DE2640420A1

DE2640420A1 - Als procidine bezeichnete proteaseinhibitoren, ein verfahren zu deren herstellung und deren verwendung als arzneimittelwirkstoff

Info

Publication number: DE2640420A1
Application number: DE19762640420
Authority: DE
Inventors: Ten Koide; Shinichi Kojima; Kazuro Nakamura; Shigeo Ogino
Original assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date: 1975-09-12
Filing date: 1976-09-08
Publication date: 1977-03-31
Also published as: FR2323394A1; AU1754876A; GB1519101A; US4091093A; CH633964A5; FR2323394B1; SE7609960L; DE2660964C2; NL7610032A; CA1066212A; SE436137B; DE2640420C2; CA1159000B

Description

Als Procidine bezeichnete Proteaseinhibitoren, ein Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung als Arzneimittelwirkstoff

Die Erfindung betrifft neue Proteaseinhibitoren, die als Procidine bezeichnet werden. Weiterhin betrifft die Erfindung einen neuen Mikroorganismus und von diesem erzeugte und angesammelte Produkte. Insbesondere betrifft die Erfindung einen neuen Stamm, der zur Art der Streptomyces gehört; weiterhin ein Verfahren zur Herstellung verschiedener

München: Kramer · Dr.Weser · Hirsch — Wiesbaden: Blumbach · Dr. Bergen · Zwirner

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Procidine unter Verwendung dieses Stammes. Schließlich ist die Erfindung auf die Verwendung dieser neuen Procidine als Wirkstoff in Arzneimitteln gerichtet.

Im Rahmen der Erfindung sind ausgedehnte Untersuchungen
über von Mikroorganismen gebildete Produkte auf der Suche nach neuen Proteaseinhibitoren durchgeführt worden; dabei ist festgestellt worden, daß ein neuer Stamm, der zur Art der Streptomyces gehört, in seinem Züchtungs -Produkt eine Substanz bildet und ansammelt, die fähig ist, die Aktivitäten von Pepsin und verschiedenen sauren Proteasen stark zu inhibieren. Als Ergebnis der verschiedenen Untersuchungen konnten im Rahmen der Erfindung die dabei gebildeten Proteaseinhibitoren erfolgreich isoliert und in Form von Kristallen gewonnen werden.

Bei dem im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten
Mikroorganismus handelt es sich um einen neuen Stamm, der aus einer Bodenprobe aus Fukuzaki-cho, Hyogo prefecture,
Japan, isoliert wurde und der als Streptomyces procidinanus bezeichnet worden ist. Der Mil:r ο Organismus ist beim
"Fermentation Research Institute", Abt. für industrielle
Forschung und Technologie, Chiba, Japan, hinterlegt worden und hat die Hinterlegungs-Nr. FERM-P No. 3156 erhalten.
Der Stamm ist weiterhin am 29. Juli 1976 in der "American

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Type Culture Collection" hinterlegt worden und hat die Nr. ATCC No. 31233 erhalten.

Nachfolgend werden die "bakteriologischen Eigenschaften dieses erfindungsgemäßen Mikroorganismus im einzelnen "beschrieben, der nachfolgend als "Stamm SC-4708" bezeichnet wird. Bei der Beschreibung der Farben wird auf den "color standard" des "Japan Color Institute" Bezug genommen.

Bakteriologische Eigenschaften des Stammes SC-4708

I. Charakteristische morphologische Eigenschaften:

Unter dem Mikroskop wurden eine Reihe von leicht gewellten •Luftmyzeln festgestellt, die aus gut verzweigten Substratmyzeln wuchsen. Keine Bildung von Spiralen und Wirtein. Die ausgereifte Sporenkette besitzt 10 oder mehr Sporen mit einer Größe von 1,4 bis 1,8 auf 0,8 bis 1,0 um, mit glatter Oberfläche.

II. Wuchs auf verschiedenen Kulturmedien:

(1) auf Sucrosenitratagar (gezüchtet bei 27⁰C): der Wuchs ist schlecht, farblos; kein luftmyzel; kein lösliches Pigment.

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(2) auf Glycerolasparaginagar (gezüchtet "bei 27⁰C): der Wuchs ist 'blaß-gelblich; ein leuchtend graues Luftmyzel; ein lösliches Pigment, leicht blaß-gelt»;

(3) auf G-lucoseasparaginagar (gezüchtet bei 27⁰G): der Wuchs ist schlecht, blaß-gelb; kärgliches Luftmyzel, weiß; lösliches Pigment, leicht blaß-gelb;

(4) auf G-lucose-Czapeck-Agar (gezüchtet bei 27 C): Wuchs, blaß-rötlich-gelb; kein Luftmyzel; Pigment, leicht rötlich-gelb;

(5) auf Stärkeagar (gezüchtet bei 27°C):

Wuchs, blaß-gelb; Luftmyzel, weiß; lösliches Pigment, leicht blaß-gelb;

(6) auf Nährmittelagar (gezüchtet bei 27°C):

sehr schlechter Wuchs, farblos; kein Luftmyzel; kein lösliches Pigment;

(7) auf Peptonglucoseagar (gezüchtet bei 27°C): Wuchs, matt-rötlich-gelb; Luftmyzel, kärglich und weiß; lösliches Pigment, leicht matt-rötlich-gelb;

(8) auf Malzextraktagar (gezüchtet bei 27⁰C): Wuchs, gräulich-gelb; Luftmyzel, weiß; lösliches Pigment, leicht gräulich-gelb;

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ORIGINAL INSPECTED

(9) auf Tyrosinagar (gezüchtet bei 27°C): Wuchs, blaß-gelb; Luftmyzel, sehr leicht weiß; kein lösliches Pigment; Tyrosinasereaktion negativ;

(10) auf Calciummalatagar (gezüchtet "bei 27°C): Wuchs schlecht; kein Luftmyzel; kein lösliches Pigment; am Umfang der Wuchsstelle wurde Calciummalat nicht gelöst;

(11) auf Kartoffelscheibe (gezüchtet bei 27°C): kein Wuchs nach 21 Tagen;

(12) auf Rübenscheibe (gezüchtet bei 27⁰C): kein Wuchs nach 21 Tagen;

(13) auf Pferdeserum (gezüchtet bei 3O⁰C): kein Wuchs nach 21 Tagen;

(14) auf Cellulose (gezüchtet bei 27°C): kein Wuchs nach 21 Tagen;

(15) auf Hefemalzagar (gezüchtet bei 27⁰C): reichlicher Wuchs, gelblich-rosa bis blaß-rosa; Luftmyzel, leuchtend-grau,, kein lösliches Pigment;

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(16) auf Hafermehlagar (gezüchtet bei 27°C): kein Wuchs nach 21 Tagen;

(17) auf Ei (gezüchtet bei 27⁰C): kein Wuchs nach 21 Tagen;

(18) auf Milch (gezüchtet bei 37⁰C): kein Wuchs nach 21 Tagen;

(19) auf Gelatine (gezüchtet bei 20⁰C):

Wuchs, farblos bis blaß-gelb; Luftmyzel, weiß; kein lösliches Pigment; keine wesentliche Gelatineverflüssigung;

(20) auf Peptonwasser (gezüchtet bei 27⁰C): kein Wuchs nach 21 Tagen.

III. Charakteristische physiologische Eigenschaften:

(1) Temperaturbereiche für das Wachstum: Die Ergebnisse von Versuchen bei 20, 24, 27, 30 und 37°C unter Verwendung von Glue ο seasparaginagar als Kulturmedium zeigen, daß Wachstum bei jeder Temperatur, ausgenommen 37⁰C, gegeben ist; optimale Wachstumstemperaturen scheinen zwischen 27 und

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3O⁰C zu liegen.

(2) Verwertung von Kohlenstoffquellen (gezüchtet auf Pridham-Gottrieb-agar bei 27⁰C): Gutes Wachstum mit "Verwertung von Glucose und Galaktose. Xylose, AraMnose, Bhamnose, !Fructose, Saccharose, Maltose, Lactose, Raffinose, Inulin, Mannitol, Sorbitol, Dulcitol, Inositol und Salicin wurden nicht verwertet.

Die oben aufgeführten charakteristischen Eigenschaften können dahingehend zusammengefaßt werden, daß der Stamm SC-4708 zur Art der Streptomyces gehört; sein Luftmyzel bildet weder Wirtel noch Spiralen; die Sporen weisen eine glatte Oberfläche auf; eine spezifische Eigenschaft des Stammes ist sein schlechtes Wachstum mit Ausnahme von Hefemalzagar; das Wachstum ist insbesondere bei 37⁰C außerordentlich schlecht; trotz seines schlechten Wachstums weist der Stamm ausgeprägte Aktivität zur Hydrolyse von Stärke auf; der Stamm gehört zum nicht-chromogenen Typ von MikTOOrganismen; der Wuchs ist farblos, blaß-gelb oder blaß-braun; das Luftmyzel ist weiß oder stark grau und wird leicht gebildet; lösliches Pigment wurde nicht in wesentlichem Umfang festgestellt; bei den nachfolgenden Reaktionen, nämlich der Gelatineverflüssigung, der Koagulation und Peptonbildung von entfetteter Milch,

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λχ.

der Auflösung von Calciummalat und der Reduktion von Nitrat ist der Stamm stets negativ. Vergleicht man diese Eigenschaften mit denjenigen "bekannter Mikroorganismen, welche diese Eigenschaften aufweisen, dann wird kein ähnlicher Stamm gefunden. Als ein Stamm mit relativ ähnlichen Eigenschaften wird Streptomyces omiyaensis gefunden. Nachfolgend werden die Eigenschaften des Stammes SG-4708 mit der Beschreibung des Stammes Streptomyces omiyaensis in der Literatur (1) Bergey's "Manual of Determinative Bacteriology", 8. Auflage, Seite 762 (1974) und (2) Waksman "The Actinomycetes", Band 2, Seite 254, verglichen; die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle aufgeführt:

	SG-4708	Streptomyces omiyaensis
Wirtelbildung	_	_
Spiralbildung	-	-
Sporenoberfläche	glatt	glatt
Farbe des Luftmyzels	weiß bis stark-grau	grau
Farbe des Wuchses	farblos bis blaß-gelb	weiß bis blaß gelb

Melaninpigment Hydrolyse von Stärke Proteolyse

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SC-4708

Streptomyces omiyaensis

Gelatineverflüssigung

Verwertung von Kohlenstoffquellen

D-Glucose D-G-alaktose D-Xylose L-Rhamnose D-Pructose Stoffwechselprodukte

Proeidine

Chloramphenicol

Wie aus obiger Tabelle ohne weiteres zu ersehen ist, erinnert der Stamm SC-4708 an Streptomyces omiyaensis, unterscheidet sich davon jedoch in den proteolytischen Eigenschaften und bei der Verwertung von Kohlenstoffquellen und weiterhin darin, daß er Chloramphenicol nicht bildet. Demzufolge ist der Schluß zutreffend, daß der Stamm 4708 einen neuen Stamm darstellt und dem der Name Streptomyces procidinanus gegeben wird.

Actinomycetes unterliegen gewöhnlich der künstlichen oder natürlichen Mutation. Demzufolge umfaßt der erfindungsgem. Stamm Streptomyces procidinanus auch alle davon ausgehenden Mutanten.

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«Η

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren können neue Procidine hergestellt werden; diese entsprechen der nachfolgenden allgemeinen Formel:

CH₃	(	CH₃	CH	H₃
CH			CH I
CH^OH I 'I

\V ⁵

CH R₁ R₀

I I¹ I²

CH₂COM-CH-COm-CH-CONH-CH-CH-CH₂CONH-CH-CONH-CH-CH-CH₂-R₃

wobei Rj. und R₂, die identisch oder versc-hieden sein können, für den Isopropylrest oder den Isopropyl-Methyl-Rest stehen; sofern die beiden Reste R₁ und R₂ jeweils für den Isopropylrest stehen, bedeutet R^ Viasserstoff; für den Pail, daß die Reste R₁ und R₂ unterschiedlich sind oder beide Reste R₁ und R₉ für den Isopropyl-Methyl-Rest stehen, bedeutet R^ den Carboxylrest; wenn die Reste R₁ und R₂ verschieden sind, dann liegt dieses Procidin als ein Gemisch von Verbindungen vor.

Im einzelnen werden von dem erfindungsgemäßen Stamm SC-4708 neue Procidine erzeugt und angesammelt, welche für die Unterbindung von Magengeschwüren und Zwölffingerdarmgeschwüren geeignet sind; die Strukturformeln dieser Procidine sind nachfolgend aufgeführt:

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Stamm S-735

CH, CH, CH, CH,

ν / ν /

CH, CH, CH, CH, CH, CH, CH CH

χ/ χ/χ/ I I

CH CH CH CH₀OH CH, CH₀OH

I I I I ²Il I³I ²ΐ|
CH₂CONH-CH-COIIH-CH-COIIH-CH-CH-CH₂-CONH-CH-COm-CH-CH-CH

Stamm S-II4

Dieser Stamm besteht aus einem Gemisch aus den beiden

nachfolgenden Verbindungen, nämlich

CH, CH, CH, CH, CH, CH,

N3/ 3 ^/ 3 ^/ 3

CH, CH, CH, CH, CH CH CH

^/ ³ <li ³ ι ι ι

CH CH CH₀ CH₀OH CH, CH₀OH

I I I ² I ²I I ³ I ²I

CH₂C0IIH-CH-C0IIH-CH-σ01IH-CH-CH-CH₂-C0m-CH-σ01ffi-CH-CH-CH₂-C00H

und

CH, CH, CH, CH, CH₃ CH,

CH, CH, CH CH, CH, CH CH

ψ³ I \³/³ I, I .:

CH CH₀ CH CH₀-OH CH, CH JOH

I I²I I ²Il I ³ / ²I

CH₂CONH-CH-CONH-CH-COm-CH-CH-CH₂-CONH-CH-CONH-CH-CH-CH₂COOH

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Stamm 5-346

CH, GH, CH, GH, CH, CH,, CH,, CH,

\V ³ ^/ ³ ^/ ³ N?/ ³

CH, CH, CH CH CH CH

^/³III I

CH CH₀ CH₀ CH₀OH CH, CH₀OH

I ² I ² I ²A I ³ I ²I CH₂COIiH-CH-CONH-CH-COKH-CH-CH-CH₂COFH-CH-CONH-CH-CH-CH₂-COOH

Darüberhinaus erzeugt der Stamm SC-4708 das Procidin (S-735 A), das in der Britischen Patentschrift 1 314 231 beschrieben und nachfolgend mit seiner Strukturformel aufgeführt ist; dieses Procidin (S-735 A) und sein Methylesterderivat (S-735-M) sind als Mittel gegen Magengeschwüre oder Zwölffingerdarmgeschwüre brauchbar; der Stamm SC-4708 erzeugt auch dieses Procidin und kann daher zur Herstellung dieser Verbindungen eingesetzt werden.

Stamm S-735 A

CH, CH, CH, CH₅

GH, CH, CH, CH₃ CH₅ CH₅ CH CH

CH CH CH ChJoH CH, CH₀OH

I I I I ²Sl I³I²I

σH₂C0NH-CH-C0NH-CH-C0NH-σH-CH■·CH₂-C0NH-CH-σ0NH-CH-CH-CH₂-σ00H

Im "breitesten Umfang wir d daher mit der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von wenigstens einem Procidin der nachfolgenden allgemeinen StruWurformel angegeben:

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GH-? GH·? CH, CH

\V ³ \V

GH, CH, CH CH

^³ I . I

CH R. R₀ CH₀OH CH, CH₀OH

I¹ I² I ^{2 3} \

CH₂CONH-CH-CONH-CH-CONH-CH-CH-CH₂-CONH-CH-CONH-Ch-CH-CH₂-R₄

wobei die Reste R₁ und R„, die identisch oder verschieden sein können, den Isopropylrest oder den Isopropyl-Methyl-Rest "bedeuten; sofern beide Reste R und R₀ für den Isopropylrest stehen, bedeutet der Rest R. Wasserstoff, den Carboxylrest, oder den Methyl-Carboxylat-Rest; sofern die beiden Reste R. und R₂ verschieden sind, oder sofern die beiden Reste R. und R_p für den Isopropyl-Methyl-Rest stehen, bedeutet der Rest R, den Carboxylrest; sofern die Reste R₁ und Rp verschieden sind, liegt dieses Procidin als ein Gemisch von Verbindungen vor.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von .Procidinen mit der oben angegebenen Struktur besteht darin, Streptomyces procidinanus in einem adäquaten Medium zu kultivieren und daraus das gebildete Procidin zu isolieren.

Zur Erläuterung der Erfindung dienen auch 10 Blatt Abbildungen mit den Fig. 1 bis 10; hierbei zeigen die Fig. 1, 3,

|_NSPECrED

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λ*

5, 7 und 9 die IR-Spektren der Procidine S-735, S-114, S-346, S-735-A und S-735-M; die Pig. 2, 4, 6, 8 und 10 zeigen die NMR-Spektren der Procidine S-735, S-114, S-346, S-735-A und entsprechend S-735-M.

Das im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendete Kulturmedium kann flüssig oder fest sein. Üblicherweise ist "bei der Verwendung eines flüssigen Mediums die Schüttelkultivierung oder die Kultivierung unter aeroben Bedingungen geeignet und zweckmäßig. Es kann jedes "beliebige Medium verwendet werden, solange der vorliegende Mikroorganismus darin wachsen und in diesem Medium Procidin ansammeln kann. Im einzelnen können solche Kohlenstoffquellen wie etwa Glucose, Lactose, Glyzerin, Stärke, Sucrose, Dextrin, Melassen, organische Säuren und dgl. verwendet werden; als Stickstoffquellen können solche Materialien wie etwa Proteolyseprodukte, beispielsweise von Pepton, Casaaminosäure, oder ΪΤ-Z-Amine, Fleisohextrakt, Hefeextrakt, Sojabohnenkörner, Maiswasser, Aminosäuren, Ammoniumsalze, Nitrate und andere organische oder anorganische Stickstoff enthaltende Verbindungen verwendet werden. Es ist festgestellt worden, daß für die Bildung von S-114 und S-346 der Zusatz von L-Ieucin zu dem Medium erforderlich ist. Die zugesetzte Menge an L-Leucin beträgt vorzugsweise 0,5 bis 2%, was jeweils von den Kulturbedingungen abhängt. Als anorganische

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Salze können verschiedene Phosphate, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid und ähnliche Salze zugesetzt werden. Zur Beschleunigung des Wachstums der Mikroorganismen können auch Vitamine oder mit den Nukleinsäuren verwandte Verbindungen zugesetzt werden. In einigen Fällen kann auch der Zusatz von die Schaumbildung unterdrückenden Mitteln, wie etwa Silikone, Polypropylenglykol-Derivate oder Sojabohnenöl wirksam sein, um die Menge der in dem Medium angesammelten Procidine zu steigern.

Bei der praktischen Durchführung der Kultivierung wird es angestrebt, auf das Medium eine Zucht aufzuimpfen, die durch vorherige PräinkuMerung in kleinem Maßstat) erhalten wurde. Die Bedingungen zur Kultivierung "bzw. zum Züchten, wie etwa die Züchtungstemperatur und die Züchtungsdauer, werden geeignet ausgewählt und kontrolliert, so daß ein max. Gehalt an Procidinen angesammelt wird. In vielen Fällen erfolgt das Züchten vorzugsweise unter aeroben Bedingungen bei 25 bis 35⁰C für 2 bis 7 Tage bei pH-Werten im Bereich von 4 bis 9,5.

In dem auf diese Weise gezüchteten Produkt werden Procidine gebildet und angesammelt. Wird die Züchtung in einem flüssigen Medium durchgeführt, so wird das Produkt grundsätzlich in dem flüssigen Anteil angesammelt. Demzufolge wird das

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Züchtungsprodukt zuerst filtriert oder zentrifugiert, um die Mikroorganismuszellen zu entfernen; anschließend erfolgt die Abtrennung des Produkts aus dem Piltrat oder der überstehenden Flüssigkeit. Alternativ dazu kann das Produkt direkt aus dem Züchtungsprodukt ohne die Entfernung der Mikroorganismuszellen abgetrennt werden. Die Abtrennung und Reinigung des angestrebten Produkts aus dem Züchtungsprodukt kann leicht mittels verschiedener Kombinationen von Verfahren erfolgen, die auf den chemischen Eigenschaften der Procidine beruhen. Zum Beispiel kann die Ausfällung durch Zusatz eines Fällmittels wie etwa Ammoniumsulfat, durchgeführt werden; es kann die Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel wie etwa n-Butanol durchgeführt werden, das nicht frei mit Wasser mischbar ist, jedoch die Procidine zu lösen vermag; es kann die Auflösung in einem polaren Lösungsmittel wie etwa Methanol oder Äthanol erfolgen; die Entfernung von Verunreinigungen kann durch Behandlung mit Hexan oder dgl. erfolgen; es kann die Gelfiltration mit Sephadex durchgeführt werden; die Ionen-Austauseh-Chromatographie mit verschiedenen Ionenaustauschern wie etwa Ionen-Austausch-Harzen, -Cellulose, -Sephadex und dgl. kann durchgeführt werden; schließlich kann die Adsorptions-Chromatographie mit Adsorptionsmitteln wie etwa aktivierter Holzkohle, Aluminiumoxid, Siliciumdioxidgel, Amberlite XAD-1,2 und dgl. wirksam angewandt werden. Zusätzlich können natürlich geeignete andere Reinigungsverfahren, die auf den Eigen-

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schäften der Procidine beruhen, "benutzt werden, soweit
diese verfügbar sind. Buren eine geeignete Kombination
dieser Verfahren können die Procidine aus dem Züchtungsprodukt in Form von Kristallen isoliert werden.

In der nachfolgenden Tabelle 1 sind die R_f-¥erte von
S-735, S-114, S-346, S-735-A und S-735-M aufgeführt, die mittels Dünn-Schicht-Chromatographie in verschiedenen Lösungsmittelsystemen bestimmt wurden. Als Dünnschicht wurde eine dünne Schicht aus Siliciumdioxidgel verwendet (hergestellt von Merck & Co., Handelsbez. 5715, Schichtdicke 0,25 mm) und die Entwicklung erfolgte bei Raumtemperatur.

Tabelle 1:

	Lösungsmittel	R_f - Werte	Lösungsmittel
Procidin	system A	Lösungsmittel	system C
	0,30	system B	0,61
	0,15	0,84	0,57
S-735	0,16	0,58	0,63
S-114	0,14	0,62	0,49
S-346	0,42	0,54	0,65
S-735-A		0,88
S-735-M

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Bemerkungen:

Lösungsmittelsystem A: Chloroform/Methanol/Essigsäure

(92,5 : 6 : 1,2)
Lösungsmittelsystem B: Chloroform/Methanol/Essigsäure

(86 : 12 : 2)
Lösungsmittelsystem C: Butanol/Butylacetat/Essigsäure

Wasser (10 : 20 : 1 : 1)

Die Bestimmung der Pepsin inhibierenden Aktivität wurde entsprechend dem nachfolgenden Verfahren durchgeführt.

1,9 ml eines Reaktionsgemisches aus 1,0 ml 0,6%iger Caseinlösung, wobei das Caseinsubstat in 0,08 m Milchsäure-Pufferlösung (pH 2,2)gelöst wurde? 0,7 ml 0,02 η Salzsäure/0,02 m Kaliumchlorid-Pufferlösung (pH 2,2); 0,2 ml procidinhaltiger Probelösung wurden mit 0,1 ml einer Lösung versetzt, die kristallines Pepsin in einer Konzentration von 40 ug/ml enthält. Nach Durchführung der Reaktion im Verlauf von 30 min bei 37⁰C wird die Reaktion durch Zugabe von 2,0 ml einer 1,7 m Perchlorsäure-Lösung be endet. Nachdem das Reaktionsgemisch eine weitere Stunde bei Raumtemperatur stehen konnte, wird es zentrifugiert und daraufhin die Absorption (A)der erhaltenen überstehenden Flüssigkeit bei

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280 nm bestimmt. Andererseits wurde an einer Vergleichsprobe, zu deren Herstellung die gleiche Pufferlösung ohne Procidin verwendet wurde, die gleiche Bestimmung der Absorption (B) durchgeführt. Das Ausmaß der Inhibierung bzw. der Inhibierungsgrad wird aus der Beziehung (B-A)/B χ 100 errechnet. In der nachfolgenden Tabelle 2 ist die erforderliche Menge Procidin aufgeführt, die notwendig ist, um 50% der Aktivität von 4 Ug kristallinem Pepsin (ID™) zu inhibieren, wenn die Messung nach dem beschriebenen Verfahren erfolgt.

T a b e 1 Ie 2:

S-735 S-114 S-346 Erforderliche Menge zur

Inhibierung von 50% des 0,02 ug 0,02 ^ig 0,02 Pepsins (4

Um im einzelnen die Wirksamkeit gegen Geschwüre darzulegen, wird in der nachfolgenden Tabelle 3 die Wirkung eines typischen erfindungsgemäßen Procidins, nämlich der Verbindung S-735 gegen ein Magengeschwür aufgeführt, das durch Ligatur des Pylorus der Shay-Ratte hervorgerufen worden war.

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T a t> e 1 le 3:

Wirkung von S-735 gegen Geschwüre

Dosierung Zahl der Anteil an Sekret des Pepsinakti- Mittlere Ge-

(mg/kg) Tiere Magensaftes (ml) vitätCug/m]) schwür-Kaßzahl

O 6 3,10 i 0,18 6,23 - 0,37 6

0,5 4 4,50 ± 0,34 0,51 - 0,32 3,75

5,0 4 5,08 - 0,27 0 0

Bemerkungen;

1. Bei den Ratten handelte es sich um männliche Viister vom Typ HLA, mit einem Körpergewicht von 180 bis 240 g;

2. unmittelbar nach der Ligatur des Pylorus wurde S-735 oral verabreicht. Nach 18 Stunden wurde der Magen extrahiert und mit bloßem Auge geprüft, ob ein Geschwür vorlag. Der Grad der Geschwürbildung ist in 6 Stufen eingeteilt mit Maßzahlen von O bis 6.

Die Toxizität von S-735ist außerordentlich gering; bei der Maus wurden LD™—Werte von 5 g/kg oder mehr bei oraler Verabreichung und von 0,5g/kg oder mehr bei interabdominaler Einspritzung ermittelt. D.h., die erfindungsgemäßen Procidine weisen eine sehr geringe Toxizität auf und zeigen trotzdem eine sehr stark Pepsin inhibierende Wirkung. Daraus folgt, diese Procidine sind brauchbar als

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«.sr

Arzneimittel zur Unterbindung oder Heilung von Magengeschwüren und Zwölffingerdarmgeschwüren, für welche Pepsin als eine der Ursachen angesehen wird.

Zur Erläuterung v/eiterer Details wird die Erfindung nachfolgend mit Bezugnahme auf Beispiele beschrieben; die Beispiele dienen lediglich zur Erläuterung der Erfindung, ohne diese einzuschränken.

Beispiel 1:

Streptomyces procidinanus wurde in eine Sakaguchi-Flasche mit einem Passungsvermögen von 500 ml eingeimpft, welche 100 ml steriles, flüssiges Medium mit einem pH-Wert von 7,0 mit den nachfolgenden Bestandteilen enthielt.

Glucose 1,096

Lactose 1,0%

Sojabohnenpulver 1,0%

Fleischextrakt 0,5%

Pepton 0,5%

Natriumchlorid 0,3%

Magne s iumsulfat 0,1%

Dikaliumphosphat 0,1%

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Die Kultivierung "bzw. Züchtung wurde bei 28⁰C im Verlauf von 2 Tagen unter wiederholtem Schütteln durchgeführt. Die Kulturbrühe wurde in Anteilen von jeweils 2,0 ml in 30 Sakaguchi-Flaschen mit einem Fassungsvermögen von 500 ml eingebracht, die jeweils 100 ml des oben angegebenen sterilisierten flüssigen Mediums enthielten; die Züchtung wurde in jeder Flasche bei 28⁰O für eine Dauer von 7 Tagen unter gelegentlichem Schütteln fortgesetzt, wobei 3,0 1 Kulturbrühe erhalten wurden. Diese Kulturbrühe wurde filtriert, und das erhaltene Filtrat wurde zweimal mit 2,0 1 n-Butanol behandelt, um aktive Substanzen zu extrahieren. Der n-Butanol-Extrakt wurde konzentriert, und das erhaltene Konzentrat wurde mit 200 ml Methanol vermischt, um das Konzentrat darin zu lösen. Die Lösung wurde anschließend durch eine Säule mit 100 ml aktivierter Holzkohle hindurchgeführt. 500 ml des Eluates wurden gesammelt und konzentriert und ergaben 1,8 g blaßgelber Pulver. Nach der Auflösung in Methanol und dem Aufziehen auf 2 g Siliciumdioxidgel wurden die Pulver stuf 150 g Siliciumdioxidgel überlagert, das in einer Säule (mit einem Durchmesser von 2,6 cm) gepackt war und daraufhin mit einem Lösungsmittelgemisch aus Chloroform, Methanol und Essigsäure (92,5 : 6 : 1,2) equilibriert und daraufhin mit diesem Lösungsmittelgemisch eluiert, Die Eluate wurden jeweils in Fraktionen von 15 g aufgefangen und mittels Dünnschicht-Chromatographie analysiert. Da-

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It

bei vrurde festgestellt, daß die Substanz S-735-M in den eluierten Fraktionen 43 "bis 51, die Substanz S-735 in den Fraktionen 53 bis 67 und die Substanz S-735-A in den Fraktionen 72-85 enthalten war. Die entsprechenden Fraktionen wurden gesammelt, konzentriert, die Substanzen getrocknet, anschließend aus wasserfreiem Methanol zweimal umkristallisiert, worauf 20 mg S-735-M, 18 mg S-735 und 180 mg S-735-A jeweils in Form feiner Nadeln erhalten wurden.

Beispiel 2:

Der Stamm Streptomyces procidinanus wurde in 4 Sakaguchi-Flaschen mit einem Fassungsvermögen von 500 ml eingeimpft, von denen jede 100 ml sterilisiertes flüssiges Medium mit einem pH-Wert von 7,0 mit den nachfolgenden Bestandteilen enthielt:

Glucose " 2,0%

Lactose 1,0%

Sojabohnenpulver 1,0%

Fleischextrakt 0,75%

Pepton 0,75%

Natriumchlorid 0,3%

Magne siumsulfat 0,1%

Dikaliumpho sphat 0,1%

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Die Züchtung erfolgte "bei 28 C im Verlauf von 2 Tagen unter gelegentlichem Umschütteln und ergab 400 ml Kulturbrühe. Die Kulturbrühe wurde in zwei Tanks mit 25 1 Fassungsvermögen überführt, von denen jeder 12 1 des obigen, sterilisierten flüssigen Mediums enthielt. Jedem Tank wurden ungefähr 100 ml Silikon zugesetzt und die Züchtung bei 28⁰C im Verlauf von 72 Stunden unter Rührung bei Luftzutritt durchgeführt. Die Kulturbrühe wurde filtriert und das erhaltene Filtrat wurde zweimal mit ungefähr 15 1 n-Butanol behandelt, um die aktiven Substanzen zu extrahieren. Der n-Butanol-Extrakt wurde konzentriert. Der konzentrierte Extrakt wurde mit einem Liter Hexan gewaschen und anschließend 500 ml Methanol zugesetzt, um das Konzentrat darin zu lösen. Die Lösung wurde durch eine Säule mit 300 ml aktivierter Holzkohle geführt und es wurden 1,51 Eluat gesammelt. Das Eluat wurde konzentriert und ergab 5,6 g gelblich-braune Pulver. Nach der Auflösung in Methanol und dem Aufziehen auf 3 g Siliciumdioxidgel wurden die Pulver auf 200 g Siliciumdioxidgel überlagert, das in einer Säule (mit einem Durchmesser von 4,5 cm) gepackt war, und mit einem Lösungsmittelgemisch aus Chloroform, Methanol und Essigsäure (92,5 : 6 : 1,2) equilibriert, und anschließend mit diesem Lösungsmittelgemisch eluiert. Das Eluat wurde jeweils in Fraktionen von 15g gesammelt, wobei die Substanz S-735-M in den eluierten Fraktionen 93 bis 101, die Substanz S-735 in den Fraktionen 109-12t und die Substanz S-735-A in den Fraktionen 125 bis 134 enthalten war. Die entsprechenden

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Fraktionen wurden gesammelt, konzentriert und die Substanzen getrocknet; im Anschluß daran wurde zweimal aus wasserfreiem Methanol umkristallisiert, wonach 140 mg S-735-M, 160 mg S-735 und 1680 mg S-735-A jeweils in Form weißer Fädeln erhalten wurden.

Beispiel 3:

(i) Der Stamm Streptomyces procidinanus wurde in eine Sakaguchi-Piasehe mit einem Passungsvermögen von 500 ml eingeimpft, welche 100 ml sterilisiertes flüssiges Medium mit einem pH-Wert von 7»0 mit den nachfolgenden Bestandteilen enthielt:

Glucose 1,0%

lactose 1,0%

Sojabohnenpulver 1,0%

Fleischextrakt 0,5%

Pepton 0,5% .

Natriumchlorid 0,3%

Magnesiumsulfat 0,1%

Dikaliumphosphat 0,1%

Die Züchtung unter Schütteln wurde bei 28⁰C im Yerlauf von 2 Tagen durchgeführt. Die Kulturbrühe wurde aufgeteilt und jeweils in einer Menge von 10 ml in 10 Sakaguchi-Flaschen mit einem Fassungsvermögen von 2 1 eingefüllt, welche jeweils

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500 ml sterilisiertes flüssiges Medium mit einem pH-Wert von 7,0 mit den folgenden Bestandteilen enthielt:

G-lucose 1,0%

Lactose 1,096

So j abohnenpulver 1,0%

!-Leucin 1,0%

Fleischextrakt 0,5%

Pepton 0,5%

Natriumchlorid 0,3%

Magnesiumsulfat 0,1%

Dikaliumpho sphat 0,1%

In jeder Flasche wurde die Züchtung bei 28⁰C im Verlauf von 7 Tagen unter gelegentlichem Schütteln durchgeführt, und ergab 5,0 1 Kulturbrühe. Die Kulturbrühe wurde filtriert, und das erhaltene Eiltrat wurde durch eine Säule mit einem Durchmesser von 3,3 cm geführt, in der 120 g aktivierter Holzkohle für die Chromatographie, die mit (480 ml) Wasser befeuchtet waren, gepackt waren. Nachdem die Säule mit 6,0 1 Wasser und mit 3,0 1 4o%igem Methanol gewaschen worden war, erfolgte die Eluierung mit 3,0 1 angewärmten Methanol bei 4O⁰C. Das mit Methanol eluierte Eluat wurde unter vermindertem Druck konzentriert und ergab 4,1 g blaßgelbe Rohpulver. Die Rohpulver wurden in Methanol gelöst und durch eine Säule mit einem Durchmesser von 2,2 cm geführt, in der

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264042Q

40 g aktivierter Holzkohle für die Chromatographie, die mit Methanol "befeuchtet waren, gepackt waren. Das mit 300 ml Methanol' eluierte Eluat wurde unter vermindertem Druck konzentriert und erga"b 2,3 g weiße Pulver.

(2) Die auf diese Weise erhaltenen weißen Pulver wurden nach der Auflösung in Methanol und dem Aufziehen auf 3,0 g SiIiciumdioxidgel auf 200 g Siliciumdioxidgel, das in einer Säule (mit einem Durchmesser von 2,6 cm) gepackt war, überlagert und mit einem Lösungsmittelgemisch aus Chloroform, Methanol und Essigsäure (36 : 12 : 2) equilibriert und schließlich mit diesem Lösungsmittelgemisch eluiert. Das Eluat wurde jeweils in Fraktionen von 20 g aufgefangen und diese mittels Dünnschicht-Chromatographie analysiert. Es wurde festgestellt, daß die Substanzen S-114 und S-346 in den eluierten Fraktionen 64 Ms 68 enthalten waren. Diese Fraktionen wurde gesammelt und unter vermindertem Druck konzentriert und ergaben 1,4 g weiße Pulver. Die Pulver wurden nach der Auflösung in Methanol und dem Aufziehen auf 2,0 g Siliciumdioxidgel auf 200 g Siliciumdioxidgel, das in einer Säule (mit einem Durchmesser von 2,6 cm) gepackt war, überlagert, und mit einem Lösungsmittelgemisch aus Butanol, Butylacetat, Essigsäure und Wasser (10 : 20 : 1 : 1) equilibriert, und schließlich mit diesem Lösungsmittelgemisch eluiert. Das Eluat wurde

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264042Q

in Fraktionen von jeweils 15 g aufgefangen und mittels Dunnschich.t-Chromatograph.ie analysiert. Dabei wurde festgestellt, daß die Substanz 3-346 in den eluierten Fraktionen 64 "bis 70 und die Substanz S-114 in den eluierten Fraktionen 73 "bis 85 enthalten war. Die entsprechenden Fraktionen wurden gesammelt, konzentriert und die Substanzen getrocknet. Die getrockneten Produkte wurden erneut in Methanol gelöst, und die Lösungen blieben an einem kühlen Ort stehen, wobei 178 mg 3-346 und 303 mg S-114 in Form von Nadeln anfielen.

An den verschiedenen, nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Procidinen wurden deren chemische und physikalische Eigenschaften bestimmt; die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 4 aufgeführt.

7 O 9 8 1 3 / 1 G 3 O

Tabelle

4:

Elementaranalyse:

S-735

C: 61,20% H: 9,68% N: 10,84%

S-114

0: 60,05% H: 9,30% N: 10,02%

S-346

C: 60,57%
H: 9,40%
N: 9,82%

S-735-A

C: 59,28% H: 9,17% N: 10,16%

S-735-M

C: 60,01% H: 9,28% N: 10,00%

Molekulargewicht:

641

699

713

685

699

-4 O CO CO

Schmelzpunkt:

Spezifisches Drehvermögen

UV-Absorptionsspektrum:

IR-Absorptions· spektrum:

NMR-Spektrum:

253-255⁰C	231-233⁰C	214-216⁰C	233-235°C	269-271 0
-83,45, (0,145% Methanol)	-78,61 (0,533% Methanol)	-71,95 (0,492% Methanol)	-86,86 (0,152% Methanol)	-85,42 (1,828% Methanol) I
kein Maxi mum, Absorp tion bei 210-400 nm	kein Maxi mum, Absorp tion bei 210-400 nm	kein Maxi mum, Absorp tion bei 210-400 nm	kein Maxi mum, Absorp*· tion bei 210-400 nm	kein Maxi- * mum, Absorp tion bei 210-400 nm
Fig. 1	Fig. 3 ·	Fig. 5	Fig. 7	Fig. 9
• Fig. 2	Fig. 4	Fig. 6	Fig. 8	Fig. 10 ,S₀ cn
				ο
				ro ο

noch Tabelle 4s

S-735

S-114

S-346

S-735-A

S-735-M

Massenspektrum:

Molekülionpeak:

641 m/e

Molekülionpeak des Methylesters: 713 m/e

Molekülionpeak des Methylesters:
m/e

Molekülionpeak des Methylesters : m/e

Molekülionpeak:

699 m/e

Bestandteile

Alanin: Talin: 4-Amino-3-hydroxy- 6-methy1-heptansäure: 3-Amino-2-hydroxy-5-methy1-hexan:

Iso-valeriansäure im Verhältnis

Alanin:
Valin:
Leucin:
4-Amino-3-hydroxy-6-methylheptansäure: Iso-valeriansäure im Verhältnis
1:1:1:2:1

Alanin:
Leucin:
4-Amino-3-hydroxy-
6-methylheptansäure:
Iso-valeriansäure im Verhältnis
1:2:2:1

Alanin: Valin:
4-Am'ino-3-hydroxy- 6-methylheptansäure: Iso-valeriansäure im Verhältnis 1:2:2:1

Alanin: Valin: 4-Amino-3-hydroxy- 6-methylheptansäure 4-Amino- , 3-hydroxy-6-methylheptansäuremethylester: Iso-valeriansäure im Verhältnis 1:2:1:1:1

CD

to

IT

Leerseite

Claims

Patentansprüche :

_v1. Ein Procidin der nachfolgenden allgemeinen Strukturformel :

CH_x CH_x OH_x CH_x

CH_x CH CH CH

CH R, R₀ CH₀OH CH_x CH₀OH

I I¹ I² I ²I I ³ I ².l
CH₀COHH-CH-COIIH-CH-COIiH-CH-CH-CH₀COlTH-CH-COM-CH-CH-CH₀-R,

wobei die Reste R.. und R₂, welche identisch oder verschieden sein können, den Isopropylrest oder den Isopropyl-Methyl-Rest bedeuten; wobei der Rest R_x Wasserstoff bedeutet, wenn beide Reste R₁ und R_? für den Isopropylrest stehen, oder wobei der Rest R_x den Carboxylrest bedeutet, sofern die Reste R₁ und R₂ verschieden sind, oder beide Reste R₁ und R₂ für den Isopropyl-Methyl-Rest stehen; wobei das Procidin als Gemisch von

München: Kramer ■ Dr.Weser · Hirsch — Wiesbaden: Blumbach · Dr. Bergen · Zwirner

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" ²' 264042Q

Verbindungen vorliegt, wenn die Reste R₁ und R₂ verschieden sind.
2. Das Procidin nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die nachfolgende allgemeine Strukturformel:

CH₃ CH₃ CH₃ CH₃

CH₃ CH₃ CH₃ CH₃ CH₃ CH₃ CH CH

CH CH CH CH₀OH CH, CH₀OH

I I i ²I I ³ I ²I

H₂CONH-CH-COM-CH-CONH-CH-CH-CH₂-CONH-CH-CONH-CH-CH-Ch₃
3. Das Procidin nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die nachfolgende allgemeine Strukturformel:

CH, CH, CH, CH, CH- GH, CBL CH,

X / ³ X / ³ \v ³ X / ³

CH₃ CH₃ CH CH CH CH

CH CH₂ CH₂ CH₂OH CH₃ CH₂OH CH₂COM-CH-COM-CH-COM-CH-CH-CH₂COM-CH-COM-CH-Ch-CH₂-COOH
4. Das Procidin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet» daß das Procidin aus einem Gemisch von Verbindungen mit den nachfolgenden allgemeinen Strukturformeln besteht, nämlich aus:

CH, CH^ CH, CH, CH- CH,

^/³N³/³ ^ / ³

OH, CH, CH_x CHL CH CH CH

CH CH CH₉ CH₉OH CH, CH₉OH

I I I ² f ²Il I ³ \ ²I

CH₂COM-CH-CONH-CH-COM-CH-CH-CH₂-CONH-CH-CONH-CH-CH-CH₂-COOh

- '" 164G42Q

und

ΠΈΓ r>TJ fill ΠΙΙ ΠΤΤ ΠΤΙ

Oil-, Oil™ 011-7 Oii^ ν>Ά·2 v/tl-z

\³/ ³ N³ / ³ ^ / ³

CH₅ CH₅ CH CH₅ CH₅ CH CH

CH CH₀ CH CHaOH CH_x CH₀OH

CH₂COIIH-CH-COIiH-CH-CONH-CH-CH-CH₂-COIiH-CH-COlIH-CH-CH-CH₂-COOH
5. Verfahren zur Herstellung von wenigstens einem Procidin mit der nachfolgenden allgemeinen Strukturformel:

CH^ CH-j CH^

n!/ ³ ^/ ³

CH^ CH CH

/ ³ I I :

CH R. R₀ CH₀OH CE, CH₀OH

¹ I² I 3| I³I ²H

CH₂CONH-CH-COMi-CH-COlIH-CH-CH-CH₂-CONH-CH-COIIH-CH-CH-CH₂-R

H-COIIH-CH-CH-CH₂-R₄

wobei die Reste R., und R_?, die identisch oder verschieden sein können, den Isopropylrest oder den Isopropyl-Methyl-Rest "bedeuten; wobei R, Wasserstoff, den Carboxylrest oder den Methylcarboxylat-Rest bedeutet, sofern beide Reste R^ und Rp für den Isopropylrest stehen, oder wobei der Rest R, den Carboxylrest bedeutet, sofern die Reste R₁ und R₂ verschieden sind, oder sofern beide Reste R₁ und R₂ für den Isopropyl-Methyl-Rest stehen; wobei das Procidin als.ein Gemisch von Verbindungen vorliegt, wenn die Reste R₁ und R₂ verschieden sind,

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2B4Ö420

dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm Streptomyces procidinanus in einem adäquaten Medium gezüchtet, und das gebildete Procidin isoliert wird.
6. Pharmazeutische Zusammensetzung, "bestehend aus einem Procidin nach Anspruch 1 und pharmazeutisch zulässigem Trägermaterial.

ORIGINAL

V IC30