DE1617902A1

DE1617902A1 - Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Armentomycin

Info

Publication number: DE1617902A1
Application number: DE19661617902
Authority: DE
Inventors: Argoudelis Alexander Demetrios; Mason Donald Joseph; Herr Ross Robert
Original assignee: Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1965-04-16
Filing date: 1966-04-14
Publication date: 1970-02-12
Also published as: NL6604978A; GB1131079A; US3342681A

Description

Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Armentomy-

cin .

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellüng-jies Antibiotikums Armentomycin (U-10,923). ■

Armentomycin ist ein biosynthetisches Produkt, das durch Züchten eines armentomycin-bildenden Actinoniyzeten in einem wässrigen Mhrmedium hergestellt wird. Es ist eine amphoter« Substanz^ die die Eigen schaft besitzt, das Wachstum gewisser Organismen, insbesondere Bakterien, z.B. Pseudomonas aeruginpsa_s Proteus vulgaris» Proteus mirabilis* Saliaonella gallinarum, Proteus rettgeri und Bscüerichia eoli zu beeinträchtigen und kaHH allein oder in iiosibinatioK mit anderen antibakteriellen Mitteln vertjeiidet x-ieröss.,, vm das Wachstum derartiger in vei^sehiedsnen

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vorkommender Organismen zu verhindern oder ihre An zahl zu verringern. Beispielsweise kann es in Papierfabriken verwendet werden, um das Wachstum von Aero bacter aerogenes zu verhindern, das bekanntlich in derartigen Anlagen Schleim erzeugt. Es ist auch als Öl konservierungsmittel geeignet, z.B. als bakteriostatisches Mittel zur Wachstumshemmung von Proteus vul garis, das bekanntlich das Verderben von Schneidölen verursacht. Außerdem ist es in Waschlösungen für sanitäre Zwecke geeignet, z.B. zum Händewaschen und zum Reinigen von Geräten, Böden oder Einrichtungen verun reinigter Bäume oder Laboratorien; es ist ferner als industrielles Schutzmittel geeignet, z.B. als bacteriostatisches Spülmittel für gewaschene Kleidungsstücke und zum Imprägnieren von Papier und Geweben und es ist zur Wachstumshemmung empfindlicher Organismen in Plattenkultüren und anderen biologischen Medien geeignet. Es kann auch als Nahrungsmittelzusatz verwendet werden, um das Wachstum von Tieren, z.B. Säugetieren, Vögeln, Fischen und Reptilien zu fördern.

Der Mikroorganismus:

Der erfindungsgemäß zur Herstellung von Armentomycin verwendete Actinomyzet wurde als S. armentosus var. armentosus nov. sp. bezeichnet. Eine seiner Zucht eigenschaften ist die Bildung von Armentomycin. Eine Subkultur des lebenden Organismus kann unter der Nummer NRRL 3176 von der ständigen tJamialung -er Nor them Utilization and Research Divir^ion, Agvicul tural Research Service, U.S. Department of Agricul ture_s Peoria_s Illinois, U.S.A. erhalten werden.

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Die Eigenschaften von Streptomyces armentosus var. armentosus nov. sp., NEHL 3176» sind in den folgenden Tabellen angegeben:

Tabelle I : Tabelle II: Tabelle III

Tabelle IV: Tabelle V :

Aussehen auf Ektachrom; Mikroskopische Eigenschaften;

Assimilierung von Kohlenstoffverbindungen in synthetischem Medium (J. Bact. Band 56, Seite 107-114, 1948);

Kultureigenschaften;

Farbe nach dem Color Harmony Manual, 3. Auflage, 1948 und dem ISCC-NBS-Verfahren zur Bestimmung von Farben und einem Wörterbuch von Farbnamen, NBS Rundschreiben, 553.

Tabelle I:

Aussehen von Streptomyces armentosus var. armentosus nov. sp. auf Ektachrom .

Agar-Medium

Oberfläche

Unterseite

Bennett's Medium Czapek*s Sucrose

Maltose Trypton Pepton-Eisen 0,1 io Tyrosin Kaseinstärke

lacherosa blassrosa

lachsrosa Spur rosa blassrosa rosa

gelblich-braungelb farblos bis blassrosa

braungelb braun
blassrosa blass braungelb

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- 4 -Tabelle II:

Mikroskopische Eigenschaften von Streptomyoes annen -tosuB var. annentoeus nov. sp«

Lichtmikroskop: Sporophoren grade_f offene

Schleifen und Spiralen;

£1ekt ronenmikrο ek op:

Direkt Sporen wurstart ig, glatt;

Kohlenstoffreplika Sporen glatt mit Leistenbildung und etwas Korb flechteffekt.

Tabelle III;

Aeaimilierung von Kohlenstoffverbindungen in synthetischem Medium (J. Bact. Band 56. Seite 107-114. 1948) durch Streptomyces araentosus var. annentosus nov.sp.

Kontrolle (+)

1. D-Xylose +

2. L-Arabinose . +

3. Rhamnose +

4. D-Fructose (+)

5. D-Galactoee +

6. B-Ölucose +

7. IVMannose +

8. Maltose +

9. Saccharose (+)

10. Lactose (+)

11. Cellobiose +

12. Raffinose (-)

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- 5 -Tabelle III (Fortsetzung)

13. Dextrin +

14. Inulin (-)

15. lösliche Stärke +

16. Glycerin +

17. DuIoit (-)

18. D-Mannit (-)

19. D-Sorbit (-)

20. D-Inoait +

21. Salicin (-)

22. Phenol (-)

23. Cresol (-)

24. Na-Format (-)

25. Na-Oxalat (-)

26. Na-Tartrat (-)

27. Ha-Salioylat

28. Na-Acetat

29. Na-Citrat

30. Ha-Suocinat

+ 3 poaitire Asaimilierung; (-) » leichtes Wachstum, kein· Aesimilierune

(+) - positive AeeiBilierung

leichtes Wachstue; - * kein Wachetua.

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Tab·11· IVt

Kultureigenachaften τοη Streptomyces armentosua Tar, armentosus nov. sp.

Medium

Pepton-Eisen-Agar

Calciuamalatagar

Glucoae-Aaparagin-Agar

Oberfläche

(Luftwach a turn)

weiß

gut, Sandalhols

grauweiß

Magermilch-Agar grau um den Rand

Tyroain-Agar Xanthin-Agar

Agar

weißgrau .

weiß

rosa und grau

Rückseite

braungelb

farblos

cremefarben

gelbbraungelb

hellgelb

Pigment

braungelbbraun

keines

braun -braungelb

braungelb

keines

cremefarben keines

sonstige Angaben

Melanin +

Malat löslich gemacht

keine

Kasein um das Wachstum herum löal. gemacht

Tyrosin löslich ge · macht

Xanthin löslich gemacht

Stärke löslich gemacht

co • ο

Medium	Oberfläche (Luftwachstum)	Rückseite
Tomatenpaste- Hafermehl-Agar	weiß	farblos
sythetischer Nitratbrei	weiß	keine
Nähr-Nitrat-	rosa-weiß	keine
Lakmusmilch	keine	keine

Tabelle IY (Fortsetzung)

einfache Gelatine Spur weiß

Nährgelatine

Spur weiß

keine

keine Pigment

keines keines

keineβ blau

gelbbraungelb

gelb-braungelb in 1/3 des Glases

sonstige Angaben

keine

keine Reduktion

gewisse Peptonisierung, pH-Wert 7,1

Spuren von Ver- -^J flüssigung '

Verflüssigung in des Glases

Tabelle V:

Farbe von Streptomyces armentosus var. armentosus nov, ep. nach dem Color Harmony Manual, 3· Auflage, 1946 und dem ISOO-NBS-Verfahren der Bezeichnung von Farben und einem Wörterbuch von Farbnamen, NBS Runde ehr ei -

ben 553.

Medium
Bennets

Czapeks
Saccharose

Maltose-Trypton

Oberfläche

l) 5 ob = unbezeichnet

2)

1) 5 ba = muschelrosa

2) 9m

weiß

» rosa-

1) 5 ba = muschelrosa

2) 9 m = rosaweiß

Rückseite

2 ge β bambus, chamois

90 gm = graugelb

2 db
bein

89 gm
gelb

90 g β graugelb

121 m = blaßgelb-grUn

2 gc = bambus,
chamois

90 gm
gelb

grau

Pigment

2 gcM+ = bambuß, chamois

90 gm = graugelb

β elfen- keines

blaß- keines

2 gcM = bambus, mois

90 gm = graugelb

cha-

= Matte Oberfläche (alle anderen glänzend).

Die erfindungsgemäße Verbindung wird gebildet, wenn der produzierende Organismus in einem wässrigen

_{β 8} 7 /

Nähnnedium unter submersen aeroben Bedingungen ge züchtet wird* Ee ist ferner zu beachten, daß für die Herstellung begrenzter Mengen, Oberfläohenkultüren in Flaschen verwendet werden können. Der Organismus wird in einem Nährmedium gezüchtet, das eine Kohlen stoffquelle, z.B. eine assimilierbare Stickstoffverbindung oder »inen proteinhaltigen Stoff enthält. Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind u.a. Glucose, brauner Zucker, Saccharose, Glycerin, Stärke, Maisstärke, Galactose, Dextrin, Melassen und dgl.. Bevorzugte Stickstoffquellen sind u.a. Maiaquellwasser, Hefe, autolysierte Brauereihefe mit Milchfeststoffen, Sojabohnen mehl, Baumwollsamenmehl, Maismehl, Milchfeststoffe, Pancreas-Digest von Kasein, Schlempe, Fischmehl, tierische Peptonfltissigkeiten, Fleisch- und Knoohenabfälie und dgl.. Vorteilhaft erweise kann eine Kombination die-? ser Kohlenstoff- und Stickstoffquellen verwendet werden. Spurenmetalle, z.B. Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Bisen und dgl. brauchen der Gärung nicht züge setzt werden, da Leitungswasser und ungereinigte Stoffe als Beetandteile der Medien verwendet werden.

SLe Herstellung der erfindungsgemäflen Verbin dung kann bei jeder beliebigen Temperatur erfolgen, die ein zufriedenstellendes Wachstum des Mikroorganis raus zuläßt, z.B. zwischen etwa 18 und 40 C und vorzugsweise zwischen etwa 25° und 50⁰C. Gewöhnlich wird eine optimale Bildung der Verbindung in etwa 2 bis 10 Sagen erhalten» Während der Gärung bleibt das Medi« sä>f «=» malerweise nahezu neutral oder etwas sauer. Be? ©siel "« gültige pH-Wert hängt teilweise von eventuall denen Puffern und teilweise von dem anfängliches

.iöiSII/HSS

Wert des Kulturmediums ab, das vorteilhaft erweise vor der Sterilisierung auf einen pH-Wert von 6 bis 8 eingestellt wird.

Wenn die Züchtung in großen Gefäßen oder Tanks durchgeführt wird, ist es vorzuziehen, statt der Sporenform die vegetativ« Fora der Mikroorganismen für die Impfung zu verwenden, um eine deutliche Verzögerung bei der Bildung der neuen Verbindung und die sich daraus ergebend· unwirtschaftliche Ausnutzung der Anaige zu vermeiden. Dementsprechend ist es erwünscht, ein vegetatives Inokulum in einer Nährbruhenkultur herzustellen, indem man die Mährbrühenkultur mit einer gleichen Menge einer Boden- oder Schrägbodenkultur impft. Wenn ein junges, aktives, vegetatives Inokulum auf diese Welse sichergestellt ist, wird es aseptisch in große Gefäße oder Tanks überführt. Das Medium, in dem das vegetative Inokulum hergestellt wird, kann das gleiche oder verschieden von dem sein, das für die Herstellung der neuen Verbindung verwendet wird, so -lange es so beschaffen ist, daß ein gutes Wachstum das Mikroorganismus erzielt wird.

IHe erfindungsgemäß herstellbare Verbindung ist eine amphoter» Verbindung, die die empirisch· formel C^H₇CX₂HO₂ bet. sie hat eine basische Funktion von etwa pKa⁽ 8,28. Sie ist löslich in Wasser und niederen Alkanolen, z.B. Methanol_s Äthanol, Isopropanol, den Butanole^ und dgl.; sie ist relativ unlöslich in chlorierten niederen Alkanen» 8,3. Methylenchlorid, Chloroform, Xthylendichlorid und dgl·; niederen Alkanouen, z.B. Aceton, MethyläthylKeton und dgl., höheren Alkoholen und gesättigten Kohlenwaeeer-

st of f-!lösungsmitteln·

Pur die Isolierung und Reinigung von Armentomycin kann eine Vielzahl von Verfahren angewendet werden, z.B. Lösungsmittelextraktion, Flüssigkeits-Flüssigkeit s -Verteilung in einem Craig-Apparat, die Verwendung von Adsorptionsmitteln und Auskristallisieren aus Lösungsmitteln.

In einem bevorzugten Verfahren wird Armentomycin aus seinem Kulturmedium durch Abtrennen des My eel s und ungelöster Feststoffe durch übliche Maßnahmen wie Filtrieren oder Zentrifugieren gewonnen. Bas Antibiotikum wird dann aus der filtrierten oder zentrifugierten Brühe durch die Verwendung von oberflächenaktiven Adsorptionsmitteln, z.B. von entfärbender Kohle oder entfärbenden Harzen und Auswaschen des adsorbierten Stoffs mit einem Lösungsmittel entfernt. Es kann irgend eines der vorgenannten Lösungsmittel verwendet werden, in dem Armentomycin löslich 1st. Ein geeignetes entfärbendes Harz ist Permutit DR (U.S,-Patentschrift 2 702 265). Die bei dem oberflächenaktiven Adsorptionsmittel erhaltenen Eluate können zur Trockne eingedampft werden und ergeben ein verunreinigtes Präparat des Antibiotikums Armentomycin. Dieses Präparat kann in Fällen verwendet werden, bei denen eine ,hohe Reinheit des Antibiotikums nicht erforderlieh ist.

Hochgradig reines Armentomycin kann erhalten werden, indem man ein verunreinigtes trockenes Präparat von Armentomycin, das auf die vorstehende Weise erhalten wurde, einer Flüssigkeits-Flüssigkeits-Ver-

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teilung In einem Craig-Apparat unterwirft. Vor der. Verwendung des Craig-Apparates kann das trockne Präparat mit einem niederen Alkanol ausgelaugt werden; hierbei wird Methanol bevorzugt.

Sie Gegenstromverteilung im Craig-Apparat kann unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems, das aus gleichen Mengen n-Butanol und Wasser besteht, durch geführt werden. Wirksame Fraktionen, die vom Craig-Apparat erhalten werden, können zu einer wässrigen Lösung eingeengt und dann gefriergetrocknet werden. Aus einer Lösung eines niederen Alkanols (Äthanol wird bevorzugt) und Wasser läßt sich dieser Stoff dann als kristallines Armentomycin gewinnen.

Die erfindungsgemäß herstellbare Verbindung läßt sich außerdem durch aufeinanderfolgende Über führungen aus der freien Form in die gebundene Form und umgekehrt reinigen, insbesondere wenn andere Behandlungsarten dazwischengeschaltet werden, z.B. Lösungsmittelextraktionen und Auswaschen, Chromatographie und fraktionierte Flüssigkeits-Flüssigkeits-Extraktion. Auf diese Weise lassen sich die Salze von Armentomycin verwenden, um das Antibiotikum zu isolieren und zu veredeln. Beispielsweise kann das Antibiotikum in ein unlösliches Salz, z.B. das Picrat, überführt werden, das gereinigt wird und dann zur Regenerierung des Antibiotikums verwendet wird, oder das Antibiotikum kann in ein wasserlösliches Salz, z.B. das Hydrochlorid oder Sulfat überführt werden und die wässrige Lösung des Salzes kann mit verschiedenen mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln extrahiert werden bevor das

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Antibiotikum regeneriert wird.

Ba Armentomycin eine amphotere Substanz ist, bildet es mit Säuren, Alkalimetallen, Erdalkali -metallen und Aminen-Salze. Es lassen sich Metallsalze dadurch herstellen, daß man Armentomycin in Wasser löst, eine verdünnte Metallbase zusetzt, bis der pH-Wert der Lösung etwa 7 bis 8 beträgt und die Lösung gefriertrocknet, wobei man «inen getrockneten Bücketand erhält, der aus dem Armentomycinmetallsalz besteht» Zu den Armentomycin-Me tall salzen gehören Natrium-, Kalium» und Caloiumealze· Aminsalze von Armentomycin einschließlich derjenigen mit organischen Basen wie primären, sekundären und tertiären Mono-, Pi- und Polyaminen, lassen sich ebenfalls nach den vorstehend beschriebenen oder anderen Üblicherweise angewandten Verfahren herstellen. Andere Salze.werden mit therapeutisch wirksamen Basen erhalten, die ihnen zusätzliche therapeutische Wirkungen verleihen. Derartige Basen sind z.B. die Purinbasen, wie z.B. Theophyllin, Theobromin, Koffein oder Derivate derartiger Purinbasen; antihistamin Basen, die imstande sind, Salze mit schwachen Säuren zu bilden; Pyridinverbindungen wie Nikotinsäureamid, Isonlootinsäurehydrazid sind dgl.; Phenyl alkyl amine wie Adrenalin, Bphedrin und dgl., Cholin und andere.

Durch Neutralisieren des Armentomycin mit der geeigneten Säure auf einen pH-Wert unter etwa 7,0 und vorzugsweise Einstellen auf einen pH-Wert von etwa 2 bis 6 lassen sich die sauren Salze von Armen-

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tomycin herstellen. Geeignete Säuren für diesen Zweck sind 2.B. Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Bernsteinsäure, Zitronensäure, Milchsäure» Maleinsäure, Fumarsäure, Pamoineäure, Cholsäure, PaI-mitinsäure, Mucinsäure, Kamphersäure, Glutarsäure, Glycolsäure, Phthalsäure, Weinsäure, Laurinsäure, Stearinsäure, Salicylsäure, 3-Phenylsalicylsäure, 5-Phenyl -salicylsäure, 2-Methylglutarsäure, ortho-Sulfobenzoe -säure, Cyclohexansulfaminsäure, Cyclopentanproplonsäure, 1,2-Cyclohexandicarbonsäure, 4— Cyclohexencarbonsäure * Octadecenylbernsteinsäure, Octenylbernsteinsäure, Methansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Helianthsäure, Reineckes Dimethyldithiocarbaminsäure, Sorbinsäure, Monochloressigsäure, Undecylensäure, 4'-Hydroxy -azobenxol-4-sulfonsäure, Octadecylschwefelaäure, Picrinsäure, Benzoesäure, Zimtsäure und ähnliche Säuren. Saure und basische Salze von Armentomycin können für die gleichen biologischen Zwecke verwendet werden wie die Auigangsverbindung.

StLe erfindungßgemäße Verbindung kann außerdem aus der gefilterten Brühe durch Adsorption an ein Kationenauetauscherhar* gewonnen werden. Es können sowohl di· Carbonsäure- als auch die SuIfonsäuretypen verwendet werden. Geeignet· Carbonsäureharze sind die Polyacrylsäureharze, die durch die Mischpolymerisation von Acrylsäure und BLvinylbenzol nach dem Verfahren erhalten werden, das von Kunin, Ion Exchange Resins, 2. Auflage, Seite 87 (1958), John Wiley <fc Sens Inc. beschrieben wurde. Carbonsäure-Kationaustauscherharze dieses Typs werden unter den Handelsnamen Amberlit· IRC-50 und Zeokarb 226 vertrieben. Geeignete Sulfon -

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säureharze sind am Kern sulfonierte Polystyrol harze, die mit Divinylbenzol vernetzt sind und nach dem von Kunin, Seite 84 siehe oben beschriebenen Verfahren erhalten wurden. Sulfonierte Kationenaustauscherharze dieses Typs werden unter den Handelsnaffien Dowex 50, Amberlite IR-120, Halcite HCR, Chempro C-20, Per mutit Q und Zeokarb 225 vertrieben.

Das Antibiotikum wird aus dem Harz bei einem sauren pH-Wert, vorzugsweise einem niedrigeren pH-Wert als der pKa'-Wert des verwendeten Kationenaustauscherharzes mit Wasser ausgewaschen. Zufriedenstellende Ergebnisse werden mit einem pH-Wert von etwa 1 bis 6 erhalten. Die überschüssige Säure in dem Eluat wird auf einen pH-Wert von etwa 7,5 bis 8,5 mit einer Base, z.B. Natriumhydroxyd oder einem stark basischen Anionenaustauscherharz neutralisiert und das Antibiotikum wird mit einem Lösungsmittel nach dem obigen Verfahren extrahiert.

Armentomycin kann jedoch aus dem Kulturmedium auch durch Verwendung eines starken basischen Anionaustauscherharzes abgetrennt werden. Geeignete AnionenaustauBcherharze für diesen Zweck werden erhalten, indem man nach dem von Kunin auf Seite 88 und 97, Ion Exchange Resins, 2. Auflage (1958) John Wiley and Sons, Inc. beschriebenen Verfahren gegebenenfalls mit Divinylbenzol vernetztes Polystyrol, das nach dem auf Seite 84 von Kunin, s. o. beschriebenen Verfahren hergestellt wird, ehlormethyliert und mit Trimethylamin oder Dirnethyläthanolamin nach dem auf Seite 97 von Kunin s.o. beschriebenen Verfahren quaterniert.

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Anionaustauscherharze dieses Typs werden unter den· Handelsnamen Dowex-1, Dowex-2, Dowex-3, Amberlite IRA-400, Duolite A-102 und Permutit S-I vertrieben.

Die erfindungsgemäß herstellbare Verbindung, Armentomycin, ist gegen proteus mirabilis wirksam und kann verwendet werden, um Gerüche zu beseitigen oder zu verhindern, die durch diesen Organismus in Papierfabriken hervorgerufen werden. Sie kann außer dem Fabriken der geilügelverarbeitenden Industrie verwendet werden, um durch den Organismus Salmonella gallinarum hervorgerufene Infektionen zu bekämpfen.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens und dessen Produkte. Alle Prozentsätze beziehen sich auf das Gewicht und alle Verhältniese von Lösungsmittelgemi sehen beziehen sich auf das Volumen, sofern nichts anderes angegeben ist.

Beispiel 1:
A Gärung.

Eine Bodenkultur von Streptomyces armentosus var. armentosus nov. sp. HHRL 3176 wurde zum Impfen von 500 CBr Erlenmeyerkolben verwendet, die 100 ecm steriles Vorimpfmedium enthielten, das aus folgenden Komponenten bestand:

Glucosemonohydrat 25 g

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Pharmamedia⁺ 25 g Leitungswasser aufgefüllt auf 1 Liter

Pharmamedia ist ein Baumwollsamenmehl In -dustrieller Reinheit, das durch die Trader's Oil Mill Company, Fort Worth Texas herge -stellt wird.

Der pH-Wert des Vorimpfmediums vor dem Sterili -sieren betruf 7,2. Bas Vorimpfinokulum wurde 2 Hage bei 28°C auf einer rotierenden öuap-SchUttelmaschine gezüchtet, die «it 260 Umdrehungen pro Minute arbeitete.

Das Vorimpfinokulum (100 ecm) wurde sum Impfen eines 40 Liter fassenden Impf tanks verwendet, der 20 Liter des folgenden sterilen Impfmediums enthielt:

Gluoosemonohydrat 10 g/Liter Maisquellwasser 10 g/Liter PharmamftäiÄ „ ■,— 2 g/Liter Wilson's Peptonflüssigkeit Hr. 159"¹* 10 g/Idter Safcmalsol 2 ocm/Idter Leitungswaseer Rest

+Wilson»· Peptonflüssiglceit Hr. 159 ist ·ίϋ Präparat ensymatisch hydrolysiert er Proteine tierischen Ursprungs.

Der pK-Wert des Impftankmediuata betrug vor dem Sterilisieren 7,2. Diesea Inoculum wurde 24 Stunden

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lang bei einer Temperatur von 25°C unter Belüftung mit einer Menge von 10 Standardlitern pro Hinute und Rühren alt einer Geschwindigkeit von 400 Umdrehungen pro Minute gezüchtet.

Sin Teil des vorstehend beschriebenen Impftankinokulums (12,5 Liter) wurde dann zum Impfen eines 400 Liter fassenden Gärgefäßes verwendet, das 250 Liter des folgenden sterilen Gärmediums enthielt:

Stärke 30 g/Liter Endmelasse 20 g/Liter

fharmamedia . 15 g/Liter

fischmehl 15 g/Liter_v

Schmalzöl 5 ecm/Liter Leitungswasser Heat

Der pH-Wert des Gärtankmediums vor dem Sterilisieren betrug 7,2. Sie Gärung dauerte 4 Tage und während dieser Zeit wurde die Temperatur auf 25 C gehalten· filtrierte Luft wurde in einer Menge von 100 Standardlitern pro Minute zugeführt und es wurde mit einer Geschwindigkeit von 200 Umdrehungen/Minute gerührt. Steriles Schmalzöl wurde zur Regulierung des Schaums zugesetzt. Bine vor der Veiterverarbeitung entnommene Probe ergab 213 Bioeinheiten pro ecs» gegen P, airabilis. Bas Gewicht der gesamten Brühe betrug 263 kg.

B. Extraktion .

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BLe gesamte Brühe der oben beschriebenen Gärung wurde mit 7 i» ihres Gewichts Diatomeenerde ange schlämmt und filtriert. Das FiItrat (286 Liter) würde im Vakuum auf ein Volumen von 47 Liter eingeengt. Nachdem es mit 2,5 kg Aktivkohle 45 Minuten lang gerührt worden war, wurde es mit Hilfe von Diatomeenerde filtriert. Dem Filtrat wurde unter Rühren Aceton auge setzt. Der erhaltene Niederschlag wurde mit Hilfe von 3,5 kg Diatomeenerde abfiltriert. Das Aeetonfiltrat (250 Liter) wurde zu einem wässrigen PiItrat einge engt und gefriertrocknet und ergab 1991 S rohes Armentomycin, dessen Probe gegen P. mirabilis 12 Bioeinheiten pro mg ergab. ^

C. Reinigung.

In einem Waring-Mischer wurden 200 g Armentomycin , die auf die vorstehend beschriebene Weise erhalten wurden, mit 1200 com absolutem Methanol 10 Minuten ausgelaugt. Das Gemisch wurde filtriert und der unlösliche Bilcketand verworfen. Das Filtrat (1000 acm) wurde mit 5 Volumen Aceton (5000 com) gemischt und der sich bildende Niederschlag wurde abfiltriert und verworfen. Das verbleibende Piltrat wurde zur Trockne eingedampft und ergab 22,6 g Armentomycin. Dieser Stoff wurde durch Gegenstromverteilung auf die nach stehend weiter beschriebene Weise gereinigt.

(1) Erste Gegenstromverteilung .

Das verwendete Lösungsmittel syst em bestand aus

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gleichen Mengen n-Butanol und Wasser. Der Ausgangs stoff 10 g Armentomycin aus Teil C wurde in der unteren Phase des obigen Systems (200 ecm) gelöst und diese wurde in einem ganz aus Glas bestehenden Craig-Gegenstromapparat (20 Rohre) eingeführt. Die obere Phase 200 ecm aus gleichen Mengen n-Butanol und Wasser wurde zugesetzt und die Verteilung wurde bei lOOÖDurchgängen durchgeführt*

£e wurden die folgenden Fraktionen gesammelt ι

Fraktion I Rohre 20-40

Fraktion II Rohre 41-60

Fraktion III Rohre 61-80

Fraktion IV Rohre 81-120

Fraktion V Rohre 121-210

Fraktion VI Rohre 211-260

Jede Fraktion wurde zur Trockne eingedampft, indem man sie zuerst zu einer wässrigen Lösung im Vakuum einengt und dann gefriertroeknete. Die gefriertrockneten Präparate der Fraktionen I bis V erwiesen sich als nicht wirksam gegen P. mirabilis. Die gesamte Wirksamkeit befand sich In dem gefriertrockneten Präparat (480 mg), das aus der Fraktion VI hergestellt worden war.

Sine ähnliche Gegenstromverteilung, bei der 12 g Ausgangsstoff verwendet wurde* das auf die in Teil C beschriebene Weise erhalten worden war, ergab 870 Bg wirksames Armentomycinpräparat ♦

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Diese beiden Präparate (480 mg und 870 mg) von Armentomycin wurden vereinigt und unter Erhitzen in 125 ecm absolutem Methanol und 7 ecm Wasser gelöst. Die klare Lösung wurde bei 5°C 24 Stunden lang stehenge lassen und danach wurde ausgefallenes Armentomycin abfiltriert und getrocknet; die Ausbeute betrug 400 mg Armentomycin.

(2) Zweite Gegenstromverteilung.

Um die Reinheit des obigen kristallinen Annen tomyeins au bestimmen, wurde dieses Präparat in einem Craig-Gegenstrom-Verteilungsapparat (2 ccm/Phase) un ter Verwendung gleicher Mengen n-Butanoli Wasser als Lösungsmittelsystem verteilt. Nach 1000 Durchgängen wurden die Rohre 181 bis 245 vereinigt. Die Lösung wurde zu einer wässrigen Lösung eingeengt und gefriertrocknet; die Ausbeute betrug 300 mg Armentomycin. Dieses Präparat wurde aus 25 ecm absolutem Äthanol und 2,2 ecm Wasser umkristallisiert; die Ausbeute betrug 250 mg kristallines Armentomycin.

Die in dar ganzen vorliegenden Anmeldung durchgeführte Probe gegen Proteus mirabilis ist eine mikrobiologische Plattenkulturprobe auf synthe ti scheiß Agar» das auf einen pH-Wert von 7»0 eingestellt ist. Das verwendete synthetische Agar wird von den Baltimore Biological Laboratoriess Baltimore» Maryland hergestellt. Es wird aia "Upjoha Mineral Salts Agar " bezeichnet und enthält folgend® Bastandteiles

ORfÖINAL INSPECTED

& <0 υ

Prim, Kaliumphosphat sek. Kaliumphosphat Magnesiumsulfat Ammoniumsulfat Natriumeitrat Agar

3 g/Liter
7 g/Liter
0,1 g/Liter 1,0 g/Liter 1,0 g/Liter 15 g/Liter

Es werden 27,1 g des obigen Mediums pro Liter destillierten Wassers verwendet. Bei den verwendeten Platten handelt es sich um übliche 12,7 mm standard platten auf die 0,08 ecm der Testlösung aufgebracht wird. Eine Bioeinheit ergibt einen Hemmungshof von 20 mm.

Chemische und physikalische Eigenschaften von Armentomycin.

Elementaranalyse: berechnet für Ο

C 27,93; H 4,10; N 8,14; Cl 41.23; 0 18,60;

gefunden:

G 28,39; H 4,44; N 9,09; Cl 40,60; 0 17,48

Berechnetes Molekulargewicht: 172

Äquivalent gewicht s 168 (Titration mit KOH)

174 (in Essigsäurelösung unter Verwendung von Perchlorsäure als Titrationsmittel)

Titration:

pKa¹ 8,28

Ultraviolettspektrum: Armentomycin zeigt keine

Maxima zwischen 220 und 400

Infrarotspektrum: Das Infrarotabsorptionsspektrum von Armentomycin» suspendiert in Hujolmull ist in Fig. 1 der Zeichnungen wiedergegeben. Armentomycin zeigt Maxima bei den folgenden, in reziproken Zentime tern ausgedrückten Wellen längen:

3060 (S)	1553 (S)	1195 (W)
2990 (S)	1509 (S)	1188 (W)
2950 (S)	1503 (S)	1162 (W)
2920 (S)	1437 (S)	1150 (M)
2850 (S)	1417 (S)	1037 (W)
2740 (M)	1410 (W)	1022 (W)
2610 (M)	1375 (M)	971 (W)
2585 (M)	1362 (M)	955 (W)
2470 (W)	1357 (S)	914 (W)
2085 (W)	1328 (M)	855 (M)
1612 (S)	1272 (M)	785 (M)
1588 (S)	1225 (M)	760 (W)
1562 (S)	1215 (W)	675 (W)
		642 (S)

Die Bandintensitäten sind als "S", ¹¹M" bzw. ^NW^N angegeben und stellen Annäherungen bezogen auf den Hintergrund in der Sähe des Bandes dar. Ein ¹¹S"-Band besitzt die gleiche Größenordnung an Intensität wie das stärkste Band im Spektrum; "M"-Bänder sind 1/3 bis 2/3 so intensiv wie das stärkste Band und "W"-Bänder sind weniger als 1/3 so intensiv wie das stärkste Band.

909887/1151

Diese Schätzungen erfolgten auf der Grundlage einer die prozentuale Durchlässigkeit anzeigenden Skala.

Optische Drehung:

6,7 (c = 0,74, Wasser)

26,24° ( c * 0,74, pH 1, Wasser)

Löslichkeit:

Armentomycin ist löslich in Wasser und niederen Alkoholen, z.B. Methanol und Äthanol. Es ist relativ unlöslich in weniger polaren Lösungsmitteln höheren Alkoholen, Alkanonen, chlorierten Kohlenwasser stoffen und gesättigten Kohlenwasserstoff lösungsmitteln.

Papierchromatogramm:

Das papierchromatographisehe Muster von Armentomycin in den folgenden Lösungsmittelsystemen ist in Fig. 2 der Zeichnungen gezeigt ί

I 1-Butanol, Wasser (84-16), 16 Stunden?

II 1-Butanol, Wasser (84-16), plus 0,25 ^ p-Toluol·

sulfonsäure, 16 Stunden;

III 1-Butanol Essigsäure, Wasser (2il:l),

16 Stunden;

IV 2$ Piperidin (V./V.) in n-Butanol, Waeeer

(84 : 16), 16 Stunden;

V 1-Butanol, Wasser (4:96), 5 Stunden;

VI 1-Butanol, Wasser (4i96), plus 0,25 1· p-Toluol-

sulfonsäure, 5 Stunden .

900667/1755

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Armentomycin, dadurch gekennzeichnet, daß man den Streptomyces armentosuB var. annentosus nov. sp. NRRL 3176 in einem wässrigen Nährmedium züchtet und die Gärlösung aufarbeitet.

The Upjohn Company

Rechtsanwalt

7/-1TI5