DE2316965A1

DE2316965A1 - Proteaseinhibitoren, ihre herstellung und verwendung

Info

Publication number: DE2316965A1
Application number: DE2316965A
Authority: DE
Inventors: Tsuneo Asano; Atsushi Kakinuma; Tsuneo Kanamaru; Hiromu Sugino; Masahiko Yoneda
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1972-04-07
Filing date: 1973-04-05
Publication date: 1973-10-18
Also published as: CH585791A5; NO138214C; ES413425A1; HU170225B; NL7304783A; SE400577B; DK132899B; US3907764A; FI51369B; FI51369C; AT323695B; FR2182940B1; CA994693A; DK132899C; NO138214B; FR2182940A1; GB1430672A

Description

PATENTANWÄLTE

DR.-ING. VON KREISLEF: DR.-IMG. 5CHDNWAL3 DR.-ING. TH. MEYER DR. FUES DIPL-CHEM. ALEK VON KREISLER DIPL.-CHEM. CAROLA KELLER DR.-ING. KLÖPSCH DIPL.-ING. SELTING

KÖLN 1, DEICHMANNHAUS 2316965

Köln, den 4. April 1973 K3/Ax/Bt

TAKEDA CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.,

27,. Doshomachi-2-chorne, Higashi-ku, Osaka, Japan

Proteaseinhibitoren, ihre Herstellung und Verwendung

Eine eingehende Umschau unter den Metabo]iten von Mikrobien, die von der Anmelderin auf der Suche nach neuen Proteaseinhibitoren durchgeführt wurde, führte zu der Feststellung, daß gewisse Stämme der Gattung Streptomyces eine oder mehrere Substanzen, die die Aktivitäten von Pepsin und mehreren anderen Säureproteasen stark hemmen, anzuhäufen vermögen. In weiteren Versuchen gelang die Isolierung · dieser Substanzen in Kristal!form. Im Hinblick auf ihre Eigenschaften wurden zwei dieser Inhibitoren als "Pepsinostreptin" und "Pepsinostreptin-P" bezeichnet, und nach weiteren Untersuchungen wurde ein Verfahren zu ihrer Herstellung entwickelt.

Gegenstand der Erfindung sind demgemäß Pepsinostreptin, Pepsinostreptin-P und ihre Methyl ester, die nachstehend, falls nicht anders angegeben, jeweils allein oder als Gemisch zu mehreren einfach als "Pepsinostreptine" bezeichnet werden, ein Verfahren zur Herstellung der Pepsinostreptine sowie pharmazeutische Zubereitungen , die die Pepsinostreptine enthalten.

Gemäß der Erfindung werden die Pepsinostreptine hergestellt, indem man einen Mikroorganismus der Gattung Streptomyces, der Pepsinostreptine anzuhäufen vermag, in einem Nährmedium

³ 0 ^{9 8} <*^{2 f} ^{1 1} ° ⁶ ORIGINAL INSPECTED

züchtet, wobei der Mikroorganismus die gewünschte Substanz bzw. die gewünschten Substanzen im erhaltenen Kulturmedium bildet, und anschließend die Pepsinostreptine aus dem \ Kulturmedium isoliert.

Beim Verfahren gemäß der Erfindung können beliebige Stämme der Gattung Streptomyces, die Pepsinostreptine zu bilden vermögen, erfolgreich verwendet werden. Als Beispiele typischer Stämme sind Streptomyces ramulosus, Streptomyces citricolor und Streptomyces catenulae zu nennen. Beispielsweise seien die folgenden bekannten Stämme genannt:

Streptomyces ramulosus IFO 12812 ;

(für die Öffentlichkeit erhältlich, im IFO-Kataτ

]og von 1972 genannt) " :

Streptomyces citricolor Ferm-P 393 (ATGC ) ! Streptomyces catenulae IFO 12848 (ATCC 12476 )

Die Zahlen nach den Abkürzungen "IFO", "ATCC" und "Ferm-P" bezeichnen jeweils die Hinterlegungsnummern beim Institute for Fermentation, Osaka, Japan, bei der American Type CuI ture Collection in Rockville, Maryland, USA, und beim Fermentation Research Institute, the Agency of Industrial Science and Technology, Japan.

Diese Mikroorganismen werden nach der folgenden Methode ausgewählt: Mikroorganismen der Gattung Streptomyces werden in einem flüssigen Medium gezüchtet, und die pepsinhemmende Wirkung jeder Kultur wird auf einer Casein-Pepsin-Agarplatte bestimmt. Ein Pepsinostreptine bildender Stamm kann dann aus den Stämmen ausgewählt werden, die bei der vorstehend genannten Bestimmung eine hohe hemmende .Wirkung haben.

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Beim Verfahren gemäß der Erfindung wird ein Pepsinostreptine bildender Stamm in einem Nährmedium kultiviert. Das Medium kann f3üssig oder fest sein, jedoch ist es im allgemeinen zweckmäßiger, den Mikroorganismus in der Schüttelkultür oder aeroben Kultur unter Rühren zu schütteln.

Die Zusammensetzung des Nährmediums ist beliebig, so lange der verwendete Stamm darin wachsen und den Proteaseinhibitor anzuhäufen vermag. Das Medium kann als Kohlenstoffquellen beispielsweise Glukose, Lactose, Glycerin, Stärke, Saccharose, Dextrin, Melasse und organische Säuren und als Stickstoffquellen Pepton, Proteinhydrolysate, z.B. Casaminosäure (Difco Laboratories), N-Z-Ämine (Sheffield Chemical), Fleischextrakt, Hefeextrakt, Sojabohnenkuchen, Maisquel!wasser, Aminosäuren, Ammoniumsalze, Nitrate und andere organische und anorganische Stickstoffverbindungen enthalten. Als anorganische Salze können beispielsweise .verschiedene Phosphate, Magnesiumsulfat und Natriumchlorid dem Medium zugesetzt werden. Ferner können zur Förderung des Wachstums der Mikroorganismen Faktoren wie Vitamine und mit Nucleinsäure verwandte Verbindungen zugesetzt werden. Ferner wurde gefunden, daß durch Zusatz von Valin, N-Acylvalin und/oder Isobuttersäure zum Nährmedium die Anhäufung von Pepsinostreptin und/oder Pepsinostreptinmethylester bedeutend gesteigert wird, und daß bei Zugabe von Propionsäure die Anhäufung Von Pepsinostreptin-P und/oder seines Methyl esters gesteigert wird. Als Beispiele des N-Acyl restes von N-Acyl valin sind der N-Acetylrest und der N-Benzoylrest zu nennen. Die empfohlenen Mengen dieser Zusatzstoffe betragen etwa 0,25 bis 5*0$, vorzugsweise etwa 2 bis 4 $ für Valin und N-Acylvalin, etwa 0,25 bis 2,0$, vorzugsweise etwa 0,5 bis 1,0$ für Isobuttersäure und etwa 0,25 bis 5,0$, vorzugsweise etwa 0,5 bis 3,0$ für Propionsäure. Isobuttersäure und Propionsäure können in Form der Natriumsalze oder Kaliumsalze zugesetzt werden. Diese Zusatz-

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stoffe können zu Beginn der Ku]tivierung oder in mehreren Portionen während der Kultivierungsdauer zugegeben werden. Durch Züchtung der Mikroorganismen in Gegenwart dieser Zusatzstoffe kann die angehäufte Menge der gewünschten Pepsinostreptine maximal etwa 10-fach bis 20-fach gesteigert werden.

Die Zugabe von Schaumverhütungsmitteln, z.B. Siliconölen,., Polypropyleng]ykolderivaten oder Sojabohnenöl, zum Medium begünstigt die Steigerung der Ausbeuten an Pepsinostreptinen.

Zur Züchtung der Mikroorganismen ist es zweckmäßig, eine kleine Vorkultur durchzuführen und das Nährmedium anschliessend mit der erhaltenen Vorkultur zu impfen. Die Kultivierungsbedingungen einschließlich Temperatur und Bebrütungszeit und pH-Wert des Mediums werden so gewählt und geregelt, daß die Anhäufung der gewünschten Pepsinostreptine maxima] = ist. In vielen Fällen genügt es, den' Stamm aerob bei etwa 20° bis J35°C 1 bis 6 Tage zu kultivieren, während das Medium im pH-Bereich von etwa 4 bis 9*5 gehalten wird.

Das erhaltene Kulturmedium enthält Pepsinostreptine. Bei Verwendung eines flüssigen Mediums wird der überwiegende Teil der gebildeten Substanzen in der Flüssigphase angehäuft. Es ist daher zweckmäßig, zuerst das Mycel vom Kulturmedium durch Filtration oder Zentrifugieren zu entfernen und dann die Pepsinostreptine vom erhaltenen FiItrat oder überstand abzutrennen, jedoch können die Produkte wahlweise auch ohne vorherige Entfernung des Mycels gewonnen werden. Die Abtrennung und Reinigung der gewünschten Substanzen vom Kulturmedium kann leicht mit Hilfe einer geeigneten Kombination von verschiedenen Verfahren erfolgen, wobei die Wahl einer bestimmten Kombination von den chemischen Eigenschaften der Pepsinostreptine abhängt. Geeignet zur Abtrennung sind

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beispielsweise Verfahren wie Ausfällung mit einem Fällmittel, z.B. Ammoniumsulfat, Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, das mit Wasser nicht leicht mischbar ist und in dem die Pepsinostreptine löslich sind, z.B. mit n-Butanol, Auflösung in einem stark polaren Lösungsmittel wie Methanol oder Äthanol, Entfernung der Verunreinigungen durch Behandlung, beispielsweise mit Äthylacetat oder Hexan, Gelfiltration unter Verwendung verschiedener Typen von Dextranperlen, z.B. Sephadex (Pharmacia Fine Chemicals) oder dessen Äquivalent, Ionenaustauschchromatographie mit verschiedenen Ionenaustauschern wie Ionehaustauscherharz, Ionenaustauschercellulose, Ionenaustauscher-Sephadex (Pharmacia Fine Chemicals), Adsorptionschromatographie an verschiedenen Adsorptionsmitteln wie Aktivkohle, Aluminiumoxyd, Kiesel gel oder makromolekularen Adsorptionsmitteln, z.B. "Amberlite XAD-I und 2" (Rohm & Haas) usw. Natürlich können außer den vorstehend genannten Methoden beiiebige andere Reinigungsver-' fahren, die den Eigenschaften der Pepsinostreptine angepaßt sind, angewandt werden. Durch Anwendung einiger dieser Methoden in geeigneter Kombination können die Pepsinostreptine in kristalliner Form aus dem Kulturmedium isoliert werden.

Pepsinostreptin, Pepsinostreptin-P und ihre Methyl ester können getrennt voneinander auf einer Casein-Pepsin-Agarplatte durch Dünnschichtchromatographie an Kiesel gel unter Verwendung geeigneter Lösungsmittel systeme als Entwickler nachgewiesen werden. Beispiele solcher Lösungsmittel systeme und Rf-Werte von 4 Pepsinostreptinen mit diesen Lösungsmittelsystemen sind in Tabelle 1 genannt.

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- 6 -Tabelle 3

Rf-Werte in

Pepsinostreptine Lösungsmitte] A Lösungsmittel B

Pepsinostreptin 0,40-0,50 0,55-0,65

Pepsinostreptin-P .0,55-0,45 0,40-0,50

Pepsinostreptinmethy]ester 0,75-0,85 0,68-0,78

Pepsinostreptin-P-methy]ester 0,73-0,83 0,56-0,66

Lösungsmitte] A: Äthylacetat-Methanol (4:3) Lösungsmitte] B: n-Butano]-Essigsäure-Wasser-n-Butylacetat

(2O_:]:3:2O)

Durch Anwendung der zweidimensional en Dünnschichtchromatographie an Kiesel gel mit den Lösungsmitteln A und B als Entwickler können die Pepsinostreptine somit getrennt nachgewiesen werden.

Die Abtrennung eines Pepsinostreptins aus einer Lösung,^ die 'mehrere Pepsinostreptine enthält, kann ebenfalls durch Anwendung dieser Nachweismethode erfolgen. Beispielsweise kann jede Komponente aus dem Gemisch von vier Pepsinostreptinen durch Kombination von zwei aufeinander folgenden Trennstufen bei der Säul enchromatogr.aphie abgetrennt werden:

(3) Zuerst werden Pepsinostreptin und Pepsinostreptin-P von ihren Methyl estern durch Säulenchromatographie an SiIicagel mit Äthyl ac e tat-Methanol (5:3.) als ElutionslÖsungsmittel abgetrennt.

(2) Dann wird Pepsinostreptin von Pepsinostreptin-P oder der Pepsinostreptin-methy]ester vom Pepsinostreptin-P-methylester durch Sau!enchromatographie an SiIicagel mit η-Butano3-Essigsäure-Wasser-n-ßuty3acetat (30:1:3 :J>0); als E3utions3ösungsmittel abgetrennt.

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Die Abtrennung von Pepsinostreptin von Pepsinostreptin-P in der zweiten Stufe kann durch Sau]enchromatographie an einem makromolekularen Adsorptionsmittel, z.B. Amberlite XAD-2 (Rohm & Haas) mit einer alkalischen Methanol3ösung als Elutionslösungsmittel erfolgen.

Die in dieser Weise herstellbaren Pepsinostreptine haben die folgenden chemischen Strukturen, die aus den Ergebnissen verschiedener chemischer und physikalisch-chemischer Analysen, die in den späteren Beispielen beschrieben werden, geklärt wurden:

CH, CH, ■ " » ■

\V ³

_Ί CH, CH, CH, CH_x CH

R¹ \³/ ³ \³/ ³ I

I ' CH CH · CH- OH CH,

I ι I I²I r

C 0 N H C H C 0 H H C H C 0 Π C H C H C H₂ C 0 H H C H CH, CH_x " ^;

Λ³/ ³ · :

CH

CH₂ OH '

COJJHCHCHC H₂ COO R² .

In der vorstehenden Formel ist R ein Äthyl rest oder Iso-

p
propylrest und R ein Wasserstoffatom oder ein Methyl rest. Die Strukturen und die jeweiligen Pepsinostreptine haben die folgende Wechselbeziehung:

1 2
R R Pepsinostreptine

Äthyl Wasserstoff Pepsinostreptin-P

Äthyl Methyl Pepsinostreptin-P-methylester

Isopropy] Wasserstoff Pepsinostreptin

Isopropy] Methyl Pepsinostreptin-methylester

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Wie die vorstehende chemische Struktur zeigt, sind Pepsinostreptin und Pepsinostreptin-P saure Verbindungen und können a]s solche Deicht in Metallsalze, z.B. Salze mit Natrium, Kalium, Calcium und Aluminium, umgewandelt werden. Die hier gebrauchten Ausdrücke "Pepsinostreptine" und "Proteaseinhibitor" umfassen auch diese verschiedenen Salze.

Die Pepsinostreptine zeichnen sich durch ihre Fähigkeit aus, die Wirksamkeit von Pepsin und anderen sauren Proteasen stark zu hemmen. Die Aktivität als Pepsininhibitoren wurde nach der folgenden Methode bestimmt: \

Zu 1,9 ml eines Reäktionssystems, das aus 1,0 ml einer ' 0,6$igen Lösung von Substratcasein (z.B. Hammerstein-Casein, B Merck, A.G.) in 0,08-molarer Milchsäure, 0,7 ml einer mit 0,02 Mol KCl gepufferten 0,02 N-HCl (pH 2,0) und 0,2 ml einer Pepsinostreptine enthaltenden Probenlösung bestand, wurde .0,1 ml einer Lösung von kristal1inera'Pepsin (Sigma Chemical Company) einer Konzentration von 50/Ug/ml gegeben. Das . gesamte Gemisch (2 ml) wurde ^O Minuten bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zusatz von 2,0 ml einer 1,7-molaren Perch!orsäure]ösung abgebrochen. Das Gemisch wurde anschließend 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann durch Filterpapier filtriert. Eine Extinktion (A) des Filtrats bei 280 m-/U wurde gemessen. Getrennt hiervon wurde ein Vergleichssystem, das den gleichen Puffer, jedoch keine Pepsinostreptine enthielt, in der gleichen Weise behandelt, worauf seine Extinktion (B) gemessen wurde. Aus einer Eichkurve, die durch Auftragen der Extinktionen in Abhängigkeit von den Pepsinkonzentrationen gezeichnet wurde, wurden die restlichen Pepsinkonzentrationen (C) und (D) der Reaktionssysteme (A) und (B) bestimmt. Die Aktivität als Proteaseinhibitor wurde für jede Probe mit Hilfe der folgenden Gleichung berechnet: ·

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Inhibition in % = — χ 300

Die Bestimmung nach der vorstehend beschriebenen Methode ergab, daß die Menge der Pepsinostreptine, die zur Hemmung von 50$ der Aktivität von 5/Ug kristallinem Pepsin (ED₁₅₀) erforderlich war, etwas 0,05/Ug bei allen Pepsinostreptinen betrug.

Die Pepsinostreptine hemmen ebenfalls die Aktivität der sauren Protease von Rhizopus chinensis (Seikagaku Kogyo, K.K.) und der sauren Protease von Trametes sanguinia (hergestellt von der Anmelderin). Nach einer Methode ähnlich der vorstehend beschriebenen wurde unter Verwendung einer 0,oxigen Lösung von Casein in 0,05-molarer Milchsäure und einem 0,05-molaren Milchsäurepuffer (pH j5*0) festgestellt, daß die zur Inhibition von 50$ der Aktivität von 10 /Ug der sauren Protease von Rhizopus chinensis erforderlichen Menge etwa 0,05/Ug und die zur Inhibition von 50$ der Aktivität von 20/Ug der sauren Protease von Trametes sanguinia erforderliche Menge etwa 0,25/Ug für jedes Pepsinostreptin betrug.

Die Toxizität der Pepsinostreptine ist äußerst gering. Ihre LDp-Q-Werte, bestimmt durch Ermittlung der akuten Toxizität bei der Maus, lagen nicht unter 3 g/kg oral bei Pepsinostreptin und seinem Methyl ester und nicht unter 5 g/kg bei Pepsinostreptin-P und seinem Methyl ester. Bei intraperitonealer Verabreichung betrug der LD^-Wert 0,5 g/kg für alle Pepsinostreptine. ;

Die Pepsinostreptine haben eine geringe Toxizität, sind beständig in einem weiten pH-Bereich, hydrophil, leicht kristallisierbar, werden lange im Magen zurückgehalten und haben insbesondere die Fähigkeit, die Aktivität von Pepsin zu hemmen und hierdurch die Freigabe von Sialic-Säure aus :

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- 30 -

der Magens ch3eimhaut zu verhindern und Ulcera'bei Shay Ratten (künst3 ich erzeugte Ulcera) zu verhüten oder zu heilen. Die Pepsinostreptine können somit als Arzneimitte3 für die Prophylaxe und Hei3ung von Hyperpepsie, Hyperpepsinie, Magen- und Zwölffingerdarmgeschwüren, a3s deren Ursache Pepsin angesehen wird, und für die Norma3isierung der Azidität des Magensaftes verwendet werden.

A3s Beispie3 ist die Wirkung der Pepsinostreptine auf Magengeschwüre bei Ratten, die durch Abbinden des Py3orus■injiziert worden sind (siehe Gastroentero3ogy _5 09^5) ^3), sind in Tabe3 3e 2 genannt. Die Ergebnisse veranschau3ichen die Wirksamkeit der Pepsinostr'eptine. :

T a b e 3 3 e 2 I

Antiu3cerationswirkung von Peptinostreptineri Magensaft __,

Dosis
.mg/Tier

Gesamt- Gesamt- Pepsinvo3umen azidität aktivität m3 (/UÄqu./m3) /ug/m3

Ulceraindex -

keine Zugabe 3 8,8 Pepsinostreptin

0,2 36,7+0,7 2,0 20+0,9

Pepsinostreptinmethy3 ester

0,2 37,4+3,3

2,0 3 8,8+0,5 keine Zugabe 3 4 Pepsinostreptin-P

0,5 3.7,8+3,0

1,0 16,5+0,8

Pepsinostreptin-■P-methy3ester

3,0 3 6,0+3,3

305,0

3520

4,6 + 4

3 22,6+3,9	3 06+54	1,2+0,2
124,0+6,3	0+0	3,0+0
3 06,6+3 5,8	3 36+89	' 1,4+0,4
3 22,0+2,5	0+0	0,8+0,2
332,5±1,5	3253+58	4,0+0,6
95,6+4,0	3 23+35	1,2+0,2
85,2+5,4	37+64	0,9+0,2

80,5+8,5 23+I6

1,0+0,2

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Versuchsdurchführung: Männliche SD-Ratten, 7 Wochen alt, wurden verwendet. Jede Gruppe bestand aus fünf Tieren.Unmittelbar nach dem Abbinden des Pylorus erhielten die Tiere oral die jeweiligen Pepsinostreptine. Nach 16 bis 17 Stunden wurde der Magen jedes Tieres untersucht. DieUleera-Indices wurden nach der folgenden Skala festgelegt:

0 — normal ohne Ulcera ■ ;

1 = keineUlcera, jedoch werden Haemorragieflecken oder

Erosionen festgestellt.

2 bis 4 = zwischen 1 und 5; Ulzer vorhanden, jedoch ohne

Perforationen. :

5 = Perforationen: die meisten Ratten gehen ein. - ;

ι Von 18 Patienten mit peptischen Ulcera (13 Magenulcera, 4 Duodenalulceraund 3 Gastroduodenalulcera;!4 männliche und 4 weibliche Patienten, Alter 19 bis'64 Jahre) erhielten 12 Pepsinostreptin und 6 Pepsinostreptin-methylester jeweils in einer Tagesdosis von 200 mg in 4 Gaben zwei bis drei Stunden nach jeder Mahlzeit und vor dem Schlafengehen. Die Patienten wurden nach vier Wochen untersucht. :

1) Auffallende Heilungstendenzen wurden bei Röntgenuntersuchungen und gastroskopischen Untersuchungen in 13 Fällen beobachtet: Verschwinden der Ulcera in 10 Fällen, Besserung der Ulcera in drei Fällen.

2) Verschwinden von subjektiven Symptomen in 1.4 Fällen.

3) Verminderung der Azidität des Magensaftes (von Superazidität auf normal) in vier von sieben Fällen. I

4) Untersuchung auf okkultes· Blut im Stuhl: negativ in

13 Fällen. ^:

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In der gleichen Weise wurde Pepsinostreptln-P 6 Patienten mit peptischen Ulcera (j5 Magenulcera, 2 Duodenalulcera,' und 1 Gastroduodenalulcera; 5 männlichen Patienten und ein weib-] icher Patient, A3ter 2j5 bis 64 ,Jahre) in einer Tagesdosis von 200 mg in vier Gaben jeweils 2 bis 5 Stunden nach jeder Mahlzeit und vor dem Schlafengehen verabreicht. Nach vier Wochen wurden die Patienten untersucht.

1) Auffallende Heilungstendenzen wurden durch Röntgenuntersuchung und gastroskopische Untersuchung in fünf Fällen Fällen festgestellt (Verschwinden der Ul^er in vier Fällen, Besserung der Ulzer in einem Fall). ;

2) Verschwinden subjektiver Symptome in fünf Fällen.

3) Verminderung der Azidität des Magensaftes in einem von drei Fällen (von Superazidität auf normal). j

4) Untersuchung auf okkultes Blut im Stuhl: negativ in- ; Fällen. J

In keinem Fall wurden irgendwelche Nebenwirkungen festgestellt. !

Bei einem weiteren Versuch "betrug die-Pepsinwirkung von Magensaftproben, die von einem Patienten (männlich, 23 Jahre alt) mit Magengeschwüren entnommen wurden, · 0,4$mg/ml für das Michternsekret und 0,67 mg/ml bei einer Magensaftprobe, die 45 Minuten nach Tetragastrin-Stimulation genommen^wurde. 50fo der proteolytischen Aktivität entsprechend 2 ug Pepsin in diesen Magensäften wurden, durch 0,061 ug bzw, 0,051 Wg Pepsinostreptin und durch ^: 0,058 ug bzwo 0,050 ug Pepsinostreptin-P inhibiert,,

Bei der vorstehend genannten Anwendung beträgt die empfohlene Tagesdosis von Pepsinostreptin und Pepsinostreptin-P

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für Erwachsene etwa 1 mg Ms 10 g, vorzugsweise 5 mg "bis 5 g für die orale Verabreichung.

Die Pepsinostreptine können allein oder in Kombination mit pharmazeutisch unbedenklichen Trägern verabreicht werden» Sie können in Form von Pulvern, Tabletten, Lösungen oder Emulsionen oral genommen werden.

Pharmazeutische Zubereitungen, die ein oder mehrere Pepsinostreptine enthalten, können nach Verfahren, die für die Herstellung von Pulvern, Kapseln, Tabletten, Pillen usw. üblich sind, hergestellt werden. Die Träger werden in Abhängigkeit von der Anwendungsweise, der Löslichkeit der Pepsinostreptine usw. gewählt.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert. In diesen Beispielen verhalten sich Raumteile zu Gewichtsteileiwie Kubikzentimeter zu Gramm.

Beispiel 1 1) Herstellung von Pepsinostreptinen

Streptomyces ramulosus IFO 12812 wurde zur Impfung von 30 Raumteilen eines flüssigen Mediums (p_H 7,0} in einem Kolben mit einem Fassungsvermögen von 200 Raumteilen verwendet. Das Medium enthielt 3$ Glucose, 2$ Maisquellwasser, 0,05$ Dikaliumhydrogenphosphat, 0,02$ Ammoniumsulfat, 0,05$ Magnesiumsulfat und 0,5$ Calciumcarbonat und wurde 2 Tage bei 28⁰C auf einer Rotationsschüttelvorrichtung bebrütet» Mit je 15 Raumteilen des erhaltenen Kulturmediums wurden jeweils 500 Raumteile des flüssigen Mediums der vorstehend genannten Zusammensetzung in 2 Behältern geimpft, worauf 2 Tage bei 28⁰C auf einer Rotationsschüttelvorrichtung bebrütet wurde. Die hierbei erhaltene Kultur (insgesamt 1000 Raumteile) wurde zur Impfung von 30000 Raumteilen eines flüssigen Mediums (Pjj 7,0) verwendet, das in einem Fermenter mit einem Fassungsvermögen von 50000 Raumteilen enthalten war und 1$ Glucose, 0,7$ Pepton, 0,3$ Fleischextrakt, 0,3$

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Natriumchlorid und 0,2$ Dikaliumphosphat enthielt. Unter Zusatz von 30 Gew.-Teilen eines Schaumverhütungsniittels wurde die Fermentation 5 Tage bei 28⁰G unter Belüftung und Rühren durchgeführt.

Das erhaltene Kulturmedium wurde mit einer Filterpresse unter Verwendung von Diatomeenerde als Filterhilfsmittel filtriert. Das erhaltene. Filtrat wurde mit etwa 15000 Raumteilen Äthylacetat "behandelt,, Die Äthylacetatschicht wurde verworfen und die wässrige Schicht zweimal mit je 30000 Raumteilen n-Butanol behandelt, um die aktive Fraktion zu extrahieren. Der n-Butanolextrakt wurde eingeengt und der Rückstand in 3000 Raumteilen Methanol gelöst.

Die lösung wurde durch eine Säule von 500 Raumteilen Aktivkohle geleitet. 7500 Raumteile Eluat wurden aufgefangen und eingeengt, wobei 13 Gew.-Teile eines Pulvers erhalten wurden. Dieses Pulver wurde mit Äthylacetat- gut gewaschen» Die Waschflüssigkeit wurde verworfen und der. ■' Rückstand in 50$igem Methanol gelöst»

Die .Methanollösung wurde durch eine Aktivkohlesäule (500 Raumteile) geleitet, die mit 1500 Raumteilen 50$igem" Methanol gewaschen wurde. Die aktive Fraktion wurde mit 2000 Raumteilen Methanol eluiert. Das Eluat wurde eingeengt, wobei 11 Raumteile eines weißen Pulvers erhalten wurden. Die weitere Reinigung kann wie folgt durchgeführt werden: 0,15 Gew.-Teile dieses Pulvers wurden in einer geringen Menge eines Lösungsmittelgemisches aus n-Butanol, Essigsäure, Wasser und ButyLacetat (50:1:1:50) gelöst. Die Lösung wurde durch eine Kieselgelsäule , (967 Raumteile, Verhältnis von Innendurchmesser zu Höhe 4:77) geleitet. Die aktiven Fraktionen wurden mit dem gleichen Lösungsmittel eluiert. Die erste Fraktion (1000 Raumteile) wurde verworfen. Die anschließende Fraktion von 300 Raumteilen (diese Fraktion entspricht der aktiven Fraktion von Pepsinostreptin) und die Fraktion von 150 Raumteilen nach Elution von 1600 Raumteilen (dies entspricht der

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aktiven Fraktion von Pepsinostreptin-P) wurden getrennt aufgefangen und zur Trockene eingedampfte Die Rückstände wurden getrennt in Methanol gelöst und bei Raumtemperatur stehengelassen, wobei sich weiße Nadeln von Pepsinostreptin und Pepsinostreptin-P abschieden. Die Kristalle wurden aus Methanol umkristallisiert. Die Endprodukte wurden in einer Menge von 0,025 bzw. 0,01 Gew.-Teilen erhalten.

2) Analyse der erhaltenen Kristalle

Mit den Kristallen wurden verschiedene physikochemische

Analysen durchgeführt.

Tabelle 3

Physikochemische Eigenschaften von Pepsinostreptin und Pepsinostreptin-P

1) Schmelzpunkt

2) 1⁵

3) Elementaranalyse

4) W-Absorptionsspektrum

5) Infrarotspektrum

6) Kernmagnetisches
Resonanzspektrum

7) Massenspektrum
des Methylesters

8) IDcQ gegen Pep-

9) Bestandteile

Pepsinostreptin 236-238⁰C

Methanol)

C 59,12; H 9,34 N 10,59

keine Absorptionsmaxima bei 210^-400 mn

siehe Fig.1

siehe Fig.3

siehe Fig.5 Peak für molekulares Ion 685 m/e

0,048 ug

Alanin: Valin: 4-AminO"3-oxy-6-methylheptansäure = 1:2:2, etwa 1,1 mg Isobutteraäure aus 10 mg Kristallen Pepsinostreptin-P 210-212⁰G

-92,9° (0.49* Methanol)

0 57,53;H 9,05 N 10,52

keine Absorptionsmaxima bei 210 bis 450 mn

siehe Fig.2

siehe Fig.4

siehe Fig.6 Peak für molekulares Ion 671 m/e

0,05 m

Alanin:Valin: 4-Amino-3-oxy-6-methylheptansäure 1:2:2, etwa 2,0 mg Propionsäure aus 10 mg Kristallen

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Beispiel 2

1) Herstellung ·

Mit Streptomyces citricolor Ferm-P-Nr.393 (ATCC ). wurden 30 Raumteile eines flüssigen Mediums (p_H 7,0) geimpft, das in einem Korben mit.einem Fassungsvermögen von 200 Raumteilen enthalten war und aus 3$ Glucose, 2$ Maisquellwasser, 0,05$ Dikaliumhydrqgenphosphät, 0,02$ Ammoniumsulfat, 0,05$ Magnesiumsulfat und 0,5$ Calciumcarbonat "bestand. Das geimpfte Medium wurde. 2 Tage bei 28⁰C auf einer Rotationsschüttelvorrichtung bebrütet. Die erhaltene Kultur wurde in einen Kolben überführt, der ein Fassungsvermögen von 2000 Raumteilen hatte und 500 Raumteile des Mediums der vorstehend genannten Zusammensetzung enthielt. Das Medium wurde 2 Tage bei 28⁰C auf einer hin- und hergehenden Schüttelvorrichtung bebrütet. Die erhaltene Kultur wurde in einen Fermenter überführt, der ein Fassungsvermögen von 50000 Raumteilen hatte und 30000 Raumteile des flüssigen Mediums der vorstehend genannten Zusammensetzung enthielt« Nach Zusatz eines Schaumverhütungsmittels wurde das geimpfte Medium 2 Tage bei 28⁰C unter Rühren und Belüftung bebrütet.

Mit der erhaltenen Kultur wurden 1 000 000 Raumteile eines flüssigen Mediums (p_H 7,0) geimpft, das in einem Fermenter mit einem Fassungsvermögen von 2 000 000 Raumteilen enthalten war und 1$ Glucose, 3$ Pepton, 0,7$ Fleischextrakt, 0,3$ Natriumchlorid und 0,2$ Dikaliumphosphat enthielt. Unter Zusatz von etwa 500 Gew.-Teilen eines Schaumverhütungsmittels wurde das geimpfte Medium 3 Tage bei 28⁰C unter Belüftung und unter Rühren bebrütet, wobei etwa 1 000 000 Raum.teile eines Kulturmediums erhalten wurden.

Dieses Kulturmedium hatte eine Aktivität als Pepsininhibitor von 10,5 ug/ml, gerechnet für Pepsinostreptin, jedoch wurde durch Kombination von Dünnschichtchromatographie mit der Pepsin-InhibitOrbestimmungsmethode unter Verwen-

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dung einer Casein-Pepsin-Agarplatte, die nachstehend beschrieben wird, festgestellt, daß dieses Kulturmedium wenigstens zwei verschiedene Pepsininhibitoren enthielt,

2) Analyse

Die Dünnschichtchromatpgraphie wurde mit Proben d es Kulturmediums unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus Äthylacetat und Methanol (4:1) durchgeführt. Das an der Schicht haftende Lösungsmittel wurde abgedampft, . wobei eine trockene Schicht erhalten wurde. In der Zwischenzeit wurde eine 3$ige wässrige Agarlösung hergestellt und mit 0,4$iger Caseinlösung (p_H 2,0) im Volumenverhältnis von 1:1 gemischt. Das Geraisch wurde auf 50 C gekühlt und mit einer Lösung von kristallinem Pepsin in einer solchen Menge versetzt, daß das Gemisch eine Konzentration von 2 mg/100 ml hatte, worauf das Geraisch schnell gerührt wurde.

Das Gemisch wurde in eine Petrischale gegeben und einige Zeit stehen gelassen, während eine Casein-Pepsin-Agarplatte von 2 bis 3 mm Dicke hergestellt wurde. Die in der oben beschriebenen Weise beschriebene dünne Schicht wurde auf diese Agarplatte gelegt. Das Ganze wurde 10 Minuten in der Kälte gehalten, damit die auf der Dünnschicht entwickelten aktiven Faktoren in das Agar diffundieren konnten» Die dünne Schicht wurde dann abgestreift und die Agarplatte über Nacht bei 37°C gehaltene Die Agarplatte wurde durch die proteolytische Wirkung des Pepsins transparent» Wenn jedoch eine Inhibitorsubstanz für Pepsin vorhanden ist, bleibt das Agar undurchsichtig und trübe» Diese Methode stellt somit einen einfachen Test auf Pepsininhibitoren dar. Nach dieser Methode wurden zwei Inhibitoren festgestellt, die deutliche Flecken bei Rf 0,75 bis 0,85 bzw. Rf 0,4 bis 0,5 bei der Dünnschichtchromatographie ergaben, die mit dem vorstehend genannten Lösungsmittelsystem durchgeführt wurde.

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. - Ί8 -■-■■■

2315965

Diese beiden Substanzen wurden abgetrennt und getrennt gereinigte Zunächst wurde das oben genannte Kulturmedium mit Salzsäure auf Ρττ 4 eingestellt und dann mit einer Filterpresse filtrierte Das Filtrat wurde mit einer Natriumhydroxydlösung auf p_H 8 eingestellt und dann.'mit 300 000 Raumteilen n-Butanol extrahiert. Die n-Butanolschicht wurde eingeengt. Ein Zehntel des Konzentrats wurde mit Aktivkohle behandelt. Die Aktivkohle wurde abfiltriert. Das Filtrat wurde auf eine Kieselgelsäule aufgegeben und die aktive Fraktion mit einem Lösungsmittelgemisch aus Äthylacetat und Methanol', (4s 1 ) desorbiert. Alle aktiven Fraktionen wurden vereinigt, einge.-engt und an einer Kieselgelsäule unter den oben genannten Bedingungen chromatographiert, wobei die aktiven Fraktionen I und II getrennt aufgefangen wurden. Die Fraktion I wurde eingeengt und das Konzentrat an einer Kieselgelsäule mit einem Lösungsmittelgemisch aus Benzol, Methanol und Essigsäure (90:10:1) chromatographiert. Die hierbei erhaltene aktive Fraktion wurde eingeengt und auf eine Aktivkohlesäule aufgegeben-. Nach einer Wäsche mit 60$igem wässrigem Methanol wurde die aktive Fraktion mit Methanol eluiert und das Eluat eingeengte Dieses Konzentrat wurde weiter auf eine Säule des Ionenaustauschers "Sephadex LH-20" (Pharmacia Fine Chemicals) aufgegeben. Die aktive Fraktion wurde mit Methanol eluiert. Das Eluat wurde eingeengt und stehen gelassen, wobei 0,10 Gew.-Teile weiße Nadeln (i) erhalten wurden.

In der gleichen Zeit wurde die Fraktion II unter den gleichen Bedingungen wie die aktive Fraktion I durch Säulenchromatographie an Kieselgel und Aktivkohle gereinigt, wobei 0,41 G-ew.-Teile weiße Nadeln (II) aus einer Methanollösung erhalten wurden. Die Rf-Werte dieser Produkte auf dem vorstehend genannten Dünnschichtcbromatograram betrugen 0,75 bis 0,85 für das Produkt I und 0,4 bis 0,5 für das Produkt II.

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Tabelle 4 zeigt die verschiedenen physikochemischen Werte für die Produkte I, II und den II-Methylester, der durch Behandlung des Produkts II mit Diazomethan erhalten wurde. Die Infrarotspektren dieser Verbindungen sind in Fig.? dargestellt.

Tabelle 4

Physikochemische Eigenschaften der Produkte I, II und des II-Methylester3

II

II-Methylester

Schmelzpunkt

Elementaranalyse Berechnet

Gefunden

270 - 272⁰C 237-239°0

-91°(0,25/o -95°(O,5?S

Methanol) Methanol

(C₃₄H₆₃N₅O₉) (C₃₃H₆₁N₅O₉)

C 59,56 C 59,02

H 9,20 H 9,09

N 10,22 N 10,43

C 59,50
H 9,16
F 10,03

C 58,50 H 9,14 N 10,51

271-273°C

-85°(0,5# Methanol

(C₃₄H₆₃N₅O₉)

C 59,56 H 9,20 N 10,22

C 59,21 H 9,35 N 9,71

Aus diesen Daten und den Ergebnissen der in Beispiel 1 beschriebenen verschiedenen Analysen wurde das Produkt II als das in Beispiel 1 erhaltene Pepsinostreptin identifiziert.

Andererseits stimmte die Verbindung I in Bezug auf die sie bildenden Aminosäuren und Fettsäuren völlig mit der Verbindung II überein. Aus ihrer Elementaranalyse (Tabelle 4) wurde der Verbindung I die Molekularformel C₃₄H₆₃N₅O₉ zugeschrieben, und diese war um ein Kohlenstoffatom und zwei Wasserstoffatome höher als die in gleicher Weise berechnete Formel C₃₃H₆₁NcOq der Verbindung II. Aus diesen experimentellen Daten wurde die Verbindung I schließlich als der Methylester der Verbindung II bestimmt.

3 09842/1106

Die Aktivität als Pepsininhibitor IDc₀ "betrug 0,054 Ag für die Kristalle I und 0,045 Wg für die Kristalle II..

Beispiel 3

Mit Streptomyces ramulosus IFO. 12812 (ISP 51QO) wurden 30 Raumteile eines flüssigen Mediums (p„ 7,0) in einem Kolben mit einem Passungsvermögen von 200 Raumteilen geimpfte Das Medium enthielt 5$ Dextrin, 3$ Sojabohnenmehl,. 0,7$ Pepton, 0,5$ CaIciurnearbonat, 0,05$ Eisen(Il)-sulfat, 0,05$ Mangansulfat, 0,05$ Magnesiumsulfat, 0,05$ Dikaliumphosphat und unterschiedliche Konzentrationen von DL-Valin oder L-Valin oder D-Valin oder N-Acetyl-DL-valin oder IT-Benzoyl-DL-valin. Das geimpfte Medium wurde 4 Tage bei 28⁰C auf einer Rotationsschüttelvorrichtung bebrütet. Die Bildung von Pepsinostreptin in. dem erhaltenen Kulturmedium wurde gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 genannt.

Tabelle 5

Einfluß der Zugabe von Valin und Anhäufung von Pepsinostreptin	0,25$	N-Acylvalin auf die
	0,5$	Angehäuftes Pepsino streptin, mg/ml
- - - ■	1,0$	0,13
DL-VaIiη	2,0$	0,28
	4,0$	0,42
	2,0$	0,67
	2,0$	0,99
	2,0$	0,84 .
L-Valin	2,0$	1,03
D-Valin	0,98
N-Acety1-DL-valin	0,95
N-Bensον1-DL-vali η	0,80

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Beispiel 4

Streptomyces citricolar Ferm-P-Nr.393 (ATGC ) wurde 4 Tage "bei 28⁰C auf die in Beispiel .3 beschriebene Weise gezüchtet,, Die angehäuften Mengen von Pepsinoatreptin und Pepsinostreptinmethylester wurden unabhängig - nach der in Beispiel 2 beschriebenen Casein-Pepsin-Agarplattenmethode bestimmte Die Ergebnisse sind in Tabelle genannt.

Tabelle 6

Einfluß der Zugabe von Valin und N-Acylvalin auf die Anhäufung von Pepsinostreptin und Pepsinostreptinmethyl- ester	2$	Angehäuftes Pepsinostrep tin, ug /ml	,0	I	5	Angehäufter Pepsinostrep- tinmethyl- ester, ug/ml
	2$	8,			2,1
_	2$	60		15
DL-VaIiη	2$	63		VJI
L-VaIiη	2$	59	14
D-Valin		41	12
N-Acetyl-DL-valin	39	10
N-Be nz oyl-DL-vali η	Beispiel

Mit Streptomyces ramulosus Ii¹O 12812 oder Streptomyces catenulae IPO 12848 (ATCC 12476) wurden je 50 Raumteile eines flüssigen Mediums (p_H 7,0) in einem Fermenter mit einem Passungsvermögen von 200 R_aumteilen geimpft. Das Medium enthielt 5$ Dextrin, 3$ Sojabohnenmehl, 0,5$ Pepton, 0,7# Calciumcarbonat, 0,05$ Eisen(H)-sulfat,~Ö,05$ Mangansulfat, 0,05$ Magnesiumsulfat, 0,05$ Dikaliumhydrogenphosphat und unterschiedliche Propionsäuremengen und wurde 4 Tage bei 28⁰C bebrütet. Die angehäufte Menge von Pepsinostreptin-P in jedem erhaltenen Kulturmedium wurde ermittelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 genannt.

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Tabelle 7

Einfluß der Zugabe von Propionsäure auf die Anhäufung von Pepsinostreptin-P - ' __■

Konzentration der Angehäuftes Pepsinostreptin-P, Propionsäure, $ mg/ml -'

IPO 12812 . "IPO 12848

0	0,05
0,5	0,31
1,0	0,56
2,0	0,80
3,0	0, 68
	Beispiel 6

0,02 0,10 0,19 0,28 0,23

Mit Streptomyces ramulosus IPO 12812 wurden je 500 Raumteile eines flüssigen Mediums (p_H 7,0) in zwei Kolben geimpft, die'ein Passungsvermögen von 2000 Raumteilen hatten. Das Medium enthielt 3$ Glucose, 2$ Maisquellwasser, 0,05$ Dikaliumhydrogenphosphat, 0,02$ Ammoniumsulfat, . 0,05$ Magnesiumsulfat und 0,5$ Calciumcarb.onat. Die beiden Kolben wurden auf einer hin- und hergehenden Schüttelvorrichtung 2 Tage bei 28⁰C bebrütet, wobei 1000 Raumteile eines Kulturmediums erhalten wurden»

Diese Impfkultur wurde in einen Permenter überführt, der ein Passungsvermögen von 50000 Raumteiler hatte und

' 30000 Raumteile des Mediums der vorstehend genannten Zusammensetzung enthielte Die Fermentation wurde 2 Tage bei 28⁰O unter Belüftung und Rühren durchgeführt= Die erhaltene Kultur wurde weiter in einen Permenter überführt, der ein Fassungsvermögen von 2.»000*000 Raumteilen hatte und I₀OOO₀OOO Raumteile eines flüssigen Mediums (P_H 7,0) enthielt, das 5$ Dextrin, 3$ Sojabohnenmehl, 0,7$ Pepton, 0,5$ Caleiumcarbonat, 0,05$ Eisen(II)-sulfat, 0,05$ Mangansulfat, 0,05$ Magnesiumsulfat, 0,05$ Dikaliumphosphat und 0,5$ Natriumpropionat (0,39$ als Propionsäure) enthielt» Unter Zugabe von etwa 500 Qewo-Tei-

' len eines Schaumverhütungsmittels wurde das geimpfte

0 9 8 4 2/1106

Medium bei 28⁰C unter Belüftung und unter Rühren bebrütet. Nach 16 Stunden wurden 10O₀OOO Raumteile einer vorher auf einen p^-Wert von etwa 7,0 eingestellten und sterilisierten 15$igen wässrigen Natriumpropionatlösung zugesetzt, worauf die Fermentation weitere 74 Stunden unter Belüftung und unter Rühren durchgeführt wurde. Das erhaltene Kulturmedium, das· ein Volumen von etwa 1„100o000 Raumteilen hatte, wurde zur Kristallisation von Pepsinostreptin-P wie folgt behandelt: Zunächst wurde das Kulturmedium mit einer Filterpresse mit Hilfe von Diatomeenerde filtriert. Das erhaltene Filtrat wurde mit 300.000 Raumteilen Äthylacetat behandelt. Die Äthylacetatschicht wurde verworfen und die Wasserschicht auf etwa 850.000 .Raumteile eingeengt, mit' Salzsäure auf P₁₁ 4,0 eingestellt und auf eine Säule von 100.000 Raumteilen Aktivkohle (Qualität Shirasagi, hergestellt von der Anmelderin) aufgegeben, wobei die aktive Fraktion adsorbiert wurde.

Die Säule wurde zunächst mit 200.000 Raumteilen Wasser und dann mit 300.000 Raumteilen einer 40$ Methanol enthaltenden wässrigen Lösung behandelt. Die aktive Fraktion wurde mit 500.000 Raumteilen Methanol desorbiert. Das Eluat wurde eingeengt, wobei 600 Gew.-Teile eines Pulvers erhalten wurden, das Pepsinostreptin-P enthielt.

Eine Menge von 50 Gew₀-Teilen dieses Pulvers wurde in 3000 Raumteilen 0,05N-Natri.umhydroxyd-Metbanol (55:45) gelöst. Nach Einstellung auf ρ_Η 10 wurde die Lösung durch eine Kolonne von 44.000 Raumteilen (Verhältnis von Innendurchmesser zu Höhe 1:7) eines'makromolekularen Adsorptionsmittels, z.B. Amberlite XAD-2 (Rohm and Haas) geleitet, das eine Teilchengröße von 74 bis 149« hatte.

Die aktive Fraktion wurde in einem linearen Gradientensystem von 0,05N-Natriumhydroxyd-Methanol (55:45) bis O,O5N-Natriumhydroxyd-Methänol (35:65) bei einem Gesamtvolumen von 200.000 Raumteilen eluiert. Die erste Fraktion von 8OeOOO Raumteilen wurde verworfen und die anschlies-

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sende Fraktion von 4O₀OOO Raumteilen, die Pepsinostreptin-P enthielt, wurde aufgefangen und mit Salzsäure auf P_H 3 eingestellt und dann auf eine Säule von 2000 Raumteilen Aktivkohle aufgegeben. .

Die Säule wurde mit Wasser und 40$igem wässrigem Methanol gewaschen, worauf das Pepsinostreptin-P mit Methanol eluiert wurde. Das Eluät wurde zur Trockene eingedampft, wobei etwa 28 Gew.-Teile eines weißen Pulvers erhalten wurden. Das Pulver wurde in heißem Methanol gelöst und die Lösung stehen gelassen, wobei 25 Gew.-Teile Pepsinostreptin-P als weiße Nadeln vom Schmelzpunkt 210-211 C erhalten wurden»
Elementaranalyse: C 57,58, H 9,06, N 10,51.

Beispiel 7

Streptomyces ramulosus Ii¹O 12812 und Streptomyces citricolor i¹erm-P-lire393 (ATCC ) wurden zum Impfen von . je 30 Raumteilen eines flüssigen Mediums (Pu- 7,0) verwendet, das in einem Kolben mit einem Fassungsvermögen von 200 Raumteilen enthalten war und 5$ Dextrin, 3$ Sojabohnenmehl, 0,7$ Peptori, 0,5$ Calciumcarbonat, 0,05$ Eisen(Il)-sulfat, 0,05$ Mangansulfat, 0,05$ Magnesiumsulfat und 0,05$ Dikaliumhydrogenphosphat enthielt. Unter Zusatz einer 25$igen Natriumisobutyratlösung (auf p_H 7,0 eingestellt) entweder unmittelbar nach der Impfung oder während der Kultivierung wurde das geimpfte Medium 4 Tage bei 28⁰C auf einer Rotationsschüttelvorrichtung bebrütet. Die gebildeten Mengen an Pepsinostreptin und Pepsinostreptinmethylester in den erhaltenen Kulturmedien wurden unabhängig nach der in Beispiel 2 beschriebenen Methode bestimmt» Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 genannt.

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Tabelle 8

Einfluß der Zugabe von Natriumisobutyrat auf die Anhäufung von Pepsinostreptin und Pepsinostreptinmethylester

Mikroorganismus

Art der Zugabe von Natriumisobutyrat

Angehäuftes Pepsinostreptin mg/ml

Pepsino-

streptin-

methylester,

mg/ml

Streptomyoes ramulosus (ISP-51OO)

kein Zusatz 0,11

0,5$ sofort - 0,43

0,5$ nach 18 Std. 0,48

0,5$ sofort und 0,59 1,0$ nach 18 Std„ (insges.1,5$)

Streptomyces citricolor Perm-P-Nr. 393 (ATCC )

kein Zusatz 0,0072 0,0019

0,5$ sofort 0,036 0,0074

0,5$ nach 18 Std. 0,031 0,0087

0,5$ sofort und 0,042 0,0093 1,0$ nach 18 Std.

Beispiel 8

Streptomyoes citricolor Ferm-P-Nr.393 (ATCC ) wurde zur Impfung von 30 Raumteilen eines flüssigen Mediums (p_H 7,0) verwendet, das in einem Kolben mit einem Passungsvermögen von 200 Raumteilen enthalten war und 3$ Glucose, 2$ Maisquellwasser, 0,05$ Dikaliumhydrogenphosphat, 0,02$ Ammoniumsulfat, 0,05$ Magnesiumsulfat und 0,5$ Calciumcarbonat enthielt« Das geimpfte Medium wurde 2 Tage bei 28⁰C bebrütet und in einen Kolben überführt, der ein Passungsvermögen von 2000 Raumteilen hatte und 500 Raumteile des gleichen Mediums enthielt, worauf weitere 2 Tage bei 28⁰C bebrütet wurde. Das erhaltene Kulturmedium wurde in einen Fermenter überführt, der ein Passungsvermögen von 50.000 Raumteilen hatte und ein flüssiges Medium (p_H 7,0) enthielt, das aus 1$ Glucose, 3$ Pepton, 0,7$ Fleischextrakt, 0,3$ Natriumchlorid, 0,2$ Dikaliumhydrogenphoshat und 0,5$ Natriumpropionat (0,39$

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als Propionsäure) "bestand.

Unter Zusatz von etwa 20 Gewo-Teilen eines S.chaumverhütungsmittels wurde das geimpfte Medium "bei 28 C unter Belüftung und unter Rühren bebrütet. Nach 16 Stunden, gerechnet vom Beginn, wurden 3000 Räumteile" einer wässrigen Propionsäurelösung (I5$ig) zugesetzt, worauf die Fermentation weitere 50 Stunden durchgeführt wurde, wobei etwa 33000 Raumteile Kulturmedium erhalten wurden. Dieses Kulturmedium wurde mit einer Filterpresse filtriert. Das FiI-trat wurde mit Äthylacetat gewaschen<> Nach Entfernung der Äthylacetatschicht wurde die wässrige Phase auf 25 ο000 Raumteile eingeengt und nach Einstellung auf einen p^-Wert von etwa-4j5 durch eine Aktivkohlesäule geleitet. Die Säule wurde mit Wasser und Methanol (40$ige wässrige lösung) gewaschen, worauf die aktive Fraktion eluiert wurde.

Das Eluat wurde eingedampft, wobei,etwa 5 Gew.-Teile eines Pulvers erhalten wurden, das in Wasser gelöst und auf eine Kieselgelsäule aufgegeben wurde_c Die aktiven Fraktionen I und II wurden mit Äthylacetat-Methanol (5ίΐ) aus der ^: Säule eluiert. Die aktive Fraktion I wurde zur Entfernung des Äthylacetats und Methanols eingeengt und der Säulenchromatographie an Kieselgel mit einem aus n-Butanol, Essigsäure, Wasser und Butylacetat (30:1:1:30) bestehenden Lösungsmittelsystem unterworfen. Die so gereinigte Fraktion I wurde erneut auf eine Aktivkohlesäule aufgegeben. Die Säule wurde mit Methanol (50$ige wässrige Lösung) gewaschen und das Eluat zur Trockene eingedampft» Der Rückstand wurde in einer kleinen Methanolmenge gelöst und stehen gelassen, wobei 0,09 Gew.-Teile weiße Nadeln erhalten wurden.

Die Behandlung der aktiven Fraktion II in der gleichen Weise wie die Fraktion I ergab etwa 0,32 Gew.-Teile weiße Nadeln. Durch Elementaranalyse, Schmelzpunkt, Aminosäure-

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zusammensetzung, Massenspektruni usw. wurden die beiden kristallinen Produkte als Pepsinoatreptin-P-methylester und Pepsinostreptin-P "bestimmt „

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Claims

Pat e η t a η s ρ r ü c h e " Proteaseinhibitoren der Formel '

CH₇ CH₃

CH CH₀ OH

I ι ti

CONHCHCONHC H CONHCHCHC H₂ COiTH-

CH

H₂ OH

C H C 0 N H C H C H C H₂ C 0 0 R²

1 2

in der R ein Athylrest oder Isopropylrest und R ein Wasserstoffatom oder ein Methylrest ist.
2)Verfahren zur Herstellung von Proteaseinhibitoren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus der Gattung Streptomyces, der den Proteaseinhibitor anzuhäufen vermag, in einem Kulturmedium, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und eine verwertbare Stickstoffquelle enthält, unter aeroben Be- . dingungen züchtet, bis der Proteaseinhibitor in wesentlichen Mengen im Kulturmedium angehäuft worden ist, und den Proteaseinhibitor aus dem Kulturmedium.isoliert.
3) Verfahren nach Anspruch 2. , dadurch gekennzeichnet, daß man Valin, ein N-Acylderivat von Valin und/oder Isobuttersäure dem Kulturmedium zur Steigerung der Bildung eines Proteaseinhibitors der in Anspruch 1 genannten

1 2

Formel, in der R ein Isopropylrest und R ein Wasserstoff atom oder ein Methylrest ist, zusetzt.
4) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Propionsäure dem Kulturmedium zur Steigerung der Bildung eines Proteaseinhibitor-s der in' Anspruch 1 ge-

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1 2

nannten Formel, in der R ein Athylrest und R ein Wasserstoffatom oder ein Methylrest ist, zusetzt.
5) Verfahren nach Ansprüchen 2 "bis A, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismen Streptomyces ramulosus, Streptomyces citricolor oderStreptomyces catenulae verwendet.
6) Pharmazeutische Zubereitungen zur Prophylaxe und Therapie von Magengeschwüren und Duodenalgeschwüren, Hyperpepsie und Hyperpepsenie und zur Normalisierung der Acidität des Magensaftes, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einem Proteaseinhibitor nach Anspruch in Verbindung mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger.
7) Pharmazeutische Zubereitungen nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Tagesdosis 5 mg bis 5 g eines Proteaseinhibitors nach Anspruch 1 enthalten.

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■ 30 L e e r s e i t e