DE1617909A1 - Alamethicin und Verfahren zu seiner Herstellung - Google Patents

Alamethicin und Verfahren zu seiner Herstellung

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    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/911—Microorganisms using fungi
    • Y10S435/945—Trichoderma

Description

RECHTSANWÄLTE
DR. JUR. DIPL-CHEM. WALTEI BEIL 1617909
ALFRED HOEPPENER
DR. JUR. DIPL-CHEM. H.-J. WOLFF ·
DR. JUR. HANS CHR. BEIL
623 FRANKFURT AM MAIN-HÖCHST
ADELONSTKASSE 5·
Unsere Fr. 13 465 3. NOV. 1969
The Upjohn Company Kalamazoo (Mich., V.St.A.)
Alamethicin und Verfahren zu seiner Herstellung
Gegenstand der Erfindung ist das neue Antibiotikum Alamethicin und ein Verfahren zu seiner Herstellung.
Alamethicin ist eine organische Verbindung, die
a) das Wachstum verschiedener Gram-negativer und Gram-positiver Bakterien hemmt,
b) in im wesentlichen reiner kristalliner Form in Methanol, Äthanol, Chloroform, Methylenchlorid, Aceton, Methyläthylketon löslich; in Äthylacetat und Amylacetat wenig löslich; in !form der freien Saure in Wasser verhältnismäßig unlöslich; in form seines Natriumsalzes in Wasser dagegen sehr gut löslich ist,
c) die Elementaranalyse O 54>89| H 8,21; Ii 15,66
d) die optische Drehung C0Ojp = *-5,0 (0,86 $ in Alkohol)
e) das Molekulargewicht 1755-1770
f) den pKa'-Wert 5,5 und
g) das in lig. 1 abgebildete charakteristische Infrarot-Absorptionsspektrum hat,
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Man erhält es in erfindungsgemäßer Weise durch Züchtung von Irichoderma viride NRRL 3199 i» einem wässrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen. Wegen seiner Eigenschaft, das Wachstum gram-positiver Mikroorganismen, z.B. von Bacillus subtills, Bacillus cereus. Staphylococcus aureus, Sarcina lutea und Salmonella gallinarum zu beeinträchtigen, kann das Alamethicin allein oder in Kombination mit anderen antibakteriellen Mitteln zur Verhinderung des Wachstums dieser Mikroorganismen bei Pflanzen, Tieren, z.B. Säugetieren, Vögeln, Fischen, Reptilien und bei Menschen verwendet werden. Bin anderer Anwendungszweck besteht im Zusatz zu sanitären Waschlösungen, die zum Händewaschen, zum Reinigen von Apparaturen, Fußböden, Möbeln oder infizierten Räumen verwendet werden können. Außerdem ist es als gewerbliches Konservierungsmittel, z.B. als bakteriostatisches Spülmittel für gewaschene Kleider, zum Imprägnieren von Papier oder Geweben und zum Unterdrücken des Wachstums von Mikroorganismen in Plattentests und auf anderen mikrobiologischen Medien brauchbar. Alamethicin bildet leicht Schaum und kann demzufolge als biologisch abbaubares Waschmittel verwendet werden.
Alamethicin behindert auch das Wachstum von KB Zellen (menschlichen Haut-Krebszellen) in Gewebe-Kultiiζ*«η.
Zur Herstellung des Alamethicins wird grichoderma viride NRRL 3199 (Hinterlegungsnummer bei der Northern Utilization and Research Division, Agricultural Research Service, US-Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA) in einem wässrigen Nährmedium unter submersen, aeroben Bedingungen gezüchtet. Zur Herstellung begrenzter Mengen kann auch eine Oberflächenkultur in Flaschen angewendet werden. Das wässrige Nährmedium enthält eine Kohlenstoffquelle, z.B. assimilierbare Kohlenhydrate, und eine Stickstoffquelle, z.B. assimilierbare Stickstoffverbindungen oder Eiweißstoffe.
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Bevorzugte Eohlenstoffquellen sind Glucose, brauner Zukker, Saccharose, Glycerin, Stärke, Maisstärke, Galaktose, Dextrin, Melasse oder dergl., bevorzugte Stickstoffquellen Maisquellwasser, Hefe, autolysierte Bierhefe mit Milch-Feststoffen, Soyabohnenmehl, Baumwollsaatmehl, Maismehl, Milch-Feststoffe, das Pankreas-Hydrolysat von Casein, Rückstände aus der Alkoholdestillation, Fischmehl, Eiweißhydrolysate tierischen Ursprungs, Fleisch- und Knochenabfälle oder dergl. Zweckmäßig verwendet man eine Kombination dieser Kohlenstoff- und Stickstoffquellen» Spurenmetalle, wie Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen und dergl., brauchen nicht zugesetzt zu werden, da als Bestandteile des Mediums Leitungswasser und ungereinigte Zusätze verwendet werden.
Die Züchtung kann bei jeder !temperatur durchgeführt werden, die ein zufriedenstellendes Wachstum des Mikroorganismus herbeiführt, beispielsweise zwiscl»«*:*. 18 und 40° C und vorzugsweise zwischen etwa 25 vmä 30° G0 Gewöhnlich wird eine optimale Bildung des Alamethicins in etwa zwei bis zehn Sagen erreicht. Das iTährmedium bleibt während der Züchtung normalerweise annähernd neutral oder basisch» Der Snd-pH-Wert ist teilweise von den gegebenenfalls vorhandenen Puffersubstanzen. abhängig und teilweise vom Anfangs-pH-Wert des Kulturmediums» der vorteilhaft vor der Sterilisierung auf etwa 6-8 eingestellt wird.
Wenn die Süohtung in großen Gefäßen und Sänke erfolgt» verwendet man sum Impfen vorzugsweise die vegetative Fora des Mikroorganismus mit nicht tie Sporen, um eine Verzögerung bei der Herstelliaig &©r neuen Verbindung und damit eine unwirtschaftliche Auexmtsung der Vorrichtung zu vermeiden. Dementsprechend stellt man sweckmäßig zunächst einen vegetativen Impfstoff in eines ,Kahrmedium her, indem man letzteres mit einer Boden- oder Sehräg-Kultur impft. Wenn auf diese Weise ein junger, kräftiger, vegetativer Impfstoff
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erhalten worden ist, wird er aseptisch in große Gefäße oder Tanks übergeführt. Das Medium, in dem der vegetative Impfstoff hergestellt wird, kann das gleiche sein wie das für die Herstellung des Antibiotikums verwendete. Es kann auch von diesem verschieden sein, sofern nur in ihm ein gutes Wachstum des Mikroorganismus erreicht wird.
Das neue Antibiotikum Alamethicin ist ein saures Polypepti-d, das in Methanol, Äthanol und ähnlichen Alkoholen! Chlorofgokn, Methylenchlorid und ähnlichen halogenierten Kohlenwasserstoffen! Aceton, Methyläthylketon, Isopropylbutylketon und ähnlichen niedrigen Alkanonen löslich! in A'thylacetat, Amylacetat, Butylacetat und ähnlichen aliphatischen Estern wenig löslich und in Form der freien Säure in Wasser verhältnismäßig unlöslich ist. Das Natriumsalz des Alamethicins ist in Wasser jedoch leicht löslich.
Zur Isolierung und Reinigung des Alamethioins kann eine Vielzahl von Verfahren angewendet werden, z.B. Lösungsmittelextraktion, Flüssig-Flüssig-Verteilung in einer Craig-Apparatur, die Verwendung von Adsorptionsmitteln und die Kristallisation aus Lösungsmitteln, Man kann das Alamethicin aus dem Kulturmedium durch Adsorption an Holzkohle bei einem pH-Wert unter 7, vorzugsweise bei pH etwa 3-4» und anschließende EIution mit einem Lösungemittel, z.B. 50 tigern wässrigen Aceton, isolieren. Di· Gewinnung aus dem Acetonextrakt erfolgt in der nachfolgend beechriebenen Weise· Eine endere Methode besteht im Eindampfen des filtrierten Kulturmediums unter vermindertem Druck und dem Ansäuern der erhaltenen Lösung auf einen pH-Wert von etwa 3-4, zur Ausfällung des Alamethicins. Das in dieser Weise erhaltene rohe Alamethicin kann dann nach dem nachfolgend beschriebenen Verfahren gereinigt werden. Ein weiteres Gewinnungsverfahren besteht in der Extraktion des Kulturmediums mit einem niederen Alkohol, z.B. Butanol-(l) und dem Abdestillieren des Butanols,
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worauf das Alamethicin zurückbleibt und unter Anwendung der nachfolgend beschriebenen Verfahren weiter gereinigt wird. Nach einem bevorzugten Verfahren wird das Mycel in üblicher V/eise, z.B. durch Filtrieren oder Zentrifugieren, abgetrennt und die geklärte Brühe dann mit einer Mineralsäure, z.B. Salzsäure, angesäuert; darauf wird ein Filterhilfsmittel, z.B. Kieselgur, zugefügt und filtriert. Der Filterkuchen wird mit einem niederen Alkanon, vorzugsweise Aceton, extrahiert. Die Acetonextrakte werden vereinigt, unter vermindertem Druck eingeengt und durch Gefriertrocknung in ein trockenes Alamethicin-Präparat übergeführt. Dieses Präparat kann allein oder gemischt mit anderen Antibiotika überall dort angewendet werden, wo eine höhere Reinheit des Alamethicins nicht erforderlich ist.
Hochreines Alamethicin erhält man, wenn man das oben beschriebene Alamethißin-Präparat folgenden Reinigungsverfahren unterwirft. Das unreine Alamethicin kann durch direkte Kristallisation gereinigt werden, indem man es in einem warmen niederen Alkohol, z.B. 95 $igem Äthanol, auflöst und die Lösung langsam abkühlen läßt. Dabei kristallisiert das Alamethicin aus. Manche unreinen Alamethicin-Präparate können die Extraktion von die Kristallisation störenden Stoffen erforderlich machen. Hierzu können lösungsmittel, wie Diäthyläther, Methylisobutylketon oder Ithylacetat, Amylacetat, Butylacetat und ähnliche aliphatisehe Ester verwendet werden. Das extrahierte Material kann dann aus einem niedrigen Alkanon oder einem niedrigen Alkohol, wie oben angegeben, umkristallisiert werden. Der Zusatz von Wasser verringert die löslichkeit des Alamethicins in diesen lösungsmitteln und erleichtert damit seine Gewinnung. Ebenso verringert der Zusatz von Diäthyläther zu einer alkoholi-"schen AlamethicinlÖsung die löslichkeit und verursacht eine Kristallisation.
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Salze des Alamethicins erhält man aus der freien Säure und anorganischen oder organischen Basen. Die Alamethicinsalze kann man z.B. dadurch herstellen, daß man das Alamethicin in Form der freien Säure in Alkohol löst, die äquimolare Menge einer verdünnten Base zufügt, bis der pH-Y/ert der Lösung etwa 7 "bis 8 beträgt und die Lösung gefriertrocknet, worauf man einen trockenen Rückstand auB dem Alamethicinsalζ erhält. Auf diese Weise können Ammonium-, Natrium-, Kalium- und Calciumsalze sowie andere Salze des Alamethicins, z.B; solche mit organischen Basen, z.B. primären, sekundären oder tertiären Monoaminen, sowie Salze mit Polyaminen hergestellt werden. Ihre Herstellung kann auch nach anderen üblicherweise angewendeten Verfahren erfolgen. Wertvolle Salze werden ferner mit therapeutisch wirksamen Basen erhalten, die zusätzliche wertvolle therapeutische Eigenschaften verleihen, z.B. mit Purin-Basen, wie Theopyliin, Theobromin, Coffein oder Derivaten solcher Purin-Basenf Antihistamin-Basen, die Salze mit schwachen Säuren bilden; Pyridin-Verbindungen, wie Nicotinsäureamid, Isonicotinsäurehydrazid und dergl.j Phenylalkylaminen, wie Adrenalin, Ephedrin und dergl.| Gholin u.a. Die Salze des Alamethicins können für die gleichen Zwecke verwendet werden wie die . freie Säure.
Alamethicin eignet sich zur Bekämpfung von SaImQr=SlIa gallinarum bei Haustieren und Geflügel und von Staphylococcus aureus auf gewaschenem und gestapeltem Geschirr, Bestecken etc. Es kann auch zur Desinfizierung von verschiedenen zahnmedizinischen und medizinischen Instrumenten, die mit Staphylococcus aureus verunreinigt sind, Verwendet werden.
Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung. Falls nichts anderes angegeben ist, stellen alle Prozentangaben Gewichtsprozente und alle Lösungsmittelmengen Yolumteile dar.
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Beispiel .
A. Fermentation
Eine bodenprobe von Trichoderma viride, WRRL 3199, wurde zur Beimpfung einer Reihe von 500 ml Erlenmeyer-Kolben, die 100 ml eines sterilen Nährmediums der folgenden Zusammensetzung enthielten, verwendet:
Glucose-Monohydrat 25 g/l
Baumwollsaatmehl ' 25 g/l
Leitungswasser zum Auffüllen auf 1 1
1 vertrieben von der Trader's Oil Mill Company, Port Worth, Texas.
Die Kolben wurden drei Tage auf einer Gump-Schüttelmaschine bei 28° C und 250 U/Min, bebrütet.
Ein Teil des oben beschriebenen Impfstoffs (5 ml) wurde' zur Beimpfung einer fieihe von 500 ml Erlenmeyer-Kolben verwendet. Jeder Kolben enthielt 100 ml eines sterilen Nährmediums mit den folgenden Bestandteilen:
"Black-Strap^-Melasse 20 g/l
Dextrin 30 g/l
Eisehmehl 15 g/l
Baumwollsaatmehl 15 g/l
Die Kolben wurden fünf Tage auf einer Gump-Schüttelmaschine bei 25° C und 250 U/Min, bebrütet. Der behalt an Alamethicin im Kulturmedium wurde In Zeitabständen mikrobiologisch bestimmt.
Die Bestimmung erfolgte gegen Saroina lutea auf einem Agar-Nährboden (Baltimore Biological Laboratory, Baltimore, Maryland) . Der Nährboden wurde mit dem (Destorganismus im Verhält-
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nia 0,5 ml einer Über-Nacht-Kultur je 1000 ml Agar beimpft. Die Platten wurden bei 30° 0 über Nacht bebrütet. Eine typische Alamethicin-Fermentation ergab folgende Werte:
Dauer der Fermentation 2 0 Gehalt
(Tage) 2 ,4
1 VJl ,6 BU/ml
2 ,4 BU/ml
3 BU/ml
4 BU/ml
Eine Bio-Einheit (BU) ist diejenige Menge an Antibiotikum, die nach dem Auflösen in 0,08 ml der Testlösung und Aufbringen auf eine 12,7 mm Papierscheibe unter mikrobiologischen Standardbedingungen eine 20 ml Hemmzone ergibt.
B. Isolierung
Das gesamte Kulturmedium aus der oben beschriebenen Alamethicln-Fermentation wurde mit 3 Ί* seines Gewichtes an Kieselgur vermischt und filtriert. Das FIltrat wurde mit 37 #iger Salzsäure auf einen pH-Wert von 4t60 eingestellt. Dann wurde Kieselgur (1 Gew.^ deB Filtrate) zugefügt und das Gemisch erneut filtriert und fast bis zur Trockne abtropfen laesen. Der Filterkuchen wurde zweimal mit 1/8 Volumen Aceton» berechnet auf dae Volumen dee Filtrate, extrahiert. Die Aoeton-Bxtrakte wurden vereinigt und unter mehrmaliger Zugabe von Waeser bei vermindertem Druck zu einer wässrigen lösung eingedampft. Das verbleibende Konzentrat wurde zu einem trockenen Alamethicin-Produkt gefriergetrocknet. Sa« oben beechriebene Is olierungs verfahr en ergab /für die einzelnen Stufen die folgenden Alamethicin-aehaltej
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Menge Gehalt
Gesamtkultürmedium 1600 ml 5 ,4 BU/ml
Piltrat 850 ml 5 BU/ml
Erster Aceton-Extrakt 63 ml 34 ,6 BU/ml
Zweiter Aceton-Bxtrakt 106 ml 8 BU/ml
Trockenes Alamethicin-Präparat 2,72 g 1 BU/ml
1 Sarcina· lutea-Bestimmungt wie oben beschrieben
0. Reinigung
5 g des oben erhaltenen rohen Alamethicin-Präparats wurden unter Erwärmen auf 40° C in 100 ml 95 tigern Äthanol gelöst. Diese Lösung wurde dann mit einer zur Entfärbung ausreichenden Menge Aktivkohle behandelt. Zu der entfärbten Lösung wurde Diäthyläther bis zur Trübung zugegeben. Dann wurde über Nacht gekühlt. Die ausgefallenen Kristalle wurden abfiltriert und durch Auflösen in Alkohol und Zugabe von Äther wie oben umkristallisiertj Ausbeute 1,3 g kristallines AIamethicin.
Natriumaalz des Alamethicins
1,0 g Alamethicin, hergestellt wie in Beispiel 1, wird in
6 ml absolutem Äthanol gelöst und die Lösung mit der äquimolaren Menge verdünntem Uatriumhydroxid versetzt, bis der pH-Wert der Lösung etwa 7-8 beträgt. Die Lösung.ergibt beim Gefriertrocknen das Natriumsalz des Alamethicins.
Kennzeichnung dea Alamethioina
Alamethicin ist ein Polypeptid mit den folgenden Eigenschaften:
Elementar-Analyse, gefunden: ö 54,89| H 8,21{ N 15,66 "Molekulargewicht: 1755-1770 (berechnet nach den im Molekül
vorhandenen Aminosäuren)
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Optische Drehung: C0Od^ =-5.o° (O,,86 # in Alkohol) Titration: pK'a = 5.5
Aminosäure Analyse: Nachfolgend sind die Aminosäuren aufgeführt, die in einem kristallinen Alamethicinpräparat nach der Methode von Spackman, Stein und Moore, Anal. Chem. 30, 1190 (1958) gefunden wurden.
Aminosäure Moläquivalente
Prolin 2
Glycin 1
Alanin 2
Valin 2
Leucin 1
Glutaminsäure 1
Außerdem waren zwei Äquivalente Glutamin (Amid oder Glutaminsäure) vorhanden.
Nach dem folgenden Verfahren wurde 2-Methylalanin (8 Mole) aus kristallinem Alamethicin isoliert.
2,5 g kristallines Alamethicin wurden mit 6 η Salzsäure 60 Stunden lang hydrolysiert. Das Hydrolyse-Prcc^akt wurde über eine Säule aus Dowex-1 (stark basisches Anionenaustausche rh ar ζ mit quaternären Ammoniumgruppen), die nach dem Verfahren von C.H.W. Hirs, S. Moore und W.H. Steinen JAOS 76, 6063 (1954) beschrieben ist, hergestellt worden war, chromatographiert. Die Mono-amino- und Mono-Biearbonsäuren, die zuerst aus der Säule eluiert wurden, wurden über eine Säule aus Dowex-50 (ein Polystyrolsulfonsäure-Harz), die nach der Methode von C.H.W. Hire, et. all., loc. cit. hergestellt worden war, chromatographiert. 2-Methylalanin wurde aus der Säule isoliert und durch Vergleich der IH- und
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NMR-Spektren mit denen einer authentischen Probe von 2-Methylalanin identifiziert.
Ultraviolett-Spektrum: Alamethicin zeigt nur End-Absorption in 0,01 η alkoholischer Säure oder Base.
Löslichkeit: Alamethicin ist löslich in Methanol, Äthanol und ähnlichen Alkoholen! Chloroform, Methylenchlorid und ähnlichen halogenierten Kohlenwasserstoffe^ Aceton, Methyläthylketon, Isopropylbutylketon und ähnlichen niedrigen Alkanonenj es ist wenig löslich in Äthylacetat, Amylacetat, Butylaoetat und ähnlichen aliphatischen Estern, und in Form der freien Säure verhältnismäßig unlöslich in Wasser. Das Natriumsalz des Alamethicins jedoch ist in Wasser leicht löslich.
Infrarot-Spektrums Das Infrarot-Absorptionsspektrum des Alamethicins in Mineralöl ist in Fig. 1 wiedergegeben. Alamethicin zeigt bei folgenden Wellenlängen (Angaben in cm"" ) Absorptionsbanden
3450 (M) 1410 (M)
3310 (S) 1380 (S)
3050 (M) 1362 (M)
2950 (S) (Öl) " 1295 (M)
2920 (S) (Öl) 1218 (M)
2850 (S) (Öl) 1190 (M)
1720 (M) 1170 (M)
1650 (S) 1097 (Schw)
1535 (S) 1042 (Sohw) ;
1462 (S) 920 (Schw)
1415 (M) 698 (Schw)
Die Bandenintensitäten sind mit "S", "M" bzw. "Schw" bezeichnet tmd stellen Schätzwerte in bezug auf den Hintergrund
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1Ü17S09
in der ITähe der Banden dar. "S"-Banden haben die gleiche Intensität wie die stärkste Bande im Spektrumj "M"-Banden haben eine Intensität zwischen einem Drittel und zwei Dritteln der Intensität der stärksten Bande und "Schwfr-Banden haben eine Intensität von weniger als ein Drittel der Intensität der stärksten Bande. Diese Schätzwerte wurden auf der Basis einer prozentualen Durchlässigkeitsskala ermittelt.
Antiprotozoon-Aktivität:
Alamethicin hemmt da.s Wachstum von (Petrahymena pyriformis und Ochromonas danica.
Fungizide Wirksamkeit;
Alamethicin hemmt das Wachstum der folgenden Fungi im Agar-Platten-Test: liocardia asteroldes, Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis, Hormodendrum compactum, Histoplasma capsulatum, Trichophyton rubrum, Trichophyton asteroides und Trichophyton mentagrophytes.
*
Die Test-Verbindung wird in Konzentrationmvon 1, 10, 100 und 1000 |"/ml auf Agar in Petri-Sehalen aufgetragen.
Suspensionen der Test-Fungi werden auf der Oberfläche des Agars ausgestrichen. Nach einer Inkubationszelt von 72 Stunden bei 28° C wurden die Petri-Schalen untersucht und der Grad der Wachstumshemmung ermittelt.
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Claims (7)

Patentansprüche
1. Alamethicinpräparat mit einem Gehalt von mindestens 5 Bioeinheiten/ml Alamethicin, einer Verbindung, die
a) das Wachstum verschiedener Gram-negativer und Grampositiver Bakterien hemmtr
b) in im wesentlichen reiner kristalliner Form in Methanol, Äthanol, Chloroform, Methylenchlorid, Aceton, Methylethylketon löslich; in Ithylacetat und Amylacetat wenig löslich; in Form der freien Säure in Wasser verhältnismäßig unlöslich; in Form seines ITatriumsalzes in Wasser dagegen sehr gut löslich ist,
c) die Elementaranalyse C 54-,89; H 8,21; ΪΓ 15,66,
d) die optische Drehung Jj0Oχ> = -5,0 (0,86 ?i in Alkohol),
e) das Molekulargewicht 1755-1770,
f) den pKa'-Wert 5,5 und
g) das in Fig. 1 abgebildete charakteristische Infrarot-Absorptionsspektrum hat.
2. Alamethicin in im wesentlichen reiner Form.
3. Alamethicinpräparat in trockener Form mit einem Gehalt von mindestens 1 Bioeinheit/mg Alamethicin.
4. Alkalimetall-, Erdalkalimetall- und Aminsalze des AIamethicins.
5. Alamethicinpräparat nach. Anspruch 1 in Form des Natriumsalzes. -
6. Verfahren zur Herstellung eines Präparates mit einem Gehalt von mindestens 5 Bioeinheiten/ml AlametMcin,
dadurch gekennzeichnet, daß man Trichoderma virlde NRRL 3199 unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen^ assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff enthaltenden Nährmedium züchtet und das Alamethicin aus dem Kulturmedium gewinnt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß • man das Alamethicin durch Filtrieren des Kulturmediums,
Ansäuern des Filtrats, Zugabe von Kieselgur zum angesäu- f erten Filtrat, Filtrieren der Mischung, Extrahieren des Filterkuchens und Isolieren des Alamethicina aus den Extrakten gewinnt.
Für
The Upjohn Company Kalamazoo, Mich., V.St.A,
Dr.lLJ.WolH
R e ent sanwalt
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