weitere Stunde lang bei Zimmertemperatur stehen konnte, wird es zentrifugiert und daraufhin die Absorption (A) der erhaltenen überstehenden Flüssigkeit bei 280 nm bestimmt. Anderseits wurde an einer Vergleichsprobe, zu deren Herstellung die gleiche Pufferlösung ohne Procidin verwendet wurde, die gleiche Bestimmung der Absorption (B) durchgeführt. Das Ausmass der Inhibierung bzw. der Inhibierungsgrad wird aus der Beziehung (B-A)/ B x 100 errechnet. In der nachfolgenden Tabelle 2 ist die erforderliche Menge Procidin aufgeführt, die notwendig ist, um 50% der Aktivität von 4 ng kristallinem Pepsin (ID50) zu inhibieren, wenn die Messung nach dem beschriebenen Verfahren erfolgt.

Tabelle 2:

S-735 S-l 14 S-346

Erforderliche Menge zur Inhibierung von 50% des

Pepsins (4 \ig) (ID50) 0,02 ng 0,02 ng 0,02 (ig

Um im einzelnen die Wirksamkeit gegen Geschwüre darzulegen, wird in der nachfolgenden Tabelle 3 beispielsweise die Wirkung eines typischen erfindungsgemäss hergestellten Procidins, nämlich der Verbindung S-735 gegen ein Magengeschwür aufgeführt, das durch Ligatur des Pylours der Shay-Ratte hervorgerufen worden war.

Tabelle 3:

Wirkung von S-735 gegen Geschwüre

Dosie- Zahl Anteil an Pepsin- Mittlere rung der Sekret des aktivität Geschwür-

mg/kg Tiere Magensaftes (jxg/ml) Masszahl (ml)

0 6 3,10 + 0,18 6,23 + 0,37 6

0,5 4 4,50 + 0,34 0,51 ±0,32 3,75 5,0 4 5,08 + 0,27 0 0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

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6

Bemerkungen

1. Bei den Ratten handelte es sich um männliche Wister vom Typ HLA, mit einem Körpergewicht von 180 bis 240 g; 2. unmittelbar nach der Ligatur des Pylorus wurde S-735 oral verabreicht. Nach 18 Stunden wurde der Magen extrahiert und mit blossem Auge geprüft, ob ein Geschwür vorlag. Der Grad der Geschwürbildung ist in 6 Stufen eingeteilt mit Masszahlen von 0 bis 6.

Die Toxizität von S-735 ist ausserordentlich gering; bei der Maus wurden LD50-Werte von 5 g/kg oder mehr bei oraler Verabreichung und von 0,5 g/kg oder mehr bei interabdominaler Einspritzung ermittelt. Das heisst, die erfin-dungsgemäss hergestellten Procidine weisen eine sehr geringe Toxizität auf und zeigen trotzdem eine sehr stark Pepsin inhibierende Wirkung. Daraus folgt, diese Procidine sind brauchbar als Arzneimittel zur Unterbindung oder Heilung von Magengeschwüren und Zwölffingerdarmgeschwüren, für welche Pepsin als eine der Ursachen angesehen wird.

Zur Erläuterung weiterer Details wird die Erfindung in den nachfolgenden Beispielen beschrieben.

Beispiel 1

Der Stamm SC-4708 wurde in eine Sakaguchi-Flasche mit einem Fassungsvermögen von 500 ml eingeimpft, welche 100 ml steriles, flüssiges Medium mit einem pH-Wert von 7,0 mit den nachfolgenden Bestandteilen enthielt.

Gew.-%

Glucose

1,0%

Lactose

1,0%

Sojabohnenpulver

1,0%

Fleischextrakt

0,5%

Pepton

0,5%

Natriumchlorid

0,3%

Magnesiumsulfat

0,1%

Dikaliumphosphat

0,1%

Die Kultivierung bzw. Züchtung wurde bei 28 °C im Verlauf von 2 Tagen unter wiederholtem Schütteln durchgeführt. Die Kulturbrühe wurde in Anteilen von jeweils 2,0 ml in 30 Sakaguchi-Flaschen mit einem Fassungsvermögen von 500 ml eingebracht, die jeweils 100 ml des oben angegebenen sterilisierten flüssigen Mediums enthielten; die Züchtung wurde in jeder Flasche bei 28 °C für eine Dauer von 7 Tagen unter gelegentlichem Schütteln fortgesetzt, wobei 3,01 Kulturbrühe erhalten wurden. Diese Kulturbrühe wurde filtriert, und das erhaltene Filtrat wurde zweimal mit 2,01 n-Bu-tanol behandelt, um aktive Substanzen zu extrahieren. Der n-Butanol-Extrakt wurde konzentriert, und das erhaltene Konzentrat wurde mit 200 ml Methanol vermischt, um das Konzentrat darin zu lösen. Die Lösung wurde anschliessend durch eine Säule mit 100 ml aktivierter Holzkohle hindurchgeführt. 500 ml des Eluates wurden gesammelt und konzentriert und ergaben 1,8 g blassgelber Pulver. Nach der Auflösung in Methanol und dem Aufziehen auf 2 g Siliciumdioxidgel wurden die Pulver auf 150 g Siliciumdioxidgel überlagert, das in einer Säule (mit einem Durchmesser von 2,6 cm) gepackt war und daraufhin mit einem Lösungsmittelgemisch aus Chloroform, Methanol und Essigsäure (92,5: 6: 1,2) equilibriert und daraufhin mit diesem Lösungsmittelgemisch eluiert. Die Eluate wurden jeweils in Fraktionen von 15 g aufgefangen und mittels Dünnschicht-Chromatographie analysiert. Dabei wurde festgestellt, dass die Substanz S-735-M in den eluierten Fraktionen 43 bis 51, die Substanz S-735 in den Fraktionen 53 bis 67 und die Substanz S-735-A in den Fraktionen 72 bis 85 erhalten war. Die entsprechenden Fraktionen wurden gesammelt, konzentriert, die Substanzen getrocknet, anschliessend aus wasserfreiem Methanol zweimal umkristallisiert, worauf 20 mg S-

735-M, 18 mg S-735 und 180 mg S-735-A jeweils in Form feiner Nadeln erhalten wurden.

Beispiel 2

Der Stamm SC-4708 wurde in 4 Sakaguchi-Flaschen mit einem Fassungsvermögen von 500 ml eingeimpft, von denen jede 100 ml sterilisiertes flüssiges Medium mit einem pH-Wert von 7,0 mit den nachfolgenden Bestandteilen enthielt:

Gew.-%

Glucose

2,0%

Lactose

1,0%

Sojabohnenpulver

1,0%

Fleischextrakt

0,75%

Pepton

0,75%

Natriumchlorid

0,3%

Magnesiumsulfat

0,1%

Dikaliumphosphat

0,1%

Die Züchtung erfolgte bei 28

°C im Verlauf von 2 Tagen unter gelegentlichem Umschütteln und ergab 400 ml Kulturbrühe. Die Kulturbrühe wurde in zwei Tanks mit 251 Fassungsvermögen überführt, von denen jeder 121 des obigen, sterilisierten flüssigen Mediums enthielt. Jedem Tank wurden ungefähr 100 ml Silikon zugesetzt und die Züchtung bei 28 °C im Verlauf von 72 Stunden unter Rührung bei Luftzutritt durchgeführt. Die Kulturbrühe wurde filtriert und das erhaltene Filtrat wurde zweimal mit ungefähr 151 n-Butanol behandelt, um die aktiven Substanzen zu extrahieren. Der n-Butanol-Extrakt wurde konzentriert. Der konzentrierte Extrakt wurde mit 11 Hexan gewaschen und anschliessend 500 ml Methanol zugesetzt, um das Konzentrat darin zu lösen. Die Lösung wurde durch eine Säule mit 300 ml aktivierter Holzkohle geführt und es wurden 1,51 Eluat gesammelt. Das Eluat wurde konzentriert und ergab 5,6 g gelblichbraune Pulver. Nach der Auflösung in Methanol und dem Aufziehen auf 3 g Siliciumdioxidgel wurden die Pulver auf 200 g Siliciumdioxidgel überlagert, das in einer Säule (mit einem Durchmesser von 4,5 cm) gepackt war, und mit einem Lösungsmittelgemisch aus Chloroform, Methanol und Essigsäure (92,5 : 6 :1,2) equilibriert, und anschliessend mit diesem Lösungsmittelgemisch eluiert. Das Eluat wurde jeweils in Fraktionen von 15 g gesammelt, wobei die Substanz S-735-M in den eluierten Fraktionen 93 bis 101, die Substanz S-735 in den Fraktionen 109 bis 121 und die Substanz S-735-A in den Fraktionen 125 bis 134 enthalten war. Die entsprechenden Fraktionen wurden gesammelt, konzentriert und die Substanzen getrocknet; im Anschluss daran wurde zweimal aus wasserfreiem Methanol umkristallisiert, wonach 140 mg S-735-M, 160 mg S-735 und 1680 mg S-735-A jeweils in Form weisser Nadeln erhalten wurden.

Beispiel 3

1) Der Stamm SC-4708 wurde in eine Sakaguchi-Flasche mit einem Fassungsvermögen von 500 ml eingeimpft, welche 100 ml sterilisiertes flüssiges Medium mit einem pH-Wert von 7,0 mit den nachfolgenden Bestandteilen enthielt:

Gew.-%

Glucose

1,0%

Lactose

1,0%

Sojabohnenpulver

1,0%

Fleischextrakt

0,5%

Pepton

0,5%

Natriumchlorid

0,3%

Magnesiumsulfat

0,1%

Dikaliumphosphat

0,1%

Die Züchtung unter Schütteln wurde bei 28 °C im Verlauf von 2 Tagen durchgeführt. Die Kulturbrühe wurde aufgeteilt und jeweils in einer Menge von 10 ml in 10 Sakaguchi-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

7

Flaschen mit einem Fassungsvermögen von 21 eingefüllt,

welche jeweils 500 ml sterilisiertes flüssiges Medium mit einem pH-Wert von 7,0 mit den folgenden Bestandteilen enthielt:

Gew.-%

Glucose

1,0%

Lactose

" 1,0%

Sojabohnenpulver

1,0%

L-Leucin

1,0%

Fleischextrakt

0,5%

Pepton

0,5%

Natriumchlorid

0,3%

Magnesiumsulfat

0,1%

Dikaliumphosphat

0,1%

In jeder Flasche wurde die Züchtung bei 28 °C im Ver-

lauf von 7 Tagen unter gelegentlichem Schütteln durchgeführt, und ergab 5,01 Kulturbrühe. Die Kulturbrühe wurde filtriert, und das erhaltene Filtrat wurde durch eine Säule mit einem Durchmesser von 3,3 cm geführt, in der 120 g ak- 20 tivierter Holzkohle für die Chromatographie, die mit (480 ml) Wasser befeuchtet waren, gepackt waren. Nachdem die Säule mit 6,01 Wasser und mit 3,0140%igem Methanol gewaschen worden war, erfolgte die Eluierung mit 3,01 angewärmten Methanol bei 40 °C. Das mit Methanol eluierte 25 Eluat wurde unter vermindertem Druck konzentriert und ergab 4,1 g blassgelbe Rohpulver. Die Rohpulver wurden in Methanol gelöst und durch eine Säule mit einem Durchmesser von 2,2 cm geführt, in der 40 g aktivierter Holzkohle für die Chromatographie, die mit Methanol befeuchtet waren, 30 gepackt waren. Das mit 300 ml Methanol eluierte Eluat wurde unter vermindertem Druck konzentriert und ergab 2,3 g weisse Pulver.

633 964

2) Die auf diese Weise erhaltenen weissen Pulver wurden nach der Auflösung in Methanol und dem Aufziehen auf 3,0 g Siliciumdioxidgel auf 200 g Siliciumdioxidgel, das in einer Säule (mit einem Durchmesser von 2,6 cm) gepackt war, überlagert und mit einem Lösungsmittelgemisch aus Chloroform, Methanol und Essigsäure (36 : 12 : 2) equilibriert und schliesslich mit diesem Lösungsmittelgemisch eluiert. Das Eluat wurde jeweils in Fraktionen von 20 g aufgefangen und diese mittels Dünnschicht-Chromatographie analysiert. Es wurde festgestellt, dass die Substanzen S-l 14 und S-346 in den eluierten Fraktionen 64 bis 68 enthalten waren. Diese Fraktionen wurden gesammelt und unter vermindertem Druck konzentriert und ergaben 1,4 g weisse Pulver. Die Pulver wurden nach der Auflösung in Methanol und dem Aufziehen auf 2,0 g Siliciumdioxidgel auf 200 g Siliciumdioxidgel, das in einer Säule (mit einem Durchmesser von 2,6 cm) gepackt war, überlagert, und mit einem Lösungsmittelgemisch aus Butanol, Butylacetat, Essigsäure und Wasser (10 : 20 : 1 : 1) equilibriert, und schliesslich mit diesem Lösungsmittelgemisch eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von jeweils 15 g aufgefangen und mittels Dünnschicht-Chromatographie analysiert. Dabei wurde festgestellt, dass die Substanz S-346 in den eluierten Fraktionen 64 bis 70 und die Substanz S-l 14 in den eluierten Fraktionen 73 bis 85 enthalten war. Die entsprechenden Fraktionen wurden gesammelt, konzentriert und die Substanzen getrocknet. Die getrockneten Produkte wurden erneut in Methanol gelöst, und die Lösungen blieben an einem kühlen Ort stehen, wobei 178 mg S-346 und 303 mg S-l 14 in Form von Nadeln anfielen.

An den verschiedenen, nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhaltenen Procidinen wurden deren chemische und physikalische Eigenschaften bestimmt; die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 4 aufgeführt.

Tabelle 4:

S-735 S-l 14 S-346 S-735-A S-735-M

Elementaranalyse:

C: 61,20%

H: 9,68%

N: 10,84%

Molekulargewicht:

641

Schmelzpunkt:

253-255°C

Spezifisches

-83,45

Drehvermögen

(0,145%

(<*)d25

Methanol)

UV-Absorptions-

kein Maximum,

spektrum:

Absorption bei

210-400 nm

IR-Absorptions-

Fig. 1

spektrum:

NMR-Spektrum:

Fig. 2

Massenspektrum:

Molekülionpeak:

641 m/e

Bestandteile:

Alanin:

Valin:

4-Amino-

3-hydroxy-

6-methylheptan-

säure: 3-Amino-

2-hydroxy-

5-methylhexan:

Iso-valeriansäure

im Verhältnis

1:2:1:1:1

C: 60,05%

C: 60,57%

H: 9,30%

H: 9,40%

N: 10,02%

N: 9,82%

699

713

231-233°C

214-216°C

-78,61

-71,95

(0,533%

(0,492%

Methanol)

kein Maximum,

Absorption bei

210-400 nm

Fig. 3

Fig. 5

Fig. 4

Fig. 6

Molekülionpeak

Molekülionpeak des Methylesters:

des Methylesters:

713 m/e

727 m/e

Alanin:

Valin:

Leucin:

4-Amino-

3-hydroxy-

6-methylheptan-

säure: Iso-

valeriansäure im valeriansäure im

Verhältnis

1:2:2:1

1:1:1:2:1

C: 59,28%

C: 60,01%

H: 9,17%

H: 9,28%

N: 10,16%

N: 10,00%

685

699

233-235°C

269-271°C

-86,86

-85,42

(0,152%

(1,828%

Methanol)

kein Maximum,

Absorption bei

210-400 nm

Fig. 7

Fig. 9

Fig. 8

Fig. 10

Molekülionpeak

Molekülionpeak:

des Methylesters:

699 m/e

Alanin:

Valin:

4-Amino-

3-hydroxy-

6-methylheptan-

säure: Iso-

säure: 4-Amino-

valeriansäure im

3-hydroxy-6-

Verhältnis methylheptansäure-

1:2:2:1

methylester: Iso-

valeriansäure im

Verhältnis

1:2:1:1:1

s

10 Ri,in /eichnunijen

Claims

633 964 2 PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung von Pepsin-Inhibitoren der Strukturformel ch3^CH3 CH ch3 sCE2 CH I

^1 *2 0H

i I I I z |

CH_CONH-CH-CONH-CH-CONH-CH-CH-CH,

ch3/CH3 ÇH

Çh3 Œ2 oH

-CONH-CH-CONH-CH-CH-CH.

worin Rj und R2, gleich oder verschieden, Isopropyl oder Isopropylmethyl bedeuten und R4 Wasserstoff, Carboxyl oder Methylcarboxyl bedeutet, wenn R! und R2 für Isopropyl stehen, oder R4 Carboxyl bedeutet, wenn Rx und R2 verschieden sind oder wenn Rx und R2 für Isopropylmethyl stehen, wobei das Procidin als ein Gemisch von Verbindungen vorliegt, wenn Rj und R2 verschieden sind, dadurch gekennzeichnet, dass man den Mikroorganismus ATCC 31233 in einem Nährmedium züchtet und den gebildeten Pepsin-Inhibitor isoliert.
2. Nach dem Verfahren nach Anspruch 1 hergestellte Pepsin-Inhibitoren.