Uprawniony z patentu: The Upjohn Company, Kalamazoo (Stany Zjednoczone Ameryki) Sposób wytwarzania nowych 3-fosforanowych estrów linkomycyny i jej analogów, zwlaszcza celestycetyny Przedmiotem wynalazku jest sposób wy twarza- nia nowych 3-fosforanowych estrów linkomycyny i jej analogów, zwlaszcza celestycetyny. Zwiazki otrzymywane sposobem wedlug wynalazku i ich sole przedstawia wzór ogólny 1, w którym R ozna¬ cza CH3, C2H5 lub grupe o wzorze 2; Rx oznacza H lub cis, badz trans nizsza grupe alkilowa za¬ wierajaca t—8 atomów wegla; R2 oznacza H, CH3 lub C2H5; X oznacza OH, chlor lub brom, kazdy o konfiguracji (R) lub (S), lub — OCH3; A oznacza grupe o wzorze 3. Przykladem alkili' zawieraja¬ cych 1—8 atomów wegla sa. metyl, etyl, propyl, butyl, pentyl, heksyl, heptyl i oktyl oraz ich izo¬ mery.Nowe zwiazki wytwarza sie przed dodanie zwiazku o wzorze 7, w którym R, Rly R2 i X maja wyzej podane znaczenie, do fermentacji Strepto- myces lub przez inkubacje tego zwiazku w wol¬ nym od komórek ekstrakcie z kultury Streptomy- ces i przeprowadzenie w nowy ester fosforowy w pozycji 3.Dotychczas fosforylowanie w pozycji 3 czastecz¬ ki linkomycyny lub celestycetyny (w której R oznacza grupe o wzorze 2, Rx i R2 sa H i X ozna¬ cza OCH3) bylo nie znane i nie istnieje wczesniej znana metoda, umozliwiajaca wykonanie takiego fosforylowania. 2-fosforanowe estry linkomycyny otrzymywane sa na drodze chemicznej syntezy najpierw przez kondensowanie linkomycyny lub jej analogów 10 15 20 25 z aromatycznym aldehydem w celu otrzymania 3,4-O-arylideno-linkomycyny. Zwiazek ten nastep¬ nie trytyluje sie (trójfenylometyluje), jesli zawiera grupe hydroksy w pozycji 7, w celu utworzenia 7-0-trytylo-3,4-0-arylidenolinkomycyny, która jest nastepnie fosforylowana w celu otrzymania odpo¬ wiedniego 2-fosforanu 3,4-O-arylideno-linkomycy¬ ny.Po usunieciu grup oslaniajacych otrzymuje sie 2-fosforan linkomycyny lub jego analogi. Jest oczy¬ wiste, ze powyzszy proces nie moze byc stosowa¬ ny do otrzymania 3-fosforanu linkomycyny, ponie¬ waz stadium kondensacji z aromatycznym aldehy¬ dem obejmuje pozycje 3 w czasteczce.Zwiazki otrzymywane sposobem wedlug wyna¬ lazku, chociaz nieaktywne przeciwbakteryjne in vitro, wykazuja dzialanie, gdy stosowane sa in vi- vo. Przypuszczalnie aktywnosc ta in vivo daje sie porównac do reaktywacji zwiazków linkomycyny in vitro przez zetkniecie fosforylowanych zwiazków linkomycyny z alkaliczna fosfataza.Nowe zwiazki sa szczególnie uzyteczne do poda¬ wania doustnego zwierzetom, wlaczajac ssaki, po¬ niewaz wykazuja brak gorzkiego smaku linkomy¬ cyny.Zwiazki linkomycyny, stanowiace materialy wyj¬ sciowe, moga byc otrzymywane metodami przed¬ stawionymi w róznych opisach patentowych i pu¬ blikacjach. Sa one nastepujace. 802733 80273 4 Linkomycyna (opis patentowy St. Zjedn. Ame¬ ryki nr 3C86912) w odniesieniu do wzoru 7, w któ¬ rym: R = metyl lub etyl Opis patentowy St. Zjed.Ameryki nr 3380992 (opis i przyklad 12) Ri = R2 = X = X = X = : cis lub trans do 8 atomów gla alkil we- = wodór lub alkil do 8 atomów gla (S) OH (R) lub (S) Cl lub Br (R) lub (S) Celestycetyna we- Opis patentowy St.Zjedn. Ameryki nr 3380992 (opis i przy¬ klad 1) Opis patentowy St.Zjedn. Ameryki nr 3380992 (Opis i przy¬ klady 1, 1E i IG H) Opis patentowy St.Zjedn. Ameryki nr 3380992 (opis i przyklad 11-D) belgijski opis patentowy nr 676202 brytyjski opis patento¬ wy nr 1140833 Opis patentowy St.Zjedn. Ameryki nr 3496163 Opis patentowy St.Zjedn. Ameryki nr 2928844 4-Depropylo-4-etylo-linkomycyne o wzorze 7, w którym R oznacza CH3, Rx oznacza etyl, R2 oznacza CH3 i X oznacza OH, wytwarza sie za po¬ moca sposobu, podanego w przykladach 1 i 2 opi¬ su patentowego St. Zjedn. Ameryki nr 3359164.W opisie tym zwiazek ten nazywany jest linkomy¬ cyna B. 1-Demetylo-l etylo-linkomycyne o wzorze 7, w którym R oznacza CH3, Rx oznacza n-propyl, R2 — etyl a x oznacza OH mozna wytwarzac spo¬ sobem, podanym w przykladach 1 i 2 opisu pa¬ tentowego St. Zjedn. Ameryki nr 3359163, w któ¬ rym zwiazek- ten nazywany jest linkomycyna C. 1-Demetylolinkomycyne o wzorze 7, w którym R oznacza CH3, Rx oznacza n-propyl, R2 oznacza H, a X oznacza OH wytwarza sie za pomoca sposo¬ bu, podanego w przykladzie 1 opisu patentowego St. Zjedn. Ameryki nr 3329568, w którym wymie¬ niony zwiazek jest linkomycyna D. Sposród po¬ wyzszych zwiazków 7(S)-chloro-7-dezoksy-linkomy- cyna znana jest obecnie równiez pod nazwa „kli- nimycyna".Zwiazki linkomycyny lub ich analogii i celesty- cetyne, jak opisano to wyzej, mozna fosforylowac przez wprowadzenie niefosforylowanego zwiazku do fermentacji Streptomyses, zawierajacej fosfory- lujacy enzym, lub przez inkubacje niefosforylowa¬ nego zwiazku wolnym od komórek ekstraktem z kultury Streptomyces, przy czym ten bezkomórko- wy ekstrakt zawiera konieczny fosforylujacy en¬ zym. Na przyklad dodajac chlorowodorku linko¬ mycyny, do fermentacji Streptomyces rochei, NRRL 3512, otrzymuje sie 3-fosforan linkomycyny, 10 15 20 25 30 40 45 55 60 65 dodajac chlorowodorku klinimycyny otrzymuje sie 3-fosforan klinimycyny.Inkubujac linkomycyne z wolnym od komórek ekstraktem pochodzacym z kultury Streptomyces otrzymuje sie 3-fosforan linkomycyny; inkubujac klinimycyne z bezkomórkowym ekstraktem, pocho¬ dzacym z kultury Streptomyces otrzymuje sie 3- -fosforan klinimycyny.Fermentacje, majaca na celu otrzymanie nowych zwiazków sposobem wedlug wynalazku, prowadzi sie w wodnym . srodowisku odzywczym w warun¬ kach wglebnej fermentacji tlenowej.Stosowany do fermentacji organizm hoduje sie w srodowisku odzywczym, zawierajacym zródlo we¬ gla, na przyklad przyswajalny weglowodan i zród¬ lo azotu, na przyklad przyswajalny zwiazek azo¬ towy lub material proteinowy. Korzystne zródla wegla obejmuja: glukoze, brunatny cukier, sacha¬ roze, gliceryne, skrobie kukurydziana, laktoze, dek¬ stryne, melase i tern podobne.Korzystne zródla azotu obejmuja: wyciag nar mokowy z kukurydzy, drozdze, autolizowane droz¬ dze browarniane ze stalymi substancjami mleka, maczke sojowa, maczke z nasion bawelny, macz¬ ke kukurydziana, substancje stale z mleka, trzu¬ stkowy wyciag kazeiny, wywar gorzelniany, zwie¬ rzece roztwory peptynowe, mieso i odpadki kosci i temu podobne.Kombinacje tych zródel wegla i azotu moga byc stosowane równie korzystnie. Sladowe metale, na przyklad cynk, magnez mangan, zelazo i temu po¬ dobne nie musza byc dodawane do srodowiska fer¬ mentacyjnego, poniewaz woda wodociagowa i nie oczyszczone komponenty stosowane sa jako sklad¬ niki tego srodowiska.Wedlug wynalazku fosforylowanie nowych zwia¬ zków mozna przeprowadzic w dowolnej tempera¬ turze, sprzyjajacej zadawalajacemu wzrostowi kul¬ tury Streptomyces, na przyklad od okolo 18°C do 40°C, korzystnie od okolo 20° do 37°C. Gdy stosu¬ je sie fermentacje Streptomyces, jak opisano wy¬ zej, do fosforylowania linkomycyny lub jej analo¬ gu, w pozycji 3 czasteczki, zwiazki linkomycyny lub celestycetyny, (niefosforylowany zwiazek) mo¬ zna dodawac przed zaszczepieniem srodowiska fer¬ mentacji.Alternatywnie niefosforylowany zwiazek mozna dodawac malymi porcjami podczas cyklu fermen¬ tacyjnego tak dlugo, jak dlugo dodawanie to nie jest zbyt spóznione w cyklu fermentacyjnym, aby dokonac pozadanego fosforylowania calego dodane¬ go niefosforylowanego zwiazku. Ilosci i czas do¬ dawania niefosforylowanego zwiazku mozna latwo oznaczyc dla kazdej fermentacji przez dodawanie niefosforylowanego zwiazku, az zaobserwuje sie pewna toksycznosc, jaka jest hamowanie fosfory= lowania. Ponadto, jesli przy koncu cyklu fermen¬ tacyjnego pozostaje niefosforylowany zwiazek wte¬ dy nalezy stosowac mniejsze ilosci niefosforylowa¬ nego zwiazku i/lub zmienic czas dodawania.Alternatywny sposób postepowania w celu fosfo¬ rylowania linkomycyny lub jej analogu lub cele¬ stycetyny polega na inkubowaniu wolnego od ko¬ mórek ekstraktu, pochodzacego z kultury Strep¬ tomyces, zawierajacego konieczny enzym fosfory-S027S 6 lujacy, ze zwiazkiem, który ma byc fosforylowany.Wolny od komórek ekstrakt otrzymuje sie z kul¬ tury Streptomyces, z przed 24 godzin.Inkubacje przeprowadzi sie w temperaturze od 26°C do 32°C. Czas inkubacji zmienia sie w zale¬ znosci od ilosci zwiazku, który poddaje sie fosfo- rylowaniu.Na przyklad, czas inkubacji mniejszy niz 24 go¬ dziny jest wystarczajacy do przeprowadzenia fos- forylowania 5(ty (ml linkomycyny.w 3-fosforan lin- komycyny.Gdy wolny od komórek ekstrakt kultury Strep¬ tomyces, stosuje sie do fosforylowania zwiazku, wyzej omówionego, dodawana ilosc niefosforylo- wanego zwiazku zalezy od zdolnosci ekstraktu kul¬ tury do sfosforylowania calego dodanego zwiazku.Poziom ten moze byc wyznaczony przez stopnio¬ we dodawanie dalszych ilosci niefosforylowanego zwiazku do ekstraktu kultury, az stanie sie oczy¬ wiste, ze dodany niefosforylowany zwiazek nie ulega juz fosforylowaniu. Poniewaz przeciw-bak- teryjna aktywnosc in vitro niefosforylowanego zwiazku zanika pod wplywem fosforylowania cza¬ steczki w pozycji 3, obecnosc przeciw-bakteryjnej aktywnosci in vitro w ekstrakcie kultury w 24 go¬ dziny po dodaniu niefosforylowanego zwiazku jest swiadectwem, ze zdolnosc ekstraktu kultury prze¬ prowadzenia fosforylowania niefosforylowanego zwiazku jest swiadectwem, ze zdolnosc ekstraktu kultury przeprowadzenia fosforylowania niefosfo¬ rylowanego zwiazku zostala przekroczona. Wyzej wymieniona przeciwbakteryjna aktywnosc in vi- tro mozna stwierdzic za pomoca badania na stan¬ dardowej plytce mikrobiologicznej wobec mikro¬ organizmu Sarcina lutea.Róznorodne sposoby postepowania mozna stoso¬ wac do wyodrebnienia i oczyszczenia nowych zwiaz¬ ków otrzymywanych sposobem wg wynalazku, na przyklad ekstracja rozpuszczalnikami, podzial w ukladzie ciecz-ciecz w aparacie Craiga, ekstrakcja za pomoca cieklych wymieniaczy jonowych, ad- sorbcja na odpowiednim adsorbencie, na przyklad na weglu i chromatografia kolumnowa.Korzystnie odzyskuje sie nowe fosforylowane zwiazki z brzeczki fermentacyjnej lub z ukladu, zawierajacego wolny od komórek ekstrakt, przez filtrowanie. Przesacz nastepnie przeprowadza sie przez odpowiedni absorbent, na przyklad wegiel aktywny lub Amberlit XAD-2 w celu usuniecia rozpuszczalnych w wodzie zanieczyszczen, które moga przeszkadzac w nastepnym stadium chromo- tograficznym.Eluat, pochodzacy z wegla lub zywicy Amberlit XAD-2 nastepnie przepuszcza sie przez kolumne chromatograficzna, zawierajaca zywice amonitowa, na przyklad Dowex-l (X4) w formie octanowej, Frakcje z kolumny chromatograficznej zbiera sie i bada na aktywnosc wzgledem . mikroorganizmu S. lutea, po traktowaniu i przed traktowaniem tych frakcji alkaliczna fosfataza, jak to uprzednio opisano.Frakcje, wykazujace najwyzsza aktywnosc wzgledem S. lutea w badaniach z alkaliczna fosfa¬ taza, nastepnie laczy sie razem, zateza i poddaje rozdzialowi przeciwpradowemu w aparacie Craiga^ przy uzyciu ukladu rozpuszczalników, zawierajace¬ go n-butanol i wode (1:1 obj./obj.). 3-Fosforan linkomycyny i 3-fosforany analogów 5 linkomycyny sa zasadniczo nieaktywne wobec bak¬ terii in vitro. Tak wiec nowe zwiazki fosforanowe wykrywa sie w mieszaninach redukcyjnych in vi- tro przez traktowanie hydrolizatów lub innych mieszanin, zawierajacych zwiazki 3-fosforanowe, 10 alkaliczna fosfataza. Na przyklad mieszanina reak¬ cyjna, sluzaca do dzialania alkaliczna fosfataza na 3-fosforan linkomycyny zawiera 0,5 ml buforu TRIS (0,5 m ) pH = 8,0, 0,5 ml alkalicznej fosfa¬ tazy (1 mg/ml), uzupelnionej buforem podstawo- 15 wym buforu Tris (0,5 m), pH = 8,0 i 0,5 ml/50 mg 3-fosforanu linkomycyny. Mieszanine te inkubuje sie przez noc w temperaturze 28°. Fosfataza usuwa grupe fosforanowa w pozycji 3, po czym zwiazek linkomycyny wykazuje aktywnosc in vitro. 20 Przykladowymi Streptomyces, które mozna sto¬ sowac do otrzymywania nowych zwiazków sposo¬ bem wedlug wynalazku sa: S. rochei NRRL 3512; S. vendargansis NRRL 3530; S. coelicolor 1945 NRRL 3531; S. coelicolor Mueler NRRL 3532; Ac- 25 tinomyces (Streptomyces) cylindrosporus .3166 CCM NRRL 3535; Actinomyces (Streptomyces) cyaneofu- scatus NRRL 3534; S. rochei NRRL 3533; i S. ar- mentosus NRRL 3176. Kultury te sa dostepne bez trudnosci z Northern Utilization and Research Di- 30 yision Agrikultural Research Service, U.S. Depart¬ ment of Agrikulture Peoria, Illinois, U.S.A.Korzystnie, w celu otrzymania zwiazku o wzo¬ rze 9, w którym A oznacza grupe o wzorze 3, do srodowiska, w którym prowadzi sie fermentacje 35 Streptomyces rochei NRRL 3512, wprowadza sie zwiazek o wzorze 8; w celu otrzymania zwiazku o wzorze 11, w którym A oznacza grupe o wzo¬ rze 3, do srodowiska, w którym prowadzi sie fer¬ mentacje Streptomyces coelicolor NRRL 3532, 40 wprowadza sie zwiazek o wzorze \0; w celu otrzy¬ mania zwiazku o wzorze 13, w którym A oznacza grupe o wzorze 3, do srodowiska, w którym pro¬ wadzi sie - fermentacje Streptomyces coelicolor NRRL 3532, wprowadza sie zwiazek o wzorze 12, 45 a w celu otrzymania zwiazku o wzorze 15, w któ¬ rym A oznacza grupe o wzorze 3, do srodowiska, w którym prowadzi sie fermentacje Streptomyces coelicolor NRRL 3532, wprowadza sie zwiazek o wzorze 14. 50 Stwierdzono, ze klinimycyne fosforyluje sie w calych ukladach komórkowych z wieksza latwo¬ scia w porównaniu z linkomycyna i innymi ana¬ logami linkomycyny i klinimycyny, na przyklad w porównaniu z 1-demetyloklinimycyna i 1-de- 55 metylo-4-pentylo-klinimycyna. Gdy stosuje sie wolny od komórek ekstrakt, pochodzacy z kultury Streptomyces, wszystkie zwiazki wyjsciowe w pro¬ cesie, wedlug wynalazku fosforyluje sie z równa latwoscia. 60 Nowe zwiazki, otrzymywane sposobem wedlug wynalazku, sa zwiazkami amfoterycznymi i moga istniec w róznych formach jonowych zgodnie z wartoscia pH srodowiska. Przy niskich pH zwiaz¬ ki te istnieja w postaci kwasnych soli addycyj- 65 nych, przy wyzszych pH w postaci jonu dwubie-7 80273 8 gunowego, a przy jeszcze wyzszych wartosciach pH w postaci soli metalu. Ta ostatnia moze byc sola obojetna (dwa równowazniki zasady na kazdy mol 3-fosforanu linkomycyny), sola kwasna lub monosola (jeden równowaznik zasady na kazdy mol 1 3-fosforanu linkomycyny), lub tez hemi-sola (pól równowaznika zasady na kazdy mol 3-fosforanu linkomycyny).Przez dodanie odpowiedniej ilosci stosowanego kwasu lub zasady mozna wyodrebnic kazda z tych róznych postaci. Kwasne sole addycyjne obejmuja te sposród silnych kwasów organicznych lub nie¬ organicznych, których pK jest równe lub mniejsze od pK fosforanu, na przyklad kwas solny, siar¬ kowy, fosforowy i temu podobne.Kwasne i obojetne sole metali alkalicznych (lacznie z amoniakiem) i sole metali ziem alkalicz¬ nych (lacznie z magnezem i glinem) otrzymuje sie przez zobojetnienie formy kwasowej odpowiednia zasada, na przyklad: wodorotlenkiem amonu, wo¬ dorotlenkiem sodu lub potasu, lub alkoholami, wo¬ dorotlenkami wapnia lub magnezu i im podobny¬ mi. Kwasne i obojetne sole aminowe otrzymywane przez zobojetnienie formy kwasowej zasadowa amina, na. przyklad: mono-dwu- lub trójmetylo- aminami, mono, dwu, lub trójetyloaminami, mono, dwu, lub trójpropyloaminami (izo- i normalnymi), etylodwumetyloamina, benzylodwuetyloamina, cy- kloheksyloamina, benzyloamina, dwubenzyloamina, N,N-dwubenzyloetyleno-dwuamina, bis-(orto-meto- ksy-fenyloizopropylo)-amina i im podobnymi niz¬ szymi alifatycznymi, nizszymi cykloalifatycznymi i nizszymi aryloalifatycznymi aminami, nizszymi alifatycznymi i nizszymi cykloalifatycznymi rodni¬ kami, zawierajacymi jeden do osmiu atomów we¬ gla, takimi jak: 1-metylopiperydyna, 4-etylomor- folina, 1-izopropylopirolidyna, 1,4-dwumetylopipe- razyna, 1-m-butylopiperydyna, 2-metylopiperydyna i 1-etylo-2-metylopiperydyna; aminy, zawierajace grupy, ulatwiajace rozpuszczalnosc w wodzie lub hydrofilne takie, jak: monodwu- i trójetanoloami- ny, etylodwuetanoloamina, n-butylo-monoetanoloa- mina, 2-amino-l-butanol, 2-amino-2-etylo-l, 3-pro- pandiol, 2-amino-2-metylo-l-propanol, trój-(hydro- ksymetylo)-aminometan, fenylomonoetanoloamina, p-tert-amylofenylodwuetanoloamina i galaktoami- na, N-metyloglukoamina, fenyloefryna, efedryna, epinefryna i prokaina; wodorotlenek czteroetyloa- minowy i guanidyna. Rózne formy moga byc przy tym zamiennie stosowane, ale do wiekszosci ce¬ lów korzystna jest forma jonu dwubiegunowego o wzorze 4, w którym A oznacza korzystnie grupe o wzorze 3 a i forma soli hemi-aminowej.Zwiazki, wytwarzane sposobem wedlug wynalaz¬ ku mozna stosowac do leczenia ludzi i zwierzat, bedacych zywicielami drobnoustrojowych mikroor¬ ganizmów, wywolujacych choroby bakteryjne (bak¬ terie i inne pasozyty) i profilaktycznego traktowa¬ nia podatnych na choroby zywicieli, polegajacego na podawaniu zywicielowi estrów 3-fosforanowych lub farmakologicznie dopuszczalnych soli. • Nowe zwiazki stosuje sie równiez w postaci kompozycji przydatnych, jak linkomycyna i cele- stycetyna, w leczeniu ludzi, ptaków i zwierzat w róznych stanach patologicznych; kompozycje te ulatwiaja podawanie terapeutycznych skladników droga doustna lub paranteralna w systematycznym traktowaniu.Mieszanki te zapewniaja ponadto sposób terapii 5 w przypadku zapalenia migdalków, zapalenia pluc. zapalenia uszu, zapalenia spojówek, czyraków, karbunkulów,. i innych stanów infekcyjnych u lu¬ dzi, wywolanych obecnoscia bakterii. U zwierzat kompozycje te moga byc stosowane profilaktycz¬ nie. Na przyklad szczury mozna zabezpieczyc prze¬ ciw Streptomyceus viridians podczas transportu.Zwierzetom, hodowanym na mieso, mozna je sto¬ sowac profilaktycznie w celu uzyskania wiekszego przyrostu wagi.Ssaki, bedace zywicielami pasozytniczego pier¬ wotniaka z klasy Sporazoa, rzad Coccidia (mikro- pasozyt wywolujacy chorobe coccidiosis), mozna le¬ czyc za pomoca wyzej wspomnianych kompozycji.Na przyklad mozna leczyc bydlo zarazone E. zur- nii, E. bovis, E. illipsordalis, owce i kozy zarazo¬ ne E. parva, E. faurei, swinie zarazone E. deblie- cki, E. scarba i Isospora suic, psy i koty zarazone Isospora bigemina, Izospora felis, E. canis, E. fe- lini, drób zarazony E. tenella, króliki zarazone E. steedae, E. perforans i norki zarazone E. mu- stelae.Mieszanki te sa równiez przydatne w leczeniu chorób, wywolanych przez mikroorganizmy rodza¬ ju Mycoplasma, sposród których najbardziej ogól¬ nie znanymi odmianami sa PPLO (organizmy po¬ dobne do plauropneumonia), takie jak: M. homi- nis, M. salivarium, M. mycoides, M. hyopneumonia, M. hyorhinis, M. gallisepticum, M. arthriditis i in¬ ne gatunki. Choroby te wystepuja u ludzi i zwie¬ rzat, lacznie ze zwierzetami domowymi, takimi jak owce, bydlo, swinie i drób (np. kurczaki, in¬ dyki, kaczki i gesi) i zwierzetami laboratoryjnymi (np. króliki i myszy).Mieszanki znajduja zastosowanie w leczeniu ne¬ rek i innych infekcji, gdy wystepuja formy L gram-negatywnych i gram-pozytywnych bakterii, na przyklad formy LP. mirabilis.Estry 3-fosforanowe i sole zalecane sa równiez do doustnego i paranteralnego stosowania, w po¬ staci stalych lub cieklych jednostkowych dawek, takich jak: tabletki, kapsulki, proszki, granulki, pigulki sterylne roztwory i zawiesiny paranteralne, roztwory i zawiesiny doustne oraz doustne emul¬ sje wodne.Proszki przygotowuje sie przez rozdrabnianie 3- -fosforanu do odpowiedniej wielkosci i mieszanie z podobnie rozdrobnionym rozcienczalnikiem. Roz¬ cienczalnikiem moze byc jadalny material weglo¬ wodanowy, taki jak skrobia lub laktoza. Korzyst¬ nie powinny one zawierac srodek slodzacy lub cu¬ kier, jak równiez srodek zapachowy. Suche gra¬ nulaty do roztwarzania w wodzie przygotowuje sie przez zastosowanie rozpuszczalnych w wodzie roz¬ cienczalników.Mieszanine proszkowa dokladnie rozdrobnionego 3-fosforanu i rozpuszczalnego w wodzie rozcien¬ czalnika, takiego jak sacharoza, glukoza i temu po¬ dobne, zwilza sie substancja wiazaca, taka jak guma arabska lub roztwór zelatyny, a nastepnie przetlaczana przez sito w celu uformowania gra- 15 20 25 30 35 40 45 50 55 609 nulek, którym pozwala sie wyschnac. Korzystnie zawiera ona srodek zageszczajacy lub zawieszajacy, taki jak metyloceluloza, jak równiez srodek zwil¬ zajacy i olejek zapachowy.Kapsulki produkuje sie przez przygotowanie sproszkowanej mieszaniny i wypelnienie nia ufor¬ mowanych otoczek zelatynowych. Korzystnie, jako srodek ulatwiajacy proces napelniania, dodaje sie do tej sproszkowanej mieszaniny przed napelnie¬ niem srodek smarny, taki jak talk, stearynian magnezu i stearynian wapnia.Tabletki wytwarza sie przez przygotowanie sproszkowanej mieszaniny, granulowanie jej na mokro lub sucho, dodanie srodka smarnego i pra¬ sowanie tabletki.Mieszanine proszkowa przygotowuje sie przez zmieszanie odpowiednio rozdrobnionego 3-fosfora- nu z rozcienczalnikiem lub podlozem, takim jak skrobia, laktoza, kaolin, fosforan dwuwapniowy i temu podobne. Sproszkowana mieszanine mozna granulowac przez zwilzenie, srodkiem wiazacym, takim jak syrop kukurydziany, roztwór zelatyny, roztwór metylocelulozy lub gumy arabskiej i tlo¬ czenie przez sito.Inny sposób granulowania polega na tym, ze sproszkowana mieszanine formuje sie w wieksze kawalki, to jest przepuszcza przez tabletkarke, a otrzymane duze tabletki (brylki) nastepnie roz¬ drabnia sie na granulki. W celu unikniecia przy¬ lepiania sie do sztancy, formujacej tabletki, doda¬ je sie do masy tabletkowej kwas sterarynowy, ste¬ aryniany, talk lub olej mineralny. Mieszanine te nastepnie tabletkuje sie. Korzystnie, tabletka mo¬ ze posiadac ochronna powloczke, skladajaca sie z warstwy zabezpieczajacej w szelaku, warstwy cukru i metylocelulozy i warstwy wygladzajacej — wosku Karnauba.Doustne formy ciekle maja w postaci dawek jed¬ nostkowych, takich jak syropy i eliksiry, w któ¬ rych jedna lyzeczka pelna od herbaty kompozycji zawiera z góry ustalona do podawania ilosc 3-fo- sforanu.Syrop wytwarza sie przez zdyspergowanie 3-fo- sforanu w odpowiednio zawierajacym dodatki sma¬ kowe i zapachowe wodnym roztworze sacharozy.Podobnie sporzadza sie eliksir przy zastosowaniu wodno-alkoholowego nosnika. Eliksiry sa korzyst¬ nymi postaciami do stosowania wtedy, gdy po¬ trzebny jest roztwór zwiazku, odznaczajacego sie mala rozpuszczalnoscia w wodzie i dobra rozpusz¬ czalnoscia w srodowisku wodno-alkoholowym.Do podawania paranteralnego stosuje sie posta¬ cie sterylnych cieklych jednostek dozowania. Pod¬ czas przygotowywania postaci paranteralnej od¬ mierzona ilosc 3-fosforanu umieszcza sie w fiolce, fiolke i jej zawartosc sterylizuje sie i zatapia. Dla wygody moze byc dolaczona fiolka towarzyszaca, zawierajaca sterylizowana wode w celu przygoto¬ wania zawiesiny lub roztworu (w zaleznosci od- rozpuszczalnosci zwiazku w wodzie) przed poda¬ niem leku. Korzystnie sterylna woda moze zawie¬ rac rozpuszczolny srodek zawiesino-twórczy, oraz srodki miejscowe znieczulajace i buforujace.Alternatywnie mozna przygotowac zawiesine pa- ranteralna o przedluzonym dzialaniu przez sporza- 10 dzenie zawiesiny 3-fosforanu w odpowiednim dla celów paranteralnych oleju roslinnym z dodatkiem lub tez srodków pomocniczych.Termin „postac jednostki dozowania", odnosi sie do fizycznie odrebnych jednostek, odpowiednich jako jednostki dawkowania w medycynie ludzkiej, przy czym kazda jednostka zawiera z góry zalo¬ zona ilosc substancji aktywnej, wyliczonej dla wy¬ maganej dawki' lacznie z pozadanym, farmaceu¬ tycznym rozcienczalnikiem, nosnikiem lub wypel¬ niaczem. Sklad szczególowy nowych postaci jed¬ nostek dozowania zalezy wprost od (a) specyficz¬ nych cech substancji aktywnej i okreslonego efek¬ tu terapeutycznego, który ma byc osiegniety i (b) ograniczen, nieodlacznie zwiazanych ze sposobem mieszania substancji aktywnej dla celów terapeu¬ tycznych.Przykladami odpowiednich postaci jednostek do¬ zowania sa: tabletki, kapsulki, proszkowe pakiety, granulki, oplatki, zawartosc lyzeczki od herbaty, zawartosc lyzeczki stolowej, zawartosc kroplomie¬ rza, ampulki, fiolki, oddzielne wielokrotnosci kaz¬ dej z wyzej wymienionych postaci i inne opisane postacie. Postacie jednostek dozowania w miesza¬ ninie z odpowiednim nosnikiem farmaceutycznym zawieraja na jednostke dozowania', w korzystnych formach, od 25 mg do 500 mg 3-fosforanu lub je¬ go dopuszczalnej farmakologicznie soli i 5 do 65% ciezar (obj. dla preparatów paranteralnych). 30 Ilosc 3-fosforanu lub jego soli, która ma byc podawana zalezy od wieku i wagi pacjenta, szcze¬ gólowych warunków leczenia i drogi podawania.Korzystna jest w systematycznym traktowaniu 35 dawka od okolo 1 mg/kg/dzien do okolo 50 mg/kg/ /dzien.Nastepujace przyklady wyjasniaja 'sposób wedlug wynalazku, nie ograniczajac jego zakresu. Wszyst¬ kie procentowosci sa wagowe i wszystkie propor- 40 cje mieszanin rozpuszczalników objetosciowe, jesli nie zaznaczono tego inaczej.Przyklad I. 3-fosforan linkomycyny.A. Fermentacja Surowiec glebowy zawierajacy Streptomyces ro- chei NRRL 3512, uzyto w celu zaszczepienia serii 500 ml-kolb Erlenmeyera, z których kazda zawie¬ rala 100 ml sterylnego nasiennego medium obej¬ mujacego nastepujace skladniki: 50 jednowodzian glukozy 25 g/litr pharmamedia*) 25 g/litr woda wodociagowa q.s. uzupelnienie 55 *) Pharmamedia jest maczka z nasion bawelny stosowana w przemysle i produkowana przez Tra- der's Oil Company, Fort Worth, Texas.Wstrzasane kolby poddano hodowaniu przez 3 dni w temperaturze 28°C na obrotowej wstrza.- 60 sarce.Nasienne inokulum (20 ml) przygotowane tak, jak opisano to wyzej, uzyto do zaszczepienia kazdej z serii 500 ml-kolb Erlenmeyera, zawierajacych po 100 ml sterylnego medium fermentacyjnego, zlo- 65 zonego z nastepujacych skladników:11 80273 12 sacharoza azotan sodu fosforan dwupotasowy siarczan magnezu chlorek potasu siarczan zelazawy woda wodociagowa 30 g/litr 3 g/litr 1 g/litr 0,5 g/litr 0,5 g/litr 0,01 g/litr uzupel¬ nienie .: D Do mieszaniny tej dodano 50 mg/litr chlorowo¬ dorku linkomycyny po autoklawowaniu, a przed zaszczepieniem. Kolby fermentacyjne poddano ho¬ dowaniu przez dwa dni w temperaturze 27°C na obrotowej wstrzasarce. Reakcje fosforylowania za¬ chodzaca w kolbie fermentacyjnej sledzono przez pomiar utraty aktywnosci przez linkomycyne przy wykorzystaniu próby krzywej wzorcowej z S. lu- tea. W przyblizeniu 80—90% dodanej linkomycyny jest fosforylowane, tworzac nieaktywna antybak¬ teryjnie forme in vitro w ciagu 48 godzin.Próbe z S. lutea przeprowadzono nastepujaco: próbe prowadzi sie na agarze zbuforowanym do pH = 6—8 za. pomoca buforu fosforanowego o pH = 7,0 (0,1 M). Jednostkowa objetosc (0,08 ml) roztworu, zawierajacego badany material, umiesz¬ cza sie na 1)2,7 mm krazku badawczym, który na¬ stepnie umieszcza sie na plytce agarowej, posia¬ nej badanym mikroorganizmem. Bio-jednostka jest ilosc materialu na milimetr, która, gdy zawarta jest w 1 ml roztworu, daje 20 mm strefe hamowa¬ nia.B. Odzyskiwanie Powyzsza fermentacje prowadzono na wieksza skale w zbiorniku fermentacyjnym w celu otrzy¬ mania 4900 litrów cieczy fermentacyjnej, zawie¬ rajacej 3-fosforan linkomycyny. 3-fosforan linko¬ mycyny odzyskano z calosci tej cieczy przez filtro¬ wanie za pomoca 2% filtracyjnego materialu po¬ mocniczego z ziemi okrzemkowej, po czym klaro¬ wana ciecz ekstrahowano 400 litrami Skellysolvo E (izomeryczne heksany). Wartosc pH klarowanej cieczy doprowadzono do okolo 5,9 i nastepnie ciecz ekstrahowano okolo 450 litrami 9% roztworu so¬ dowego sulfonianu kwasu dwunonylonaftalenosul- fonowego (Na DNNS) w Skellysolvo B.Ekstrakcje te jeszcze raz powtórzono. Trzecia ekstrakcje cieczy prowadzono 300 litrami Skelly- *solvo B. Wszystkie ekstrakty nastepnie polaczo¬ no razem i przemyto 200 litrami wody. Przemyty ekstrakt NaDNNS ekstrahowano 800 litrami 25% Aliguat 336 (chlorek trójkaprylornetyloamoniowy) w Skellysolvo B i 200 litrami wody. Ekstrakt ten nastepnie jeszcze dwa razy ekstrahowano woda, a ekstrakt wodny ekstrahowano 200 litrami Skel- lysolvo B. Wartosc pH tego wodnego ekstraktu doprowadzono do 4,0 i ekstrakt zatezono w prózni do 185 litrów. Nastepnie dodano do koncentratu wegiel aktywny (11,2 kg) i mieszanina wstrzasano przez 30 minut, po czym dodano pomocniczy sro- 15 20 25 30 35 45 50 dek filtrujacy (4 kg) do tej mieszaniny zawiera¬ jacej wegiel, a nastepnie filtrowano.Otrzymany placek filtracyjny przemyto 280 li¬ trami wody, a nastepnie 5% acetonem. Nastepnie placek ten ekstrahowano 3 razy 25% acetonem, uzywajac 180 1 tego ostatniego za kazdym razem, Ekstrakty acetonowe laczono razem, zatezano w prózni i liofilizowano otrzymujac liofilizowany preparat 3-fosforanu linkomycyny.W wyniku poddania tego liofilizowanego prepa¬ ratu, zawierajacego 3-fosforan linkomycyny, oczyszczeniu na kolumnie chromatograficznej, a na¬ stepnie za pomoca rozdzialu przeciwpradowego, jak to opisano w przykladzie II — dla prepara- , tu, zawierajacego 3-fosforan klinimycyny, otrzy¬ mano czysty preparat, zawierajacy jon dwubiegu¬ nowy 3-fosforanu linkomycyny.Charakterystyka 3-fosforanu linkomycyny.Widmo w podczerwieni: widmo absorpcyjne w podczerwieni jonu dwubiegunowego 3-fosforanu linkomycyny w zawiesinie w oleju mineralnym wykazuje piki przy nastepujacych dlugosciach fali wyrazonych w odwrotnych centymetrach: 3330 3070 2920 2850 2730 2400 1670 1565 1535 1460 1375 1300 1240 * (S) (S) (S) (olej) (S) (olej) (M) (M) (S) (S) (S) (S) (olej) (S) (olej) (S) (S) 1160 1092 1070 1048 995 970 925 877 845 777 • 735 720 (S) (S) (S) (S) (S) (S) (S) (S) (M) (M) (M) (M) Widmo absorpcyjne w podczerwieni jonu dwubie¬ gunowego 3-fosforanu linkomycyny, sprasowanego w krazki z KBr, wykazuje piki przy nastepuja¬ cych dlugosciach fali, wyrazonej w odwrotnych centymetrach: 3400 3250 3070 2960 2930 2870 1675 1650 1620 1563 1537 1469 1^450 1382 1320 (S) (S) (S) (S) (S) (S) (S) (S) (S) (S) (M) (M) (M) (S) (S) 1305 1255 1180 1090 1070 1048 995 975 920 878 843 780 740 700 (S) (S) (S) (S) (S) (S) (S) (S) (S) (S) (M) (M) (M) (M) 65 Szybkosc hydrolizy: w surowicy ludzkiej 3-fo¬ sforan linkomycyny hydrolizuje sie znacznie wol¬ niej, niz 2-fpsforan linkomycyny.80273 13 Miareczkowanie: znaleziony ciezar równowazni¬ kowy = 289.Skrecalnosc wlasciwa: a25D, +127° (c, 0.689 Wo¬ da).* Antybakteryjna aktywnosc 3-fosforanu linkomy- cyny in vivo: CD50 wynosi okolo 30 mg/kg pod¬ skórnie myszy zarazone S. aureus.Przyklad II. 3-fosforan klinimycyny A. Fermentacja Surowiec glebowy, zawierajacy Streptomyces coelicolor NRRL 3532, uzyto w celu zaszczepienia serii 500 ml-kolb Erlenmeyera, z których kazda zawierala 100 ml sterylnego medium nasiennego, obejmujacego nastepujace skladniki: jednowodzian glukozy 25 g/litr pharmamedia 25 g/litr woda wodociagowa q.s. uzupelnienie Wstrzasane kolby poddano hodowaniu przez trzy dni w temperaturze 28° na obrotowej wstrzasarce.Nasienne inokulum (5 ml), przygotowane, tak jak opisano to- wyzej, uzyto do zaszczepienia kazdej z serii 500 ml-kolb Erlenmeyera, zawierajacych 100 ml sterylnego medium fermentacyjnego, zlo¬ zonego z nastepujacych skladników: azotan sodu 3 g/litr fosforan dwupotasowy 1 g/litr siarczan magnezu 0,5 g/litr chlorek potasu 0,5 g/litr siarczan zelazawy 0,01 g/litr jednowodzian glukozy 20,0 g/litr ekstrakt drozdzowy 2,5 g/litr amina NZ B* 5,0 g/litr woda wodociagowa uzupelnienie * sprzedawana przez Difco Laboratories, Detroit, 45 Michigan.Do kazdej kolby fermentacyjnej w 24 godziny po zaszczepieniu dodano klinimycyne, 50 mg/litr, w temperaturze 28°C na obrotowej wstrzasarce. po czym poddano kolby hodowli przez dwa dni Reakcje fosforylowania zachodzaca w kolbie fer¬ mentacyjnej sledzono za pomoca pomiaru utraty aktywnosci 3-fosforanu klinimycyny przy wyko¬ rzystaniu próby z S. lutea. Obecnosc 3-fosforanu klinimycyny oznaczono przez inkubowanie nieak¬ tywnej cieczy za pomoca alkalicznej fosfatazy przy pH = 8,0 i w buforze Tris i badanie mieszaniny reakcyjnej wzgledem S. lutea. 14 B. Odzyskiwanie Cala ciecz (w przyblizeniu 12 litrów), otrzymana z wyzej opisanej fermentacji, przesaczono stosujac ziemie okrzemkowa jako pomocniczy srodek filtru¬ jacy. Placek filtracyjny przemyto 2 litrami wody.Wodne przemywki dolaczono do klarownego prze- 10 15 20 25 30 35 40 50 55 saczu i polaczona ciekla mieszanine traktowano adsorbentem, na przyklad weglem lub Amberlitem XAD-2, w celu usuniecia rozpuszczalnych w wo¬ dzie zanieczyszczen, które przyczyniaja sie do ob¬ nizenia skutecznosci pózniejszej chromatografii.Kolumne absorpcyjna przygotowano przez roz- beltanie okolo 600 g adsorbenta (wegla lub Am- berlitu XAD-2) w wodzie, wlanie tej papki do szklanej kolumny (2" wewnetrzna srednica) i po¬ zwolenie tej papce na osiadanie pod atmosferycz¬ nym cisnieniem. Wyzej opisana klarowna polaczo¬ na mieszanine cieczy, przepuszczono przez te ko¬ lumne. Wyplywajacy plyn zbierano jako jedna frakcje i oznaczono ja A» Nastepnie kolumne prze¬ myto woda.Ten wodny eluat zebrano i oznaczono jako frak¬ cje B. Nastepnie kolumne eluowano 5 litrami 6Q°/o wodnego roztworu metanolu. Ogólem zebrano 200 frakcji. Nastepnie kolumne eluowano 2 litrami 95% wodnego roztworu metanolu. Ten eluat ze¬ brano jako jedna 'frakcje. Wszystkie zebrane frak¬ cje badano na aktywnosc wzgledem mikroorganiz¬ mu S. lutea przed i po potraktowaniu alkaliczna fosfataza w celu stwierdzenia obecnosci 3-fosfora¬ nu klinimycyny. Wyniki tych badan przedstawie no ponizej: Opis frakcji polaczona ciekla mie¬ szanina plyn — prze¬ mywki wyplywajacy roztwór- -frakcja A wolny eluat — frakcja B 60°/o wodny metanol Frakcja nr 5 10 15 20 25 30 35 40 45 1 50 60 •70 80 90 100 120 140 3,60 180 200 95% wodny metanol 1 Wielkosc Strefy (mm) kontrola przed trak¬ towaniem fosfataza 26 0 0 19 0 0 0 18.5 20 22 23 26 25 25 23 23 22 • 21 20 18 18 17 18 37 kontrola po trak¬ towaniu fosfataza 36 0 28 30 27 22 22 23 41 42 46 47 46 45 .' 44 44 44 4.3 43 41 38 38 37 4180273 15 Frakcje 25—200, otrzymane przez eluowanie ko¬ lumny 60% wodnym roztworem metanolu, polaczo¬ no i roztwór ten oznaczono C (w przyblizeniu 4 li¬ try). Material ten nastepnie chromatografowano na kolumnie chromatograficznej, zawierajacej wymie¬ niacz amonitowy. Kolumne te wypelniono Dowe- xem — II (X-4) w formie octanowej, dostarcza¬ nym przez f-me Dow Chemical Co, Midlland, Mi¬ chigan.Wartosc pH roztworu C (4 litry) z kolumny ad- sorbcyjnej, opisanej wyzej, doprowadzono do 10,0 za pomoca wodnego roztworu wodorotlenku amo¬ nu i alkaliczny roztwór przepuszczano przez ko¬ lumne chromatograficzna. Wyciek z kolumny ze¬ brano w postaci czterech 1-litrowych frakcji, któ¬ re oznaczono, jako: wyciek-1, wyciek-2, wy- ciek-3, wyciek-4, po czym kolumne przemyto 2-litrami wody i oznaczono ja jako przemywki wodne. Nastepnie przemywano kolumne 5°/o wod¬ nym roztworem kwasu octowego, zbierajac 20 ml frakcji. Wybrane frakcje sprawdzono na aktywnosc wzgledem S. lutea przed i po traktowaniu alka¬ liczna fosfataza.Wyniki przedstawione sa nizej. 16 Opis Material wyjsciowy (roztwór C) Wyciek — 1 •Wyciek — 2 Wyciek — 3 Wyciek — 4 Wodne przemywki 5°/o kwas octowy Frakcja nr 20 25 30 35 40 45 50 60 70 80 90 100 120 140 160 180 200 Wielkosc strefy (mm) kontrola (przed trak¬ towaniem fosfataza) 23 20,5 21 21,5 20,5 r 16,0 15 25 29 26 25 19 18 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 kontrola po trakto¬ waniu alkaliczna fosfataza ' 43 21 22 21,5 23 16,0 15 52 5*, 50 47,5 42,5 39 31 26 22 20 17 17 17 16 16 16 1 Frakcje 22—70, otrzymane z przemywania ko¬ lumny 5'°/o roztworem wodnym kwasu octowego, polaczono i roztwór ten liofilizowano, otrzymujac 2,59 g preparatu oznaczonego D. 2 g tego prepara¬ tu D poddano rozdzialowi przeciwpradowemu, sto¬ sujac uklad rozpuszczalników, skladajacy sie z n- -butanolu i wody (1 : 1 v/v). Aparat do rozdzialu przeciwpradowego zawieral fazy o objetosci 10 ml i rozdzial odpowiadal 500 przeniesieniom. Po 500 5 przeniesieniach wybrane probówki byly analizo-- wane na aktywnosc wzgledem S. lutea, jak opisa¬ no to wyzej, przed i po potraktowaniu alkaliczna fosfataza. Frakcje 200—300 polaczono, roztwór ten zatezono do sucha w prózni i sucha pozostalosc 10 rozpuszczono w 5 ml metanolu. Nastepnie roztwór ten zmieszano z acetonem, eterem i 1 ml 1 n. me¬ tanolowego roztworu chlorowodoru. Wytracony osad 3-fosforanu klinimycyny wyodrebniono przez saczenie i wysuszono; wydajnosc 300 mg.Charakterystyka tego preparatu, zawierajacego 3-fosforan klinimycyny jest nastepujaca. 15 Widmo w podczerwieni: widmo absorpcyjne w podczerwieni 3-fosforanu klinimycyny w zawie- 20 sinie w oleju mineralnym wykazuje piki przy na¬ stepujacych dlugosciach fali wyrazonych w od¬ wrotnych centymetrach: 25 30 35 40 3300 (S) 3055 (S) 3940 (S) (olej) 2845 (S) (olej) 2720 (S) 2680 (S) 1718 (S) (przegiecie) 1705 (S) 1700 (S) 1685 (S) 1675 (S) 1652 (S) (przegiecie) 1625 (S) (przegiecie) 1575 1570 (S) 1555 1532 1520 1505 1470 lr458 1435 1385 1375 1365 1310 (S) (S) (S) (przegiecie) (S) (S) (S) (olej) (S) .(przegiecie) (S) (S) (olej) (S) (przegiecie) (S) 1258 (S) 1220 (S) 1148 (S) 1(098 (S) 1070 (S) 1040 (S) 987 .(S) 960 (S) 880 (M) 855 815 (M) 780 (M) 720 (M) 45 50 55 60 65 widmo IR 3-fosforanu klinimycyny, sprasowanej w krazek z KBr, wykazuje piki przy nastepuja¬ cych dlugosciach fali wyrazonych w odwrotnych centymetrach: 3430 (S) 3230 (S) 3070 2960 (S) 2930 (S) 2870 (S) 1685 (S) 1680 (S) 1635 (M) 1560 (M) 1540 (W) 1455 (W) 1384 (M) 1,315 (W) 1255 (M) 1222 (M) 1150 (M) 1095 (S) 1073 (S) 1045 (M) 989 (W) 930 (W) 880 (W) 855 (W) 780 (W) Intensywnosci pasm przy widmach IR, przed¬ stawionych tutaj, oznaczone sa odpowiednio jako »S", „M" i „W" i sa zblizone w przeliczeniu na tlo w poblizu tych pasm. Pasmo „S" posiada in¬ tensywnosc tego samego rzedu, jak najmocniejsze80273 17 18 pasmo w widmie; pasma „M" posiadaja intensyw¬ nosc miedzy jedna a dwie trzecie intensywnosci najmocniejszego pasma i pasma „W" sa mniej niz jedna trzecia tak intensywne, jak najmocniejsze pasma. Oceny te sa poczynione na podstawie pro¬ centowej skali transmisji.Przeciwbakteryjna aktywnosc in vivo 3-fosfora- nu klinimycyny: CD5o wynosi 15 (10—23) mg/kg/ /podskórnie, myszy zarazone Staphylococcus au- reus. 3-fosforan klinimycyny jest nieaktywny in vitro wobec nastepujacych mikroorganizmów do pozio¬ mu 1000 y na ml 3-fosforanu klinimycyny wlacz¬ nie: B. substilis S. aureus M. avium K. pneumonie E. coli S. schottmuelleri Proteus vulgaris M.R.S. lutea S. postorianus Przyklad III. 3-fosforan 1-demetyloklinimy- cyny. Caly plyn (w przyblizeniu 12 litrów), otrzy¬ many z fermentacji, opisanej w przykladzie II, w której dodano do srodowiska fermentacyjnego 1-demetyloklinimycyne w ilosci 50 7/ml przesaczo¬ no, stosujac ziemie okrzemkowa jako pomocniczy material filtrujacy. Otrzymany placek filtracyjny przemyto 1 litrem wody. Wodne przemywki dola¬ czono do klarownego przesaczu i polaczone roz¬ twory chromatografowano na kolumnie chromato¬ graficznej. Kolumne stanowil Dowex — 1 (X-4) w formie octanowej.Wartosc pH klarowanej cieczy, opisanej wyzej, doprowadzono do wartosci 10,0' za pomoca wodne¬ go roztworu wodorotlenku amonu i roztwór ten przepuszczono przez kolumne. Wyciek zebrano w postaci trzech czterolitrowych frakcji oznaczo¬ nych: wyciek — 1, wyciek — 2, wyciek — 3, po czym kolumne przemyto 4 litrami wody, która zebrano w dwie dwulitrowe frakcje oznaczone Wash — 1 i Wash — 2. Nastepnie kolumne prze¬ myto 5% wodnym roztworem kwasu octowego, obierajac siedem jednolitrowych frakcji, które oznaczono jako Eluat — 1 do Eluat — 7. Wszyst¬ kie frakcje badano na aktywnosc. wobec S. lutea przed i po potraktowaniu alkaliczna fosfataza.Eluaty 2—7 polaczono i roztwór ten lifiolizowa- no, otrzymujac 16,98 g lifiolizowanego preparatu, zawierajacego 3-fosforan 1-demetyloklinimycyny.Material fen poddano rozdzialowi przeciwpradowe- mu, stosujac uklad rozpuszczalników, zawierajacy n-butanol-woda (1:1 .v/v). Aparat do rozdzialu przeciwpradowego zawieral fazy o objetosci 10 ml.Po 500 przeniesieniach wybrane probówki byly analizowane na aktywnosc wzgledem S. lutea, przed i po potraktowaniu alkaliczna fosfataza.Frakcje z probówek zlano razem i zatezono w wodnistej cieczy, po czym roztwór liofilizowano: wydajnosc 370 mg 3-fosforanu 1-demetyloklinimy¬ cyny o wzorze 5, w którym A oznacza grupe o wzorze 3.Przyklad IV. 3-fosforan l-demetylo-4-depro- pylo-4-pentylo-klinlmycyny. Caly plyn (w przybli¬ zeniu 12 litrów), otrzymany z fermentacji, opi- 10 15 20 30 40 45 50 55 sanej w przykladzie II, w której dodano do srodo¬ wiska fermentacyjnego l-demetylo-4-depropylo-4- -pentylo-klinimycyne w ilosci 50 y/ml, przesaczo¬ no, stosujac ziemie okrzemkowa jako pomocniczy srodek filtrujacy. Otrzymany placek filtracyjny przemyto 1 litrem wody. Przemywki wodne pola¬ czono z klarownym przesaczem i polaczone ciecze chromatografowano na kolumnie chromatograficz¬ nej.Kolumne stanowil Dowex-l (X-4) w formie octanowej. Przeprowadzono proces chromatogra¬ ficzny tak, jak w przykladzie III. Zebrane frakcje badano na aktywnosc S. lutea, przed i po potrak¬ towaniu alkaliczna fosfataza. Eluaty 2—7 polaczo¬ no i roztwór ten liofilizowano, otrzymujac 18,63 g liofilizowanego preparatu, zawierajacego 3-fosfo¬ ran l-demetylo-4-depropylo-4-pentyloklinimycyny.Material ten oczyszczono, poddajac go rozdzialowi przeciwpradowemu tak, jak w przykladzie III. Po 500 przeniesieniach, wybrane probówki badano na aktywnosc wzgledem S. lutea; przed i po potrak¬ towaniu alkaliczna fosfataza. Frakcje z probówek 380—400 polaczono razem, zatezono do wodnego roztworu, który nastepnie liofilizowano do otrzy¬ mania preparatu, zawierajacego 3-fosforan 1-deme- tylo-4-depropylo-4-pentyloklinimycyny o wzorze 6, w którym A oznacza grupe o wzorze 3.Przyklad IV. Zastepujac linkomycyne w sro¬ dowisku fermentacyjnym, opisanym w przykladzie I, 4-depropylo-4-etylo-linkomycyna otrzymano 3- -fosforan 4-depropylo-4 etylolinkomycyny.Przyklad VI. Zastepujac linkomycyne w sro¬ dowisku fermentacyjnym, opisanym w przykladzie I, przez 1-demetylo-l-etyloliiiikomyicyne otrzyma¬ no 3-fosforan 1-demetylo-l-etylolinkomycyny.Przyklad VII. Zastepujac linkomycyne w sro¬ dowisku fermentacyjnym, opisanym w przykladzie I, przez 1-demetylo-linkomycyne, otrzymano 3-fo¬ sforan 1-demetylolinkomycyny.Przyklad VIII. Zastepujac klinimycyne w srodowisku fermentacyjnym, opisanym w przy¬ kladzie II, przez celestycetyne otrzymano 3-fosfo¬ ran celestycetyny.Przyklad IX. Niefosforylowane zwiazki z przykladów I—VIII oddzielnie inkubowano z wolnym od komórek ekstraktem kultury Strep- tomyces, wyhodowanej w zmodyfikowanym me¬ dium Czapeka-Doxa. Komórki byly niszczone albo za pomoca dzwieków w ciagu 4 minut w buforze fosforanowym, pH = 7,5 lub buforze glicylo-gli- cynowym, 0,1 m pH = 8,0, badz tez za pomoca dzialania przez 1 godzine w temperaturze 28° lizo- zymem bialka z jaj. Zmodyfikowane medium Cza- pek'a-Doxa zawiera nastepujace skladniki: Na N03 i(NH4)2S04 CaC03 65 K2HP04 g/l 1,5 1,5 5,0 1,080273 19 20 MgS04 KC1 FeS04 • 7H20 monohydrat glukozy ekstrakt drozdzy Difco NZ amina B 0,5 0,5 0,01 20,0 2,5 5,0 1' litr H20 pH = = 7,2 przed auto- klakwowaniem pH = 7,2 po au- toklawowaniu Produkt niszczenia komórek za pomoca dzwie¬ ków, badz tez za pomoca lizozymu, odwirowano przy 30,000 x G przez 20 minut otrzymujac wolny od komórek, aktywny roztwór nad osadem, trwaly podczas przechowywania w cieklym azocie. • Mieszanina reakcyjna i odczynnik do reakcji transfosforylowania sa nastepujace: Odczynnik: kwas adenozynotrójfo¬ sforowy 0,1 m, pH=8,0 MgCl2 0,2 m glicyloglicyna 0,1 m. pH=8,0 Mieszanina reakcyjna: 0,1 m MgCl2 0,1 ml kwasu adenozyntrójfosforowego 0,2 ml substratu (np. niefosforylowany zwiazek) 0,5 ml enzymu w glicyloglicynie lub buforze fosforanowym Inkubacja przez 24 godziny w tempera¬ turze 28°C.Po zakonczeniu powyzszej reakcji otrzymuje sie fosforylowane zwiazki, opisane w przykladach I— Przyklad X.A. Dwuamonowa sól 3-fosforanu linkomycyny 3-fosforan linkomycyny w formie jonu dwubie¬ gunowego rozpuszczono w minimalnej ilosci wody i rozcienczono równa iloscia etanolu. Roztwór ten chlodzono na lazni, zawierajacej wode z lodem i nasycano gazowym amoniakiem. Bialy osad fo¬ sforanu dwuamonowego usuwano przez saczenie, a przesacz odparowywano do sucha w temperatu¬ rze 30° pod wysoka próznia. Pozostalosc rozpusz¬ czono w minimalnej ilosci metanolu i rozcienczono 5 objetosciami eteru w celu wytracenia 3-fosfora¬ nu linkomycyny w postaci soli amonowej.B. Pól-amonowa sól 3-fosforanu linkomycyny.Pól-amonowa sól otrzymano w nastepujacy spo¬ sób. Roztwór zawierajacy 1,0 gram amonowego 3- -fosforanu linkomycyny, otrzymano pod A, roz¬ puszczono w 4 ml wody. Bezbarwny roztwór roz¬ cienczono 0,25 ml kwasu octowego, a nastepnie 30 ml acetonu (punkt pierwszego zmetnienia). Kry¬ stalizacja nastepuje bardzo szybko. Po ochlodzeniu roztworu w lodówce przez 8 godzin, oddzielono krysztaly przez saczenie, przemyto je 5 ml roz¬ tworu aceton-woda (95—5), a nastepnie 20 ml acer tonu. Bialy krystaliczny zwiazek bedacy pól-amo¬ nowa sola 3-fosforanu linkomycyny oddzielono przez saczenie i Wysuszono.Przykladowe receptury.A. Wodne krople doustne 3-fosforan linkomycyny 100 Gm parabenian propylu 0,25 Gm parabenian metylu 0,75 Gm kwas sorbinowy 0,75 Gm 10 15 20 25 30 35 45 55 wodorotlenek sodu, 4 n roztwór wodny q.S. do pH = 7,5 woda dejonizowana q.S. 1000 ml 800 Gm 7,5 Gm 2,5 Gm 10 Gm 6,5 Gm 3000 ml 100 Gm 10 Gm 7,5 Gm 10.000 ml 65 B. Syrop Wodny preparat doustny, zawierajacy 400 mg 3- -fosforanu linkomycyny w kazdych pieciu milime¬ trach, przygotowano z nastepujacych skladników: 3-fosforan linkomycyny parabenian metylu, U.S.P. parabenian propylu, U.S.P. kwas sorbinowy sacharyna sodowa gliceryna proszek tragakantowy zapachowy olejek pomaranczowy barwnik pomaranczowy F.D. and C wodorotlenek sodu, 4n roztwór wodny g.s. pH = 7,5 woda dejonizowana W miejsce 3-fosforanu linkomycyny w receptu¬ rze A i B moze byc uzyty 3-fosforan 7(S)-chloro- -7-dezoksylinkomycyny lub tez rozpuszczalne w wodzie sole 3 fosforanu linkomycyny i 3-fosfora¬ nu 7(S)-chloro-7-dezoksylinkomycyny, na przyklad sole metali alkalicznych, oraz sole amonowe. Mo¬ ga byc uzyte albo pól lub mono- lub tez dwume- taliczne sole. .Wodne preparaty farmaceutyczne z receptur A i B sa szczególnie przydatne jako preparaty dla dzieci i moga byc podawane doustnie w tych sa¬ mych dawkach, jak linkomycyny.C. Kapsulki Tysiac dwuczesciowych kapsulek z twardej ze¬ latyny do stosowania doustnego, z których kazda zawierala 350 mg. 3-fosforanu <-demetyloklinimy- cyny, przygotowano z nastepujacych radzajów i ilosci substancji: 3-fosforan 1-demetyloklinimycyny 350 Gm ' skrobia kukurydziana 50 Gm talk 25 Gm stearynian magnezu 2,5 Gm Materialy te starannie wymieszano, a nastepnie sporzadzono kapsulki w zwykly sposób. Powyzsze kapsulki sa odpowiednie do traktowania systemi- cznego infekcji u ludzi doroslych przez doustne podawanie 1 kapsulki co 4 godziny.Stosujac wyzej opisany sposób postepowania, po¬ dobnie przygotowuje sie kapsulki, zawierajace 3- -fosforan 1-demetylo-klinimycyny w ilosciach 50, 125, 250 i 500 mg przez zastapienie wyzej stoso¬ wanych 350 g ilosciami 3-fosforanu 1-demetylo- -klinimycyny, wynoszacymi 50, 125, 250, i 500 Gm.D. Tabletki Tysiac tabletek do stosowania doustnego, z któ¬ rych kazda zawierala 500 mg 3-fosforanu 1-deme- tylo-4-depropylo-4-pentylo-klinimycyny, przygoto-80273 21 wano z nastepujacych rodzajów i ilosci substancji: 3-fosforan l-demetylo-4-depropylo- 500 Gm -4-pentylo-klinimycyny laktoza 50 Gm skrobia kukurydziana 65 Gm stearynian magnezu 3 Gm lekka wazelina ciekla 3 Gm Skladniki te starannie mieszano i zbrylono. Pi¬ gulki rozdrobniono za pomoca przetlaczania przez sito numer szesnascie. Otrzymane pigulki spraso¬ wano w tabletki, z których kazda zawierala 500 mg substancji aktywnej.Powyzsze tabletki odpowiednie sa do systemicz- nego traktowania infekcji u ludzi doroslych przez doustne podawanie 1 tabletki co 4 godziny.Stosujac powyzszy sposób postepowania, poza zmniejszeniem ilosci substancji aktywnej do 200 Gm, przygotowano tabletki zawierajace 200 mg substancji aktywnej.E. Preparat parenteralny Sterylny preparat wodny do stosowania domie¬ sniowego, zawierajacy w 1 ml 300 mg 3-fosforanu celestycetyny przygotowywano z nastepujacych ro¬ dzajów i ilosci substancji: 22 3-fosforan celestycetyny alkohol benzylowy woda do injekcji g.s. 300 Gm 9 Gm 1000 ml Sterylny lek dyspergowano w sterylnym nosni¬ ku, zawierajacym alkohol benzylowy i wode, a na¬ stepnie napelniono fiolki i zatopiono je.F. Pasza zwierzeca Tysiac Gm mieszanki paszowej przygotowano z nastepujacych rodzajów i ilosci skladników: 3-fosforan 4-depropylo-4-etylo- -linkomycyny 20 Gm maczka sojowa 400 Gm maczka rybna 400 Gm olej z kielków pszenicznych 50 Gm melasa z Sorgo (prosa afrykan¬ skiego) HO Gm Skladniki mieszano razem i prasowano w pa¬ stylki. Kompozycja ta moze byc podawana zwie¬ rzetom laboratoryjnym, tj. szczurom, myszom, swinkom morskim i królikom, w celach profilak¬ tycznych w czasie ich transportu.W odniesieniu do wiekszych zwierzat kompozy¬ cja ta moze byc dodawana do regularnego pozy¬ wienia w ilosciach wyliczonych w celu podania im odpowiedniej dawki substancji aktywnej.G. Preparat parenteralny Sterylny preparat wodny do stosowania domie¬ sniowego, zawierajacy w 1 ml 3-fosforanu cele¬ stycetyny przygotowywano z nastepujacych rodza¬ jów i ilosci substancji: 3-fosforan linkomycyny 300 Gm alkoholbenzylowy 9 Gm woda do injekcji 1000 ml Sterylny lek dyspergowano w sterylnym nosni¬ ku, zawierajacym alkohol benzylowy i wode, a na¬ stepnie napelniano fiolki i zatapiano je. Powyz¬ szy preparat parenteralny pozwala uzyskac bar- 5 dziej dlugotrwale leczenie w stosunku do porów¬ nywalnych preparatów, zawierajacych 2-fosforah linkomycyny, poniewaz hydroliza 3-fosforanu lin¬ komycyny jest wolniejsza niz hydroliza 2-fosfo- ranu. 10 PL PL