DE1952317A1

DE1952317A1 - 3-Phosphat-Ester von Lincomycin,dessen Analysen und Celestin sowie Verfahren zu deren Herstellung

Info

Publication number: DE1952317A1
Application number: DE19691952317
Authority: DE
Inventors: Argoudelis Alexander Demetrios; Coats John Henry
Original assignee: Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1968-10-18
Filing date: 1969-10-17
Publication date: 1970-04-30
Also published as: IL33097A0; BE740456A; US3544552A; NL6915672A; CS178851B2; IL33097A; FR2021036B1; PL80273B1; CH542245A; JPS49512B1; FR2021036A1; GB1235599A

Description

1552317

Λ. WALTER BEIl

al'fred" hoeppener .

DR. JUR. DIPL-CMcM. H-J. WOLFP DR. JUR. HANS CHR. BEIL j

623 FRANKFURTAM MAlN-HOCHSf

ADELONSTRASSE5·

Unsere Nr. 15864

16. Okt. 1969

The Upjohn Company Kalamazoo (Michigan)USA

5-Phosphat-Ester von Lincomycin, dessen Analysen und CeIestin sowie Verfahren zu deren Herstellung.

Gegenstand vorliegender Erfindung sind 3-Phosphat-Ester von Verbindungen der allgemeinen Formel

HH

und·deren Salze, worin R ein Methyl- oder Äthylrest oder

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.1 f5|317

It

den Rest -

7 χ\

ein Wasserstoff-

atom oder ein eis- oder trans-Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, R₂ ein Wasserstoffatom, ein Methyloder Äthylrest; X eine Hydroxylgruppe, ein Chlor- oder Bromatom in (R)- oder (S)-Konfiguration oder ein Methoxyrest und P der Rest

^0H :

sind,

OH

sowie deren zwitterionische Formen.

- Die Herstellung dieser neuen Phosphatester erfolgt durch Zugabe einer Verbindung der Formel

CH,

i8

in der R einen Methyl- oder Äthylrest oder den Rest

9-8 187 T te6

6AD ORfGiNAL

-CHp-CHp-O-C L ¹J * % ^ein Wasserstoffatom oder einen

eis- oder trans-niedrig Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, R₂ ein Wasserstoffatom, ein Methyl- oder Äthylrest, X eine Hydroxylgruppe, ein Chlor- oder Bromatom, jeweils in (R)- oder (S)-Konfiguration, oder ein Methoxyrest sind, au einer Streptomyces-Gärbruhe, oder durch Inkubation dieser Verbindung in einem zellfreien Extrakt einer Streptomyces-Kultür und Überführung der Ausgangsverbindung in einen neuen Phosphat-3-ester.

Die Phosphorylierung von Lincomycin oder CeIesticin (in denen R den Rest

-CH₂-CH₂-O-C
HO

darstellt, R₁ und R₂ Wasserstoffatome sind und X einen Methexyrest bedeutet) in 3-Stellung war bisher unbe kannt und auch entsprechende Verfahren zur Phosphorylierung waren nicht bekannt. Lincomycin-2-phosphatester werden auf chemischem. Wege hergestellt, indem man zunächst das Lincomycin oder seine Analogen mit einem aromatischen Aldehyd unter Bildung eines 3,4-0-Aryliden-lincomycins umsetzt. Diese Verbindung wird trityliert, falls sie eine 7-Hydroxylgruppe aufweist, unter Bildung des 7-0-Trityl-3fA-0-aryliden-lincomycins, das dann unter Bildung des entsprechenden 3,4-0-Aryliden-lir.comyein-2-phosphats phosphoryliert wird. Nach Entfernung der Schutz-

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gruppen erhält man Lincomycin-2-phosphat bzw. dessen Analoge. Offensichtlich kann dieses Verfahren nicht auf die Herstellung von Lincomycin-3-phosphat angewandt werden, da die Kondensation mit einem aromatischen Aldehyd die 3-Stellung des Lincomycinm.oleku.ls blockiert.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden, obgleich sie in vitro antibakteriell unwirksam sind, bei Verwendung in vivo aktiviert. Vermutlich läßt sich diese Aktivierung in vivo vergleichen mil; der Reaktivierung der Lincomycinverbindung in vitro durch in Berührung bringen der phosphorilierten Lincomyeinverbindung mit alkalischer Phosphatase. Die erfindungsgemäßen Verbindungen eignen sich insbesondere zur oralen Verabreichung an Tiere einschließlich' Säugetiere, da ihnen der bittere Geschmack des Lincomycins fehlt.

Die als Ausgangsmaterial des Verfahrens verwendeten Lincomycinverbindungen können nach verschiedenen, bereits veröffentlichten Verfahren hergestellt werden:

Lincomycin

Verbindungen der Formel I, in denen

R=Methyl oder Äthyl

R, = eis oder trans-Alkyl bis zu 8 C-Atomen

Wasserstoff oder Alkyl bis zu 8 C-Atomen

U.S.A.Patent 3 086 912

U.S.A.Patent 3 380 992 (Beschreibung und Bsp.12)

U.S.A. Patent 3 380 992 (Beschreibung und Bsp.l)

U.S.A.Patent 3 380 992 (Beschreibung und Bsp.l E und IG +H)

0 0 9 818/ 1 8 6 6

X = (S)OH U.S.A. Patent 3 380 992

(Beschreibung und Bsp.ll-D)

X = (R) oder (S) Cl oder BeIg. Patent 676 202; Br U.S.A.Patent

eingereicht am 20.10.65

X = (R) oder (S) U.S.A. Patent

eingereicht am 9·1.68

Celesticetin U.S.A. Patent 2 928 844

4'-Depropyl-4^l-äthyl-lincomyein, in welchem R Methyl, R-, Äthyl, R₂ Methyl und X eine Hydroxylgruppe sind (siehe Formel I)» kann hergestellt werden nach dem Verfahren der Beispiele 1 und 2 des U.S.Patents 5 359 164, in welchem diese Verbindung als Lincomycin B bezeichnet wird.

1'-Demthyl-1'-äthyl-lincomycin, eine Verbindung der Formel I, in der R Methyl, R_{1 n} -Propyl, R₂ Äthyl und X eine Hydroxylgruppe sind, kann hergestellt werden nach dem Verfahren der Beispiele 1 und 2 des U.S. Patents 3 359 163, in welchem diese Verbindung als Lincomycin C bezeichnet wird. ,

l'-Demethyl-lincomycin, eine Verbindung der formel I, in welcher R Methyl, R₁ n-Propyl, R₂ Wasserstoff und X eine Hydroxylgruppe sind, kann hergestellt werden nach dem Verfahren von Beispiel 1 des U.S. Patents 3 329 568, in welchem genannte Verbindung als Lincomycin D bezeichnet wird.

. Aus obiger Gruppe ist ferner die Verbindung 7(S)-

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Chlor-7-deoxylincomycin bekannt unter dem Trivialnamen Clinimycin.

Die Lineomycinverbindungen und ihre Analogen, sowie Celesticetin, können phosphoryliert werden, indem man die unphosphorylierte Verbindung in eine Streptomyces-Gärbrühe einbringt, die ein phosphorylierendea Enzym enthält, oder indem man die unphosphorylierte Verbindung mit einem zellfreien Extrakt einer Streptomyces-Kultur inkubiert, welche das erforderliche phosphorylierende Enzym enthält. Beispielsweise wird bei Zugabe von Iiincomycinhydrochlorid zu einer Gärbrühe, die Strep tomyces rochei, NEEL 3512 enthält, das Lincomycin-3-Phosphat gebildet. Bei Verwendung von Clinimycin-hydro chlorid erhält man das Clinimycin-3-Phosphat. Inkubiert man Lincomycin oder Clinimycin mit einem zellfreien Extrakt einer Streptomyces-Kultur, so erhält man ebenfalls Lincomycin-3-phosphat bzw. Blinimycin—3-phosphat.

Die zur Herstellung der neuen Verbindungen erforderliche Gärung kann in wässrigem Nährmedium unter submersen aeroben Bedingungen stattfinden. Selbstverständlich können bei der Herstellung kleinerer Mengen der phosphorylierten Verbindungen Oberflächenkulturen und Flaschen verwendet werden. Der zum Einsatz gelangende Organismus wird in einem Kährmedium gezüchtet, das eine Kohl ens toff.quelle, beispielsweise ein assimilierbares Kohlehydrat und eine Stickstoffquelle, beispielsweise eine assimilierbare Stickstoffverbindung oder eiweißartiges Material, enthält. Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind eiucose, Eohzucker, Sucrose, Glyzerin, Stärke,

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Maisstärke, Lactose, Dextrin, Heiassen und dergleichen. Bevorzugte Stickstoffquellen sind Maisquellwasser, Hefe, autolysierte Brauereihefe mit Milchfeststoffen, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Maismehl, Milchfest stoffe, pankreatisch abgebautes Casein, Distillers' solubles, tierische Peptonflüssigkeiten, Fleisch- und Knochenschnitzel und dergleichen. Mit Erfolg können auch Gemische aus diesen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen eingesetzt werden. Es ist nicht erforderlich, Spurenmetalle wie beispielsweise Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen und dergleichen zuzusetzen, da man mit Leitungswasser arbeitet und die Gärmedien mit ungereinigten Ausgangsmaterialien zubereitet werden.

Die Phosphorylierung der neuen Verbindungen kann bei beliebigen Temperaturen, die zu einem befriedigenden Wachstum des Streptomyces führen, durchgeführt werden, beispielsweise bei Temperaturen zwischen etwa 18 und 40⁰G und vorzugsweise zwischen etwa 20 und 37°C.

Wird eine Streptomyces-Gärbrühe wie oben beschrieben, rzur Phosphorylierung des Lincomyeins oder seiner Analoga oder von Celesticetin verwendet, so kann die Lincomycin- oder Celestieeton-Verbindung vor oder nach der Inokulierung des Gämediums zugesetzt werden. Ferner kann die unphosphorylierte Verbindung auch in kleinen Portionen während der Gärung zugesetzt werden, solang diese Zugabe nicht zu spät im Gärungszyklus erfolgt, daß die gewünschte Phosphorylierung nicht mehr voll ständig erfolgen kann. Zeitpunkt und Menge der jeweiligen Zugabe von unphosphorylierter Verbindung kann für Je-

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den Pall leicht bestimmt werden, indem man die unphosphorylierte Verbindung zusetzt, bis eine gewisse Toxizität beobachtet wird, beispielsweise eine Inhibierung der Phosphorylierung. Auch wenn am Ende des Gärungszyklus unphosphorylierte Verbindung übrig bleibt, sollte man mit geringeren Mengen des unphosphoylierten Ausgangsmaterials arbeiten und/oder den Zeitpunkt der Zugabe verändern.

Eine weitere Möglichkeit zur Phosphorylierung von Lincomycin oder dessen Analoga bzw. von Celesticetin besteht darin, daß man einen zellfreien Extrakt einer . Streptomyces-Kultur, der das erforderliche phosphorylierende Enzym enthält, mit der zu phosphorylierenden Verbindung inkubiert. Der zellfreie Extrakt kann aus einer 24 Stunden alten Streptomyces-Kultur hergestellt werden. Die Inkubation kann bei Temperaturen zwischen 26 und 32°C erfolgen. Die Dauer der Inkubation hängt von der Menge der zu phosphorylierenden Verbindung ab. Beispielsweise genügt eine Inkubationszeit von weniger als 24 Stunden zur Phosphorylierung von 50 Y/ml. Lincomycin.

Wird ein zellfreier Extrakt zur Phosphorylierung verwendet, so hängt die Menge an unphosphorylierter Verbindung, die zugesetzt werden kann, von der Kapazität des Extrakts zur Phosphorylierung ab. Die Menge kann bestimmt werden, indem man allmählich die Gesamtmenge an unphosphorylierter Verbindung, die dem Extrakt zugegeben wird, steigert, bis festgestellt wird, daß weiter zugegebene unphosphorylierte Verbindung nicht phosphoryliert wird. Da die antibakterielle Wirkung der nicht phcsphorylierten Verbindung in vitro bei der Phosphory-

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lierung in 5-Stellung verloren geht, stellt die An Wesenheit einer solchen Aktivität in vitro, in einem Kulturextrakt 24 Stunden nach Zugabe der nicht phosphorylierten Verbindung den Beweis dar, daß die Phosphorylierungskapazität des Extrakts überschritten wurde. Die antibakterielle Wirkung in vitro, von der vorstehend die Rede ist, kann durch einen mikrobiologischen Standardtest gegen den Mikroorganismus Sarcina lutea bestimmt werden.

Zur Isolierung und Reinigung der neuen Verbindungen können verschiedene Verfahren angewandt werden, beispielsweise die Lösungsmittelextraktionen, Flüssig-Flüssig-Verteilung in einer Craig-Vorrichtung, Ionenaustauschextraktion, Adsorption an geeigneten Adsorptionsmitteln wie Kohle oder Säulenchromatographie. Gemäß einer bevorzugten Methode werden die neuen Verbindungen aus der G-ärbrühe oder dem zellfreien Extrakt durch Filtration gewonnen. Das FiItrat gelangt dann über ein geeignetes Absorptionsmittel, beispielsweise Aktivkohle oder Amberlite XAD-2 (Vertrieb Rohm & Haas Co.), um wasserlösliche Verunreinigungen zu entfernen, die bei der folgenden Chromatographierung stören könnten. Das Eluat aus der Adsorptionsstufe wird dann über eine chromatographische Säule geleitet, die ein Anionenaus tauscherharz, beispielsweise Dowex-1 (X-4) in Acetatform enthält (Vertrieb Dow Chemical Co., Midland, Michigan). Die aus der chromatographischen Säule erhaltenen Fraktionen werden gesammelt und auf ihre Aktivität gegen S. lutea getestet, vor und nach einer Behandlung dieser Fraktionen mit alkalischer Phosphatase, wie nachstehend

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näher beschrieben wird. Fraktionen mit der stärksten Aktivität gegen S. lutea werden zusammengegossen, eingeengt und dann einer Gegenstromverteilung in einer Craig-Vorrichtung unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus n-Butanol-Wasser (1 Volumenteil : 1 Volumenteil) unterworfen.

Lincomycin-3-phosphat und die 3-Phosphate seiner

^ Analoga sind gegen Bakterien in vitro im wesentlichen

W unwirksam. Diese neuen Verbindungen werden daher in vitro

bestimmt, indem man Hydrolysate oder andere Gemische, die die 3-Phosphatverbindungen enthalten, mit alkalischer Phosphatase behandelt. Beispielsweise besteht ein Reaktionsgemisch auf die Wirkung von alkalischer Phosphatase auf Lincomycin-3-phosphat aus 0,5 ml Tris-puffer (0,5 M) mit pH 8,0, 0,5 ml alkalischer Phosphatase (1 mg pro ml)-Vorratslösung in Tris-puffer (0,5 M) vom pH 8,0 und 0,05 ml (50 mcg) Lincomycin-3-phosphat. Dieses Reaktionsgemisch wird über Nacht bei 28 C inkubiert. Die Phosphatase entfernt die 3-Phosphatgruppe und die resultierende Lincomycinverbindung zeigt dann antibakterielle _k Wirkung in vitro.

Beispiele für Streptomyceten, die zur Herstellung der bleuen Verbindungen verwendet werden können, sind: S. rochei, NRRL 3512j S. vendargensis, NRRL 3530; S. coelicolor 1945, NRRL 3531; S. coelicolor Müller, NRRL 3532; Actinomyces (Streptomyces) cylindrosporus 3166 CCN, NRRL 3535; Actinomyces (Streptomyces), cyanec— f us cat us, NRRL 3534; S. rochei, NRRL 3535 und S. armentosus, NRRL 3176. Diese Kulturen sind ohne Be schränkungen von der Northern Utilization und Research

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Division, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, U.S.A. erhältlich.

Es wurde gefunden, daß in ganzen Zellsystemen¹ Clinimycin" im Vergleich zu Lincomycin und anderen Lincomycin- und Clinimycin-Analoga, beispielsweise 1'-Demethylclinimycin und l'-Demethyl-A'-pentyl-clinimycin am leichtesten phosphoryliert wird. Wird ein zellfreier Extrakt einer Streptomyces-Kultur verwendet, so verläuft die Phosphorylierung bei sämtlichen der genannten Ausgangsmaterialien mit gleicher Leichtigkeit.

Die erfindungsgemäß erhältlichen Verbindungen sind amphoter und können je nach dem pH-Wert der Umgebung in verschiedenen lonenformen vorliegen. Bei niedrigen pH-Werten liegen sie in Form eines Säureadditionssalzes vor, bei höheren pH-Werten in zwitterionischer Form und bei noch höheren Werten in Foim eines Metallsalzes «_v Letzteres kann ein neutrales Salz sein (zwei Äquivalente Base pro Mol Lincomycin-3-phosphat), ein saures oder Monosalz (ein Äquivalent Base pro Mol Lincomycin-3-phosphat), oder ein Hemi-Salz (1/2 Äquivalent Base pro Mol Lineomyein-3-phosphat). Durch Zugabe entsprechender Mengen geeigneter Säuren und Basen können diese verschiedenen Formen isoliert werden. Zu den Säureadditionssalzen gehören die Salze mit starken organischen und anorganischen Säuren mit pK-Werten gleich oder niedriger als der pK-Wert des Phosphats» beispiels weise Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure und dergleichen.

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Zu den sauren und neutralen Salzen gehören die Alkalimetallsalze (einschließlich Ammoniumsalze) und-Erdalkalimetallsalze (einschließlich Magnesium- und Aluminiumsalze) , die durch Neutralisieren der Säureform mit den entsprechenden Basen, beispielsweise Ammoniumhydroxid, Natrium- oder Kaliumhydroxyd, oder den entsprechenden Alkoxiden, Calcium- oder Magnesiumhydroxid oder dergleichen gebildet werden. Zu den sauren und neu-

JP tralen Salzen gehören ferner die Aminsalze, die durch

. Neutralisieren der Säureform mit einem basischen Amin,

beispielsweise Mono-, Di— und Trimethylamin, .Mono—, M- und Triäthylamin, Mono-, Di- und Tripropylamin (iso- und normal), Äthyldimethylamin, Benzyldiäthyl- : amin, Cyclphexylamin, Benzylamin, Dibenzylamin, NVN¹ Dibenzyläthylendiamin, Bis-(ortho-methoxy-phenyliso proi;yl)-amin und ähnlichen, niedrig—aliphatischen, niedrig-eycloaliphatischen und niedrig-araliphati sehen Aminen, erhalten werden, v/obei die aliphatischen und cycloaliphatischen Reste bis zu 8 Kohlenstoffatome aiif-■weisen, ferner ernalten werden mit heterocyclischen Aminen wie Piperidin, Morpholin, Pyrrolidin, Piperazin

P und den niedrig-alkylsubstituierten Derivaten, in denen

die niedrigen Alkylreste 1 bis '8 Kohlenstoff atome aufweisen, wie z.B. 1-Methylpiperidin, 4-Äthylmorpholin,, 1-Isopropylpyrrolidin, 1,4—Dimethylpiperazin, .1-n-Butylpiperidin, 2-Methylpiperidin und 1-Äthyl-2-methylpiperidin, ferner mit Aminen, die hydrophile oder in Wasser löslich mäciienae Gru op en aufweisen wie Mono-, Bi- und Iriäthanolamin, Äthyldiäthanolamin, n-Butylfflonoäthanola^nin,, 2-Amino-l-butanol, 2-Amino-2-äthyll,3-prop:andicl, 2-Amino-2-methyl-l-propanol, TrIs-

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(hydroxymethyl)-aminomethan, Phenylmonoäthanolamin, ptert. Amylphenyldiäthanolamin und Galactamin, N-Methylglucamin, N-Methylglucosamin, Ephedrin, Phenylephrin, Epinephrin und Procain; Tetraäthylanimoniumhydroxid und Guanidin. Die verschiedenen Formen können wechselweise verwendet werden, jedoch wird für die meisten Zwecke die zwitterionische Form

CH₅

EH —

HO .-{—"0

Ϊ0Ρ .,

OH ■
in der P den Rest -P bedeutet und die Hemi-salzforra

II©⁰

bevorzugt.

Die erfindungsgemäß erhältlichen Verbindungen sind anwendbar zur Behandlung von Menschen und Tieren, die krankheitserregende MierοOrganismen (Bakterien und an dere Mikroparasiten) beherbergen, sowie zur entsprechenden Prophylaxe.

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Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind einsetzbar wie Lincomycin und Celestlcin zur Behandlung von Menschen, Vögeln und anderen Tieren zur Bekämpfung verschiedener pathologischer Zustände. Die neuen Verbin düngen erlauben die Verabreichung auf oralem und parenteralem Wege zur systemischen Behandlung. Die Verbin düngen erlauben eine Therapie bei Mandelentzündung, Lungenentzündung, Otitis, Konjunctivitis, gegen Geschwü- m re und Furunkel und andere, auf die Anwesenheit von Bak-■^ terien zurückgehende Infektionen. Bei Tieren können die Verbindungen prophylaktisch eingesetzt werden. Beispielsweise können Ratten während der Verschiffung gegen Streptococcus viridans geschützt werden. Wegen ihres ileisches gezüchtete Tiere können prophylaktisch behandelt werden, womit eine Gewichtszunahme erzielt wird.

Säugetiere, die parasitische P.rotozoen aus der Klasse der Sporazeen, Gattung Kokken (Mikroparasiten, die die Krankheit Coccidiose hervorrufen), beherbergen, können ebenfalls durch Verabreichung der erfindungs gemäßen Verbindungen behandelt werden. Beispielsweise - kann man so Rindvieh behandeln, welches mit E. zurnii, ™ E. bovis, E. illipsordalis infiziert ist; Schafe und Ziegen, die mit E- parva, E. faurei infiziert.sind; Schweine , die mit E. debliecki, E. seabra und Isospora suic infiziert sind; Hunde und Katzen, die mit Isospora bigemina, Isospora felis, E. canis, E. felini infiziert sind; Geflügel, das mit E-. tenella infiziert 1st; Kaninchen, die mit E. steedae, E. perforans infiziert sind und Nerze, die mit E. mustelae infiziert sind.

Die Verbindungen eignen sich auch zur Behandlung

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von Krankheiten, die durch Glieder der Gattung Mycoplasma hervorgerufen werden, von denen die bekanntesten Formen die PPLO-(pleuropneumoni-) ähnlichen Organis men wie M. hominis» K. salivarium, M. mycoides, M. hyopneumonia, M. hyorhinis, M. gallisepticuni, M. arthriditis und andere Arten sind, die Mensch und Tier, einschließlich Haustiere wie Schafe, Rindvieh, Schweine, Geflügel und Versuchstiere befallen*

Die Verbindungen werden ferner angewandt zur Behandlung von Nieren- und anderen Infektionen, bei denen Ir-förmige gram-negative und gram-positive Bakterien anwesend sind, beispielsweise die L-Formen von P. mirabilis.

Die 3-Piiosphatester und Salze gemäß vorliegender Besenreibung werden in festen und flüssigen Do sierungsformen zu oralen und parenteralen Mitteln wie Tabletten, Kapseln,,. Pulvern, Granulaten, Pillen, sterilen parenteralen Lösungen und Suspensionen, oralen Lösungen \ind Suspensionen und oralen wässrigen Bnulsionen formuliert.

Pulver werden hergestellt, indem man den Λ-Phosphatester auf eine genügend feine Teilchengröße zer kleinert und mit einem ähnlich zericleinerten Verdünnungsmittel mischt. -Das Verdünnungsmittel kann ein eßbares Kohlehydrat wie Stärke oder Lactose sein. Zweckmäßig wird ein Süßstoff oder Zucker sowie ein Aroma zugesetzt. Trockene Granulate, die mit Wasser angeteigt werden, werden unter Verwendung wasserlöslicher Verdünnungsmittel hergestellt. Ein Pulvergemisch aus feinteiligem ?-Phos-

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phat und; wasserlöslichem Verdünnungsmittel wie Sucrose* Glucose und dergleichen, wird mit einem Bindemittel wie Akazienschleim oder Gelatinelösung benetzt und. durch ein Sieb gepreßt, wobei Granulate entstehen, die man trocknen läßt. Zweckmäßig wird ein Verdickungs- oder Sus pendiermittel wie Methylcellulose mitverwendet sowie ein Netzmittel und.ein aromatisierendes Öl»

Kapseln werden hergestellt, indem man ein Pulvergemisch wie vorstehend beschrieben, herstellt und dieses in vorgeförmte Gelatinekapseln einfüllt. Zweckmäßig wird ein Hilfsmittel für die Füll opera ti on, nämlich ein Gleitmittelλ wie Talk, Magnesiumstearat oder Calcium stearat, dem Pulver vor dem Einfüllen zugesetzt.

Tabletten werden hergestellt, indem man ein Pulvergemisch naß oder trocken granuliert oder zu Stäbchen verarbeitet, ein Gleitmittel zugibt und zu Tabletten verpreßt. Das Pulvergemisch wird erhalten, indem man das entsprechend feinteilige 3-Phosphat mit einem Ver dünnungsmittel wie Stärke, Lactose» Kaolin, Dicalciumphosphat und dergleichen mischt. Dieses Gemisch kann naß granuliert werden unter Verwendung eines Bindemittels wie Maissirup, Gelati-nelösung, Methylcelluloselösung oder Akazienschieimy und diese Mischung wird durch ein Sieb gepreßt. Weiterhin kann man das Pulvergemisch au Stäbchen verformen, d.h. durch die Tablettenmaschine laufen lassen und die resultierenden großen Tabletten (Stäbchen) werden in ein Granulat zerbrochen. Das Granulat kann mit einem Gleitmittel versehen werden, um das Anhaften an der Tablettenmaschine:. asu vermeiden; geeignete Mittel dieser Art sind Stearinsäure* Stearate, Talk oder Mineralöl. Dieses

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mit Gleitmittel versehene. Gemisch wird dann zu Tabletten verpreßt. Die Tabletten können auch mit einem Schutz Überzug versehen werden, der aus einer Hülle aus Schellack, einem Überzugszucker und Methylcellulose und einem Glanzmittel wie Carnauba-Wachs besteht.

Flüssige Präparate zur oralen Verabreichung werden in einheitlichen Dosierungsformen als Sirupe und Elixiere hergestellt, von denen eine bestimmte VoIumenraenge eine vorbestimmte Menge an 3-Phosphat enthält.

Ein Sirup wird erhalten, indem man das ^--Phosphat · in einer geeignet aromatisierten wässrigen Sucroselösung dispergiert«. Ein Elixier wird erhalten_s indem man einen wässrig-alkoholischen Träger verwendet. Elixiere sind zweckmäßig, wenn die Verbindung eine geringe Löslichkeit in Wasser und eine gute"Löslichkeit in wässrig-alkoholischem Medium zeigt.

Zur parenteral en Verabreichung werden sterile flüssige Dosierungsfoimen hergestellt. Dabei wird eine abgewogene Menge des 3-Phosphats in eine Ampulle ge geben. Die Ampulle und Inhalt werden sterilisiert und verschlossen. Zweckmäßig wird eine weitere Ampulle mit sterilem Wasser gleichzeitig vorbereitet, welche zur Bildung.einer Suspension oder Lösung vor der Verarbreichung benützt wird. Im sterilen Wasser können Suspen-, diermittel, Lokalanästhetika und Puffer gelöst sein.

Parenterale Suspensionen mit Dauerwirkung können hergestellt werden, indem man das 3-Phosphat in einem parenteral zulässigen Pflanzenöl, gegebenenfalls zusammen mit weiteren Zusätzen, suspendiert. ,

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Der Ausdruck "Sinheitsdosierungsform" in vorliegender Beschreibung bezieht sich auf physikalisch diskrete Einheiten, die als einmalige Dosierungen für Menschen geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbe stimmte Menge des Wirkstoffs enthält. Die Vorschriften für die Einheitsdosierungen werden vorgegeben und sind direkt abhängig von (a) den Eigenschaften des aktiven Materials und dem jeweils zu erzielenden therapeutischen Effekt und (b) den durch die Pormulierteehnik gesetzten Grenzen. Beispiele für geeignete Bosierungsein-» hexten sind Tabletten, Kapseln, Pulverpäekclieii, Granulate, Oblaten» die Menge von ein Teelöffel, die Menge von ein Eßlöffel, Tropfen, Ampullen uad weitere !formen wie in dieser Beschreibung erwähnt. Die Dosierungseinheit in mit geeigneten pharisaseuti sehen Prägern hergestellten Präparaten enthält in-bevorzugten. Ausfuiauasgsformen 25 bis 500 Eg 3^-Phosphat oder ein pharmakologiseh zulässiges Salz davon pro Dosiseinheit und 5 bis 65 f* (Gewicht/Volumen) bei parenteralen Präparaten.

Die Meage-an" au-verabreichendem 3--Piiosphat oder seinen.Salasn-hängt ab von. Alter und G-ewicht des Patienten, der su behandelnden Krankheit und der Art der Verabreichung. Bei systemischer Behandlung werden Dosen von etwa.l mg pro kg pro Tag bis etwa 50 mg pro kg pro Tag bevorzugt.

Ia den folgenden Beispielen beziehen sich alle Prozentangaben auf das Gewicht und alle Verbaltnis»erte für Lösungsmittelgemisohe auf das Volumen, falls nichts anderes angegeben.

00081 87 18.8-i BAD onm_mL

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Beispiel 1: Lincomycin-3-phosphat A. Fermentation

Zur Inokulierung von mehreren 500 ml-Erlenmeyerkolben, von denen jeder 100 ml eines sterilen Mediums aus folgenden Komponenten enthält:

Glucosemonohydrat 25 g/l

Phanaamedia ⁺ 25 g/l

Leitungswasser aum Auffüllen

Pharmamedia ist ein technisches Baumwollsamenmehl, Hersteller Trader's Oil Mill Company, Fort Worth, Texas

wird Streptomyces rochei, KRRL 3512 verwendet. DLe Kolben werden 3 Tage Ii
maschine behandelt.

ben werden 3 Tage lang bei 28 C auf einer Schüttel -

20 ml des wie vorstehend beschriebenen Inokulums werden zur Inokulierung von mehreren 500 ml -ErI en ----meyerkolben verwendet Y von denen jeder 100 ml eines sterilen Förmentationsmediums aus folgenden Komponenten aufweist:

Sucrose 30 g/l

Natriumnitrat 3 g/l

Dikaliumphosphat 1 g/l

Magnesiumsulfat 0,5 g/l

, Kaliumchlorid 0,5 g/l

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BADORKStNAL

Ferrosulfat 0,01 g/l

Leitungswasser zum Auffüllen

Den Pennentationskolben werden nach der Autoklaven-Behandlung und vor der Inokulierung 50 mg/l Lincomyeinhydrochlorid zugesetzt.

-'."-.■ Die Kolben werden dann 2 Tage lang bei 37°C auf

P der Schüttelmaschine behandelt. Die Phosphorylierungs-

reaktion wird durch Messen des Verluste der Wirkung gegenüber S. lutea verfolgt. Etwa 80-90 "fo des zugesetzten Lineomycins werden innerhalb 48 Stunden unter Bildung einer in vitro antibakteriell inaktiven Form phosphoryliert. Der Test gegen S. lutea wird wie folgt durchgeführt: Gearbeitet wird mit Agar, das mit pH 7,0 Phosphatpuffer (0,1 Molar) auf pH 6-8 gepuffert ist. Eine Volumeneinheit (0,08 ml) der Lösung, die das zu testende Material enthält, wird auf eine Prüfscheibe von 12,7 mm gebracht, die dann auf die mit dem Mikroorganismus beimpfte Agarplatte gelegt wird. Eine biologische Einheit entspricht der Menge Material pro ml, die, ent-" halten in 1 ml Lösung, eine Irihibierungszone von 20 mm

ergibt. ^v ■

B. Aufarbeitung.

Die obige Fermentation wird so durchgeführt, da3 man 4900 1 Fermentationsbrühe erhält, welche das Lincomycin-^-phosphat enthält. Diese Brühe wird zunächst filtriert mit Hilfe von 2 # Diatomeen-Pilterhilfsmittel. Die klare Brühe wird dann mit 400 1 Skellysolve B (iso-

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Mmmmam ■ ~

mere Hexane) extrahiert. Der pH-Wert der klaren Brühe wird auf etwa 5,9 eingestellt, dann wird mit etwa 450 einer 9 $-igen Lösung von Natrium-dinonylnaphthalin sulfonat in Skellysolve B extrahiert. Die Extraktion wird einmal wiederholt. Eine 3. Extraktion erfolgt mit 300 1 SkelIysolve B, Sämtliche Extrakte werden vereinigt und mit 200 1 Wasser gewaschen. Der Extrakt mit Natriumdinonylnaphthalinsulfonat wird mit 800 1 25 #-igem AIiquat 336 (Tricaprylmethyl-ammoniumchlorid) in Skellysolve B und 200 1 Wasser extrahiert. Der Extrakt wird dann zwei weitere Male mit Wasser extrahiert und die wässrige Phase wird mit 200 1 Skellysolve B extrahiert. Der pH-Wert der wässrigen Phase wird auf 4,0 einge stellt, dann wird im Vakuum auf 185 1 eingeengt. Dem Konzentrat werden 11,2 kg Aktivkohle zugegeben und das Gemisch wird 30 Minuten lang gerührt, Dann werden 4 kg Filterhilfsmittel diesem Gemisch zugesetzt, dann wird filtriert. Der Filterkuchen wird mit 180 1 Wasser und dann mit 5 $-igem Azeton gewaschen. Der Kuchen wird dreimal mit 25 #-igem Azeton extrahiert, wobei für jede Extraktion 180 1 verwendet werden. Die Azetoneluate werden vereinigt, im Vakuum eingeengt und gefriergetrocknet, wobei man das Lincomycin-3-phosphat erhält.

Wird dieses Phosphat Chromatograph!ert und an schließend einer Gegenstromverteilung, wie in Beispiel 2 beschrieben, unterworfen, so erhält man ein reines Präparat aus Irincomycin-3-phosphat in der zwitterionischen Form. * .

Charakterisierung des Lincomycin-3-Phosphats.

0 9818/

195231?

Infrarotspektrums Das IR-Absorptionaspektrum des Mn-

comycin-3-pb-Qsphat-zwitterions, sus-. pendiert inMineralöl*wird durch folgende Maxima bei den angegebenen Wellenlängen» in em gekennseiahnets

3330	(S)	1160	(S)
3070	(S)	1092	(S)
2920	(S) (Öl)	1070	(S)
2850	(S) (Öl)	1048	(S)
2730	(M)	995	(S)
2400	(M)	970	(S)
1670	(S)	925	(S)
1565	(S)	877	(S)
1535	(S)	845 .	(M)
1460	(S) (Öl)	777	(M)
1375	(S) (Öl)	735	- (H)
1300	(S)	720	(M)
1240	Cs)

Das ΙΕ-Absorptionsspektrum des 3-Phosphat-zwitterions in einem Kaliumbromidpellet ist wie folgt gefcennzeichnets (6m~ )%

3400	(S)	1305	(S)
3250	CS)	1255	■-■: CS)
3070	(S)	1180	Cs)
2960	(S)	1090	(S)
2930	Cs)	1Ό70	" (S)
2870 -	(S)	1048	Cs)
1675	(B)	995 ■	Cs)

003818/1866

155231?

1650	(S)	975	(S)
1620	(S)	920	(S)
1565	(S)	878	(S)
1537	(M)	843	(M)
1460	(H)	780	(M)
1450	' (H)	740	(M)
1382	(S)	700	(H)
1320	(S)
Hvdrolysengeschwindi^ceit: In rnene	ichliche

hydrolysiert Lincomycin-3-phosphat wesentlich langsamer als Lincomycin-2-phosphat.

Titration; Äquivalentgewicht gefunden = 289.

Spezifische Drehung: C*! jj* = ^{+ 127}° (Konzentration 0,689 in Wasser).

Antibakterielle Wirkung von Lincomycin-3-phosphat in vivo: Die CD₁-Q liegt bei etwa 30 mg/kg (subkutan bei durch S. aureus infizierten Mäusen).

Beispiel 2: Clinimycin-3-phosphat.

A. Fermentation, ,

Zur Inokulierung einer Reihe von 500 ml-ErIenmeyerkolben, von denen Jeder 100 ml steriles Medium aus folgenden Komponenten:

Glucosemonohydrat 25 g/l

Pharmaaidia 25 g/l

Leitungswasser «-., Auffüllen

0098 18/188 6

enthielt, wurde Streptomyces coelicolor NREL 3532 verwendet. Die Kolben wurden 3 Tage lang bei 28 C auf der Schüttelmaschine geschüttelt. 5 ml des wie vorstehend beschrieben hergestellten Inokulums wurden zur Inokulierung einer Reihe von 500 ml-Erlenmeyer kolben verwendet, von denen jeder 100 ml steriles Fernentati onsmedium aus folgenden Komponenten enthielt:

fe Natriumnitrat -".„"""■ . 3 g/l

¹^ Dikaliumphosphat 1 g/l

Magnesiumsulfat 0,5 g/l

Kaliumchlorid , 0,5 "g/l

Ferrosulfat 0,01 g/l

Grlucosemonohydrat 20,0 g/l

Hefeextrakt 2,5 g/l

NZ-Amine B ⁺ 5,0 g/l

⁺ Vertrieb durch Difco Laboratories, Detroit, Michigan.

24 Stunden nach der Inokulierung wurden in je-

b den Kolben 50 mg pro 1 Glinimyciη eingebracht. Dann wurden die Kolben 2 Tage lang bei 28°C auf der Schüttelmaschine behandeil/. Die Phosphoryli erung sreakti on wurde durch Messen des Verlusts an Clinimycin-Aktivität unter Verwendung von S. lutea verfolgt. Die Anwesenheit von Clinimyci,n-3-phosphat wird bestimmt durch Inkubieren der inaktiven Gärbrühe mit alkalischer Phosphatase bei : pH 8,0 in Gegenwart von Tris-Puffer, wobei gegen S. lutea getestet wurde.

981871886

B. Aufarbeitung.

Gärbrühe (ca. 12 l), hergestellt wie vorstehend beschrieben, wird unter Verwendung von Diatomeenerde als Filterhilfsmittel filtriert. Der Filterkuchen wird mit 2 1 Wasser gewaschen. Die wässrige Waschlösung wird mit klarer Gärbrühe vereinigt und die vereinigten klaren Lösungen werden mit einem Adsorptionsmittelt beispielsweise Kohle oder Amberlite XAD-2 (Vertrieb durch Rohm und Haas Co.) behandelt, um wasserlösliche Verunreinigungen, die die Wirksamkeit der folgenden Chromatographierstufe herabsetzen können, zu entfernen. Die Adsorptionssäule wird hergestellt, indem man etwa 600 g des Adsorptionsmittels in Wasser aufschlämmt, die Aufschlemmung in eine Glassäule (Innendurchmesser 50 mm) gießt und die Auf schlemmung dann bei Normaldruck ab sitzen läßt. Das klare Gemisch aus Waschlösung und Brühe, wie vorstehend beschrieben, wird durch die Säule geleitet. Die verbrauchte Gärbrühe wird als eine Fraktion aufgefangen und mit A bezeichnet. Die Säule wird dann mit Wasser gewaschen. Die wässrige Lösung wird gesammelt und als Fraktion B bezeichnet. Dann wird die Säule mit 5 1 60 $-igen wässrigen Methanols eluiert. Dabei werden insgesamt 200 Fraktionen aufgefangen. Dann wird mit 2 1 95 $-igem wässrigen Methanol eluiert und dieses Eluat wird als eine Fraktion aufgefangen. Sämtliche Fraktionen werden auf ihre Wirkung gegenüber dem Mikroorganismus' S. lutea vor und nach Behandlung mit alkalischer Phosphatase getestet, um die Anwesenheit von Glininiyein-3-phosphat festzustellen* Die Ergebnisse dieser lests werden nachstehend wiedergegeben*

009818/1886

195*3.17

Beschreibung der Fraktion	Zonengröße (mm)	19	nach der alkal. Phosphatase-Be- handlung
Klare Gärbrühe- Vaschl.	Vergleich (vor der Phosphatase-Behand- lun^;)	0	36
Verbrauchte Brühe Fraktion A	26	o . ^;	0
0	0	28
Wässr. Wasch!.Fraktion BO	18,5
60 ?6 wässr.-Methanol	^: ' ■ 20. - ■ - *
Fraktion No.	22	30
5	23	27
10	26	■". . :: 22
15	25 ■-■■	-^: 22 ■"' . -:'
20	.25.
25	23	- Ai- ■ :■ ■ -
30	23	■■■■ 42 --■ ---
-35- . .■	22	46
40	21	47 ·
45	20	46
50	18	45 ':■;
.60	^:: 18 '■ ■.■-	44
70	17	. ■ 44
- 80	18	44
90; -		^: 43- ';.'.'■■
100	43
120	41
140	38 " '
160	38
. 180	37
200

95 $> wässr.-Methanol 37

ÖAD OfUßfNAL

1352317

• Die bei der Eluierung mit 60 #-igem Methanol erhaltenen Fraktionen 25-200 werden vereinigt und als Lösung G bezeichnet (ca. 4 1). Dieses Material wird dann an einem Anionenaustauscher chrömatographiert. Die Säule wird mit Dowex-1 (X-4) in Azetatform (Hersteller Dow Chemical Co., Midland, Michigan) gefüllt. Die Lösung C wird mit wässriger Ammoniumhydroxydlösung auf pH 10,0 eingestellt und die alkalische Lösung wird durch die Chromatographiersäule geleitet. Das austretende Material wird in Foim von vier 1-Liter-Fraktionen aufgefangen, die als verbrauchte Lösung -1, verbrauchte Lösung -2, verbrauchte Lösung -3 und verbrauchte Lösung -4 bezeichnet werden. Sodann wird die Säule mit 2 1 Wasser gewaschen und die dabei aus der Säule austretende Flüssigkeit wird als wässrige Waschlauge bezeichnet. Die. Säule wird sodann mit 5 #-iger wässriger Essigsäure eluiert, wobei Fraktionen von je 20 ml aufgefangen werden. Einige Fraktionen wurden auf ihre Aktivität gegen S. Iutea, vor und nach Behandlung mit alkalischer Phosphatase, getestet. Folgende Ergebnisse wurden erzielt:

^r - Zonengröße (mm)

Vergleich (vor der nach der alkal. Phosphatase-Behand- Phosphatase-Belungj handlung

Ausgangsmateriäl

(Lösung C) 23 43

verbrauchte Lösung-1	20,5	21
verbrauchte Lösung-2.	21	22
verbrauchte Lösung-<3	21,5	21,5
verbrauchte Lösung-4	20,5	23
wässrige Waschlauge	16	16

009818/1866

- 28 (Fortsetzung):

ZonenftTöße (mm)

Vergleich (vor der Phosphatas e-Behan dlung)

$-ige Essigsäure

Fraktion Nr.	15
20	25
25	29
30	26
35	25
40	19
45 .■■■■""	18
50	16
60	16
70.	16
80	16
90	16
100	16
120	16
140	16
160	16
180	16
200

nach der alkal Phösphatase-Be handlunß

15 52

50 47,5 42,5 39

20 17 17 17 16 16 16

Die beim Eluieren mit 5 ^-iger Essigsäure erhaltenen Fraktionen 22-70. werden-vereinigt und die Lösung wird gefriergetrocknet, wobei man 2»59 g eines Präparates D erhält. 2 g dieses Präparates werden einer

9819/1866

SAD ORIGINAL

G-egenstromverteilung unterworfen unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus n-Butanol und Wasser (VoIu men/Volumen 1:1). Die Vorrichtung zur Gegenstrom verteilung hält 10 ml pro Phase und die Verteilung erfolgt auf 500 Überzüge. Fach 500 Übergängen werden bestimmte Röhrchen auf die Wirkung gegen S. lutea getestet und zwar vor und nach Behandlung mit alkalischer Phosphatase. Die Fraktionen 200-300 werden vereinigt. Diese Lösung wird im Vakuum zur Trockne eingedampft, dann wird der Rückstand in 5 ml Methanol gelöst. Die Lösung wird mit Azeton, Äther und 1 ml 1 n-methanolischem Chlor wasserstoff gemischt. Der resultierende Niederschlag aus Clinimycin~3-phosphat wird abfiltriert und getrocknet, wobei man 300 mg Produkt erhält. Dieses Produkt aus Olinimyein-3-phosphat ist wie folgt charakterisiert:

Infrarotspektrum: Das Infrarot-Absorptionsspektrum von

Clinimycin-3-phosphat in Mineralöl zeigt Maxima bei folgenden Wellen längen, angegeben in cm"" :

3300	(S)	(Öl)	1575	(S)	(Sch)	1258	(S)
3055	(S)	(Öl)	1570	(S)	(Sch)	1220	(S)
3940	(S)		1555	(S)		1148	(S)
2845	(S)		1532	(S)		1098	(S)
2720	(S)	(Sch)	1520	(S)	(Sch)	1070	(S)
2680	(S)	(Sch)	1505	(S)	(Sch)	1040	(S)
1718	(S)	(Sch)	1470	(S)	(Sch)	987	(S)
1705	(S)		1458	(S)	(Öl)	960	(S)
1700	(S)		1435	(S)	(Sch)	880	(M)
1685	(S)	1385	(S)	(Sch)	855	(M)
1675	(S)	1375	(S)	(Öl)	815	(M)

003818/1866

- 50 -

	(S)	(Sch)	(Fortsetzung)	(Sch)	-	780	(M)
1652	(S)	(Sch)	1565 (S)		720	(M)
1625		1510 (S)

Das Infrarot-Spektrum des Clinimyein-5-phosphats in einem Kaliumbromid-Pellet zeigt Maxima bei folgenden Wellenlängen:

§t 5450 (S) 1560 (M) * 1073-(S) 3250 (S) 1540 (W) 1045 (M-)

3070 (S) 1455 (W) 989 (W)

2960 (S) 1384 (M) 930 (W)

2930 (S) 1515 (W) 880 (W)

2870 (S) 1255 (M) 855 (W) *

1685 (S) 1220 (M) 780 (W)

1680 (S) 1150 (M)

1655 (M) 1095 (S)

Die Intensitäten im Infrarotspektrum werden mit "S"» "M" und ^I!W" angegeben und die Angaben beziehen sich auf den Hintergrund in der Hachbarschaft der Banden. P Eine Bande "S" ist in ihrer Intensität von derselben Größenordnung wie die stärkste Bande des Spektrums; eine Bande ¹¹M" ist ein Drittel bis zwei Drittel so intensiv wie die stärkste Bande und Banden "W" sind weniger als ein Drittel so stark wie die stärkste Bande. Die Schätzungen wurden auf der Basis der prozentualen Transmission ge macht. Die antibakterielle Wirkung von Cliaimycin.-5-phosphat in vivo beträgt? ,

• CD₅₀ = 15 (10-25) mg/kg (bei subkutaner Verabreichung an mit Staphylococcus aureus in-

009818/1866

195231?

fizierten Mäusen).

Clinimyein-3-phosphat ist in vitro gegen folgende Mikroorganismen bis zu und einschließlich einer Menge von 1000 y pro ml inaktiv:

B. subtilis S. schottmuelleri

S# aureus Proteus vulgaris M.R₄

M. avium S. lutea

K. pneumoniae S. pastorianus

E. coli

Beispiel 3: 1'-Demethylclinimycin-3-phosphat.

Etwa 12 1 Gesamt-Gärbruhe aus einer Fermentation wie in Beispiel 2 beschrieben stammend, wobei l'-Demethyl-elinimyein dem Permentationsmedium in einer Menge von 50 V/ml zugesetzt wurde, werden unter Verwendung von Diatomeenerde als Filterhilfsmittel filtriert. Der Filterkuchen wird mit 1 1 Wasser gewaschen und Waschlösung und klare Brühe werden vereinigt und chromatographiert. Die dazu verwendete Säule wird mit Dowejo-l (X-4) in Aeetatfonn gefüllt. Vor dem Chromatographieren wird die klare Flüssigkeit mit wässriger Ammoniumhydroxydlösung auf pH 10,0 eingestellt. Das aus der Säule austretende Material wird in Form von drei Fraktionen von je 4 1 aufgefangen, die als verbrauchte Lösung-1, verbrauchte Lösung-2 und verbrauchte Lösung -3 bezeichnet werden. Dann wird die Säule mit 4 1 Wasser gewaschen, das in Form von 2 Fraktionen von jeweils 2 1 aufgefangen «rird. Diese FraKtionen werden als Wasch lösung-1 und Waschlösung-2 bezeichnet. Sodann wird die

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BAD ORIGINAL

Säule mit 5 $-iger wässriger Essigsäurelösung eluiert. Dabei werden 7 Fraktionen von je 1 1 aufgefangen, die als Eluar-1 bis Eluat-7 bezeichnet werden. Sämtliche Fraktionen werden auf ihre Wirksamkeit gegen S. lutea vor und nach Behandlung mit alkalischer Phosphatase getestet. Die Eluate 2 bis 7 werden dann vereinigt und die Lösung wird gefriergetrocknet.· Dabei erhält man 16,98 g eines l'*-Demethylclinimycin-3-phosphat enthaltenden Präparats. Dieses Material wird einer Gegenstromverteilung unterworfen unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus n-Butanol und Wasser (Volumen/Volumen 1:1). Die Vorrichtung zur Gegenstromverteilung hält 10 ml pro Phase. Nach 500 Übertragungen wird der Inhalt ausgewählter Röhrchen auf Wirkung gegen S. lutea getestet und zwar vor und nach Behandlung mit alkalischer Phosphatase. Die Fraktionen 220 bis 250 werden vereinigt und zu einer wässrigen Lösung konzentriert, die einer Gefriertrocknung unterworfen wird. Dabei erhältman 370 mg l'-Demethylclinimycin-3-phosphat.

Diese Verbindung besitzt folgende Formel:

: ^H ■ au ■■■■"

H -■- ^C1

n-Propyl · '

μ..: Lj ο — ν

¹ ■■..■.··■ ·1^γη

/f.;3CH₃ OH

00 98 18/1866

. OH

in der P die Gruppierung -P^

Beispiel 4; 1'-Demethyl-4'-depropyl-4'-pentyl-clinimycin-3-phosphat.

Etwa 12 1 Gesamt-Gärbrühe, entstammend aus einer Fermentation wie in Beispiel 2 beschrieben, bei welcher 1'-Demethyl-4'-depropyl-4'-pentyl-clinimycin dem Fermentationsmedium in einer Menge von 50 ypro ml zugesetzt worden war, wird unter Verwendung von Diatomeen erde als Filterhilfsmittel filtriert. Der Filterkuchen wird mit 1 1 Wasser gewaschen. Die Wasehlösung wird mit der klaren Brühe vereinigt und die Lösung wird chromatographiert unter Verwendung einer mit Dowex-1 (X-4) in Acetatform gefüllten Säule. Die Chromatographierung erfolgt wie in Beispiel 3 beschrieben. Die aufgefangenen Fraktionen,werden vor und nach Behandlung mit alkalischer Phosphatase auf ihre Wirkung gegen S. lutea getestet. Die Eluate 2-7 werden vereinigt und die Lösung wird gefriergetrocknets wobei man 18,63 g eines Prä parats aus 1 '-Demethyl-4'-depropyl-4'-pent.yl-clinimycin-3-phosphat erhält. Dieses Material wird durch Gegen stromverteilung wie in Beispiel 3 beschrieben, gereinigt. Fach 500 Übergängen wird der Inhalt von ausgewählten Röhrchen auf seine Wirkung gegen S. lutea vor und nach Behandlung mit alkalischer Phosphatase getestet. Die Fraktionen 380-400 werden vereinigt und zu einer wässrigen

009818/1866

Lösung eingeengt, die dann nach der Gefriertrocknung ein 1' -Demethyl-4' -depropyl-4' -pentyl-elinimycin-3-phosphat enthaltendes Präparat ergibt.

Diese Verbindung besitzt folgende Formel;

Pentyl

Cl

/ SCH,

OH

in der P	=	-P
		Il
		0
Beispiel	5:

Ersetzt man in dem Verfahren des Beispiels 1 das Lincomycin durch 4'-Depropyl-4'-äthyl-lincomycin, so erhält man 4' -Depropyl-4' -äthyl-lincomycin-3-phosphat.

Beispiel 6; ■

009818/1866

■Ersetzt man im Verfahren des Beispiels 1 aas Lincomycin durch l'-Demethyl-l'-äthyl-lincomycin, so erhält man das l^l-Demethyl-l'-äthyl-lincomycin-3-phosphat.

Beispiel 7;

Ersetzt man im Verfahren des Beispiels 1 das Lincomycin durch l'-Demethyl—lincomycin, so erhält man das 1' -'i5emethyl-lincomycin-3-phosphat.

Beispiel 8;

Ersetzt man im Verfahren des Beispiels 2 das Clinimycin durch Celesticetin, so erhält man Celesticeiin-3-phosphat.

Beispiel 9:

Die unphosphorylierten Verbindungen der Beispiele 1-8 werden mit einem zellfreien Extrakt aus einer Streptomyees-Kultür, welche in einem moaifizxerten Czapek's-Dox-Meaium gezüchtet worden war, inkubiert. Die Zellen werden zerrissen, indem man sie entweder 4 Kinuten lang in Q,04-molarer Phosphatpufferlösung vom pH 7,5 oder in Glycylglycin-Puffer (0,!-molar, pH 8,0) beschallt oder mit Eiweiß-Lysozyn 1 Stunde lan^ bei 28 C spaltet. Das mc ei fixierte Czapek's—Do x-Kecii um bestand aus folgenden Komponenten:

009818/1866

BAD ORIGINAL

c/l

NaNO,

CaCO,

K₂HPO₄ . ·

MgSO₄

FeSO₄.7H₂O

Glucose-Monohydrat
Difco-Hefeextrakt

NZ-Amine B

1,5

1,5 5,0 1,0 0,5 0,5 0,01

20,0 2,5

5,0

1 L,iter H₂O, pH 7,2 vor Autoklavenbehandlung

pH 7,2 nach Au to kl avenbehsndlung

Das resultierende Material wurde 2Ö Minuten lang mit 30 000 χ Qr zentrifugiert, wobei man eine zellfreie, aktive, überstehende Flüssigkeit erhielt, die in flüssigem Stickstoff aufbewahrt werden konnte. Reaktions gemisch und Reagens zur Trans-Phosphorylierung waren wie folgt: ^:

Reagens: Adenosin-triphosphat

Glycylglycin
Reaktionsgemisch:

0,1 Μ/ pH 8,0

0,2 M

0,1 M, pH 8,0

0,1 m MgCl₂

0,1 ml Adencsintriphoüphat

OG98 1 8/ 1866

8AD ORIGINAL

Reaktionsgemisch: ■

0,2 ml Substrat (z.B.

unphosphorylierte Verbindung)

0,5 ml Enzym in G-lycyl -

glycin oder Phosphatpuffer

Inkubation: 24 Stunden bei 28⁰G.

Nach beendeter Reaktion erhält man die in Bei spiel 1-8 beschriebenen phosphorylierten Verbindungen.

Beispiel 10;

Teil A: Lincomycin-3-phosphat, Diammoniumsalz.

Lincomycin-3-phosphat in der Zwitterionenform wird in einer minimalen Wassermenge gelöst und mit einer gleichen Volumenmenge Äthanol verdünnt. Die Lösung -wird in einem Eis-Wasser-Bad gekühlt und dann mit Ammoniakgas gesättigt. Her weiße Niederschlag aus Diammoniumphosphat wird abfiltriert und das Piltrat wird bei 30°G unter Hochvakuum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in einer minimalen Menge Methanol gelöst und mit 5 Volumenteilen Äther verdünnt, um das Lincomycin-3-phosphat als Ammoniumsalz auszufällen.

Teil B: Lincomycin-3-phosphat, Hemi-Ammoniumsalz.

1,0 g Ammonium-lincomycin-3-phosphat (siehe Teil A) wird in 4 ml Wasser gelöst. Die farblose Lösung wird mit 0,25 ml Essigsäure verdünnt und dann mit 30 ml Aceton

009818-/1866'

(beginnende Trübung). Die Kristallisation'verläuft sehr rasch. Nach 8-stündigem Kühlen im Kühlschrank werden die Kristalle abfiltriert, mit 5 il Aceton-tfasser (95s5) und dann mit 20 ml Aceton gewaschen. Die weiße kristalline Verbindung wird abfiltriert und getrocknet.

Beispiel 11:.. Wässrige Losung zur oralen Verabreichung. Diese wird hergestellt aus folgenden Komponenten:

Lincomycin-3-phosphat 100 g

Propylparaben 0,25 g

Methylparaben 0,75 g

Sorbinsäure 1,0 g

4 n-Natriumhydroxydlösung zu»

Einstellen von pH 7»5 - ·

Entionisiertes Wasser zum Auffüllen auf 1000 ml.

Beispiel 12; Sirup .

Ein orales wässriges Präparat mit 400 mg Lin comyein-3-phosphat in jeweils 5 ml wird aus folgenden Bestandteilen hergestellt:

Lincomycin-3-phosphat 800 g Methylparaben, U.S.P. 7,5 g

Propylparaben, U.S.P. 2,5 g

Sorbinsäure 10 g

Saccharin, Na 6,5 g

Glycerin 3000 ml

. Traganthpulver 100 g

Orangenöl-Gesehmack 10 g

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(Fortsetzung)

P.D. & C. oranger Farbstoff 7,5 g

4 n-Natriumhydroxydlösung zum
Einstellen von pH 7,5

Entionisiertes Wasser zum Auffüllen auf 10 00ü ml.

Anstelle des Lincomycin-3-phosphats können in den Beispielen 11 und 12 des 7(S)-Chlor-7-deoxylinconiycin-3-phosphat und wasserlösliche Salze von Lincomycin-3-phosphat und 7(S)-Chlor-7-deoxylineomycin-3-phosphat, beispielsweise die Alkalimetallsalze einschließlich des Ammoniumsalzes, verwendet werden. Dabei' kann mar. mit den Hemi-, Mono- oder Di-Salzen arbeiten.

Die wässrigen Formulierungen der Beispiele 11 und 12 eignen sich besonders zur Verwendung in der Kinderheilkunde; sie können oral in den selben Dosie rungen wie Lincomycin verabreicht werden.

Beispiel 13? Kapseln .

Eintausend 2-teilige, narte Gelatinekapseln zur oralen Verwendung mit jeweils 350 mg l^l-Demethylclinimycin-3-phosphat werden aus folgenden Komponenten hergestellt:

l^l-pe.'üethylclinimycin-3- . 35Og

phosphat

Maisstärke 50 g

Talk 25 g

Magnesiuinstearat 2,5 g

009818/1^66

SAD ORIGINAL

Die obigen Materialien werden sorgfältig gemischt und dann auf übliche Weise in Kapseln gefüllt.

Diese Kapseln eignen sich zur systemischen Behandlung von Infektionen bei Erwachsenen durch orale Ver abreichung von 1 Kapsel alle 4 Stunden.

Nach obigem Verfahren können ferner auch Kapseln mit 50, 125, 250 und 500 mg l'-Demethylcliniinycin^- phosphat hergestellt werden.

Beispiel 14; Tabletten.

Eintausend Tabletten zur oralen Verabreichung, mit einem Gehalt von jeweils 500 mg l'-Demethyl-4'-depropyl-4 ^g-pentyl-cl±nimycin-3-phosphat werden aus folgenden Komponenten hergestellt:

1'-Demethyl-4'-depropyl-4'-pentylclinimycin-3-phosphat 500 g

Lactose 50 g

Maisstärke 65 g

Magnesiumstearat 3g

helles flüssiges Petroleum 3g

Die obigen Materialien werden sorgfältig gemischt und zu Stäbchen verpreßt. Die Stäbchen werden zerbrochen, indem man sie durch ein Sieb Nr. 16 preßt. Das resultierende Granulat wurde dann au Tabletten ver preßt, von denen jede 500 mg Wirkstoff enthielt. Diese Tabletten eignen sich zur systemischen Behandlung von

ÖÖ9818/1866

195231?

Infektionen bei Erwachsenen unter oraler Verabreichung von 1 Tablette alle 4 Stunden.

Nach obiger Arbeitsweise können auch Tabletten mit 200 mg Wirkstoff hergestellt werden.

Beispiel 15? Parenterales Präparat.

Ein steriles wässriges Präparat zur intramuskulären Verabreichung mit 300 mg Celesticin-3-phosphat pro ml wird aus folgenden Komponenten hergestellt:

Oelesticetin-3-phosphat 300 g

Benzylalkohol 9g

Wasser f. Injektionszwecke zum'

Auffüllen auf 1000 ml

Der sterile Wirkstoff wird im sterilen Benzylalkohol -Wasser-Träger dispergiert und in Ampullen abgefüllt, die verschlossen werden.

Beispiel 16: Tierfutter.

1000 g eines Futtergemischs werden aus folgenden Komponenten hergestellt:

- 4'-Depropyl-4'-äthyl-

lincomycin-3-phosphat 20 g

Sojabohnenmehl 400 g

Fischmehl 400 g

WeizenkeimÖl 50 g

Sorghum-Molasse 140 g

09818/106«

BAD QRiOWAt

Die obigen Materialien werden vermischt und zu Pellets verpreßt.

Das so erhaltene Produkt kann an Labortiere, wie Ratten, Mäuse, Meerschweinchen und Kaninchen zur Prophylaxe während des Transports verabreicht werden.

Bei größeren Tieren kann das Produkt dem normalen Futter in der zur Erzielung der gewünschten Dosis berechneten Menge beigemischt werden.

Beispiel 17i Parenterales Präparat.

Ein wässriges Präparat aur intramuskulären Verwendung mit 300 mg Lincomycin-3-"Phosphat pro ml wird aus folgenden Komponenten hergestelltι

Lincomyein-3-phosphat ■ 500 g Benzylalkohol Sg

Wasser f. Injektionszwecke zum

Auffüllen auf 1000 ml

^; Der sterile Wirkstoff wird in dem sterilen Benzylalkohol-Wasser-Träger dispergiert und in Ampullen ge- ■ füllt, die verschlossen werden.

Mit diesem Präparat erhält man stärkere Dauerwirkung als mit einem vergleichbaren Präparat, das Lincomycin-2-phosp hat enthält, da das Lincomycizi-^-'Phosphat langsamer hydrolysiert. ■ . "' ■ '

009811/1

Claims

Patentansprüche:

1. 5-Phosphat-Ester von Verbindungen der allgemeinen Formel

CH,

NH

HO /| OP

SR

OH

und deren Salze, worin R ein Methyl- oder Äthylrest oder den Rest ^

It

.CH₂-CH₂-O-C

HO

R, ein Wasserstoffatom oder ein eis- oder trans Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoff at otaen, Rp ein Wasserstoffatom, ein Methyl- oder Äthylrest; X eine Hydroxylgruppe, ein Chlor- oder Bromatom in (R)- oder (S)-Konfiguration oder ein Methoxyrest und P der Rest

-OH
OH

sind.

09813/1866

8AD ORIGINAL

2. Die zwi tt eri oni s ehe Form der-Verbindungen, gemäß Anspruch 1.

3. Verbindungen gemäß Anspruch 1 der allge meinen Formel .

/N\

Il

CH,

HO

NH

HO

f\op _t/

' SR

OH

und deren Salze, worin R» R^ und P die vorgenannte Bedeutung besitzen.

4. ' Verbindung gemäß Anspruch 3 der allge meinen Formel:

9818/1886

CH,

I J

'N

n-C

GH,

3H₇

Il

HO

NH -

HOy -Ό

OP

SR

OH

und deren Salze, worin P der Rest - P

0 ein Methylrest sind.

und R

5. Verbindung gemäß Anspruch 3 der allgemeinen

Formel

H _x ?^H3 ©

CH,

HO

ti

HO/

OP

SR

worin P der Rest -P

OH

und R ein Methylrest ist.

009818/1S86

BADOfiiGtNAi

6. Verbindungen gemäß Anspruch 1 der- allgemeinen Formel

K .1

^Ri

Il

GH,

HO

Hai

OP

/SR

OH

und deren Salze, worin Hai ein Chlor - oder Bromatom ist und R, R₁, R
deutung besitzen.

ist und R, R₁, R„ und P die in Anspruch 1 genannte Be

7. Verbindung gemäß Anspruch 6 der allgemeinen Formel

:|_iqf

CH,

Cl

HO

OH

.OH

und-deren Salze, worin P der Rest -P

Methylrest sind.

und R ein

8. Verbindung gemäß Anspruch 6 der allgemeinen

Formel

H ^CH3
/N

CH,

n-C

5¹V

NH

HO

Cl

OP

SR

OH

worin P der Rest -P^

„ \₀ θ

9. Verbindungen gemäß Anspruch 1 der allgemeinen PorBel

CH,

I)

CH,

NH

Hai

HO₁I ^u-I OP A

OH

009818/1

und deren Salze, worin Hai ein Chlor- oder" Bromatom, E ein Methyl- und R, ein Pentylrest und P der Rest

-P

Il

OH

sind.

10."- Verbindung gemäß Anspruch 9 der allgemeinen

Formel

CH,

ΛΓ

-fc

Cl

HO

OP

SR

OH

und deren Salze, in der R ein Methyl- und R₁ ein Pentylrest und P der Rest

OH

-P

Il

sind.

11. Verbindung gemäß Anspruch 9 der allgemeinen Formel:

0008 18/1806

CH ι

GH,

Gl

OH

in der P der Rest -P , R ein Methyl- und R₁ ein

Pentylrest sind.

12. Verbindungen gemäß Anspruch 1 der allge meinen Formel

-HH-

•Hal

Il

HO ,

OP

SR

OH

und deren Salze, in der Hai ein Chlor- oder Bromatom, R ein Methyl- und R^ ein Pentylrest, R₂ ein Wasserstoff-

SAOOHiOlKAL

atom und P der Rest -P

OH

" ^x0H

sind.

13. Verbindung gemäß Anspruch 12 der allgemeinen Formel

CH₃

I— ei

St

HO

OP

/ SR

und deren Salze, worin R ein Methyl-, rest und P der Rest

ein Pentyl-

- P

sind

14. Verbindung gemäß Anspruch 12 der allgemeinen , Formell

3818/1880

8AD ORIGINAL

CH,

NH

-Cl

HO /

OP

■ SR OH

worin R ein Methyl-, R, ein Pentylrest und P ein Rest

"So ο

sind,

15. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel

CH,

Il

' O

HH

HO

,0H

" f SR OH

in der R, R-, , Rp und X die in Anspruch 1 genannte Be-

0 0 9818/1

JÄI4^?Ri> C!/' β

deutung besitzen, in das Fermentationsmedium einer Streptomyces—Fermentation eingibt.

16. Verfahren nach Anspruch 15 zur Herstellung der Verbindung gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der Formel:

CH, · ■

' ■"■■'*'-. . CH₃

HO ---—

₀ HO. /-

OH

\ j/ SGH₃

OH

in eine Fermentation von Streptomyces rochei, NRBL 3512 eingibt.

17. Verfahren nach Anspruch 15 zur Her - ■ stellung der Verbindung gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der Formel:

0033 18/ 18g

SAD

CH, ■Ν

CE

-Cl

NH

HO ,

(D.

OH

/ο

SCH,

OH

in ein Fermentationsmedium von Streptomyces eoelicolor NELL 3532 eingibt.

18. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der Formel:

Ί ⁱ

y c

Il

NH

Cl

HO /1-0

OH

l· 4

SCH₅

OH

in eine Fermentation von Streptomyces eoelicolor HRRL eingibt und eine Verbindung der Formel:

009818/186 6

H
t

η-

Il

GIt

-Cl

NH

OH

herstellt, in der P den Rest -P

bedeutet.

- 19· Verfahren nach Anspruch 15 zur Herstellung der Verbindung gemäß Anspruch 131.dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der Formel

I.

OH,

- ei

NH

HO

-0

V OH

' SCH

ι OH

in eine Fermentation von Streptomyces coelicolor NRRL

009818/1866

mmm ssm

original

_ 55 einarbeitet.

20. Verfahren zur Isolierung der Verbindung gemäß Anspruch 1 aus den nach Anspruch 15 erhaltenen, diese Verbindungen enthaltenden Fermentationsmedien, dadurch gekennzeichnet, daii man

(1) das Fermentations^edium filtriert;

(2) das resultierende FiItrat auf einem geeigneten Absorptionsmittel absorbiert, um -wasserlösliche jj Verunreinigungen zu entfernen; ™

(3) das resultierende Eluat an einem. Anionenaustauscherharz chromatographiert;

(4) bei der Chromatographierung erhaltene Fraktionen einer Gegensiromverteilung unterwirft und

(5) die gereinigte Verbindung isoliert.

21* Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung-der Formel II mit einem zellfreien Extrakt einer tatreptomyces-Kultür inkubiert.

BAD ORIGINAL

-.56 —

22. Verwendung der Verbindungen gemäß Anspruch 1 als Wirkstoffe in antibakterieller Therapeutika.

m ·· PUr The Upjohn Company

Rechtsanwalt

QU38 18/1866